Автореферат и диссертация по медицине (14.03.10) на тему:Диагностика хламидийной инфекции в комплексном обследовании больных с хирургической патологией крупных суставов

На праваАрукописи

ооьиэо«—

ВЕТОШКИН Александр Александрович

ДИАГНОСТИКА ХЛАМИДИЙНОЙ ИНФЕКЦИИ В КОМПЛЕКСНОМ ОБСЛЕДОВАНИИ БОЛЬНЫХ С ХИРУРГИЧЕСКОЙ ПАТОЛОГИЕЙ КРУПНЫХ СУСТАВОВ

14.03.10 - клиническая лабораторная диагностика 14.01.17- хирургия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

16 МАП 2013

Санкт-Петербург - 2013

005058063

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении «Всероссийский центр экстренной и радиационной медицины имени A.M. Никифорова» МЧС России

Научные руководители:

доктор биологических наук Дрыгина Лариса Борисовна доктор медицинских наук Эргашев Олег Николаевич

Официальные оппоненты:

Кобиашвили Малхаз Георгиевич, доктор медицинских наук, заведующий отделом эндоскопии ФГБУ «Всероссийский центр экстренной и радиационной медицины имени A.M. Никифорова» МЧС России. Скрябин Олег Николаевич, доктор медицинских наук, профессор, главный хирург СПб ГУЗ «Клиническая больница имени Святителя Луки (профессора медицины Валентина Феликсовича Войно-Ясенецкого)», 1-й заместитель главного хирурга города Санкт- Петербурга.

Ведущая организация: ГБОУ ВПО «Санкт-Петербургский государственный медицинский университет имени академика И.П. Павлова» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Защита состоится « мая 2013 г. в часов на заседании

диссертационного совета Д 205.001.01 при Федеральном государственном бюджетном учреждении «Всероссийский центр экстренной и радиационной медицины имени A.M. Никифорова» МЧС России по адресу: 194044, Санкт-Петербург, ул. Академика Лебедева, д. 4/2.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Федерального государственного бюджетного учреждения «Всероссийский центр экстренной и радиационной медицины имени A.M. Никифорова» МЧС России по адресу: 197374, Санкт-Петербург, ул. Оптиков, д.54.

Учёный секретарь диссертационного совет; кандидат медицинских н

Автореферат разослан «

'В. Санников

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследования. Мочеполовая хламидийная инфекция - остается актуальной проблемой медицины. По данным экспертов ВОЗ в мире урогенитальным хламидиозом ежегодно заболевают до 100 млн. человек, а число инфицированных хламидиями людей достигает 1 млрд. (Deiman В., 2002). В Российской Федерации заболеваемость урогенитальной хламидийной инфекцией вышла на первое место среди всех бактериальных инфекций, передаваемых половым путем, и составила 89,5 случаев на 100 тысяч населения (Абакарова П.Р. и соавт., 2006). В действительности истинная заболеваемость значительно превышает данные официальной статистики (Зур Н.В. и соавт., 2010).

Хроническая урогенитальная хламидийная инфекция вызывает весьма широкий спектр осложнений, обусловленных диссеминацией возбудителя из первичного очага в различные отдаленные органы и ткани (Лобзин Ю.В. и соавт., 2010). Одной из наиболее тяжелых и частых экстрагенитальных форм ее проявлений является хламидия-индуцированная артропатия (Синчихин С.П. и соавт, 2009; Кошкин C.B., 2010).

Доказано, что хламидии вызывают в пораженных органах сосудистые расстройства и дистрофические изменения клеток с последующим их некрозом (Маловичко Е.В. и соавт., 2008). Подобные патологические процессы происходят также в костной ткани при остеохондропатиях. Несостоятельность сосудистой сети и дефицит кровообращения рассматриваются в настоящее время как причины развития остеонекроза, а повышенная механическая нагрузка -предрасполагающим фактором его развития (Прохоренко В.М. и соавт., 2007).

Неуклонно растет число больных с хирургической патологией суставов конечностей, и частота этой патологии колеблется от 30 до 55 % среди всех ортопедических заболеваний (Винчель Р.В. 2009). Коррекционные операции на этих суставах обеспечивают улучшение качества жизни данной категории больных (Фомичев Н.Г., 2005). Однако, инфекционные осложнения, которые развиваются в 10-30 % после операций на суставах с использованием имплантатов, приводят во многих случаях к тяжелым ортопедическим дефектам (Жемаев М.В., 2004; Ключевский В.В., 2008). Причины послеоперационных осложнений связаны не только с асептической природой, но и инфекционной, обусловленной в том числе хламидийным поражением (Гольдина И.А. и соавт., 2007). Улучшение качества предоперационной диагностики хламидийной инфекции, создание эффективных алгоритмов обследования

больных, оптимизация их лечения, направленная на предоперационную санацию очагов хронической инфекции, весьма актуально.

При обследовании больного для исключения скрытой инфекции рекомендуется параллельное использование нескольких методов (Мог^о Р .2,., 2012). Современным направлением в лабораторной диагностике хламидийных инфекций становится комплексный подход, когда используется сочетание различных диагностических тестов для скрининга и подтверждения инфекции (Наппи Т., 2011). Однако, несмотря на значительные успехи, достигнутые в диагностике хламидийной моно- и микстинфекции, единого алгоритма предоперационного клинико-лабораторного обследования больных с хирургической патологией коленных суставов на присутствие возбудителей инфекции в настоящее время нет.

Степень разработанности темы исследования. К настоящему времени накоплен ряд данных о наличии специфических особенностей в функционировании иммунной системы больных с реактивным артритом при хламидийной инфекции, что уточняет представление о этиопатогенезе заболевания (Лобзин Ю.В. и соавт., 2010). Также, были попытки использовать различные диагностические подходы к выявлению хламидийной инфекции и определить ее роль в патогенезе дегенеративно-дистрофических изменений суставов, однако полученные результаты были не достаточно убедительными. В то же время, инфекционные осложнения, этиологически связанные с хламидийной инфекцией после операций на суставах с использованием имплантатов, могут приводить к ортопедическим дефектам (Жемаев М.В., 2004; Гольдина И.А. и соавт., 2007, Ключевский В.В., 2008). Вышесказанное обосновывает необходимость поиска новых алгоритмов предоперационного обследования пациентов с патологией суставов.

Актуальность проблемы - значительный рост числа больных с хирургической патологией суставов конечностей, высокая частота послеоперационных осложнений, ассоциированных, в том числе, с хламидийной инфекцией, ограниченность данных об основных патогенетических механизмах, лежащих в основе развития реактивных артритов, отсутствие единого алгоритма обследования больных для выявления возбудителя заболевания и статистического учета инфекционных осложнений хирургического вмешательства - послужили основанием для проведения данного исследования.

Цель исследования: оценить клинические и лабораторные изменения у пациентов с хирургической патологией коленных суставов на фоне хламидийной инфекции с целью создания эффективного алгоритма предоперационного комплексного клинико-лабораторного обследования.

Задачи исследования:

1. Определить распространенность хламидийной инфекции у пациентов с хирургической патологией коленных суставов.

2. Сравнить морфологические особенности изменений внутрисуставных тканей при реактивном артрите и хирургической патологии суставов.

3. Оценить состояние иммунной системы пациентов с хирургической патологией коленных суставов на фоне клинического течения скрытой инфекции.

4. Определить спектр возможных возбудителей скрытой инфекции с использованием полимеразной цепной реакции, иммуноблоттинга и масс-спектрометрии микробных маркеров у пациентов с суставным синдромом.

5. Обосновать необходимость комплексной диагностики хламидийной инфекции у пациентов с патологией крупных суставов.

Научная новизна. С использованием новых лабораторных технологий впервые охарактеризован специфический гуморальный иммунный ответ при хронической хламидийной инфекции.

Впервые с применением комплексного подхода, включающего широкий перечень лабораторных методов, показана эффективность обследования на скрытую инфекцию больных с хирургической патологией суставов и разработан алгоритм диагностики распространенного хламидиоза у лиц с показаниями к оперативному лечению.

Теоретическая и практическая значимость. На основании проведенного исследования выявлены и проанализированы особенности течения хирургических заболеваний и травм суставов на фоне скрытой хламидийной инфекции.

Предложен алгоритм клинико-лабораторного обследования на скрытую инфекцию больных с хирургической патологией суставов с применением современных методов лабораторной диагностики.

Обоснован и разработан метод малоинвазивной биопсии синовиальной оболочки коленного сустава и определена его роль в алгоритме предоперационного обследования больных с патологией суставов на хламидийную инфекцию.

Методология и методы исследования. В работе использованы общенаучные методы: анализ (проспективный и ретроспективный), синтез (сравнительно-сопоставительный), частно-научные методы - клинический, лабораторный, инструментальный, статистический.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Морфологические особенности изменения внутрисуставных тканей при реактивном артрите и при дегенеративно-дистрофических заболеваниях суставов не имеют значимых отличий.

2. Видоспецифические IgG к Chlamidia spp. и IgG к антигену Hsp60 Chlamydia trachomatis являются значимыми лабораторными показателями для скрининга хламидийной инфекции у больных с хирургическими заболеваниями крупных суставов до оперативного лечения.

3. Алгоритм диагностики распространенного хламидиоза у пациентов с показаниями к оперативному лечению крупных суставов с использованием метода малоинвазивной биопсии синовиальной оболочки имеет высокую диагностическую значимость.

Степень достоверности и апробация результатов исследования.

Степень достоверности полученных результатов проведенных исследований определяется достаточным и репрезентативным объёмом выбороки проведенных исследований и обследованных пациентов, достаточным количеством выполненных наблюдений с использованием арсенала современных методов исследования и подтверждена адекватными методами статистической обработки данных. Методы математической обработки полученных результатов адекватны поставленным задачам.

Основные положения работы доложены и обсуждены международной научно-практической конференции «Многопрофильная клиника XXI века. Современные технологии в эндовидеохирургии» (Санкт-Петербург, 2013), на научно-практических конференциях «20th Euroepan Congress of Clinical Chemistry and Laboratory Medicine, 45th Congress of the Italian Society of Clinical Biochemistry and Clinical Molecular Biology (SIBioC)» (Milano, 2013).

Результаты исследования внедрены в научную, учебную и лечебно-диагностическую работу Федерального государственного бюджетного учреждения «Всероссийский центр экстренной и радиационной медицины имени А.М. Никифорова» МЧС России, Ленинградской областной клинической больнице.

Личный вклад автора. Автором составлен дизайн исследования и проведен анализ результатов клинического и лабораторного обследования 94 пациентов. Автором самостоятельно проведено тщательное клиническое обследование больных, разработан и применен метод малоинвазивной биопсии синовиальной оболочки коленного сустава для получения биоптата ткани. В ходе выполнения работы проведен аналитический обзор современной отечественной и зарубежной литературы. Совместно со специалистами выполнены инструментальное обследование суставов и лабораторные исследования. Самостоятельно проведен статистический анализ полученных результатов, сделаны научные выводы.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 7 научных работ, из них 3 — публикации в изданиях, определенных перечнем рецензируемых научных журналов и изданий, оформлено 2 рационализаторских предложения.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 130 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов собственных исследований и их обсуждения, заключения, выводов, практических рекомендаций и списка литературы, включающего 228 источников, из них 152 отечественных и 76 зарубежных источников. Работа содержит 16 таблиц и 19 рисунков.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследования

Обследовано 94 человека с патологией коленных суставов, которые находились на лечении в клинике №2 ФГБУ ВЦЭРМ им. A.M. Никифорова МЧС России и Ленинградской областной клинической больнице. Средний возраст пациентов составил 35,0 ± 10,5 лет. Соотношение женщин и мужчин - 1:3.

На основании анамнеза, клинического, лабораторных и инструментальных исследований все обследованные лица были разделены на три группы.

Первую группу (и=22) составили больные с дегенеративно-дистрофическими повреждениями элементов коленного сустава (М 23.0-9, здесь и далее в круглых скобках таксон по МКБ 10).

Во вторую группу (п=40) были включены лица с наличием суставного симптомокомплекса и клинико-лабораторными маркерами урогенитальной инфекции хламидийной этиологии (М 02.0), с так называемой хламидия индуцированной артропатией.

Третью - группу сравнения (и=32) — составили больные с острой травматической патологией коленных суставов (S83.0-9).

В работу не включались лица с клиническими проявлениями и наличием лабораторных маркеров ВИЧ 1 и 2 типов, вирусных гепатитов В и С, сифилиса, туберкулеза, ревматоидного артрита, подагры, болезни Бехтерева, псориаза, с обострением соматической патологии, не относящейся к исследованию. Обследование пациентов проводили по единой схеме.

Для объективной оценки клинических проявлений патологии коленных суставов использовалась 100 балльная шкала (Joseph et Kaufmann, 1990), включающая в себя оценку следующих параметров: боль (50 баллов), функция (24 балла), амплитуда движений в суставе (14 баллов), деформация конечности (5 баллов), мышечная сила (Збалла), стабильность сустава (4 балла). С помощью этой шкалы функцию сустава оценивали в предоперационном периоде.

Всем больным выполняли стандартное рентгенологическое исследование коленных суставов на аппарате «SWISSRAY», по

показаниям выполняли рентгенологическое исследование подвздошно-крестцовых сочленений и позвоночника. МРТ коленных суставов выполнили всем пациентам с использованием аппарата «SIEMENS MAGNETOM ESREE», Германия.

Клинико-лабораторное исследование включало общеклинические методы (клинический анализ крови, определение тромбоцитов и ретикулоцитов, общий анализ мочи). Проведены биохимические (протеинограмма, СРБ, РФ, антистрептолизин, щелочная фосфатаза, мочевая кислота) и иммунологические исследования (общие иммуноглобулины A, M, G, циркулирующие иммунные комплексы; специфические антитела -антитела к модифицированному цитруллинированному виментину, антитела к циклическому цитруллинированному пептиду, антинуклеарные антитела, антитела к двуспиральной ДНК; определен субпопуляционный состав лимфоцитов периферической крови и определены антигены В7/В27 методом проточной цитометрии), молекулярно-биологические (ПЦР-анализ), серологические (иммунофлюоресцентный и иммуноферментный методы), гистоморфологические (иммуногистохимический метод) и бактериологические (культуральные) исследования.

Клинический анализ крови проводили с помощью гематологического анализатора «LH 500» (Beckman-Coulter, США).

Биохимические исследования проводили с помощью анализатора «Synchron СХ®-9 PRO» (Beckman-Coulter, США), определение протромбинового времени и количество фибриногена в плазме крови — на автоматическом коагулометре «ACL ELITE PRO» (Instrumentation Lab., США).

Исследование клеточного звена иммунитета включало определение следующих субпопуляций лимфоцитов: CD3+ (Т-лимфоциты), CD3+CD4+ (Т-хелперы), CD3+CD8+ (цитотоксические Т-лимфоциты), CD3-CD56+ (NK-клетки), CD 19+ (B-лимфоциты). Иммунофенотипирование клеток периферической крови проводили методом проточной цитометрии на Citomics FC500 (Beckman Coulter, США) с использованием моноклональных антител (Beckman Coulter, США): CD45FITC-CD4RD1-CD8ECD-CD3PC5, CD45FITC-CD56RD1-CD19ECD-CD3PC5. Накопление проводилось до 5000 событий в лимфоцитарном гейте, который оценивался по экспрессии CD45. Содержание иммуноглобулинов определяли турбодиметрическим методом с применением моноспецифических антисывороток «Audit Diagn.» (Ирландия) на анализаторе «Metrolab 2300» (Аргентина). Содержание цитокинов в сыворотке оценивали методом ИФА с использованием тест-систем «Протеиновый контур» (Россия) для IL-1, IL-8 и «Immunotech» (Франция) для IL-10 и IFN-y.

Применяли прямые методы выявления хламидии в синовиальной жидкости, синовиальной оболочке: метод прямой иммунофлюоресценции с использованием поликлонапьных антител к Chlamydia spp. «ХлаМоноСкрин» (ООО «Ниамердик Плюс», Россия).

Пункционную биопсию синовиальной оболочки коленного сустава проводили согласно разработанному нами методу (Рационализаторские предложения №10683/6 от 12.11.2007г. «Способ пункционной биопсии синовиальной оболочки коленного сустава»). Гистологическому исследованию подвергались синовиальная оболочка и мениск, полученные в ходе оперативного лечения и методом пункционной биопсии. Срезы окрашены гематоксилином и эозином- обзорно-диагностическая окраска и применялось иммунофлюоресцентное окрашивание с использованием видоспецифических поликлонапьных куриных антител к С.

trachomatis.

Методом ПЦР с использованием тест-систем фирмы «АмплиСенс» производства ФГУН ЦНИИ эпидемиологии проводилась диагностика С. Trachomatis в биологических средах.

Обнаружение антихламидийных антител в сыворотке крови больных осуществлялось методом ИФА с использованием тест-систем «Chlamydia spp. - IgG», «Hsp60 Chlamydia-IgG », «Chlamydia trachomatis-IgG», «Chlamydia trachomatis-IgA» («MEDAC», Германия). Для обнаружения антител к Y. enterocolitica при дифференциальной диагностике этиологии реактивного артрита применяли метод иммуноблотинга («Euroimmun», Германия). Для выполнения процедур иммуноблоттинга (внесения реагентов, инкубации, промывки) использовалась автоматизированная система ProfiBLOT 48 («TECAN Austria GmbH», Австрия). Результаты иммуноблоттинга обрабатывались при помощи специальной компьютерной программы «EuroLineScan», позволяющей получать графическое изображение антигенного профиля Y. enterocolitica с определением соответствующего спектра белков. Кроме этого, программа «EuroLineScan» вычисляла полуколичественные значения специфических антител классов IgA и IgG.

Гистологическому исследованию подвергали синовиальную оболочку коленного сустава, полученную при артроскопии у пациентов 1-й и Ш-й групп, а также пункционным методом с помощью оригинальной пункционной иглы у пациентов П-ой группы (Рационализаторское предложение №10684/6 от 12.11.2007г., «Способ диагностики скрытой инфекции у больных с преимущественным поражением коленных суставов»).

Выявление HLA В7/В27 проводили методом проточной цитометрии на Cytomics FC500 (Beckman-Coulter, США). Посев крови на стерильность проводили только тем больным, у которых наблюдалась субфебрильная температура и выраженная клиническая картина синовиита коленных

суставов. У этих же больных проводили культуральные исследования с целью выделения возбудителей на культуре клеток.

Для проведения масс-спектрометрического анализа синовиальную жидкость предварительно обрабатывали химическими реагентами, после чего смесь эфиров в количестве 2 мкл вводили в инжектор газового хроматографа «Agilent 7890» с масс-селективным детектором «Agilent 5975С» (Agilent Technologies, США) посредством автоматической системы ввода проб (автосэмплер). Хроматографическое разделение пробы осуществляли на капиллярной колонке с метилсиликоновой привитой фазой HP-5ms (Agilent Technologies, США) длиной 25 м и внутренним диаметром 0,25мм, газ-носитель - гелий. Режим анализа программированный, скорость нагрева термостата колонки 7 С/мин в диапазоне 135 - 320°С. Выдержка при начальной температуре 1,5 мин. Температура испарителя - 250 С, интерфейса - 250 - 300 С. Метод в 2010 г. Росздравнадзором разрешен к применению в качестве новой медицинской технологии «Оценки микроэкологического статуса человека методом хромато-масс-спектрометрии» на территории Российской Федерации (Разрешение ФС 2010/038 от 24.02.2010). Авторы медицинской технологии: академик РАМН Баранов В.М., д.б.н. Осипов Г.А., д.м.н. Мухамедиева Л.Н., д.м.н. проф. Белобородова Н.В., Пахомова A.A., д.м.н. Ильин В.К. и к.б.н. Родионова Т.А. Метод, примененный в этой работе, позволил сканировать одновременно 57 маркеров микроорганизмов разного таксономического уровня и их групп.

Статистическую обработку полученных результатов исследования проводили с использованием пакетов прикладных программ «Microsoft Excel 2007», «Statistica 6.0» с применением методов непараметрической статистики. Для оценки значимости различий количественных переменных в двух выборках использовали непараметрический U критерий Манна-Уитни. При сравнении нескольких групп проводился дисперсионный анализ Краскелла-Уоллиса и медианный тест, сравнение средних рангов для всех групп. Силу связей между признаками оценивали по величине непараметрического коэффициента корреляции (тау Кендалла, гт). Различия считались достоверными при р< 0,05.

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ РАБОТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Анализ клинических симптомов показал, что во всех случаях развитию заболевания у больных И-й группы предшествовала урогенитальная хламидийная инфекция. Подобной связи у пациентов 1-й и Ш-й групп не прослеживалось. Основные клинические симптомы и внутрисуставные изменения, выявляемые инструментальными методами, представлены в таблице 1.

Таблица 1.

Оценка основных клинических симптомов по 100 балльной шкале (Joseph et Kaufmann, 1990), балл.___

Клинические признаки I -я группа (п=22) Н-я группа (п=40) Группа сравнения (п=32)

Боль в суставе (50 баллов) 34 (28;40) 39 (32;48) 28(14;40)

Функция (24 балла) 14 (10;18) 18 (15;24) 10(4;20)

Амплитуда движений в суставе (14 баллов) 8 (5;9) 12 (10; 14) 7(3;12)

Деформация конечности (5 баллов) 2 (2;4) 4 (4; 5) 3(1;5)

Мышечная сила в суставе (3 балла) 2 (1;3) 3 (2;3) 2(1;3)

Стабильность сустава (4 балла) 2(1;4) 3 (2;4) 2(1 ;4)

Итого средний балл 62 (47;78) 79 (65;82) 52 (42;60)

В 1-ой группе пациентов оценка по шкале Joseph et Kaufman (1990) составила в среднем 62 балла (от 47 до 78 баллов)- периодические боли в покое и умеренные при ходьбе на небольшие расстояния, амплитуда движений менее 110°, конечность опороспособна, нарушение оси конечности не превышает 10° во фронтальной плоскости. Во Н-ой группе оценка по шкале Joseph et Kaufman (1990) в среднем составила 79 баллов (от 65 до 82 баллов)- умеренная боль в покое и при нагрузке, конечность опороспособна, хромота отсутствует, ось конечности правильная, сустав стабилен, амплитуда движений в суставе - 110° и более. В Ш-ей группе обследованных больных оценка по шкале Joseph et Kaufman (1990) в среднем составила 52 балла (от 42 до 60 баллов). Характерные признаки группы- это наличие постоянной боли в покое и выраженной при минимальной нагрузке, необходимость дополнительной опоры при ходьбе, наличие нестабильности в суставе, амплитуда движений до 40°. Низкий средний балл оценки в данной группе объясняется большой долей болевого синдрома в учете результатов.

К особенностям начала заболевания Н-ой группы больных можно отнести следующие: в подавляющем большинстве случаев 26 (65%) суставной процесс носил моноартикулярный характер -32 случая (в целом частота моно- артрита составила 80%), локализация первично пораженного сустава преимущественно на нижних конечностях, наиболее часто поражался коленный сустав (25%); Симптом «лестницы»

(последовательное одностороннее вовлечение суставов снизу вверх) отмечалось в 27,5% случаев, а симптом «спирали» (поражение разноименных суставов снизу вверх) — в 10% при восходящем вовлечении суставов. В дебюте реактивного артрита сочетание симптомов уретрита и артрита встречалось в 3 раза чаще, чем классическая триада Рейтера. В целом частота неполного симптомокомплекса (2 признака из 3) при РеА составила 40%, полного - 17,5%. В развернутую стадию полиартрит встречался чаще (45%), чем олиго- (40 %) или моноартикулярные поражения (7,5%). Наиболее часто вовлекались коленные и голеностопные суставы (65%).

Болевой синдром в различных отделах позвоночника встречался в 35% случаев, наиболее частая локализация боли- пояснично-крестцовый отдел позвоночника - 22,5%.

При рентгенографии суставов, обнаружили околосуставной остеопороз в 7,5% случаев, деформацию межмыщелковых возвышений в 10%, сужение суставной щели и остеосклероз в 20%. При анализе рентгенограмм различных отделов позвоночника установлены признаки остеохондроза: сужение высоты дисков (40%), субхондральный склероз (20%), остеофиты (18%).

Результаты гистоморфологического исследования образцов пункционных биоптатов

При острой травме в синовиальной оболочке сустава наблюдалась реактивная лимфо- гистиоцитарная инфильтрация, периваскулярный отек, очаговый некроз синовиального эпителия. В ткани мениска имелся некроз, очаговая слабо выраженная инфильтрация гистиоцитами. При иммунофлюоресцентном исследовании всех образцов ткани синовиальной оболочки антигенов С. trachomatis не обнаружено. В 1-й группе пациентов с длительным течением дегенеративно-дистрофических заболеваний суставов и И-ой группе пациентов с реактивным артритом патогистологические проявления не имели значимых отличий и характеризовались хроническим продуктивным воспалением, которое сопровождалось выраженным фиброзом, лимфо- плазмоцитарной и гистиоцитарной инфильтрацией, гиперплазией синовиального эпителия и формированием ворсинок, склерозированными сосудами. При иммунофлюоресцентном окрашивании в 1-й группе выявлен антигенный материал С. Trachomatis в 6 случаях (28%), во Н-ой группе 28 случаев (67.5%), что дает повод включить биопсию синовиальной оболочки в алгоритм обследования пациентов в предоперационном периоде.

Результаты лабораторного исследования

Результаты общего клинического, биохимического и коагуло-логического анализа сыворотки крови пациентов обследованных групп представлены в таблице (табл. 2).

Таблица 2.

Обобщенные показатели лабораторных исследований крови у _обследованных пациентов (Ме [25%; 75%])_

Показатель, ед.изм. Группы обследуемых

I -я группа (п=22) II—я группа (п=40) Группа сравнения (п=32)

Эритроциты, 1012/л 3,99 [3,90; 4,48] 4,43[3,99; 4,65] 4,01 [3,91; 4,53]

Гемоглобин, г/л 121 [113; 137] 119 [118; 124] 125 [120; 132]

Лейкоциты, 109/л 6,9 [5,2; 8,1] 10,6 [8,0; 12,9]* 6,4 [5,0; 7,7]

Тромбоциты, 109/л 294 [203; 315] 240 [209; 297] 216 [193; 247]

СОЭ (по Вестергрену), мм/час 16 [13; 24] * 17 [114; 26] ** 5 [4; 11]

Мочевая кислота, мкмоль/л 223 [189; 356] 220 [198; 350] 292 [187; 369]

Аланинаминотрансфер аза, Ед/л 26 [14; 38] 31 [18; 40] 34 [27; 45]

Аспартатаминотрансф ераза, Ед/л 31 [25; 49] 26 [13; 38] 44 [35; 59]

Щелочная фосфотаза, Ед/л 73 [48;91] ** 78 [54;92] ** 56 [35; 89]

Протромбиновое время, сек 10,4 [9,7; 11,0] 11,0 [9,9; 11,5] 11,5 [9,9; 12,0]

Фибриноген, г/л 3,4 Г1,7; 4,0] 2,6 [1,6; 3,5] 4,0 [2,1; 4,51

СРБ, г/л 9,4 Г6,6; 11,0] 12 [6,4; 36,0] 7.2 [4,6; 10.01

Примечания: значимое отличие 1-ой и Н-ой групп от группы сравнения: * - р<0.05; ** - р<0.01,*** р<0.001 (и критерий Манна-Уитни).

Как следует из таблицы, концентрации СРБ, количество лейкоцитов и СОЭ у пациентов второй группы достоверно отличались от таковых в контрольной группе и превышали границы референтных интервалов. Первая группа пациентов характеризовалась повышенным содержанием маркеров воспаления, однако достоверных различий с контрольной и второй группами по этим показателям выявлено не было, что указывало на необходимость дальнейшего обследования пациентов этой группы на предмет выявления очага инфекции.

Результаты оценки иммунологического статуса

Результаты исследования субпопуляционного состава периферической крови обследованных пациентов представлены в табл.3.

Таблица 3.

Субпопуляционный состав лимфоцитов периферической крови

Показатели, ед. изм. Группы обследуемых р<0,05 между группами

I -я группа (п=22) Н-я группа (п=40) Ш-я группа (п=32)

Лимфоциты, в мкл. 1733 Г1602; 1864] 1354 [1218;1490] 1860 Г1750; 19701 2 и 3

СБЗ+, % 71 [65; 77] 72 [66;78] 69 [63; 75]

СБЗ+СБ4+, % 44 [40; 48] 51 [46; 561 40 [36; 44] 2 и 3

СОЗ+СЭ8+, % 36 [32; 40] 20 [17; 23] 29 [24; 34] 2 и 3

СОЗ-СБ56+, % 13 [10; 16] 9 [6; 121 14 [10; 18] 2 иЗ

СБ 19, % 14[11; 17] 18 [15; 21] 16 [13; 181

Не выявлено достоверных отличий между показателями субпопуляционного состава пациентов первой группы и остальных групп.

У пациентов второй группы по сравнению с группой лиц с острой травмой отмечалось выраженное снижение абсолютного количества лимфоцитов периферической крови, не выходящее за пределы референтного интервала. По сравнению с третьей группой у лиц второй группы выявлено повышение количества Т-хелперов, снижение количества цитотоксических Т-лимфоцитов и МК-клеток, что может быть связано с развитием иммунного ответа на инфекцию и миграцией клеток-эффекторов в очаги воспаления. Общее количество Т-лимфоцитов и В-клеток было сопоставимо во всех группах.

Результаты исследования цитокинового профиля обследованных пациентов представлены в табл.4.

Таблица 4.

Содержание цитокинов в сыворотке крови обследованных пациентов

(Ме [25%; 75%1).

Показатели пг/мл. Группы обследуемых р<0,05 между группами

I —я группа (п=22) И-я группа (п=40) Ш-я группа (группа сравнения) (п=32)

1Ь-1Ь 132 [81;183] 123 [52; 194] 72 [43; 101] 1 иЗ

71 [65; 77] 75 [51; 99] 69 [43; 95]

ШЫ-у 54 [40; 68] 68 [33; 93] 39 [17; 611

1Ь-10 36 [32; 40] 58 [26; 90] 24 [13; 34]

У всех обследованных пациентов уровень провоспалительных цитокинов 1Ь-1Ь и 1Ь-8 превышал референтные значения, что связано с иммунным воспалением посттравматическим (Ш-я группа), инфекционным (Н-я группа) и аутоиммунным (I -я группа).

Содержание в сыворотке провоспалительного цитокина 1РТ^-у и противовоспалительного цитокина 1Ь-10 было максимальным у пациентов П-ой группы, однако не достигало статистически достоверного увеличения по сравнению с Ш-ей группой, вследствие высокой вариабельности результатов внутри группы.

Проведенные иммунологические исследования позволили выявить особенности параметров иммунитета у больных с проявлениями генерализованной хламидийной инфекции, которые свидетельствуют о развитии иммунного ответа на патоген с вовлечением популяций Т-хелперов, цитотоксических Т-лимфоцитов и ЫК-клеток. Цитокиновый статус этой группы больных характеризовался менее выраженными нарушениями по сравнению с группой пациентов с острой травмой коленного сустава. Персистенция хламидийной инфекции, вызывающая постоянную фоновую активацию иммунной системы, может приводить к формированию осложнений в послеоперационном периоде. Особенностью обследованных пациентов явилась тесная ассоциация с антигеном НЬА-В27, который достоверно чаще выявлялся у пациентов П-ой группы: антиген НЬА-В27 выявлен у 24 больных (60%) (р<0,05).

Показатели гуморального иммунитета у обследованных пациентов представлены на рис. 1

□ I группа ■ II Группа

□ Контроль

* - значимое отличие 11-от группы сравнения (р<0.05)

Рис.1. Показатели гуморального иммунитета у обследованных пациентов, г/л

Уровень общего иммуноглобулина G был повышен во И-ой группе обследованных - (22,1 [17,5; 24,1]) г/л и достоверно отличался от такового в Ш-ей группе - (10,1 [8,2; 14,8]) г/л, что , возможно, связано с интенсивным антителообразованием на антигены возбудителей скрытой инфекции. В 1-ой группе содержание общего IgG составило 16,7 [11,2; 18,8]г/л, но достоверных различий с контрольной группой выявлено не было. Уровень общего IgA в сыворотке крови больных Н-ой группы был повышен и составил 4,6 [3,8; 5,1] г/л, что отражает активность инфекционного процесса.

Результаты серологических методов исследования (определение специфических антител). С целью оценки иммунореактивности возбудителей, учитывая ассоциацию реактивного артрита с предшествующей мочеполовой, кишечной, реже носоглоточной инфекциями, было проведено исследование особенностей гуморального ответа организма пациентов на антигены С. trachomatis, Y. enterocolitica. Методами ИФА и иммуноблоттинга выявляли специфические антитела классов IgG и IgA у обследованных пациентов. Результаты исследования представлены в табл. 5.

Таблица

Частота выявления специфических антител и ^А у _обследованных пациентов_

Показатель, ед. изм. Метод исследования Группа (отн.)

1-я, п=22 Н-я, п=40 Ш-я, п=32

IgG C.spp. ИФА (36,3%)** (80,0%)*** (9,3%)

IgG Hsp60 ИФА (4,5%) (57,5%)** (0%)

IgA МОМР C.trachomatis ИФА (4,5%)** (20%)*** (0%)

IgG MOMP C.trachomatis ИФА (36,3%)** (40%)*** (3,1%)

IgA Y. enterocolitica ИБ (18,1%)** (15%)* 0 (0%)

IgG Y.enterocolitica ИБ (13,6%)** (17,5%)** 0 (0%)

Примечания: значимое отличие 1-ой и И-ой групп от группы сравнения: * - р<0.05; ** - р<0.01,*** р<0.001 (U критерий Манна-Уитни).

Как видно из представленных в таблице данных, антитела класса IgG МОМР к антигенам С. trachomatis обнаруживали достоверно чаще в сыворотке крови у пациентов 1-ой и Н-ой групп (36,3 и 40% соответственно), чем у пациентов контрольной группы (3,1 %) (р<0,001). Специфические антитела класса IgA МОМР C.trachomatis достоверно чаще обнаруживались у пациентов Н-ой группы (р<0,001). Сочетанное определение IgG и IgA антител против С. trachomatis указывает на

активный инфекционный процесс у четверти обследованных пациентов с патологией крупных суставов 1-ой группы.

Представленные в таблице данные также указывают на присутствие антител класса IgG к антигенам Y.enterocolitica в сыворотках крови обследованных пациентов и может свидетельствовать о персистенции возбудителя в слизистой кишечника и лимфатических тканях или являться маркером инфицирования в прошлом. Оценка диагностической значимости определения антител класса IgG против С. trachomatis дала следующие результаты: чувствительность - 61,9%, специфичность -65,1%, диагностическая значимость положительного результата - 19,7%, диагностическая значимость отрицательного результата — 92,5%, диагностическая эффективность — 64,7%, при этом данный метод обладал значительно большей чувствительностью при обследовании мужчин (80%), чем женщин (45,5%).

Чувствительность серодиагностики хламидиоза на основании специфических антител класса IgA составила 63,6%, специфичность — 92,9%, диагностическая значимость положительного результата — 53,8%, диагностическая значимость отрицательного результата — 95,1%, диагностическая эффективность - 89,5%. Обращает на себя внимание высокая диагностическая значимость отрицательного результата серодиагностики. Это обстоятельство может определить ценность лабораторного теста для исключения хламидийной инфекции. В то же время низкая прогностическая значимость положительного результата, особенно в случае изолированного определения специфических антител класса IgG, делает необходимым подтверждение положительных результатов серодиагностики альтернативным методом.

Использованные тесты имеют ограниченную чувствительность и специфичность. Совместное же использование нескольких методов увеличивает вероятность диагностики хламидийной инфекции.

Результаты молекулярно-биологических методов исследования. С целью сопоставления эффективности различных методов лабораторной диагностики скрытой инфекции синовиальная жидкость (СЖ) и синовиальная оболочка (СО) суставов были исследованы методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) на наличие ДНК С. trachomatis. Положительный результат ПЦР определения С. trachomatis статистически достоверно чаще встречался в СЖ и СО пациентов Н-ой группы, серопозитивных по IgG (р<0,05). В синовиальной жидкости и ткани пациентов Н-ой группы результаты ПЦР были положительными в 25% и 87.5%. (табл.б).

Таблица б.

Частота выявления ДНК С. trachomatis методом ПЦР в ткани сустава

Биологический материал для ПЦР Частота выявления (абс., отн.)

1-я, п=22 П-я, п=40 Ш-я, п=32

Синовиальная жидкость 5(22,7%)* 10(25%)** 1(3,1%)

Синовиальная оболочка 8(36,3%)* 35(87,5%)** 1(3,1%)

Примечания: различие между группами: * - р<0.05; ** - р<0.01,*** pO.OOl (U критерий Манна-Уитни).

Из 22 пациентов 1-ой группы ДНК С. trachomatis была найдена в СЖ у 5 больных (22.7%), при этом клинические признаки мочеполовой инфекции у пациентов отсутствовали. Из 40 обследуемых Н-ой группы ДНК С. Trachomatis была найдена в СЖ в 10 случаях (25%), в СО - в 35 случаях (87,5%). В 3.1 % случаев удалось вывить антигенный материал в СО и СЖ пациентов контрольной группы. При статистическом анализе была выявлена прямая корреляционная связь между уровнем специфических антител и наличием ДНК С. trachomatis у обследуемых пациентов (гг=0,64, р<0,05). ДНК С. trachomatis с помощью ПЦР в целом достоверно чаще обнаруживались у серопозитивных лиц. В то же время у 13% лиц, серопозитивных по IgG, обнаружить хламидии не удалось. Наличие антител в крови этих больных может быть связано с ранее перенесенной инфекцией или с персистенцией возбудителя в других органах. Полученные данные ПЦР анализа свидетельствуют о том, что у 36.3% больных с патологией коленных суставов в синовиальной оболочке выявлена ДНК хламидий. Таким образом, выявляемость ДНК хламидий методом ПЦР в синовиальной оболочке выше, чем в синовиальной жидкости.

Результаты масс-спектрометрии биологических сред. В

исследовании выявляли агент воспаления при синовите по абсолютному превышению расчетной численности микроорганизмов в суставе (по маркерам в СЖ) по сравнению с фоном (по маркерам в крови). По результатам масс-спектрометрического анализа синовиальной жидкости коленного сустава выявлено, что при реактивном артрите наблюдается увеличение более чем в 2 раза количества микробных маркеров: Гр (+) кокков аэробных или факультативных (Staphylococcus, Staphylococcus intermedius, Streptococcus mutans); анаэробов (Eubacterium, CI. Coccoides, Butyrivibrio, CI. Fimetarum, Clostridium ramosum, Propionibacterium CI. Subterminale, Propionibacterium, Propionibacterium acnes, Peptostreptococcus anaerobius, Prevotella); Гр (+) палочек аэробных или факультативных (Nocardia, Nocardia asteroides, Corineform CDC-group XX, Bacillus megaterium); увеличение Гр (-) палочек аэробных или факультативных (Achromobacter) и актиномицет Streptomyces.

Относительные изменения численности отдельных микроорганизмов в суставе при травме — диспропорция в сравнении с их профилем в крови достигает десятки раз для клостридий и нокардий. В несколько раз выше относительная концентрация маркеров бактерий родов Moraxella/Acinetobacter, Fusobacterium/Haemophylus и Clostridium perfringens. Путь инфицирования сустава- гематогенная диссеминация кишечного биоценоза. Полученные в результате исследования данные свидетельствуют о транслокации микроорганизмов в коленный сустав в результате его травмы. Выявлено превышения относительного уровня детектирования 12 из 57 маркеров микроорганизмов, которые в разной комбинации и количественном выражении присутствуют у всех обследованных.

Таким образом, на основании полученных в ходе исследования данных был реализован комплексный подход с применением современных методов исследования, который позволил нам решить поставленные задачи и оптимизировать предоперационную диагностику пациентов с хирургической патологией крупных суставов.

ВЫВОДЫ

1. У 36,3% пациентов с хирургической патологией коленных суставов диагностирована хламидийная инфекция.

2. Морфологические особенности изменения внутрисуставных тканей при реактивном артрите и дегенеративно-дистрофических заболеваниях суставов не имеют достоверных отличий и характеризуются хроническим продуктивным воспалением, которое сопровождается выраженным фиброзом, лимфо-плазмоцитарной и гистиоцитарной инфильтрацией, гиперплазией синовиального эпителия и формированием ворсинок, склерозированнием сосудов.

3. Состояние иммунной системы пациентов с хирургической патологией коленных суставов на фоне клинического течения скрытой инфекции в сравнении с контрольной группой характеризуется снижением общего количества лимфоцитов, и изменениями соотношения их субпопуляций: повышением количества Т-хелперов и снижением количества цитотоксических клеток (Т-киллеров и NK-клеток). Отмечается повышение содержания провоспалительных цитокинов (IL-lb, IL-8) в сыворотке крови.

4. У пациентов с дегенеративно-дистрофическими заболеваниями крупных суставов методами полимеразной цепной реакции, иммуноблоттинга и масс-спектрометрии выявлены маркеры: С. Trachomatis, Y. enterocolitica, частота выявления которых достоверно отличается от показателей контрольной группы.

5. Комплексное лабораторное обследование пациентов с патологией суставов по единому алгоритму позволяет увеличить вероятность диагностики хламидийной инфекции.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

При обследовании больных с патологией коленных суставов рекомендуется комплексное лабораторное исследование на хламидийную инфекцию. Это даст возможность дифференцированного подхода к тактике лечения.

Рекомендован следующий алгоритм лабораторного обследования:

1. Для пациентов с острой травмой коленного сустава и показаниями к оперативному лечению рекомендовано скрининговое обследование на IgG Chlamidia. Spp. и Hsp60. В случае положительного результата — предоперационная антибиотикопрофилактика.

2. Для пациентов с дегенеративно-дистрофическими изменениями коленного сустава рекомендовано обследование по схеме:

IgG Chlamidia. Spp. Hsp60

IgA, IgG MOMP C.Trachomatis

ІШЄНИВ

ПЦР C.Trachomatis

Комплексная этиопатогенети-ческая терапия

Иммунофлюоресцентный анализ СО.

иммуяоблоттинг СЖ, масс-спектпометпия СЖ

ПЕРСПЕКТИВЫ ДАЛЬНЕЙШЕЙ РАЗРАБОТКИ ТЕМЫ

Перспективы данных исследований заключаются в дальнейшей оптимизации алгоритма предоперационного обследования пациентов с дегенеративно- дистрофическими заболеваниями и травмами суставов.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ Статьи в научных журналах и изданиях, входящих в перечень рецензируемых научных журналов и изданий

1. Ветошкин А.А. Хламидийная инфекция как фактор риска развития осложнений после хирургического лечения дегенеративно-дистрофических заболеваний и травм крупных суставов / А.А. Ветошкин, Л.Б. Дрыгина, А.Л. Поздняк // Мед.-биол. и соц.-психол. пробл. безопасности в чрезв. ситуациях. - 2012. - №1. - С. 55-61.

2. Ветошкин А.А. Эффективность применения различных методов клинико-лабораторной диагностики хламидийной инфекции у пациентов с хирургической патологией / А.А. Ветошкин, Л.Б. Дрыгина // Мед.-биол. и соц.-психол. пробл. безопасности в чрезв. ситуациях.—2012,—№4-С. 78-81.

3. Ветошкин А.А. Основные механизмы формирования внутрисустаного иммунного ответа у пациентов с хламидия-индуцированным артритом / А.А. Ветошкин, О.Н. Эргашев // Мед.-биол. и соц.-психол. пробл. безопасности в чрезв. ситуациях. - 2013. — №1 . - С. 54-59.

Статьи, тезисы докладов и статей

4. Ветошкин А.А. Возможности использования технологии иммуноблоттинга у больных с патологией суставов / А.А. Ветошкин, Л.Б. Дрыгина, Т.В. Горейко / Многопрофильная клиника XXI века. Современные технологии в эндовидеохирургии : материалы междунар. науч.-практ. конф. - СПб., 2013. - С. 44.

5. Рационализаторское предложение №10683/6 «Способ пункционной биопсии синовиальной оболочки коленного сустава» Выдано ГОУ ВПО Военно-медицинская академия им. С.М. Кирова МО РФ 12.11.2007г.

6. Рационализаторское предложение №10684/6 «Способ диагностики скрытой инфекции у больных с преимущественным поражением коленных суставов» Выдано ГОУ ВПО Военно-медицинская академия им. С.М. Кирова МО РФ 12.11.2007г.

7. Vetoshkin A. Analysis of cellular and specific humoral immune response in patients with surgical pathology of joints and Chlamydial infection / A.A. Vetoshkin, T.V. Goreyko, L.B. Drygina // 20th Euroepan Congress of Clinical Chemistry and Laboratory Medicine, 45 th Congress of the Italian Society of Clinical Biochemistry and Clinical Molecular Biology (SIBioC), May 2013, Milano, Italy. - Milano, 2013. - P. 690.

Подписано в печать 12.04.13 Формат 60х84'/іб Цифровая Печ. л. 1.0 Тираж 100 Заказ 07/04 печать

Отпечатано в типографии «Фалкон Принт» (197101, г. Санкт-Петербург, ул. Большая Пушкарская, д. 54, офис 2)