Автореферат и диссертация по медицине (14.00.13) на тему:Диагностическое значение изменения состава цереброспинальной жидкости по данным МРС высокого разрешения на ядрах #21#1Н при различных неврологических заболеваниях

На правах рукописи

СОКОЛОВ Константин Владимирович

ДИАГНОСТИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ ИЗМЕНЕНИЯ СОСТАВА ЦЕРЕБРОСПИНАЛЬНОЙ ЖИДКОСТИ ПО ДАННЫМ МАГНИТНО-РЕЗОНАНСНОЙ СПЕКТРОСКОПИИ ВЫСОКОГО РАЗРЕШЕНИЯ НА ЯДРАХ ХН ПРИ РАЗЛИЧНЫХ НЕВРОЛОГИЧЕСКИХ ЗАБОЛЕВАНИЯХ

14.00.13 - нервные болезни 14.00.46 - клиническая лабораторная диагностика

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

ООЭ173иЬ4

Москва, 2008

003173064

Работа выполнена в Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Российский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному

развитию»

Научный руководитель: Член - корреспондент РАМН, профессор Вероника Игоревна Скворцова

Научный консультант: Профессор, д ф н Ю.А.Пирогов

Официальные оппоненты:

Доктор медицинских наук, профессор М Ю Максимова Доктор биологических наук, профессор Ю В Тихонов

Ведущее учреждение:

ГОУ ВПО ММА имени И М Сеченова Росздрава

Защита диссертации состоится_2008 г

в « » часов на заседании диссертационного совета Д 208 072 09 при

Российском государственном медицинском университете по адресу 117997, г Москва, ул Островитянова, д 1

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГОУ ВПО РГМУ Росздрава (117997, г Москва, ул Островитянова, д 1)

Автореферат разослан_2008 г

Ученый секретарь диссертационного совета Кандидат медицинских наук, профессор

JI В Губский

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы Одним из наиболее быстро развивающихся направлений современной медицины является создание новых высокоэффективных и малоинвазивных инструментальных методов диагностики Огромный потенциал методов ЯМР в медицине не исчерпывается применением лишь МРТ Совершенствование импульсных спектрометров ЯМР высокого разрешения привело к многократному росту их чувствительности и разрешающей способности (Э Дероум, 1992) и открыло возможность проведения количественного анализа с помощью ЯМР большинства биологических жидкостей in vitro (J С Lindon и соавт, 2001, D С Robertson и соавт, 2005) Метод ЯМР позволяет обнаруживать и количественно определять сотни компонентов, в том числе важнейшие метаболиты и биомаркеры, выявлять на ранних стадиях развития многие патологические состояния, отслеживать реакции организма на воздействия различных патогенных факторов, токсических веществ и лекарственных препаратов в динамике (J С Lindon и соавт, 2000, J К Nicholson и соавт, 1989)

Спектроскопия ЯМР высокого разрешения на ядрах 'Н оказалась особенно

подходящей для исследования составов биожидкостей, поскольку интенсивность

сигналов в спектрах ЯМР пропорциональна числу магнитных ядер, спектр которых

регистрируется, и не зависит от того, в каком структурном окружении эти ядра

находятся Именно поэтому MP-спектроскопия позволяет количественно определять

одновременно сотни компонентов за относительно короткое время В этом

отношении метод ЯМР существенно превосходит масс-спектрометрию, которая, как

правило, не позволяет в одном эксперименте одновременно количественно

определять несколько компонентов разной химической природы При МР-

спектроскопии возможно многократно использовать пробу Существенно и то, что

спектр ЯМР содержит всю информацию о структуре определяемого соединения,

достаточную для его надежной идентификации без привлечения других методов

(J К Nicholson и соавт, 2002)

Очень немногочисленные литературные данные о составе ЦСЖ в норме

неоднозначны и противоречивы (К Diem и соавт, 1970, М Garseth и соавт, 2000,

J Lynch и соавт, 1993), что обусловлено малым количеством наблюдений,

использованием различных по своим техническим характеристикам спектрометров

1

(S Maillet и соавт, 1998, EH McGale и соавт, 1977), a также различных методик приготовления образца для проведения MPC (L R White и соавт, 2004, J R Youmans, 1982) В связи этим необходимо провести изучение влияния ряда факторов, таких как влияние рН, сроки хранения, условия хранения на получаемые результаты и составить стандартизованный протокол исследования

В настоящее время практически отсутствуют данные о метаболическом профиле ЦСЖ здоровых людей по данным MPC высокого разрешения на ядрах водорода, а также информация об изменениях данного профиля при БДН и ишемическом инсульте Таким образом, актуальным является проведение *Н MPC ЦСЖ при спорадической БДН в сопоставлении с метаболическим профилем ЦСЖ лиц без неврологических, хронических соматических, инфекционно-воспалительных, эндокринных, наследственных и прочих заболеваний потенциально приводящих к изменению состава ЦСЖ

Представляет интерес сравнительное исследование состава ЦСЖ при БДН (нейродегенеративном заболевании, поражающем преимущественно серое вещество головного и спинного мозга с интактным гематоэнцефалическим барьером) и ишемическом инсульте, при котором происходит как нарушение целостности гематоэнцефалического барьера, так и вовлечение в процесс белого и серого вещества головного мозга

Болезнь двигательного нейрона (БДН) — заболевание, сопровождающееся гибелью центральных и периферических мотонейронов, прогрессирующим течением и летальным исходом Согласно современным представлениям, развитие БАС обусловлено взаимодействием наследственных и экзогенных провоцирующих факторов Наличие множественных патологических изменений в нейронах позволяет предположить многовариантность этиологии данного заболевания (W G Bradley и соавт, 1983, D W Cleveland и соавт, 2000, M J Strong и соавт, 2003)

Этиология и патогенез БДН остаются неизвестными, и знаний, необходимых

для разработки эффективных методов лечения и диагностики данного заболевания на

ранних этапах, до настоящего времени накоплено недостаточно (D W Cleveland и

соавт, 2000) Несмотря на относительно невысокий показатель заболеваемости,

следует отметить, что БДН поражает лиц преимущественно зрелого и

трудоспособного возраста, как правило, с высоким интеллектуальным и

профессиональным потенциалом, неизбежно приводит к тяжелой инвалидизации и

2

смерти больных, и это, с учетом отсутствия эффективных методов лечения, обосновывает актуальность изучения данного заболевания (О А Хондкариан и соавт , 1970, PN Leigh и соавт, 1995) Существующие на сегодняшний день методы медикаментозного лечения не приносят значимых результатов и носят паллиативный характер

Множество проведенных молекулярно-генетических, биохимических и других исследований выявили большое многообразие изменений в клетках нервной системы — структурная дезорганизация нейрофиламентов, нарушение работы транспортных мембранных систем мотонейронов, токсическое влияние внутриклеточных белковых агрегатов, изменение метаболизма свободных радикалов, развитие оксидантного стресса, нарушения работы системы энергетического обеспечения клетки и другие

Столь широкое разнообразие патологических проявлений БДН, преимущественно обнаруженных в условиях эксперимента, не может не находить отражения в метаболических профилях биологических жидкостей Учитывая, что заболевание поражает клетки нервной системы, наиболее целесообразно исследование цереброспинальной жидкости Изучение состава ликвора у больных с БДН представляет большой интерес в изучении патогенеза, диагностики и разработки методов прогнозирования характера течения заболевания Существует достаточное количество литературных данных об изменениях качественного состава (высокомолекулярных соединений) цереброспинальной жидкости (ЦСЖ) при БДН (D Devos и соавт , 2004, J Ilzecka и соавт , 2004, Е Kaufmann, 2004; S D Sussmuth и соавт , 2003) Однако, применение описанных в литературе методик для диагностики и прогнозирования течения заболевания для скрининговых целей не представляется возможным по причине высокой стоимости исследования, высоким расходом биологического материала, малым числом идентифицируемых метаболитов, что не позволяет всесторонне оценить метаболический профиль ЦСЖ

ЯМР-спектроскопический анализ биологических жидкостей являтся перспективным методом получения важнейшей диагностической информации о низкомолекулярной составляющей метаболического профиля, недоступного для исследования иными методами

Работа выполнена на базе кафедры фундаментальной и клинической

неврологии и нейрохирургии ГОУ ВПО РГМУ Росздрава (заведующая кафедрой —

член-корр РАМН, профессор В И Скворцова), НИИ Инсульта ГОУ ВПО РГМУ

3

Росздрава (директор — член-корр РАМН, профессор В И Скворцова), городской клинической больницы №31, учебно-научного межфакультетского и междисциплинарного центра магнитной томографии и спектроскопии (ЦМТС) МГУ (директор — профессор Ю А Пирогов)

Цель работы

Изучить значение изменений химического состава цереброспинальной жидкости по данным магнитно-резонансной спектроскопии высокого разрешения на ядрах водорода у больных с различными неврологическими заболеваниями

Задачи исследования

1 Разработать протокол исследования ЦСЖ методом спектроскопии ЯМР на ядрах 'Н Определить влияние ряда физических факторов на получаемые спектры

2 Оценить метаболический профиль цереброспинальной жидкости у пациентов, не страдающих неврологическими заболеваниями и иными патологическими состояниями, потенциально ведущими к изменению качественного состава ЦСЖ

3 Провести качественную и количественную оценку полученных метаболических профилей в группах больных с БДН, ишемическим инсультом и контрольной группе

4 Сопоставить полученные результаты по характеристикам метаболического профиля в группе пациентов с БДН с основными клиническими характеристиками заболевания (возрастом, формой, дебютом и вариантом, скоростью прогрессирования)

5 Провести оценку диагностических возможностей магнитно-резонансной спектроскопии высокого разрешения на ядрах 'Н при ишемическом инсульте и болезни двигательного нейрона

Научная новизна

Разработан протокол исследования ЦСЖ методом спектроскопии ЯМР на ядрах

1Н Показано, что увеличение срока заморозки ЦСЖ до 11 мес, а также

незначительное колебание рН не оказывают значимого влияния на получаемые

спектры Выявлены различия частоты идентификации метаболитов при

4

использовании различных импульсных методик подавления воды Исследован метаболический профиль ЦСЖ практически здоровых лиц, идентифицировано 29 низкомолекулярных метаболитов Установлено отсутствие статистически значимых различий качественного состава компонентов метаболического профиля цереброспинальной жидкости в норме и при болезни двигательного нейрона

Впервые проведено исследование ЦСЖ пациентов с ишемическим инсультом ш vitro методом MPC Выявлено отсутствие корреляционных связей между характеристиками БДН (вариант, форма, скорость прогрессирования) и составом ЦСЖ Обнаружены значительные количественные изменения состава ЦСЖ у пациентов с ишемическим инсультом На основании сравнительного анализа метаболических профилей ЦСЖ при ишемическом инсульте, БДН и группы сравнения выявлены маркеры нарушения гематоэнцефалического барьера

Разработан алгоритм статистической обработки массива диагностической информации, который может лечь в основу методики проведения дифференциальной диагностики патологических состояний по образцам биожидкостей с использованием магнитно-резонансной спектроскопии Проведены проверка и доказательство эффективности разработанного алгоритма

Практическая значимость работы.

Усовершенствован протокол проведения MPC нативной ЦСЖ на спектрометре высокого разрешения Показано влияние ряда физических и химических факторов на получаемые спектры, а также выяснены особенности применения различных импульсных последовательностей на спектр Предложен новый подход к оценке результатов исследования биологических жидкостей in vitro при различных неврологических заболеваниях с использованием магнитно-резонансной спектроскопии высокого разрешения на ядрах *Н Оценивая данные по маркерам нарушения гематоэнцефалического барьера, возможно использование их для прогнозирования исходов и течения заболевания Показана возможность применения метода MPC в качестве универсального диагностического инструмента в клинической практике, в исследовании биологических жидкостей организма

Внедрение в практику

Результаты настоящего исследования применяются при изучений биологических

жидкостей в Центре магнитно-резонансной томографии и спектроскопии МГУ им

M В Ломоносова

Основные положения, выносимые на защиту

1 Длительное хранение образцов ЦСЖ при температуре -20 °С, повторное замораживание-размораживание образцов, а также добавление к ним буферного раствора существенно не влияет на качество получаемого спектра и на количественный состав образца

2 Метод спектроскопии ЯМР высокого разрешения на ядрах 'Н расширяет спектр идентифицируемых метаболитов в ЦСЖ, выявлены 27 низкомолекулярных соединений с известной химической структурой и 2 соединения с неизвестной химической формулой

3 Метаболические профили ЦСЖ больных БДН и образцов группы сравнения не имеют качественных и статистически значимых количественных различий

4 В образцах ЦСЖ пациентов с ишемическим инсультом значимо повышены концентрации изучаемых метаболитов

5 В ЦСЖ пациентов, страдающих БДН, не выявлено связи между характером метаболического профиля и основными клиническими характеристиками заболевания (возрастом, формой, дебютом и вариантом, скоростью прогрессирования)

6 Алгоритм описания данных MPC 'H ЦСЖ, основанный на MPC высокого разрешения, может быть использован для построения диагностической модели при различных заболеваниях, сопровождающихся изменениями состава ЦСЖ

Апробация работы

Апробация диссертации состоялась на совместной научной конференции

кафедры фундаментальной и клинической неврологии и нейрохирургии ГОУ ВПО

«Российский государственный медицинский университет» Росздрава, сотрудников

НИИ Инсульта ГОУ ВПО РГМУ Росздрава, врачей городских клинических больниц

№20 и №31 г (протокол № 11 от 27 февраля 2008 года)

Основные результаты исследования были доложены на III Международной

конференции «Genomics, Proteomics, Bioinformatics and Nanotechnologies for

6

Medicine» в г Новосибирске 16 Июля 2006 года, на II Российском Международном конгрессе «Цереброваскулярная патология и инсульт» в г Санкт-Петербург, 20 сентября 2007 г

Публикации по теме диссертации опубликовано 5 печатных работ, из них 2 в центральной печати

Объем н структура работы

Диссертация изложена на 148 страницах машинописного текста, включает 21 рисунок, 32 таблицы Работа состоит из введения, обзора литературы, описания применяемых методов, результатов исследований и их обсуждения, заключения, выводов, 2 приложений и списка цитируемой литературы Список цитируемой литературы состоит из 181 источника, включая 36 отечественных и 145 зарубежных источников

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Общая характеристика больных и методы исследования

В исследование включены 63 пациента в возрасте от 26 до 73 лет, средний

возраст составил (среднее±стандартное отклонение (СО)) 55,75±9,97 лет

Взятие ЦСЖ производили при необходимости проведения дифференциальной

диагностики ишемического инсульта с геморрагическим (с последующей

верификацией путем проведения КТ или МРТ в течение недели от момента взятия

ЦСЖ) — группа «ишемический инсульт», при проведении оперативных

вмешательств на травматических аневризмах аорты или по удалению

межпозвонковой грыжи («группа сравнения»), при проведении дифференциальной

диагностики болезни двигательного нейрона с инфекционными заболеваниями

нервной системы (группа «БДН») Группу сравнения составили 21 пациент без

патологии нервной системы и не страдающие иными заболеваниями, потенциально

ведущими к изменению состава ЦСЖ Средний возраст этих пациентов составил

52,19+10,67 лет Число мужчин в данной группе превалировало и составило 71,43%

Исследовали 20 образцов ЦСЖ пациентов с каротидным ишемическим

инсультом Все инсульты по механизму развития являлись кардиоэмболическими или

атеротромботичсскими (по типу артерио-артериальной эмболии) Средний возраст

включенных в исследование пациентов (12 мужчин и 8 женщин) составил 64,20±4,59

7

года Пациенты с ишемичееким инсультом в бассейне правой и левой средних мозговых артериях составили 70% (14 пациентов) и 30% (6 пациентов) соответственно

Всем пациентам с ишемичееким инсультом при поступлении проводили оценку неврологического статуса по шкале Национального института здоровья США (шкала N1H) Среднее (±СО) значение по шкале NIH составило 13,8±4,1 балла (от 8 до 23 баллов)

Патогенетический вариант ишемического инсульта устанавливали на основании

данных анамнеза и особенностях клинической картины заболевания, данных

ультразвуковой допплерографии магистральных артерий головы, офтальмоскопии,

ЭКГ, Эхо-КГ, МРТ исследования, результатов исследования гемореологии

Люмбальную пункцию проводили в первые 3 суток от момента начала заболевания В

течение недели после проведения люмбальной пункции пациенту проводили КТ или

МРТ исследование головного мозга с целью верификации диагноза

Случаев, когда пациента включали в исследование на основе клинической

картины и динамики течения заболевания, характерных для ишемического инсульта,

а при проведении повторной люмбальной пункции (не в рамках проводимого

исследования) или по данным КТ или МРТ головного мозга, проведенных в течение 7

дней от даты проведения люмбальной пункции, получали данные о наличии

геморрагического инсульта или геморрагической трансфрмации ишемического очага,

в данном исследовании не было

Определение концентрации С-реактивного белка в плазме крови у пациентов с

ишемичееким инсультом проводили через 12—24 часа от начала заболевания, а у

пациентов группы сравнения и БДН — в день забора ЦСЖ

В работу включены 22 пациента [10 (32,26%) мужчин и 12 (54,55%) женщин в

возрасте от 46 до 73 лет] со спорадической болезнью двигательного нейрона из

российской популяции (жители Московского региона) Всем больным проводили

электронейромиографическое (ЭНМГ) исследование, оценку функции внешнего

дыхания методом спирометрии и магнитно-резонансную томографию (МРТ)

головного и всех отделов спинного мозга, а также рутинные лабораторные и

инструментальные методы исследования В исследуемую группу были включены

больные с достоверным диагнозом БДН, у которых были выявлены признаки

поражения центрального и периферического мотонейрона либо на уровне ствола

Е

головного мозга и двух спинальных уровнях, либо на трех спинальных уровнях с учетом данных ЭНМГ, а также неуклонно прогрессирующее течение заболевания по данным динамических осмотров каждые 6 месяцев [50] и отсутствие когнитивных, глазодвигательных, чувствительных и тазовых расстройств

Согласно классификации Норриса 2 (9,09%) пациента имели грудной, 9 (40,91 %) — шейный, 3 (13,64%) — поясничный и 2 (9,09%) — диффузный дебюты заболевания, а также 6 (27,27%) пациентов страдали прогрессирующим бульбарным параличом По вариантам все пациенты с БДН распределились следующим образом сегментарно-ядерный — 7 (31,82%), пирамидный — 6 (27,27%), классический — 9 (40,91%) человек Все пациенты с БДН были ранжированы по скорости прогрессировать заболевания (оценка по шкале ALS-FRS-R) — быстро- и среднепрогрессирующая формы заболевания наблюдались в одинаковом числе случаев (по 9 пациентов (40,91%) в каждой группе), а медленно прогрессирующую форму БДН наблюдали лишь у 4 (18,18%) пациентов

Взятие материала Люмбальная пункция Цереброспинальную жидкость получали путем прокола субарахноидального пространства в поясничной области Люмбальную пункцию проводили в стерильных условиях в промежутке между позвонками L3-L4 Перед пункцией проводили инфильтрационную анестезию подкожной клетчатки 1% лидокаином В процессе сбора материала для данного исследования осложнений при проведении люмбальной пункции зафиксировано не было Из этических соображений взятие ЦСЖ не проводили прицельно только для проведения MPC Полученная ЦСЖ направлялась на различные биохимические и иммунологические тесты

Около 1,0 мл полученной и собранной в стерильные пробирки ЦСЖ центрифугировали со скоростью 2000 об/мин, в течение 5 мин при 20-24 °С,

полученный фильтрат замораживали при -20 --25 °С на срок максимум 18 мес

после взятия ЦСЖ (среднее время хранения замороженных образцов ЦСЖ составило 7,4±9,7б мес)

Проведение МР-спектроскопии, обработка спектра

Проведена серия из 108 экспериментов — регистрации спектров с образцов

ЦСЖ, полученных у 63 пациентов Замороженный образец отправляли в лабораторию

9

ЯМР, где его размораживали непосредственно перед экспериментом Перед снятием спектра измеряли рН Для стандартизации проведения исследования к части образцов добавляли буферный раствор Для приготовления образца ЦСЖ к 550 мкл биожидкости (если проба поступала в замороженном виде — после ее полной разморозки при комнатной температуре) добавляли 50—65 мкл 0,2 M фосфатного буфера с целью выведения рН на близкие к нейтральным значения (при этом измеренное рН-метром значение рН полученных образцов составляло 7,3—7,8) и 55 мкл 24,0 мМ раствора ДСС (натриевая соль 2,2-диметил-2-силапентан-5-сульфоновой кислоты в виде кристаллогидрата, C6Hi503SSiNa Н20, «Acros Organics») в D20 (дейтерированная вода, производство «Aldrich», США, степень дейтерирования 99,9%) Готовили раствор ДСС с концентрацией 24,0 мМ в мерной колбе растворением точной навески в дейтерированной воде Образец для анализа переносили в стандартную ЯМР ампулу (с диаметром 5 мм, «Wilmad»)

Регистрацию спектров проводили на ЯМР-спектрометре AVANCE 600 фирмы Брукер с использованием инверсного датчика с импульсным Z-градиентом при температуре 295 °К Спектрометр имеет сверхпроводящую магнитную систему с активным экраном UltraShield™ напряженностью 14,1 Тесла с теплым отверстием 54 мм Рабочая частота для протонов — 600 МГц Регистрировали одномерные (1D) и двумерные (2D) спектры Для подавления сигнала воды использовали сложные многоимпульсные последовательности с условными названиями noesyprld и noesygpprld — внутренние разработки фирмы Bruker Также регистрировали двумерные гомоядерные ('Н-'Н) спектры спин-спиновой корреляции типа COSY образцов ЦСЖ Импульсную последовательность COSY дополняли преднасыщением для подавления интенсивного сигнала воды Спектры регистрировали как на области алкильных сигналов 0,5—4,5 м д, так и на всей содержательной области 0,5—8,5 м д В качестве внутреннего стандарта для расчета концентраций метаболитов использовали ДСС Обработку спектров, коррекцию базовой линии и интегрирование резонансных сигналов проводили с использованием комплекса прикладных программ XWINNMR (версия 3 1), включающий набор последовательностей сканирования, а также среду для редактирования и анализа получаемых спектров Концентрации метаболитов определяли по интегральным интенсивностям спектральных пиков, по сравнению с интенсивностью сигнала ДСС при 0,64 м д, согласно формуле

2 V,

дсс

с =

сдсс

(1)

I

лес

q V

где С — концентрация метаболита, мМ, 1м и 1дсс — интегралы данного сигнала метаболита и сигнала ДСС соответственно, Удсс — объем раствора ДСС, добавленного к образцу ЦСЖ, мкл, V — объем образца ЦСЖ, взятого для анализа, мкл, 2 — число эквивалентных протонов в СНг-группе ДСС, дающих сигнал при 0,64 м д , q — число эквивалентных протонов метаболита, дающих данный сигнал, Сдсс — концентрация раствора ДСС в D2O, мМ

Полученные спектры также обрабатывали в программе MestReC 4 09 Для статистической обработки результатов использовали пакет программ STATISTICA for Windows Release б 0 A (StatSoft, USA) и Microsoft Excel 2003

Получены спектры ядерного магнитного резонанса по ядрам 'Н цереброспинальной жидкости (рисунок 1) В ЦСЖ идентифицированы 29 низкомолекулярных соединений алифатические и ароматические аминокислоты, моносахариды, соли органических кислот, азотистые соединения (креатин, креатинин, диметиламин) и другие альфа- и бета-гидроксибутират, валин, лактат, аланин, ацетат, глутамин, ацетоацетат, пируват, цитрат, диметиламин, креатин, креатинин, а- и (5-глюкоза, фруктоза, миоинозитол, аскорбиновая кислота (аскорбат, витамин С), манноза, тирозин, гистидин, фенилаланин, формиат, этанол, изолейцин, пироглутамат, 2-Гидроксиизовалерат, ОАР, Ш Сигнал аскорбата — дуплет при 4,52 м д , зарегистрирован менее чем в 10% образцов ЦСЖ, что связано с тем, что витамин С очень чувствителен к различным воздействиям (заморозка, воздействие солнечного света, длительность хранения) и быстро разрушается

Незначительное количество этанола попадает в образец ЦСЖ искусственно во время проведения поясничного прокола и забора ЦСЖ Концентрация этого спирта не учитывалась при проведении статистического анализа

Наряду с химическими соединениями с известной химической структурой, обнаружен так называемый дементийный фактор фАР), выявленный в работе

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Протокол исследования ЦСЖ Описание спектров

L R White и соавт, и предложенный в качестве биомаркера деменции, однако идентифицировать его химическое строение пока не удалось

В проведенном исследовании не обнаружено каких-либо статистически значимых закономерностей динамики концентрации этого соединения Полученные данные полностью коррелируют с данными L R White и соавт (2004), не показавшими значимых различий концентрации DAF в группах сравнения и группе БДН

мультиплеты а и £ глюкозы

• С

Г.

J

Ik)

jlL

UAu_

JUL.

Рисунок 1. Спектр ЯМР H цереброспинальной жидкости человека без неврологических заболеваний (спектрометр AVANCE 600 МГц (фирмы «Bruker»))

При 4,77 м д — остаточный сигнал воды По оси абсцисс отложена величина химического сдвига в миллионных долях (м д ), по оси ординат — величина сигнала каждого из метаболитов Концентрация веществ прямо пропорциональна площади

под кривой линии спектра

Значения концентраций метаболитов «группы сравнения» сопоставляли с данными MPC, жидкостной хроматографии и энзимных тестов, применяемых для анализа качественного и количественного анализа ЦСЖ, по данным литературы Сравнительный анализ количества выявляемых метаболитов и определения их концентрации подтвердил высокую воспроизводимость получаемых

концентрационных показателей (U Sonnewald и соавт, 2000, S Maillet и соавт, 1998, L R White и соавт , 2004)

Проведен анализ полученных концентраций метаболитов (ммоль/л) в образцах ЦСЖ группы сравнения (6 образцов, не подвергавшихся повторным разморозкам, выраженным колебаниям температуры, проанализированные в течение первых 1,5 суток от момента взятия материала) с литературными данными Количество идентифицируемых метаболитов в опубликованных работах достаточно мало и несопоставимо с полученными данными В связи с уникальностью используемой методики и большим количеством регистрируемых метаболитов, выявление которых другими методами (например, электрофорез, иммунологический анализ) затруднительно, провести верификацию данных не представлялось возможным Отсутствие данных по концентрациям ряда метаболитов в литературе, тем не менее позволяет считать полученные результаты правильными, учитывая однородность групп пациентов, а также принимая во внимание возможные колебания показателей концентрации при методических различиях методов, описанного в литературе и применяемого настоящем исследовании

В результате парного сравнения концентраций («группа сравнения»), полученных с помощью импульсных последовательностей zgpr и noesyprld, обнаружена статистически значимые различия в концентрациях глутамина (р=0,01), валина (р=0,04), 2-оксиизовалерата (р=0,04) и миоинозитола (р=0,04)

Исследование образцов ЦСЖ группы сравнения в количестве 40 штук, вне зависимости от метода регистрации спектра (импульсной последовательности), выявило, что концентрации ацетоацетата, бета-гидроксибутирата, диметиламина, маннозы и DAF значимо коррелируют с полом пациентов Также обнаружены статистически значимые различия для этих метаболитов в группах мужчин и женщин

Влияние физических и химических факторов на данные, получаемые с образца ЦСЖ Среднее значение рН всех образцов составило 7,97±0,64 Измерение рН перед проведением эксперимента проводили в 92,06% образцов Различий между изучаемыми группами образцов по уровню рН не обнаружено Для изучения влияния рН среды образца непосредственно перед регистрацией спектра в СМЖ добавляли

фосфатный буфер В 34 образца добавляли буферный раствор и достигли среднего рН 7,58±0,19 Показатель кислотности нативных, без добавления буферного раствора, образцов (N=24) составил в среднем 8,66±0,54 По даным ÎZ-теста Манна-Уитни, различий в концентрациях метаболитов до и после добавления буферного раствора не обнаружено

Проведена серия исследований (на 40 образцах ЦСЖ) с замораживанием образцов ЦСЖ (до температуры -20°С) для выявления влияния температурного фактора на качественный и количественный состав образца ЦСЖ Не обнаружено изменений в спектрах после замораживания ЦСЖ качественно исходный профиль спектра сохранялся, однако отмечались незначительные количественные изменения состава ЦСЖ [относительное стандартное отклонение составляло, в основном, 2—5 %, в отдельных случаях — не более 10%, что подтверждается литературными данными S Maillet и соавт , (1998)] Время от момента получения ЦСЖ до ее полной заморозки составило в среднем 60±12 минут Среднее время хранения образцов в замороженном состоянии (при -20 °С) составило 10,94+1,32 месяца

Анализ метаболических профилей ЦСЖ при БДН

Не обнаужено статистически значимой корреляционной связи между

скоростью прогрессирования БДН по шкале ALSFRS-R и концентрациями изучаемых метаболитов

При попарном сравнении групп образцов пациентов с разными скоростями прогрессирования (быстрая, средняя и медленная) БДН не обнаружено статистически значимых различий концентраций метаболитов между исследуемыми группами 0»0,05)

Проведен сравнительный попарный анализ концентраций метаболитов в ЦСЖ пациентов БДН в зависимости от формы заболевания по классификации Норрриса Статистически значимых различий по этим изучаемым признакам не обнаружено, однако имелся значительный разброс (р>0,05) концентраций цитрата, пирувата, ацетоацетата и DAF в некоторых группах По остальным метаболитам изменения концентраций в зависимости от форм БДН не были так выражены, как в указанных случаях По даным ¿/-теста Манна-Уитни различий в концентрациях всех изучаемых сосединений, кроме бета-гидроксибутирата, сравниваемых по вариантам БДН, нет Содержание бета-гидроксибутирата в образцах ЦСЖ пациентов с сегментарно-

ядерным вариантом БДН (0,02±0,017 ммоль/л) было достоверно большим {р=0,028), чем в образцах группы классического варианта БДН (0,008±0,007 моль/л)

Отличий в качественном составе образцов ЦСЖ по всем изученным категориям в группе БДН (по полу, варианту или форме БДН) не обнаружено

Сравнение полученных концентраций веществ в ЦСЖ при БДН и в группе сравнения Сравнительный анализ качественного состава ЦСЖ больных БДН и пациентов группы сравнения не выявил значимых различий в количестве идентифицируемых метаболитов Пируват не смогли определить в спектре или подсчитать его концентрацию в 8 (36,36%) образцах группы БДН, и в 2 (9,52%) образцах группы сравнения Манноза, DAF и U1 также не были идентифицированы и оценены количественно в 3 (14,29%) образцах группы сравнения Однако указанные частотные различия не были статистически значимыми

Обнаружено статистически значимое [р=0,009) увеличение концентрации ■фруктозы в группе БДН (0,066±0,054 ммоль/л) по сравнению с контрольной группой (0,04±0,017 ммоль/л) Концентрация же маннозы была значимо {р=0,039) ниже в группе БДН (0,029±0,01 ммоль/л) против группы сравнения (0,034±0,008 ммоль/л)

Анализ метаболических профилей ЦСЖ при ишемическом инсульте Выявлены значимые различия в концентрациях метаболитов в группах сравнения и инсульта в частности, для лактата, пирувата, ацетоацетата, альфа- и бета-гидроксибутирата, креатина, фенилаланина, люкозы, фруктозы и маннозы (р<0,002), глутамина, аланина, формиата (р<0,005) При вычислении коэффициента ранговой корреляции Спирмена выявлена связь концентраций мио-инозитола (г=-0,74, р< 0,05) и пирувата (^=-0,69, р<0,05) с возрастом пациентов Обе корреляционные связи — сильные и отрицательные, тес возрастом концентрация указанных веществ снижается

Сравнительный анализ метаболических профилей ЦСЖ при БДН и ишемическом

инсульте

Характер изменений концентраций низкомолекулярных метаболитов ЦСЖ, по данным MPC высокого разрешения на ядрах 'Н, в группах пациентов БДН и сравнения не имел существенных различий Практически противоположная картина

15

наблюдалась при ишемическом инсульте — зарегистрировано увеличение концентраций практически всех обнаруженных метаболитов по сравнению с группой сравнения И, наконец, сопоставление концентраций соединений и качественного состава образцов пациентов с ишемическим инсультом и болезнью двигательного нейрона свидетельствовало об отсутствии различий в качественных характеристиках спектров ЦСЖ и сохранении количественных различий концентраций соединений, описанных между ишемическим инсультом и группой сравнения

Анализ данных MPC 'H ЦСЖ Выполняя задачу классификации образцов по определенным характеристикам (концентрациям метаболитов), использованы специальные многомерные статистические подходы

Для принятия решения о том, какие переменные различают (дискриминируют) три изучаемые группы, проведен дискриминантный анализ по всем метаболитам, исключая аскорбиновую кислоту, альфа- и бета-глюкозу, этиловый спирт (как ксенобиотик в ЦСЖ), DAF и U1 (компоненты с неизвестной химической формулой, описанные в литературе) Аскорбиновая кислота исключена, так как частота ее определения в образцах очень мала Необходимость исключения из анализа альфа- и бета-глюкозы очевидна, так как в массиве данных имеют место значения концентраций общей глюкозы ЦСЖ Этиловый спирт является ксенобиотиком, занесен в образец ЦСЖ при выполнении поясничного прокола и его концентрация в образце не является физиологическим показателем В модель включены оставшиеся 24 переменные (метаболиты) Вычислена дискриминирующая функция Wilks' Lambda Для всех значений этой функции значения р, кроме креатинина и альфа-гидроксибутирата, имеют величину >0,05, для указанных соединений — /?=0,021 и р=0,0002 соответственно Значения всех дискриминирующих функций близки к 0, минимальное значение функции Wilks' Lambda соответствует аланину (0,0033), а максимальная — альфа-гидроксибутирату (0,063)

Подтверждением отсутствия различий между количественным составом образцов ЦСЖ групп сравнения и БДН, является минимальное (6,38) расстояние Махаланобиса Для сопоставления, это расстояние в группах «ИИ vj группа сравнения» и «ИИ vj БДН» составляет 70,85 и 81,85 соответственно

Для проверки дискриминирующей силы концентраций апьфа-гидроксибутирата и креатинина проведен кластерный анализ методом ¿-средних В анализ включены только концентрации альфа-гидроксибутирата и креатинина Так как различиями концентраций метаболитов в ЦСЖ группы сравнения и группы БДН можно принебречь, проведена разбивка всех образцов на 2 кластера, с числом повторений, равным 10

В кластер №1 вошли 16 (80%) образцов ЦСЖ из группы ишемического инсульта, в кластер №2 попали все образцы ЦСЖ групп БДН (N=22, 100%), и сравнения (N=21, 100%), а также 4 (20%) образца ЦСЖ из группы «ишемического инсульта» Средние значения концентраций альфа-гидроксибутирата и креатина в кажом из кластеров представлены в таблице 1

Таблица 1. Средние значения концентраций альфа-гидроксибутирата и креатина в

каждом из кластеров

Концентрация (ммоль/л) Кластер №1 Кластер №2 р

Среднее СО Среднее СО

альфа-Гидроксибутират 0,103 0,024 0,028 0,011 <0,00001

Креатин 0,097 0,053 0,060 0,016 0,00027

Проведен анализ главных компонент по двум метаболитам, показавших достоверное и достаточно сильное значение дискриминирующей функции Wilks' Lambda — по креатинину и альфа-гидроксибутирату (рисунок 2) Наблюдалось четкое разделение всех образцов на 2 группы, по своему составу соответствующие группам, выделенным методом кластерного анализа по ¿-средним

Таким образом, выполнена проверка разработанной гипотезы о том, что основными дискриминационными компонентами для образцов ЦСЖ являются альфа-гидроксибутират и креатин Результат проверки оказался положительным, так как проводя проверку методом кластерного анализа, методом главных компонент, большинство образцов ЦСЖ были корректно разделены на группы Основываясь на парах значений концентраций альфа-гидроксибутирата и креатина, возможно определение неизвестного образца к одной из 2 исследуемых групп Вероятность ошибочного отнесения образца к группе не превышает 15%

Кластер 1

Кластер 2

-2 0 2 Степень межгрупповой изменчивости: 76,40%

Рисунок 2. Кластеры образцов ЦСЖ (по креатину и альфа-гидроксибутирату). Точки «И#» — образцы группы ишемического инсульта, «Б#» — образцы группы БДН, «К#» — обозначение образцов ЦСЖ группы сравнения.

Обсуждение результатов

Химический состав (метаболический профиль) цереброспинальной жидкости

косвенно отражает биохимические процессы, происходящие в веществе мозга —

«внутренней атмосфере мозга». Однако до настоящего времени химический состав

ЦСЖ остается мало изученным. Выявлены некоторые особенности и закономерности

изменений высокомолекулярного профиля ЦСЖ в патологии, но практически

отсутствуют данные о низкомолекулярной составляющей данной биологической

жидкости как для нормы, так и для многих заболеваний нервной системы.

В результате проведенной работы нами впервые проведено сопоставительное

исследование, в котором в качестве сравниваемых объектов были использованы

образцы ЦСЖ при БАС и церебральном ишемическом инсульте. Также впервые

проведен тщательный качественный и количественный анализ метаболического

профиля нормальной ЦСЖ методом 'Н ЦСЖ и описаны 29 метаболитов.

Число идентифицируемых пиков в литературе существенно отличается в

меньшую сторону от их числа, выявленного в проведенном исследовании. Это

18

связано, безусловно, с возможностью самого спектрометра, наличием современных модулей обработки сигнала и коррекции магнитного поля Также была накоплена большая информация о химических соединениях, входящих в ЦСЖ, и соответствующих им пиков на спектрах ЦСЖ, по сравнению с соответствующими базами данных Все это способствует более полной расшифровке полученного спектра

Уточненный экспериментальный протокол, апробированный в данной работе, отвечает основным требованиям, предъявляемым к аналитическим исследованиям 1) сохранение оптимального качества образцов ЦСЖ в процессах их приготовления и измерения, 2) быстрота, воспроизводимость и точность накопления данных и их обработки, 3) удобный вид представления окончательных результатов для возможности адекватной клинической интерпретации

Основной компонент любой биожидкости — вода, интенсивность сигнала протонов которой на несколько порядков превышает интенсивность сигналов растворенных в ней метаболитов, а также искажает базовую линию спектра Для удаления сигнала воды из спектра наиболее часто, по данным литературы (К Diem и соавт, 1970, Е Н McGale и соавт , 1977, J R Youmans и соавт , 1982, L R White и соавт, 2004), используют метод лиофилизации, а затем растворение остатка в тяжелой воде D20 (JС Lindon и соавт, 2001, DG Robertson и соавт, 2005) Однако, во-первых, во время лиофилизации вместе с водой неизбежно теряются летучие и нестабильные компоненты биожидкости, например, ацетон и ацетоацетат Во-вторых, интерпретацию спектра может затруднить частичное замещение некоторых подвижных (кислых) атомов водорода в молекулах метаболитов на атомы дейтерия при растворении образца в D20 (например, замещению подвержены протоны СП2-групп в креатинине), что приводит к исчезновению сигналов этих протонов и потере информации о них В связи с этим, лиофилизация ЦСЖ в нашей работе не проводилась, а для подавления сигнала воды применялись специальные импульсные последовательности (zgpr, noesyprld, noesygpprld)

Учитывая имеющиеся различия в частотах определения и последующей идентификации ряда метаболитов в спектре с подсчетом их концентрации, сделан вывод о целесообразности регистрации спектра на основе использования разных

методик подавления сигнала воды (zgpr, noesyprld) и, в последующем, включении в статистическую обработку среднего из нескольких полученных значений

Согласно полученным данным, замороженные образцы ЦСЖ можно использовать для сравнительных исследований и получения достоверных результатов, и, если после отбора пробы, невозможно провести немедленно ее анализ, то до регистрации спектра ЯМР образец необходимо хранить в замороженном виде при температуре -20°С и ниже, что подтверждается литературными данными (J D Bell, 1992, S Maillet и соавт , 1998) Полученные результаты свидетельствуют также об отсутствии влияния увеличения срока хранения замороженного образца на его метаболический профиль, что согласуется с литературными данными (Е Magal и соавт, 1991)

Определенные в процессе настоящего исследования количественные значения описанных в литературе метаболитов соответствуют данным литературы

Различия концентраций ряда метаболитов при БДН и в группе сравнения случайны и связаны с малым числом наблюдений, а также характеристиками распределений концентраций в сравниваемых группах Полученные результаты согласуются с данными R A Wevers и соавт (1995), в которых также не выявлено связи биохимических показателей ЦСЖ с возрастом пациентов, характеристиками течения, вариантами и формами БДН Однако в литературе (J D Rothstein и соавт , 1990, J D Rothstein, 1996) имеются указания на незначительное повышение уровня глутамина в ЦСЖ и в желудочках мозга при МР-спектроскопии m vivo при классическом БАС Отсутствие каких-либо корреляций с концентрацией данного соединения в ЦСЖ, полученной при люмбальной пункции, объясняется резким увеличением степени разведения по мере движения ЦСЖ в дистальном направлении, интенсивностью обмена ЦСЖ и интенсивностью патологического процесса, что согласуется с мнением В С Bowen и соавт (2000)

Статистически достоверное повышение концентраций большинства идентифицируемых метаболитов при ишемическом инсульте, наиболее вероятно, связано с повышением проницаемости гематоэнцефалического барьера в результате ишемического повреждения вещества головного мозга в сочетании с обширным разрушением мембранных структур, запуском механизма глутаматной эксайтотоксичности (ЕИ Гусев, В И Скворцова, 2001), нарушением работы

клеточных систем энергообеспечения и развитием локального воспаления Выявленное статистически значимое повышение концентрации С-реактивного белка плазмы крови в сочетании с обнаруженными изменениями метаболического профиля ЦСЖ при ишемическом инсульте позволяют утверждать о том, что изменения концентраций метаболитов ЦСЖ отражают активность воспалительных процессов в мозге и степень повреждения гематоэнцефалического барьера Эти данные продтверждаются рядом исследований концентрации С-реактивного белка при ишемическом инсульте, показавших тесную взаимосвязь концентрации СРБ с тяжестью ишемического инсульта и прогноза исхода заболевания (Гусев Е И и соавт , 1999, Скворцова В И и соавт, 1999, Arenillas JF и соавт, 2003, Winbeck К и соавт, 2002, Napoli MD и соавт 2001, Muir К W и соавт 1999)

Используя методы современной математической статистики, такие как дискриминантный анализ, факторный анализ, методы классификации данных (деревья классификации, ¿-средние), а также методы описательной статистики предложен алгоритм обработки данных МРС для исследования ЦСЖ или любой другой биожидкости при различных заболеваниях Разработанный алгоритм включает три стадии — стадию вывода характерных значений концентраций метаболитов для различных патологических состояний (методами описательной статистики), стадию редукции и классификации данных (факторный погрупповой анализ, методы классификации, дискриминантный анализ) и стадию проверки данных (сочетание методов факторного анализа, анализа главных компонент и методов классифиакации) Используемый алгоритм может быть использован для построения диагностической модели для различных заболеваний

ВЫВОДЫ

1 Разработан протокол исследования ЦСЖ методом спектроскопии ЯМР по ядрам 'Н, в котором отражены методика подготовки проб, получение спектров на двух режимах с различными импульсными последовательностями подавления сигнала воды, последовательность качественного и количественного анализа спектров и верификации данных

2 Увеличение срока хранения замороженного образца ЦСЖ (до 11 месяцев, при -20 °С) не влияет на его метаболический профиль Добавление буферного раствора при подготовке пробы не влияет на концентрации метаболитов в ЦСЖ при проведении МР-спектроскопии высокого разрешения

3 В проведенном комплексном клинико-инструментальном исследовании выявлено статистически значимое повышение концентраций аланина, лактата, цитрата, пирувата, ацетоацетата, формиата, альфа- и бета-гидроксибутирата, глутамина, креатина и креатинина, фенилаланина и ряда других соединений при ишемическом инсульте, по сравнению с БДН и образцами группы сравнения, что предположительно может быть связано с повышенной проницаемостью гематоэнцефалического барьера

4. При сопоставлении клинических данных и биохимических показателей выявлено статистически значимое (р<0,001) повышение уровня С-реактивного белка у пациентов группы ишемического инсульта по сравнению с группами БДН и группой сравнения (концентрация СРБ 10,07±1,06, 4,86±0,77 и 5,19+0,74 мг/л соответственно) Выявлена статистически достоверная, прямая, сильная, корреляционная связь между оценкой по шкале ЭДН и значением концентрации СРБ в плазме крови пациентов с ишемическим инсультом (г= 0,75, р<0,001)

5 При анализе данных 'Н ЯМР-спектроскопии ЦСЖ и концентрации СРБ плазмы крови выявлена прямая корреляционная связь концентраций СРБ и ряда компонентов метаболического профиля ЦСЖ, что позволяет утверждать о том, что изменения концентраций метаболитов ЦСЖ отражают активность воспалительного процесса в мозге и степень повреждения гематоэнцефалического барьера

6 Результаты проведенного комплексного сопоставительного клинического и МРС-исследований не позволяют предполагать наличия диагностического значения спектроскопии ЯМР 'Н ЦСЖ у больных БДН Не выявлено связи биохимических показателей ЦСЖ с возрастом пациентов, характеристиками течения, вариантами и формами БДН

7 Предложенный алгоритм анализа данных, включающий стадию количественного анализа концентраций метаболитов, стадии редукции, классификации и проверки

данных, определяет структуру и стратегию разработки диагностической модели, основанной на MPC ЦСЖ на ядрах 'Н при сомато-обусловленных заболеваниях и системных поражениях ЦНС

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1 При необходимости хранения образов ЦСЖ, в том числе длительного — до 11 месяцев, и получения в последующем достоверных результатов, возможна их заморозка

2 Температура хранения образца до регистрации спектра ЯМР должна быть не выше -20°С

3 Учитывая имеющиеся различия в частотах определения метаболитов ЦСЖ в МР-спектре, при подсчете концентрации метаболитов МР-спектроскопию ЦСЖ необходимо проводить с использованием разных методик подавления сигнала воды

4 Выявленные маркеры нарушения гематоэнцефалического барьера, возможно, могут быть использованы для прогнозирования исхода и течения ишемического инсульта, а также для изучения патогенеза заболеваний, сопровождающихся повреждением гематоэнцефалического барьера

5 Оценка метаболического профиля ЦСЖ описанными методами статистического многофакторного анализа может служить универсальным диагностическим инструментом в клинической практике

СПИСОК НАУЧНЫХ РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1 Скворцова В И , Лимборская С А , Соколов К В , Левицкий Г H Молекулярные механизмы развития болезни двигательного нейрона Журнал неврологии и психиатрии им С С Корсакова, № 4, 2005, С 68-76

2 Соколов К В , Колоколова Т H , Савельев О Ю , Сергеев H M , Губский Л В , Скворцова В И Метаболический анализ цереброспинальной жидкости в норме и при ишемическом инсульте по данным магнитно-резонансной спектроскопии Инсульт Приложение к журналу неврологии и психиатрии им С С Корсакова, спецвыпуск 2007, С 253—254

3 Скворцова В И , Губский Л В , Левицкий Г H , Пирогов Ю А , Сергеев H M , Савельев О Ю, Соколов К В, Колоколова Т H Магнитно-резонанская спектроскопия высокого разрешения цереброспинальной жидкости Материалы IX Всероссийского съезда неврологов 29 мая-2 июня 2006, Ярославль С 122

4 Колоколова Т H , Савельев О Ю , Пирогов Ю А , Сергеев H M , Соколов К В , Скворцова В И, Губский Л В Спектроскопия ЯМР в метаболическом анализе цереброспинальной жидкости в норме и при различных неврологических заболеваниях Научно-практическая конференция «Новая технологическая платформа биомедицинских исследований (биология, здравоохранение, фармация)» Южный научный центр РАН Материалы конференции (Ростов-на-Дону, 16-17 октября 2006 г ) Ростов-на-Дону Изд-во ЮНЦ РАН, 2005, С 82

5 Kolokolova Т N , Savelyev О Yu , Sokolov К V , Gubsky L V , Pirogov Yu A , Sergeyev N M , Skvortsova V I Metabolic profiles of cerebrospinal fluids by 'H NMR spectroscopy 3rd International Conference «Genomics, Proteomics, Bioinformatics and Nanotechnologies for Medicine» 12-16 July, 2006 Novosibirsk, Russia, p 109

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ БДН — болезнь двигательного нейрона ДСС — 2,2-диметил-силапентан-5-сульфонат натрия ИИ — ишемический инсульт КТ — компьютерная томография MPC — магнитно-резонансная спектроскопия МРТ — магнитно-резонансная томография СО — стандартное отклонение ЦНС — центральная неовная система ЦСЖ — цереброспинальная жидкость ЭКГ — электрокардиография ЭНМГ — электронейромиография ЭхоКГ — эхокардиография ЯМР — ядерный магнитный резонанс

Большой потенциал в медицинских приложениях, как фундаментальных, так и клинических, имеют методы, основанные на эффекте ядерного магнитного резонанса (ЯМР). Быстрое совершенствование спектрометров ЯМР высокого разрешения в последние годы, приведшее к многократному росту их чувствительности и разрешающей способности [11], открыло возможности количественного анализа с помощью ЯМР большинства биологических жидкостей (моча, плазма крови, слюна, ЦСЖ) in vitro [148]. Метод ЯМР позволяет обнаруживать и количественно определять тысячи компонентов, в том числе важнейшие метаболиты и биомаркеры, выявлять на ранних стадиях развития многие патологические состояния, отслеживать реакции организма на воздействия различных патогенных факторов, токсических веществ и лекарственных препаратов в динамике [116, 138].

Значительным преимуществом использования ЯМР-спектроскопии является неспецифичность этого метода к определенным веществам, в отличие, например, от методов хроматографии или иммунологических методик. На получаемом спектре отражаются химические сдвиги от всех соединений, которые содержат ядра водорода (при спектроскопии 'Н), то есть без использования специфических реактивов и длительных по времени проведения методик, возможно получить значительный объем информации о качественном и количественном составе исследуемого образца [40, 44].

Особенности метода являются важными и полезными при исследовании ЦСЖ, получение которой является весьма инвазивной процедурой и ограничено по объему пробы.

Очень немногочисленные литературные данные о составе ЦСЖ в норме неоднозначны и противоречивы [70, 76, 117], что обусловлено малым количеством наблюдений, использованием различных по своим техническим характеристикам спектрометров [120, 124], а также различных методик приготовления образца для проведения МРС [177, 180].

В связи с вышеизложенными причинами необходимо провести изучение влияния ряда факторов, таких как влияние рН, сроки хранения, условия хранения на получаемые результаты и составление стандартизованного протокола исследования.

В настоящее время отсутствуют работы с подробным качественным и количественным анализом цереброспинальной жидкости, полученном на высокопольных ЯМР-спектрометрах, позволяющих регистрировать широкий спектр низкомолекулярных метаболитов.

Также в литературе практически отсутствуют данные о метаболическом профиле ЦСЖ здоровых людей по данным МРС высокого разрешения на ядрах водорода, а также об изменениях данного профиля при БДН и ишемическом инсульте.

Исходя из вышеизложенного, представляется важным провести исследование ЦСЖ методом МРС высокого разрешения на ядрах водорода при спорадической БДН в сопоставлении с метаболическим профилем ЦСЖ лиц без неврологических, хронических соматических, инфекционно-воспалительных, эндокринных, наследственных и прочих заболеваний потенциально приводящих к изменению состава ЦСЖ.

Представляет интерес также сравнительное исследование состава ЦСЖ при БДН (нейродегенеративном заболевании, поражающем преимущественно серое вещество головного и спинного мозга с интактным гематоэнцефалическим барьером) и ишемическом инсульте, при котором происходит как нарушение целостности гематоэнцефалического барьера, так и вовлечение в процесс белого и серого вещества головного мозга.

Болезнь двигательного нейрона (БДН) — заболевание, сопровождающееся гибелью центральных и периферических мотонейронов, прогрессирующим течением и летальным исходом. Согласно современным представлениям, развитие БАС обусловлено взаимодействием наследственных и экзогенных провоцирующих факторов. Наличие множественных патологических изменений в нейронах позволяет предположить многовариантность этиологии данного заболевания [54, 67, 165]. Болезнь двигательного нейрона существует в спорадической (90-95% случаев) и семейной формах (5-10%) [131]. Селективная гибель мотонейронов ствола мозга, спинного мозга и гигантских пирамидных клеток двигательной коры больших полушарий с возможной гибелью волокон кортикоспинального тракта [111] начинает проявляться клинически только после гибели 80% клеток.

Этиология и патогенез БДН остаются столь же загадочными, как и 100 лет назад, когда ее описал J. М. Charcot, и знаний, необходимых для разработки эффективных методов лечения и диагностики данного заболевания на ранних этапах, до настоящего времени накоплено недостаточно [67]. Распространенность БДН в мире составляет в среднем 2— 5 на 100000 человек в год [112], однако, за последние два десятилетия многими авторами отмечена тенденция к росту заболеваемости во всех возрастных группах [56, 114, 130]. Последние эпидемиологические исследования БДН в СССР, установившие средний показатель заболеваемости в 0,5—2,5/100 тыс. чел. в год, проводились О.А.Хондкарианом и Г.А.Максудовым в 1970 году [34]. Несмотря на относительно невысокий показатель заболеваемости, следует отметить, что БДН поражает лиц преимущественно зрелого и трудоспособного возраста, как правило, с высоким интеллектуальным и профессиональным потенциалом, неизбежно приводит к тяжелой инвалидизации и смерти больных, и это, с учетом отсутствия эффективных методов лечения, обосновывает актуальность изучения данного заболевания.

За последнее десятилетие в мире в области фундаментальных нейронаук достигнуты значительные успехи в понимании общих закономерностей развития неврологических заболеваний и, в частности, БДН. Долгое время, в том числе в нашей стране, доминировала инфекционная гипотеза происхождения БДН. Однако, многие предпринятые в дальнейшем попытки подтвердить данную этиологическую гипотезу, как основополагающую, оказались безуспешными [106, 154]. Известно, что в 90% случаев БДН носит спорадический, а в 10% — семейный или наследственный характер как с аутосомно-доминантным типом наследования и вариабельной пенетрантностью, так и с аутосомно-рецессивным типом наследования [39, 112].

Около 20% семейной и 5—7% спорадической БДН связано с мутациями в гене медь-цинк зависимой супероксиддисмутазы — фермента, утилизирующего свободные радикалы. Помимо этого, при БДН было выявлено определенное количество мутаций и полиморфизмов в других генах, относящихся к системам цитоскелета мотонейронов, регуляции нейротрансмиссии, репарации ДНК, нейротрофического обеспечения, регуляции выживания и программированной клеточной гибели [39]. Кроме того, при БДН были обнаружены и субклинические признаки патологии экстрамоторных систем центральной нервной системы (ЦНС) и экстраневральные аномалии, например, кожи [32, 140]. Все это позволило сформулировать более комплексное представление о БДН, как о мультифакториальном, вероятно, первично нейродегенеративном заболевании, в основе которого лежат генетическая предрасположенность и взаимодействие организма с факторами внешней среды, поскольку общность клинических проявлений наследственной и спорадической БДН предполагает общность их этиопатогенетических механизмов [181].

Существующие на сегодняшний день методы медикаментозного лечения не приносят значимых результатов и носят паллиативный характер. Это связано с несколькими причинами — недостаточно изучен патогенез заболевания, и на момент появления клинических симптомов заболевания сохранны лишь 20% мотонейронов.

Множество проведенных молекулярно-генетических, биохимических и других исследований выявили большое многообразие изменений в клетках нервной системы — структурная дезорганизация нейрофиламентов, нарушение работы транспортных мембранных систем мотонейронов, токсическое влияние внутриклеточных белковых агрегатов, изменение метаболизма свободных радикалов, развитие оксидантного стресса, нарушения работы системы энергетического обеспечения клетки и другие.

Столь широкое разнообразие патологических проявлений БДН, преимущественно обнаруженных в условиях эксперимента, не может не находить отражения в метаболических профилях биологических жидкостей. Учитывая, что заболевание поражает клетки нервной системы, наиболее целесообразно исследование цереброспинальной жидкости. Изучение состава ликвора у больных с БДН представляет большой интерес в изучении патогенеза, диагностики и разработки методов прогнозирования характера течения заболевания. Существует достаточное количество литературных данных об изменениях качественного состава (высокомолекулярных соединений) цереброспинальной жидкости (ЦСЖ) при БДН [69, 91, 92, 104, 167]. Однако, применение описанных в литературе методик для диагностики и прогнозирования течения заболевания для скрининговых целей не представляется возможным по причине высокой стоимости исследования, высоким расходом биологического материала, малым числом идентифицируемых метаболитов, что не позволяет всесторонне оценить метаболический профиль ЦСЖ.

Разработка высокоэффективных инструментальных методов диагностики является актуальной проблемой современной медицины. ЯМР-спектроскопический анализ биологических жидкостей представляется перспективным методом получения важнейшей диагностической информации о низкомолекулярной составляющей метаболического профиля, что недоступно для исследований иными существующими методами.

Работа была выполнена на базе кафедры фундаментальной и клинической неврологии и нейрохирургии ГОУ ВПО РГМУ Росздрава (заведующая кафедрой — член-корр. РАМН, профессор В.И. Скворцова),

НИИ Инсульта ГОУ ВПО РГМУ Росздрава (директор — член-корр. РАМН, профессор В.И. Скворцова), городской клинической больницы №31, учебно-научного межфакультетского и междисциплинарного центра магнитной томографии и спектроскопии (ЦМТС) МГУ (директор — профессор Ю.А. Пирогов )

Цель работы

Изучить значение изменений химического состава цереброспинальной жидкости по данным магнитно-резонансной спектроскопии высокого разрешения на ядрах водорода у больных с различными неврологическими заболеваниями.

Для достижения указанной цели решались следующие задачи:

1. Разработать протокол исследования ЦСЖ методом спектроскопии ЯМР на ядрах !Н. Определить влияние ряда физических факторов на получаемые спектры.

2. Оценить метаболический профиль цереброспинальной жидкости у пациентов, не страдающих неврологическими заболеваниями и иными патологическими состояниями, потенциально ведущими к изменению качественного состава ЦСЖ.

3. Провести качественную и количественную оценку полученных метаболических профилей в группах больных с БДН, ишемическим инсультом и контрольной группе.

4. Сопоставить полученные результаты по характеристикам метаболического профиля в группе пациентов с БДН с основными клиническими характеристиками заболевания (возрастом, формой, дебютом и вариантом, скоростью прогрессирования).

5. Провести оценку диагностических возможностей магнитно-резонансной спектроскопии высокого разрешения на ядрах *Н при ишемическом инсульте и болезни двигательного нейрона.

Научная новизна

Разработан протокол исследования ЦСЖ методом спектроскопии ЯМР на ядрах 1Н. Показано, что увеличение срока заморозки ЦСЖ до 11 мес, а также незначительное колебание рН не оказывают значимого влияния на получаемые спектры. Выявлены различия частоты идентификации метаболитов при использовании различных импульсных методик подавления воды. Исследован метаболический профиль ЦСЖ практически здоровых лиц, идентифицировано 29 низкомолекулярных метаболитов. Установлено отсутствие статистически значимых различий качественного состава компонентов метаболического профиля цереброспинальной жидкости в норме и при болезни двигательного нейрона.

Впервые проведено исследование ЦСЖ пациентов с ишемическим инсультом in vitro методом МРС. Выявлено отсутствие корреляционных связей между характеристиками БДН (вариант, форма, скорость прогрессирования) и составом ЦСЖ. Обнаружены значительные 7 количественные изменения состава ЦСЖ у пациентов с ишемическим инсультом. На основании сравнительного анализа метаболических профилей ЦСЖ при ишемическом инсульте, БДН и группы сравнения выявлены маркеры нарушения гематоэнцефалического барьера.

Разработан алгоритм статистической обработки массива диагностической информации, который может лечь в основу методики проведения дифференциальной диагностики патологических состояний по образцам биожидкостей с использованием магнитно-резонансной спектроскопии. Проведены проверка и доказательство эффективности разработанного алгоритма.

Практическая значимость работы

Усовершенствован протокол проведения МРС нативной ЦСЖ на спектрометре высокого разрешения. Показано влияние ряда физических и химических факторов на получаемые спектры, а также выяснены особенности применения различных импульсных последовательностей на спектр. Предложен новый подход к оценке результатов исследования биологических жидкостей in vitro при различных неврологических заболеваниях с использованием магнитно-резонансной спектроскопии высокого разрешения на ядрах 'Н. Оценивая данные по маркерам нарушения гематоэнцефалического барьера, возможно использование их для прогнозирования исходов и течения заболевания. Показана возможность применения метода МРС в качестве универсального диагностического инструмента в клинической практике, в исследовании биологических жидкостей организма.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Длительное хранение образцов ЦСЖ при температуре —20 °С, повторное замораживание-размораживание образцов, а также добавление к ним буферного раствора существенно не влияет на качество получаемого спектра и на количественный состав образца.

2. Метод спектроскопии ЯМР высокого разрешения на ядрах 'Н расширяет спектр идентифицируемых метаболитов в ЦСЖ, выявлены 27 низкомолекулярных соединений с известной химической структурой и 2 соединения с неизвестной химической формулой.

3. Метаболические профили ЦСЖ больных БДН и образцов группы сравнения не имеют качественных и статистически значимых количественных различий.

4. В образцах ЦСЖ пациентов с ишемическим инсультом значимо повышены концентрации изучаемых метаболитов.

5. В ЦСЖ пациентов, страдающих БДН, не выявлено связи между характером метаболического профиля и основными клиническими характеристиками заболевания (возрастом, формой, дебютом и вариантом, скоростью прогрессирования).

6. Алгоритм описания данных МРС !Н ЦСЖ, основанный на МРС высокого разрешения, может быть использован для построения диагностической модели при различных заболеваниях, сопровождающихся изменениями состава ЦСЖ.

ВЫВОДЫ

1. Разработан протокол исследования ЦСЖ методом спектроскопии ЯМР по ядрам 'Н, в котором отражены: методика подготовки проб, получение спектров на двух режимах с различными импульсными последовательностями подавления сигнала воды, последовательность качественного и количественного анализа спектров и верификации данных.

2. Увеличение срока хранения замороженного образца ЦСЖ (до 11 месяцев, при —20 °С) не влияет на его метаболический профиль. Добавление буферного раствора при подготовке пробы не влияет на концентрации метаболитов в ЦСЖ при проведении MP-спектроскопии высокого разрешения.

3. В проведенном комплексном клинико-инструментальном исследовании выявлено статистически значимое повышение концентраций аланина, лактата, цитрата, пирувата, ацетоацетата, формиата, альфа- и бета-гидроксибутирата, глутамина, креатина и креатинина, фенилаланина и ряда других соединений при ишемическом инсульте, по сравнению с БДН и образцами группы сравнения, что предположительно может быть связано с повышенной проницаемостью гематоэнцефалического барьера.

4. При сопоставлении клинических данных и биохимических показателей выявлено статистически значимое (р<0,001) повышение уровня С-реактивного белка у пациентов группы ишемического инсульта по сравнению с группами БДН и группой сравнения (концентрация СРБ 10,07±1,06, 4,86±0,77 и 5,19±0,74 мг/л соответственно). Выявлена статистически достоверная, прямая, сильная, корреляционная связь между оценкой по шкале NIH и значением концентрации СРБ в плазме крови пациентов с ишемическим инсультом (г = 0,75, р<0,001) .

5. При анализе данных 'Н ЯМР-спектроскопии ЦСЖ и концентрации СРБ плазмы крови выявлена прямая корреляционная связь концентраций СРБ и ряда компонентов метаболического' профиля ЦСЖ, что позволяет утверждать о том, что изменения концентраций метаболитов ЦСЖ отражают активность воспалительного процесса в мозге и степень повреждения гематоэнцефалического барьера.

6. Результаты проведенного комплексного сопоставительного клинического и МРС-исследований не позволяют предполагать наличия диагностического значения спектроскопии ЯМР !Н ЦСЖ у больных БДН. Не выявлено связи биохимических показателей- ЦСЖ с возрастом пациентов, характеристиками течения, вариантами и формами БДН.

7. Предложенный алгоритм анализа данных, включающий стадию количественного анализа концентраций метаболитов, стадии редукции, классификации и проверки, данных, определяет структуру и стратегию разработки диагностической модели, основанной на МРС ЦСЖ на ядрах !Н при сомато-обусловленных заболеваниях и системных поражениях ЦНС.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. При необходимости хранения образов ЦСЖ, в том числе длительного — до 11 месяцев, и получения в последующем достоверных результатов, возможна их заморозка.

2. Температура хранения образца до регистрации спектра ЯМР должна быть не выше -20°С.

3. Учитывая имеющиеся различия в частотах определения метаболитов ЦСЖ в MP-спектре, при подсчете концентрации метаболитов МР-спектроскопию ЦСЖ необходимо проводить с использованием разных методик подавления сигнала воды.

4. Выявленные маркеры нарушения гематоэнцефалического барьера, возможно, могут быть использованы для прогнозирования исхода и течения ишемического инсульта, а также для изучения патогенеза заболеваний, сопровождающихся повреждением гематоэнцефалического барьера.

5. Оценка метаболического профиля ЦСЖ описанными методами статистического многофакторного анализа может служить универсальным диагностическим.инструментом в клинической практике.