Автореферат и диссертация по медицине (14.00.29) на тему:Диагностическое значение анализа информационной РНК в изучении гемоглобинопатий у детей и подростков



и А

о/*

1 1 ;юа &-0

на правах рукописи

СМЕТАНИНА Наталия Сергеевна

ДИАГНОСТИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ АНАЛИЗА ИНФОРМАЦИОННОЙ РНК В ИЗУЧЕНИИ ГЕМОГЛОБННОПАТИЙ У ДЕТЕЙ И ПОДРОСТКОВ

14.00.29 - гематология и переливание крови 03.00.03 - молекулярная биология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соисканиэ ученой степени кандидата медицинских наук

Москва - 1996

Работа выполнена в Медицинском Колледже Джорджии (президент -профессор Р.Л.ТеЬеэсо) и НИИ Детской Гематологии (директор института -академик РАЕН, доктор медицинских наук, профессор А.Г.Румянцев).

Научные руководители:

доктор наук, профессор Т.Н.ХНшзтап

доктор медицинских наук, профессор Ю.Н.Токарев

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Е.В.Самочатова доктор биологических наук, профессор С АЛимборская

- Ведущее учреждение: Всероссийский научный центр по молекулярной диагностике и лечению

Защита диссертации состоится «сХ ( » X ( 1996г. в

(V час.

на заседании специализированного совета Д.0В4.61.01 в НИИ Детской Гематологии N13 и МП РФ (117513, Москва, Ленинский проспект, д.117).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке УМ'Л Датской Гематологии.

Ученый секретарь специализированного совета доктор медицинских наук, професор. Заслуженный врач России

А.Е.Бухны

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Гемоглобинопатии - это гетерогенная группа заболеваний, которая характеризуется качественным (аномальные НЬ) или количественным (талассемии) нарушением синтеза гемоглобина. Они являются наиболее распространёнными моногенными заболеваниями, создающими главную проблему здравоохранения во многих странах мира. По данным ВОЗ, к 2000 году частота носителей глобиновых аномалий достигнет 7% - от популяции земного шара. Наиболее часто встречающиеся и наиболее тяжелые формы - это серповидноклеточная анемия, гемолитическая анемия, обусловленная нестабильным гемоглобином, большая форма р-таласемии, НЬ Н заболевание и Hb Bart's водянка плода (Weatherall D.J. and Clegg J.B., 1981; Токарев Ю.Н., 1983; Bunn H.F. and Forget B.G., 1986). Диагностика гемоглобинопатий быстро совершенствуется. В 60-е годы диагноз базировался на клинических данных, но уже начиная с 70-х к диагностическим тестам присоединяется электрофорез НЬ и исследование, биосинтеза глобиновых цепей, что позволило выязитъ гетерогенность в группе талассемий (гетерозиготные и гомозиготные формы р° или p+)(Weathera!l D.J. и Clegg J.В., 1981). Начиная с 1930 года существенным дополнением в диагностике стало исследование ДНК (Kazazian Н.Н., Jr. и др., 1980; Poncz М. et а!, 1982; Saiki R.K. et а!, 1938; Diaz-Chico J.C. et al, 1988; Mclchanova T.P., 1994). Использование молекулярно-биолсгических методов в изучении гемоглобинопатии внесло значительный вклад а понимание генетических механизмов заболеваний этой группы и их эпидемиологию. Начиная с 90-х годов отмечается тенденция использования информационной РНК (и-РНК) для более детального исследования молекулярных осноз гемоглобинопатий и попытки создания ряда диагностических тестов на этой оснозе (Thein S.L et а!, 1990; Lim S-K. et ai, 19Э2; Hall G.W., Thein S.L, 1994). Настоящее исследование базируется на новейшей технологии с использованием обратной транскрипции и полимеразной цепной' реакции (RT-PCR), что может значительно ускорить молёкулярно-биологическую диагностику данной группы заболеваний.

Цель исследования

Целью настоящей работы является создание легко воспроизводимого молекулярно-диагностического теста на основе использования и-РНК и уточнение молекулярных механизмов тяжелых форм гемоглобинопатии.

Задачи исследования

1. определить . относительный уровень гпобиновых и-РНК в ретикулоцитах здоровых и больных с различными формами гемоглобинопатии;

2. проанализировать связь между уровнем и-РНК и клиническим течением гемоглобинопатии.

Научная новизна

Проанализирована динамика PCR, что прозаолило стандартизировать и усовершенствовать ранее описанные, экспериментальные условия и добиться высокой воспроизводимости результатов и экономии дорогостоящих реактивов.

Разработан новый метод на базе RT-PCR для определения относительного количества различных глобиновых и-РНК, дающий возможность быстро и с большой воспроизводимостью анализировать образцы крови больных различными формами гемоглобинопатии и оценить вожможную тя:кестъ заболевания.

Описано присутствие удлиненной а2 и-РНК при а-талассемиях вследствие мутаций в терминирующем кодоне или поли(А) сигнале а2 глобинового гена. Показано, что ее количество не одинаково при указанной патологии; повышение до 90% от уровня общей а2 и-РНК значительно смягчает клиническую картину заболевания за счет участия данной молекула и-РНК в синтезе а глобиновой цепи, что в свою очередь уменьшает дисбаланс глобиновых целей.

Показано, что область между ¿¡2- и ^-глобиновыми генами несет регуляторную функцию, подавляя или усиливая экспрессию £2-глобинового гена. Трансляция £ и-РНК у пациентов с Hb Н заболеванием имеет низкую эффективность. ' >

Предложено объяснение тяжести течения "домининтной" формы ß-та-лассемии.

Впервые продемонстрированно, что и-РНК, кодирующая синтез нестабильной глобиновой цепи, является стабильной. Уровень у и-РНК у пациентов с нестабильными гемоглобинами зависит от тяжести перси стирующей анемии.

Описано две абсолютно новые мутации и одна большая делеция в области ß гпобинового локуса, приводящие к ß-талассемии.

Научно-практическая значимость

Оптимизированы и стандартизированы условия RT-PCR, позволяющие высокоэффективно использовать и-РНК для анализа образцов крови больных различными формами гемоглобинопатий, что ускоряет время молекулярной диагностики гемоглобинопатий и экономит дорогостоящие реактивы.

Разработанный метод исследования и-РНК можно использовать в качестве дополнительного теста в диагностике ß-тапассемий, а-талассемий и их совместного наследования.

Отимизирован ранее созданный метод молекулярной диагностики некоторых делеционных а-талассемий на основе PCR, что позволило использовать микроколичества ДНК и значительно понизить ошибку эксперимента.

Внедрение результатов работы в практику

Результаты работы используются в отделе Патологии Эритрона и Обмена Железа, НИИ Детской Гематологии (Москва, Россия); в отделе Биохимии и Молекулярной биологии, Медицинского колледжа Джорджии (Агастз, США); в отделе Педиатрии, медицинского факультета Кувейтского университета (Сафат, Кувейт). Результаты данной диссертации опубликованы в 18 печатных работах.

Апробация работы

Работа обсуждалась на XIII конференции Международного общества гематологов, Европейское и Африканское отделение (Стамбул, Турция, сентябрь

1995), съезде Американского общества гематологов г(Сиетп, США, декабрь 1995) и

ч

на семинаре в отделе экспериментальной гематологии Эразмус университета (Роттердам, Голандия, июль 1996).

Материалы работы апробированы на совместной конференции сотруднико! клинических и лабораторных отделов НИИ Детской Гематологии МЗ и МП РФ i сентябре 1996г.

Структура и объём диссертации

Диссертация включает следующие разделы: введение, обзор литературы описание используемых материалов и методов исследований, главы, посвященно£ результатым собственных исследований, обсуждение полученных результатов выводы, правтические рекомендации, список литературы. Работа содержит 1S

таблиц и 23 рисунков и схем, занимает __ страниц машинописного текста

Библиография включает _ источников отечественной и 190 источникое

иностранной литературы.

Работа выполнена в отделе Патологии Эритрона и Обмена Железа НИИ ДГ РФ (руководитель - заслуженный деятель науки РФ, профессор Ю.Н.Токарев) и в лаборатории Белковой Химии отдела Биохимии и Молекулярной Биология Медицинского Колледжа Джорджии, США и Международном Центре по Идентификации Аномальных Пемоглобинов (руководитель - доктор наук, профессор T.H.J.Huisman).

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ.

Всё исследование проведено на 217 пациентах, которые разделены на четыре группы.

Группа 1 - контрольная группа, состоящая из 26 человек в возрасте от 1 до 46 лет. Все имели нормальные гематологические параметры и были практически здоровыми.

Группа 2 включала 30 пациентов, среди которых 16 человек, носителей стабильных аномальных НЬ с или без сопутствующей а-талассемии, 14 пациентов

>!ли гетерозиготамн по нестабильным аномальным НЬ с различной степенью ^стабильности.

Группа 3 состояла из Я1 пациента с р-талассемией, среди которых 47 терозигот по 18 р-талассемическим аллелям (Таблица 1), 23 гомозигот и 21 юйных гетерозигот по 7 различным р-тапассемическим аллелям (Таблица 2).

Группа 4 включала 70 пациентов с различными формами а-талассемии аблица 3).

ИНСТРУМЕНТАЛЬНЫЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Образцы крови собирались в вакутейнер^ (Becton Dickinson Vacutainer Sys- . ns. New Jersey, NY, USA) с ЕДТА или гепарином в качестве антикоагулянта, зразцы хранились при температуре +4°С в течении доставки (24 часа с момента бора крови) в лабораторию в Агасте, штат Джоржия, США.

Общий анализ крови получен на автоматическом гемоанализаторе (Sysmex 1000, Toa Medical Electronics Co., Kobe, Japan).

Состав гемоглобина исследовался с помощью изоэлектрофокусирования ighetti et al, 1986). Количественный подсчет различных типов НЬ производился тем разделения на катаонно-обменной Высокочувствительной Жидкостной юматографии (ВЖХ) (Wilson J.B. et al, 1983). ВЖХ обратной фазы применялась я разделения цепей НЬ с подсчетом их количественного содержания (Shelton J.B. al, 1984):

Анализ ДНК. Геномная ДНК выделялась из цельной крови по методу Poncz et al (1982) и исследовалась путем гибридизации амплифицированных (агментов с синтетическими олигонуклеотадными пробами (Diaz-Chico J.C. et al, 88), путем сиквенса амплифицированных фрагментов ДНК (Sanger F. et al, 1977; " ilchanova T.P., 1994) или путем специфической полимеразной цепной реакции DR) для визуализации различных делеций а-гпобиновых генов (Bowden D.K. et al, 32; Baysal E. and HuismanT.HJ., 1994).

Анализ РНК. Общая клеточная РНК выделялась по методу разработанному omczynski Р. (1993) из ретикулоцитов периферической крови. Информационная

.у

[К, содержащаяся ' в выделенном продукте, обратно транскрибировалась с мощью обратной транскриттазы и использовалась в PCR специально

разработанной для определения относительных количеств различных глобиновы> и-РНК.

Таблица 1

Гетерозиготы по (3-талассеыии.

а. Без сопутствующей а-тапассемии-2.

Мутация Количество 1-14 15-18 > 18

случаев лет лет" лет

-101 (С->Т) 1 - - 1

-88 (С->Т) - - 1

-30 (Т->А) 1 - - 1

СО 8 (-АА) 1 1 -

СРэ 8/9 (+3) - -

СО 15 {С-,А) 1 - - 1

С0э30/31 (+Свв) 3 - 1

СОэ 36/37 (-Т) 3 2 - 1

СО 39 (С-»Т) 2 - -

-1(С->С) 2 - 1 1

(УБИ-б (в-»С) 2 1. - 1

(Т->С) 1 - - 1

1\/5-1-110 (С->А) 10 - - 10

МБ-! 1-850 (в->А) 1 - - 1

СО 121 (С-»Т) 1 - - 1

СОэ 134-1373 2 - -

СРэ 120/121 (+А) 2 . 1 - - 1

Делеции: (еубр) 1 - - 1

(убр) 1 - 1

(АТ5Р) 1 - - 1

-1393 Ьр 1 - - 1

Всего 39 5 2 32

* CDs 134-137 реорганизация: делеция 11 nts и вставка 5 nts.

б. С сопутствующей а-тапассемией-2.

Мутация Количество 1-14 15-18 лет >18

случаев лет лет

-88(C-»T) 3 - 2 1

-29 (A->G) 1 - - 1

CD 17 (А->Т) 1 - - 1

CDs 36/37 (-Т) 3 2 1 -

Всего 8 2 3 3 .

Гомозиготы и двойные гетерозиготы по р-талассемии.

. МУТАЦИЯ Кол-во Количество . 1-14 >18

хромасома А /хромосома В а случаев лет лет

генов

-29 (А-*С)/-29 (А-4-С) 3 1 1 -

СЭз 36/37 (-ТУ 36/37 (-1) 3 1 1 -

СО 39 (С->Т)/СО 39 (С-*Т) 4 9 - 9

МЭ-МЮ (<5-*А)/1У&-1-110(С->А) 4 7 - 7

1Х/!5-1-6(Т->С)Л\/5-1-6 (Т->С) 4 5 - 5

-101 (С-УГУСО 8 (-АА) 4 2 1 1

-101 (С-»Т)/СО 39 (С-»Т) 4 1 1 - ■

-87 (С->С)/1УЗ-1-110(в-^А) 4 2 - 2

-30 (Т-»А)/1У5-1-6 (Т->С) 4 1 1 -

СО 39 (С->Т)/1\/5-1-6 (Т->С) 4 9 - 9

СО 39(С—>Т)/1 N/5-1-110 (в->А) 4 1 - 1

1У5-1-6(Т->С)/1У5-1-110(в->А) 4 5 - 5

Всего 3 2 2 -

4 42 3 39

Пациенты с а-талассемией.

Генотип

Кол-во <1 1-4 5-7 8-11 12-14 15-18 >18 случаев' года года лет лет лет лет лет

Носители:

3.7, -а /<ха

-а laа

aCSa/aа

Всего

а-Талассемия

3.7, 3.7 -а /-а

_Г/аа

—FIL/cta -{а)20.5/аа

3.7, р -а /а а 42, cs -а /а а

Всего

НЬН заболевание

10 2 1

13

3 5

4 1 1 1

15

8 1 1 10

3 . 5 1 1 1 1 12

med ii, 3.7 — /-а 4 _ _ _ _ 4

med 1/^3.7 9 - 2 - - 7

_sea;j.7 3 - 2 1 - - - -

-<сс)20.5/-а3-7 3 ' - - - - - - 3

—f""/-a3'7 1 - 1 - - - -

_se/>y_c[4.2 1 - 1 - - . - -

med 11^4.2 1 - . - - - - 1

SEA, CS - /а а 2 - 1 - 1 - - -

MEDI, -5nt — /а а 6 - - - 2 1 3

_medi/cpa-2a 2 - - - 1 - 1 -

-(а)20.5/а5п'а 1 - - - - - 1

-(а)20.5/аРА"2а 2 - - - - - - 2

cs , р а а/а а 1 1 - - - - - -

ра-1 , ра-1 а а/а а 5 - - - 2 1 - 2

а а/а а 1 - - - - - - 1

Всего 42 1 5 1 8 2 1 24

Общее количество 70 1 7 4 . В 3 1 46

2

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Полученные результаты расширяют понимание экспресии генов при емоглобинопатиях. Новая методология, основанная на RT-PCR была разработана Ц1я выполнения задачи настоящего исследования: определения относительных зэличеств глобиновых и-РНК в ретикулоцитах здоровых и больных различными (эормами гемоглобинопатии. Предложенная методика позволяет получить легко юспроизводимые данные для одновременного определения а2/а1 и a/ß и-РНК »отношений. Таблица 4 приводит среднее значение (М), стандарное отклонение о), максимальное (гпах) и минимальное (min) значения для контрольной группы.

Таблица 4

Значения а21аЛ и a/ß и-РНК соотношений для контрольной группы

(п=26)

a2/a1 и-РНК соотношение a/ß и-РНК соотношение

м 2,75 4,40

. а 0,16 0,25

Min 2,45 3,87

Max •3,10 ■ ■ • 4,79

Синтез аир глобиновых цепей у здоровых людей сбалансирован благодаря присутствию в несколько раз большего количества а и-РНК по отношению к р и-РНК [Bunn H.F. and Forget B.G., 1986), что также отражено в наших исследованиях. Cash et al (1989) даёт объяснение этому феномену, демонстрируя сниженную способность а и-РНК присоединять рибосомы.

Средний уровень а2/а1 и-РНК соотношения 2,73±0,16 находится в полном хютветсгвии с ранее опубликованными данными (Molchanova Т.Р. et al, 1994).

Аномальные Hbs. Мутации в кодирующей области а или р глобиновых генов, 1риводящие к замене оснований в и-РНК и изменяющие последовательность аминокислот в синтезирующемся белке, не влияют на уровень данных и-РНК в зетикулоцитах. Это было показано с использованием RT-PCR на примере "етерозигот no Hb S с или без сопутствующей а-талассемии-2 (Dimovski A.J. et а!, .

1994). Сходные данные получены нами для других стабильных аномальных Hbs. Уровни рА и р° и-РНК у семи Hb D Los Angeles (Р121 Glu-»Gln;'GAA-»ÇAA) практически одинаков (Таблица 5); полученные результаты - высоко воспроизводимы (колебания в пределах 6%). Нормальное а/р и-РНК соотношения для пяти Hb Porto Alegre (09 Ser-»Cys; TCT-»TGT) гетерозигот.. и одной НЬ Sôgn (Р14 Leu-^Arg; CTG-vCGG) гетерозиготы, также предполагают равную интенсивность транскрипции ¡JA и рХ глобиновых генов и равную степень деградации соответствующих и-РНК. Различия в относительных количествах белков (Hb А и НЬ X, например) и и-РНК (рА и р*) поддерживают гипотезу о посттрансляционной регуляции путем уменьшения образования сфХ димеров, приводящего к уменьшению количества аномального Hb (Abraham Е.С. and Huisman Т.Н.J., 1977; Huisman T.H.J., 1977; Bunn H.F., 1987). Это опять же подтверждается на примере Hb SOgn и Hb Küln (р98 Val-»Met; GTG->ATG) гетерозигот с сопутствующей а-тапассемией-2 гетерозиптшостью.

Данные, полученные для гетерозигот по нестабильным аномальным гемоглобинам, демонстрируют, что и-РНК, ответственная за синтез нестабильного

А X

варианта НЬ, является стабильной. Соотношение между р и р и-РНК равные примерно 1, исключающие предположение о нестабильности этих молекул как одном из факторов влияющих на наличие гематологических нарушений. Даже в

д- Y

наиболее тяжелом случае (НЬ Yokohama [р31 Leu-»Pro; CTG->CÇGJ) р /¡3 и-РНК соотношение было равно ~1. Нестабильность аномальной глобиновой цепи или варианта НЬ, в который данная цепь инкорпорирована, является главной причиной заболевания: менее стабилен аномальный белок - более тяжелое состояние пациента. Более того, наши результаты показали, что уровень у и-РНК зависит от тяжести персистирующей анемии: у и-РНК составляет до 9-15% от общего уровня не-а и-РНК у трех пациентов с тяжело нестабильными Hbs (Hb Yokohama, Hb M¡-zuho [P68 Leu->Pro; CTC-»CÇC], Hb Brockton [P138 A!a-»Pro; GCT->ÇCT]); этот уровень значительно меньше или даже нормален у пациентов с более стабильными вариантами НЬ-(Таблица 5).

В-Талассемия. Тяжесть р-талассемии значительно уменьшается при наличии одной или более а-талассемической аллели, т.к. последняя приводит к уменьшению

Значения соотношений и-РНК у носителей аномальных гемоглобинов

Вариант НЬ Случай # a/ß и-РНК a2Ja1 и-РНК Г и-РНКГЛ) /// и-РНК

Норма* n=26 4.40±0.25 2.73±0.16 - -

Hb D 8289 4.28 2.81 1.01

8290 4.11 2.78 2.0 0.96

8291 4.09 2.57 - 1.09

617 4.25 2.77 - 0.94

619 4.13 2.79 - 0.92

623 4.30 2.83 2.4 0.92

610 4.16 2.31 - 0.99

НЬ Porto Alegre 8292. 4.04 .. 2.60 -

8294 4.28 2.58 - -

8295 4.06 2.48 - -

8296 4.51 2.49 - -

8298 4.31 2.83 - -

Hb Е 8106 4.43 2.60 - -

8125 4.23 2.54 - -

8126 4.01 2.52 0.8 -

8293 4.37 2.65 .- -

Hb Bushwick 1235 4.27 2.47 1.3 0.92

Hb Shepherds Bush 8208 4.02 2.64 - 0.88

Hb Fannin-Lubbok 8123 4.42 2.53 0.3 -

Hb Sogn 8318 4.03 2.53 - 0.96

8316" 3.08 1.14 - 0.98

Hb Atlanta 8083 4.47 2.44 _ 0.96

80S8 4.28 2.47 - 0.97

8089 4.34 2.82 - 0.98

8090 4.05 2.86 - 0.97

Hb Kol n 2452 4.02 2.42 9.0 0.90

8191" 3.29 1.30 42 1.06

Hb Yokohama 1516 4.22 2.50 9.0 0.98

Hb Mizuho 8124 4.54 2.39 12.4 -

Hb Brockton 8310 4.67 2.60 15.3 -

----^-

Значение М±сг из Таблицы 1; с сопутствующей гетерозиготностью по

сх-талассемии-2

избытка а-глобиновых цепей (Капауайэ Е. е{ а!, 1982; Wa¡nscoat .1.5. е1 а1, 1983; 1987). Взаимодействие а- и р-талассемии отражает окончательный баланс в транскрипции аир генов и последующем синтезе аир ппобиновых цепей. Присутсвие а-тапассемии также затрагивает относительные уровни аир и-РНК и

возможно у и-РНК, таким образом определение a/ß и у/(Р+т) и-РНК соотношений должно сопровождаться подсчетом a2/a1 и-РНК соотношения.

Замены- оснований в ß-глобиновом гене могут изменять уровень транскрипции, преждевременно обрывать трансляцию или создавать нефункционирутацие и-РНК, что отражается в вариабильности клинической картины ß-тапассемии от легкой до тяжелой.

Результаты исследований 46 гетерозигот по 18 ß-талассемичесхим аллелям подтверждают и углубляют ранее опубликованные данные. RT-PCR метод, разработанный нами, позволяет подсчитать относительные количества и-РНК, и во многих случаях, a/ß и-РНК соотношение отражает тяжесть состояния при ß-тапассемии. Рисунок 1 суммирует и сопоставляет эти соотношения для различных ß-тапассемичесхих аллелей. Повышение a/ß и-РНК соотношения у носителей транскрипционных мутаций является результатом снижения уровня транскрипции нормальной ß и-РНК; снижение до примерно одинакового уровня было обнаружено для ряда мутаций в области промотора ß-глобинового гена, кроме "молчащей" -101 (С->Т) мутации, при которой снижение a/ß и-РНК соотношения весьма незначительно (Таблица 6).

Присутствие сдвига рамки или нонсенс мутации в первом или втором экзоне ß-глобинового гена повышает a/ß и-РНК соотношение до значений 7,5-8,0, которые несколько ниже расчетного -9. Вероятно, транскрипция нормальной хромосомы повышается примерно на 25-35%, что является максимально возможной. Сходные значения были обнаружены для носителей мутаций, повреждающих процесс образования нормальной и-РНК, таких как IVS-ll-850 (G->A) и IVS-l-5 (G->C) мутации. Значение a/ß и-РНК соотношения было найдено несколько ниже для Hb Monroe [IVS-I, -1 (G->C)], что отражает присутствие небольших количеств сплайси-рованной ß и-РНК. Для гетерозигот по IVS-l-110(G->A), создающей альтернативный сплайсинг сайт, a/ß и-РНК соотношение обнаружено в пределах нормы, что согласуется с результатами полученными Spritz et al (1981). Аналогичные данные обнаружены для гетерозигот по Hb Е [ß26 Glu-»Gln; GAA-»CAA] (a/ß и-РНК. соотношение 4,28±0,15).

Transcrip- Nonsense Normal. tional 4 frameshrft -"спи; ; Г1

RNA . processing

Exon III Deletion 71Г"

»11 13 14

<- HUT ANT

. I

1. -88 (C->T)

2. -29 (A-»C)

3. Й8(-АА)

4. Cd 36-37 (-T1

5. Cd 39 (C->T)

6. IVS-l-1 (G-»C)

7. IVS-I-5(G->C)

8. IVS-l-110 (G->A) S. IVS-ll-850 (G->A) 11 CO 121 (G-.T)

11. CDs 134-135 Deletion/insertion

12. t^Tha!

13. Thai

14.-1393 bp delelion

Рисунок 1

cx/p и-РНК соотношения для пациентов с гетерозиготной р-талассемией (мутации указаны слева от диаграммы).

Значение и-РНК соотношений у гетерозигот по ß-талассемии.

Генотип Случай » Кол-во a генов a2/a1 и-РНК a/ß u-PHK r u-PHK % u-PHK ß'h u-PHK* %

Норма!" n=26 4 2.73±0.16 4.40±0.25 - - -

-101(С-»Т)/А 1478-T 4 2.55 5.15 . 0.97 5.10

-88(С-»Т)/А 668 4 2.55 6.83 "8.17 6.31 -

-30(Т-»А)/А 2700-M 4 2.71 6.59 531 6.26 ' -

-29(A->G)/S 8192 4 2.98 6.84 3.60 6.60 -

-88(С-»Т)/А 666 3 1.38 5.77 8.35 5.32 -

667 3 1.43 5.42 2.04 5.31 -

-88(C-»T)/C 665 3 1.69 5.80 15.3 5.03 -

-29(A->G)/S 602 3 1.54 5.61 7.77 5.20 -

CD8(-AA)/A B130 4 2.62 8.27 7.52 7.69 _

CDS8/9(+G)/PA" 8217 4 2.71 7.34 4.6 7.02 -

CD15(G->A)/Ll.b 8119 4 2.68 9Л0 6.0 8.77 -

CDs36/37(-T)/A 474 4 £67 7.21 5.8 6.81 -

480 4 2.73 7.73 3.7 7.45 -

CDs36/37(-T)/D 482 4 2.97 11.07 39.0 7.96 -

CD39(C-»T)/A 8094 4 2.69 9.19 33.2 6.90 -

8096 4 2.70 7.97 0 7.97 -

1478-M 4 2.68 7.29 6.77 6.83

CDs120/121(+A)/A 8366 4 2.93 5.18 5.4 4.91 -

CDs36/37(-T)/A 479 3 1.56 6.94 - 6.94 -

Cds36/37(-T)/D 473 3 1.86 6.52 - 6.52 -

478 3 1.52 • 6.57 - 6.57 -

IVS-I, -1 (G-»C)/A 663 ' 4 2.82 6.69 "' 0 6.69

664 4 2.85 6.72 0 6.72 -

IVS-I-5(G->C)/A 8105 4 2.59 7.28 0 7.28 -

JVS-l-110(G—>A)/A 8111 4 2.53 4.97 14.05 4.36

8407 4 2.70 4.77 0 4.77 4.79

8408 4 2.62 3.59 0 3.59 5.67

8410 4 2.74 4.65 8.21 4.30 1.03

8413 4 2.85 5.22 0 5.22 7.52

£414 4 2.76 4.01 1.85 3.94 5.12

8416 4 2.63 4.06 0 4.06 1.06

8417 . 4 2.71 4.15 2.20 2.33

8421 4 2.69 4.05 5.84 3.83 £79

8423 4 2.73 4.34 2.01 4.25 6.14

IVS-II-S50(G->A)/A 359 4 2.57 9.05 9.7 '8.25 -

(j/SpyA 8103 4 2.57 4.75 22.5 3.88 -

CrSPVS 7000 4 2.12 5.43 31.8 4.12 -

-1393 bo/S 8118 4 2.61 4.75 0 4.75 -

а Расчитано кап 100xß/(ßTh+ßA). b Значения М+а из Таблицы 1. Сокращения: С = Hb С I Glu->Lys; GAG->AAG); S = Hb S (ß6 Glu-vVal; GAG->GTG); PA = Hb Porto Alegre i Ser-»Cys; TCT-+TGT); LI. = HbLulu Jsland (ß107 G!y-+Asp; GGÇ-+GAC): D = Hb Los Angeles (ß121 Glu-+Gln; GAA->CAA). .

Известно, что нонсенс мутации и мутации сдвига рамки расположенные

экзонах 1 и 2 приводят к снижению наксплгния и-РНК в цитоплазме (Thein S.L et

1990; Baserga S,J. et al, 1992; Kugler W. et al, 1992; Enssle J. et al, 1993; Hall G.W. and Thein S., 1994); чего не происходит с аналогичными мутациями в экзоне 3. Проведенные исследования подтверждают это. а/р и-РНК соотношение у пациентов с подобного рода мутациями имеет пограничное значение или всего на 38%

<-• Th

выше полученного для контрольной группы. Это объясняет снижение уровня р

и-РНК до -50% от нормального для CD 121 (G-*T) гетерозиготы, в среднем до 79%

д

для двух пациентов с делецией/вставкой в CDs 134-137 и одинаково с р и-РНК у трех пациентов со вставкой 3 нуклеотидов (nts) в CDs 30/31 {Рисунок 2, Таблица 7).

Таблица 7

Значения и-РНК соотношений для больных с "доминантной" формой

р-талассемии.

Генотип Случай a2/a1 ajp r af(fi*}) /V

# u-PHK u-PHK u-PHK % u-PHK u-PHK

Норма3 n=26 2.73±0.16 4.40±0.25 - - -

CD 30(+CGG)/A 8311 2.50 4.78 2.45 4.67 1.12

8312 . 2.42 . 4.48 3.56 4.33 . .1.20

8313 2.75 4.29 2.48 4.19 1.07

CD 121 (G->T)/A 8223 2.75 5.99 1.03 5.93 0.50

CDs 134-137/Ab 8286 2.53 6.03 13.84 5.30 0.67

8287 2.49 6.45 20.60 5.35 0.89

---^-

Значения М±сг из Таблицы 1. CDs 134-137 реорганизация: 11 nts делеция и 5 nts вставка.

Присутствие аномальной, укороченной или удлиненной, ¡} цепи, которая не способна образовывать димеры с нормальной а цепью или обладает выраженной нестабильностью и протеолизируется до того как образует димер с нормальной а цепью, может также изменять продолжительность жизни эритроцитов. Это играет более важную роль, чем простое уменьшение количества нормальных р цепей; что действительно может быть объяснением тяжести "доминантной" формы. Впервые описанная нами вставка в CDs. 30/31-является ещё одним аргументом в пользу данного предположения.

Eco Rl digest . ..bp

{Щу^'б Sr 493 (ßD;

Vf^-iVrK.^sf"-'-;

324 CßA)

.1 2 .3

AA 8286 8287

' ;.--------- : bp

ШШР1 ■

Ш&Щ 493 (ßA) r^v.fc-^ 487 (ßTh

Рисунок 2

Разделение радиактивно меченных фрагментов на 6% полиакриламидном геле в денатурирующих условиях. Слева - анализ RT-PCR продуктов после расщепления EcoR I рестриктазой: 1- Hb D Los Angeles гетерозигота; 2- нормальный контроль; 3-

А Th

гетерозиготная р°-тапассемия (CD 121 GAA-»7ÄA). Справа - разделение ß и ß RT-PCR продуктов; АА- нормальный контроль; 8286 и 8287 - гетерозиготы по реорганизации в CD 134-137 (делеция 11 nts и вставка 5 nts).

Легкое повышение в соотношении alß и-РНК обнаружено у трех пациентов с делеционной ß-талассемией и четырьмя а-глобиновыми генами (среднее значение 5,22) достаточно сложно объяснить. Два человека имели значительный уровень у и-РНК и их a/(ß+y) соотношение было в области нормы (Таблица 6). Однако, вез три пациента имели легкую анемию (Hb 9,2-11,8 g/dl) с микроцитозом (MCV 74,2-76.7 fl) и гипохромией (МСН 20,3-26,0 рд) и не нуждались в заместитульной терапии. Можно предположить, что транскрипция нормального ß-глобинового гена компенсаторно повышена без соответству-ющего повышения трансляции. Более того, у и-РНК .вероятно, присутствует в ограниченном количестве ретмкулоиитов и, таким образом, a/(ß+y) и-РНК соотношение не отражает ситуацию во всех клетках.

а-Тапассемия. Делеция одного а-глобинового гена, приводящая к гетерозиготности по а-талассемии-2, сопровождается легкий снижением a/ß и-РНК соотношения (от4,40±0,25 для нормы до 3,61±0,31; Таблица 8). Вариабильность в значениях этого показателя среди гетерозигот по 3,7 kb делеции (от 3,29 до 4,13) требует дополнительных исследований. сс2/а1 и-РНК соотношение в этих случаях снижено от 2,73±0,16 до 1,42±0,17, что согласуется с ранее опубликованными данными (Molchanova Т.Р. et al, 1996). Гомозиготнссть по 3,7 ко приводит к потере двух' активных а глобиновых генов и a/ß и-РНК соотношение в этих случаях - 1,15.' которое является -30% от такового для контрольной группы с четырьмя a -глобиновыми генами (aa/aa). Транскрипция оставшегося гибридного a2a1 гена продуцирует и-РНК сходную с a1 и-РНК, которая в 2,5-3 раза активнее при трансляции, чем нормальная a1 и-РНК (Liebhaber SA, Kan Y.W., 1982; Molchanova T.P., Huisman Т.Н.J., 1996). Таким образом, синтез а цепей при гомозиготности по 3,7 kb делеции будет примерно на том же уровне, что обнаружен нами среди гетерозигот по а-талассемии-1 с a/ß и-РНК соотношением -2,5 (Таблица 8).

13 из 40 пациентов с Hb Н заболеванием имели сочетание одной из четырех а-талассемии-1 делеций с одной из двух а-талассемии-2 делеции (4,2 kb или 3,7 kb) или одной из трех, неделеционных а-талассемии-2 детерминант. Наиболее интересны случаи с неделеционными а-талассемии-2 аллелями: 1). 5 nts дел^иия в области донор сплайсинг сайт IVS-I нарушает процесс сплайсинга этого интссна; ?}. Hb Constant Spring (Hb CS) JAA-»CAA мутация в кодоне 142, изменяющая терминирующий кодон, что приводит к отсутствию сигнала завершения трансляции;

3). ААТААА-*ААТААС5 мутация в поли(А) сигнале а2 глобинового гена повреждает сигнал полиаденилирования а2 и-РНК.

Результаты и-РНК анализа среди пациентов с НЬ Н заболеванием представлены в таблице 9 и нанесены индивидуально на рисунке 3. Больные с делеционным типом НЬ Н заболевания {-1-й) не имеют о2 и-РНК и их сс/р и-РНК соотношение равно ~1. Это значение одинаково для всех шести типов. Один оставшийся а-глобиновый ген транскрибируется, создавая одну четверть от уровня всей а и-РНК, присутствующей в норме. Его трансляция должна быть, более' эффективна у этих пациентов, так как они в состоянии сохранять 8-10 д/й! НЬ, содержащего а-глобиновые цепи. Данные для 13 пациентов с неделеционным

типом НЬ Н заболевания (-/схТа ) - различны. Согласно а2/а1 и-РНК данным

-5п1

пациенты с 5 п!э делецией в области донор сплайсинг сайта Г\7Э-1 (—1а а) имеют небольшое количество нормально сплайсированной а2 и-РНК в ретикулоцитах, также как и один пациент с гомозиготностъю по этой делеции. Повидимому делеция пентонуклеотида ТСАвб в области донор сайта Аб-ЮТСАСССТССС -> АО|ССТССС значительно снижает, но не ликвидирует полностью сплайсинг. Другая ситуация складывается, если мутация находится в терминирующем кодоне или поли(А) сигнале а2 гена. Охончание транскрипции и полиадениляция тесно связаны между собой и зависят от наличия функционирующего поли(А) сигнала и прилегающего к нему участка ДНК (Вай й.В. е1 а1, 1994). В а2-глобиновом гене обнаружено два поли(А) сигнала: первый расположен 88 Ьр 3' от терминирующего кодона и является основным сигналом для полиадениляции, которая происходит 15 тэ от него; второй, дополнительный сигнал, расположен 1048 Ьр 3' от терминирующего кодона (Л/НсЪе^оп А.М. апй Огк1п Э.Н., 1983) и считается не функционирующим, если главный сигнал не повреждён (МШе1а\л/ Е ап<3 Proudfoot N..1., 1986; Оугсгагек С.М. е1 а1, 1992). В наших исследованиях мы использовали метод предложенный Мо1сЪапоуа Т.Р. е! а! (1995), позволяющий визуализировать две различные а2 и-РНК. Обе обратно транскрибируются в 1ЧТ реакции с использованием олиго(сГТ)1б праймера. Присутствие ААТААА последовательности в одной из них, расположенной 88 Ьр 3' от терминирующего кодона, продемонстрировано путем сиквенса. Данные, представленные в Таблице 9, показывают при-

Рисунок 3

а2/а1 и а/(5 соотношения для пациентов с НЬ Н заболеванием (общее количество случаев 40). 1 -МЕ° "/ч*3"7; 2-МЕ01/^7; 3-МЕ°'/-а4'2; 4 Ча)20.5/-а3'7;

5-5Еу-7; 6-5ЕА/-а4-2; 7 -МЕ01/а5п1а; 8 -№0.5/а 5п1а; 9-МЕ°'/а^сс; 10 -(а)20.5/аРА-2а; 11-5ЕА/аС5а; Л2аРМа1аРМ* 13

a/ß И a2/a1 и-РНК соотношения у пациентов с а-талассемией.

Генотип

Случай a/ß и-РНК a2/a1 и-РНК

' # соотношение соотношение '

п=26 4.40±0.25 , 2.73±0.16

675 3.83 1.60

599 3.41 ' 1.30"

600 4.05 1.27

627 3.75 1.60

674 3.91 1.30

625 . 3.40 -1.50

8316 3.08 1.14

8191 3.29 - 1.30

8112 3.37 1.25

8114 4.13 1.54

1014 3.63 1.67

1012 3.51 1.52

' 463 2.93 2.06

469 '2.48 2.51

•468 2.53 2.73

467 2.70 Z95

459 2.61 2.83

1011 2.55 2.63

628 " 2.56 '2.79

630 2.51 2.80

631 2.59 2.98

632 2.58 2.72

619 1.05 0

" 661 1.13 0

8317 1.31 0

362 1.32 0.13

363 1.615 0.25

Норма

3.7, -а /аа

42, -а 1а а

aCSa/aa

sea, — /аа

—^/аа

3.7, 3.7 -а /-а

3.7, р -а /а а 4.2, cs -а Ja а

Значения М±а из Таблицы 1.

сугствие удлиненной а2 и-РНК; в ретикулоцитах как здоровых (Мо1сЪапоуа Т.Р. е1 а1, 1995), так и некоторых пациентов с неделеционной а-талассемией-2 в количестве -5% от общего содержания о2 и-РНК, а так же в значительных количествах у пациентов с мутацией в области главного поли(А) сигнала. Пациенты с НЬ СБ-НЬ Н заболеванием, также как гомозиготы по мутации в поли(А) сигнале, не способны

продуцировать нормальную сс2 и-РНК. Мутации в терминирующем кодоне ликвидируют нормальный сигнал к окончанию трансляции и ответственны за

Таблица 9

Относительные количества общей а2, удлиненной а2 и а1 и-РНК в ретикулоцитак пациентов с различными неделеционными а-талассемическими детерминантами.

Генотип а2(общая)/а1 а2(удлиненная)/о1 %

и-РНК и-РНК а2 (удлиненной) и-РНК

аа/аа3 2.69 ±0.15 0.128 ±0.042 4.7 ±1.2

РА-1 , РА-1 а а/а а 0.92 0.915 99.5

а а/аа 1.89 0.445 23.5

РА-2 , а а/аа 1.67 0.295 17.7

ИЬА. us - /а а 0.230 0.040 17.4

SEA, cs - la а 0.180 0.025 13Г9Г"

CS , Р а а/а а 1.410 0.085 6.0

3 Значения М±а заимствованы из статьи Molchanova et al, 1Э95.

использование следующего возможного ТАА триплета в качестве ситала к завершению трансляции, расположенного в пределах главного поли(А) сигнала. В результате чего а2 и-РНК нормальной длины разрушается рибосомами (Hunt D.M. et al, 1982) и небольшие количества удлиненной а2 и-РНК транслируются в удлиненную а цель, которая присутствует в эритроцитах гетерозигот в количествах менее 1%. В эритроидных клетках костного мозга Hb CS присутствует в значительно больших количествах; предполагается, что нестабильность и-РНК значительно возрастает в процессе созрезания эритроцитов (Wasi P. et al, 1980; Weatheral! D.J. and Ciegg J.B., 1981; Hunt'D.M. et al, 1S82; Deny S. et al, 1984). Данные, полученные для новорожденного с двумя различными мутациями в

/ CS", Р , ' ■ -

терминирующем кодоне (а а/а а) согласуются с этим предположением.

а2(общая)/а1 И-РНК соотношение в этом случае было 1,41, что объясняется присутствием в пуповинной крови большого количества нормобластов до 7% от

общего количества эритроцитов. Удлиненная а2 и-РНК обнаружена в количестве 510% (см. Таблицу 9). а2/а1 и-РНК соотношение у двух пациентов с Hb CS-Hb Н заболеванием - низкое и равно 0,2. Данное соотношение значительно выше при неделеционном Hb Н заболевании с мутацией в главном поли(А) сигнале или у гомозигот по поли(А) мутации (а27а1 и-РНК соотношение 0,65-1,1; причем 62 и-РНК исключительно удлиненного типа).

Низкое сс/р соотношение у 13 больных с -/аТа генотипом предполагает, что мутация в а2-глобиновом гене косвенно влияет на экспрессию нормального а1-глобинового гена, не допуская компенсаторного повышения его транскрипции^ а/р и-РНК соотношение (М=0,7) значительно ниже (Р<0,01) обнаруженного у пациентов с делеционной формой Hb Н заболевания {-i-а, М=1). Данное наблюдение согласуется с более тяжелым течением неделеционного типа Hb Н заболевания (ниже уровень Hb, выше содержание Hb Н,"ниже уровень Hb A¿¡.

Эритроциты новорожденных часто содержат следовое количество Q-глобиновых цепей, которое повышается при наличии дефицита а-глобиновых генов. Значительные количества были обнаружены у новорожденных и взрослых с SEA делецией (а-талассемия-1) и Chui D.H.hC et al (1986) предложил использовать этот феномен как маркёр данной делеции. Albitar М. et al (1989).и Tang W. et al (1992),. используя сходную с нами методику показали наличие следовых количеств 61, £ и е и-РНК в ретикулоцитах здоровых взрослых Мы получили аналогичные данные. Следовое количество С, и-РНК (0,5% от a+Q было обнаружено во всех случаях неделеционного Hb Н заболевания, кроме шесги гомозигот по неделеционной а-тапассемии-2. Наиболее высокий уровень наблюдался у трех пациентов с -SEA/-a3'7 |ШИ 4-2 генотипом Hb Н заболевания - 12,2%, и у трех пациентов с -(а)20.5/-а3'7 ог4'2 генотипом - 14,0% (Таблица 8). Умеренно повышенный уровень С, и-РНК был обнаружен у пациентов с генотипом -MEDI/-<i3'7 or4'2, который составлял 1,7%. Данные результаты позволяют предположить, что область между C¡2- и тобиновыми генами несет регуляторную функцию, подавляя или усиливая экспрессию £2-глобинового гена. Однако трансляция С, и-РНК имеет низкую эффективность в результате чего уровень С, глобина в эритроцитах невысок.

- Присутствие 3,7 или 4,2 кЬ делении на противоположной хромосоме может играть ведущую роль, в повышении уровня С, цепей, так ^2 ген с этой хромосомы вносит оснссну»э часть в повышение уровня С, и-РНК. Это предположение объясняет уровень С, и-РНК меньше 1% у пациентов с неделеционным НЬ Н заболеванием.

ВЫВОДЫ

1. Метод, разработанный на основе ЯТ-РСЯ, для измерения соотношений а/р и-РНК позволяет различать гетерозиготные состояния, образующиеся в результате наследования различных типов а--и р-талассемий. Данные метод может бьгп> существенным дополнением к существующим лабораторным методам диагностики гемоглобинопатии.

2. Выраженные различия обнаружены между соотношениями для контрольной группы, носителей а-тапассемии-2, а-талассемии-1 и пациентов с НЬ Н заболеванием, а также различия в а/р и-РНК соотношениях между делеционной и неделеционной формами НЬ Н заболевания (-/-а и —/аТа, соответственно).

3. а2 и-РНК у гомозигот по мутации в поли(А) сигнале (ААТААА-» ААТАА6) является удлиненной, у гетеро- и гомозигот по мутации в терминирующем кодоне удлиненная а2 и-РНК присутствует в небольших количествах (около 5%), как и в норме, а а2 и-РНК нормального размера значительно уменьшена.

4.0тносительный уровень С, и-РНК зависит от типа делеции. Область между (,2- и у^-глобиновыми генами несет регуляторную функцию в экспресии С,2 глоби-нового гена.

5. 01-глобиновый ген, выполняющий неизвестную роль, продуцирует информационную РНК в количествах одинаковых как для нормы, так и в случаях а-тапассемий. Уровень этой и-РНК значительно варьирует.

6. У гетерозигот по р-талассемии значение а/р и-РНК соотношения зависит от типа присутствующей мутации.

7.При "доминантном" типе р-тапассемии р^1 и-РНК достаточно стабильна и используется для синтеза аномальной цепи (удлиненной или укороченной). Эта цепь не способна соединяться с а цепью для образования стабильной молекулы НЬ и поэтому является очень нестабильной. Предположительно, она протеолизируется

в зритроидных предшественниках, приводя к накоплению избытка а цепей в количествах значительно превышающих таковые при классической р-талассемии. 8. Носители нестабильных аномальных НЬ имеют стабильную р и-РНК,

д

которая присутствует в ретикулоцитах в количествах равных с р и-РНК.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ Использование разработанного ИТ-РСК метода для определения а/р и-РНК соотношения позволит ускорить молекулярную диагностику различных форм тапассемии и их сочетаний.

Таблица 11

Относительные количества а.2, а1, (3 и £ и-РНК в ретикулоцитах пациентов с НЬ Н заболеванием и гомозигот с наделеционной а-талассемией-2.

Генотип.

Случай #

ыр

и-РНК

а2/а1 и-РНК

Сх100/(С+а) и-РНК

Норма

4<х) 20.5/-а

беа, 4.2

- 1-а 5еа. сг

— /а а

меп1, ра-2 — /а а

Ча) 20.5/а ^а Ча) 20.£/аРА"2а

п=26

4.40±0.25

2.73±0.1б

3218 1.01 0 022

8219 1.08 0 0

8238 0.99 0 0.59

8280 1.00 0 0.19

8232 1.15 0 1.69

8235 1.07- 0 2.16

8247 1.05 0 1.84

8255 1.05 0 1.81

8268 1.02 0 НА

8271 0.92 0 НА

8276 1.14 0 НА

8278 0.99 0 НА

8279 0.97 0 НА

Мипбу 0.98 0 5.07

721 1.04 0 8.60

8209 1.09 0 15.70

8226 1.01 0 10.47

8251 1.03 0 НА

8256 0.97 0 17.68

629 1.03 0 0

8231 1.01 0 1.12

1015 1.06 0 19.29

465 0.53 0.12 0.70

466 0.60 0.21 0.43

8228 0.73 0.06 0.29

8265 0.72 0.21 НА

8273 0.77 0.14 0.40

8274 0.66 0.04 НА

8281 0.55 0.10 НА

8229 0.76 0.31 НА

8275 0.82 1.08 0.65

8277 0.77 1.04 0.99

8220 0.59 0 0.24

8222 0.9 Э 1.09 0.44

8223 0.83 1.06 0.40

364 1.76 1.41 НА

8242 1.15 0.92 0

8304 1.15 0.76 0

8305 . 1.26 1.07 0

8306 1.09 0.67 0

8307 1.12 0.79 0

8315 0.814 0.14 0

МЕЮ1, 3.7 — /-а

5еа. 3.7 - -а.

ри. 3.7

-а

мал, -5л1 - 1а

сз , Р а а/а а

-м , -5Ы а а/а а

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

Hb гемоглобин

Hbs гемотобины

и-РНК информационная рибонуклеиновая кислота

RT обратная транскрипция

PCR полимеразная цепная реакция

ВЖХ высокочувствительная жидкостная хроматография

ДНК дезоксирибонукпеиновая кислота

CD кодон

CDs кодоны

IVS интрон

ßTh тапассемическая ß цепепь или ß и-РНК

д -

ß нормальная ß цепь или ß и-РНК

ß аномальная ß цепь или ß и-РНК nts нуклеотиды Ьр пара оснований

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ:

1. ABELS, J., MICHIELS, J.J., GIORDANO, P.C., BERNINI, LF.. BAYSAL, E„ SMETANINA, N.S., KAZANETZ, E.G., LEONOVA, J.YE, and HUISMAN, Т.Н.J.: A novel da novo deletion leading to an EvSP-thalassemia in a Dutch female. Abstract 463. Xlllth Meeting of the International Society of Haematology, European and African Division, Istanbul, Turkey, September 1995/ Turkish

' Journal of Haematology, 14 (Supplement 1), 1995.

2. SMETANINA, N.S., LEONOVA, J.YE., LEVY, N.. and HUISMAN, T.H.J.: Identification of several a-globin gene variations in a small Laotian family. ACTA HAEMATOLOGICA, 94: 144-147, 1995.

3. SMETANINA, N.S. and HUISMAN, T.H.J.: The diagnostic importance of measuring а2!аЛ- and аДЗ-mRNA ratios in reticulocytes of patients with a-and/or p-thalassemia. Abstract 2607. American Society of Hematology Meeting, Seattle, Washington, December 1995. BLOOD, 86 (Supplement 1): 655a,

1995.

4. MOLCHANOVA, T.P., SMETANINA, N.S., and HUISMAN, T.H.J.: A second, elongated, a2-globin mRNA is present in.reticulocytes from normal persons and subjects with terminating codon or poly A mutations. BIOCHEMICAL AND BIOPHYSICAL RESEARCH COMMUNICATIONS. 214:1184-1190, 1995.

5. SMETANINA, N.S., LEONOVA, J.YE., LEVY, N.,'and HUISMAN, T.H.J.: The а/р- and a2/a1-gIobin mRNA ratios in different forms of a-thalassemia. BIOCHIMICA ET BIOPHYSICA ACTA, 1315: 188-192, 1936.

6. LEONOVA, J.YE., KAZANETZ, EG., SMETANINA, N.S., ADEKILE, A.D.,' EFREMOV, G.D., and HUISMAN, T.H.J.: Variability in the fetal hemoglobin level of the normal cduit AMERICAN JOURNAL OF HEMATOLOGY, принята в печать.

7. ' SMETANINA, N.S. and HUISMAN, T.H.J.: mRNA analysis in reticulocytes of

subjects with Hb D, Hb Porto Alegre, Hb E, and different types of unstable hemoglobin variants. AMERICAN JOURNAL OF HEMATOLOGY, 52: 258-263,

1996.

8. RODRIGUEZ ROMERO, WE, CASTILLO, M„ CHAVES, MAl\ SAENZ, G.F., GU, L-H., WILSON, J.B., BAYSAL,.E., SMETANINA, N.S'., LEONOVA, J.YE, and HUISMAN, T.H.J.: Hb Costa Rica or a2p277(EF1)Hi^Arg; the first exam-pis cf a somatic cell mutation. HUMAN GENETICS, 97: 829-833, 1996

9. SMETANINA, N.S., ADEKILE, A.D., and HUISMAN, T.H J.: Globin mRNA in p-thalassaemia heterozygotes with different p-tha'assaemia alleles and in heterozygotes for hereditary persistence of foetal haemoglobin. ACTA HAEMATOLOGICA, принята в печать.

10. ABELS, J., MICHIELS, J.J., GIORDANO, P.C., BERNINI, L.F., BAYSAL, E., SMETANINA, N.S., KAZAN ETZ, EG., LEONOVA, J.YE., and HUISMAN, T.H.J.: A da novo deletion causing eySp-thalassaemia in a Dutch patient ACTA HAEMATOLOGICA, 96: 108-109, 19S6.

11. MILLER, D.R., SMETANINA; N.S., GU, L-H., LEONOVA, J.YE., and HUISMAN, Т.Н.J.: Hb Song or а2Рг14(А11)Leu->Arg in combination with an а thalassemia heterozygosity. HEMOGLOBIN, 20,131-134, 1996. .

X

1Z SMETANINA, N.S., ONER, C„ BAYSAL, E., ONER, R„ BOZKURT, G., ALTAY, g„ GÚRGEY, A., ADEKILE, A.D., GU, L-H., and HUISMAN, T.H.J.: The relative levels of а2-, a1-, and ^-mRNA in Hb H patients with different deletions! and nondeletional а-thalassemia detenninants. BIOCHIMICA ET BIOPHYSI-CA ACTA, принята в печать.

'13. NEGRI ARJONA, S., MALDONADO ELOY-GARCIA, J., GU, L-H., SMETANINA, N.S., and HUISMAN, T.H.J.: The dominant p-thalassemia in a Spanish family is due to a frameshift that introduces an extra CGG codon (=arginine) at the 5' end of the second exon. BRITISH JOURNAL OF HAEMATOLOGY, принята в печать.

14. HOPMEIER, P., KRUGLUGER, W„ GU, L-H., SMETANINA, N.S., and HUISMAN, T.H.J.: A newly discovered frameshift at codons 120-121 (+A) of the p gene is not associated with a dominant form of p-thalassemia. BLOOD, 87, 5393-5394,1996.

15. SMETANINA, N.S. and HUISMAN, .Т.Н.J.: Detection of a-thalassernia and .a globin gene triplication by PCR; a modified and improved technical change. AMERICAN JOURNAL OF HEMATOLOGY, принята в печать.

16. SMETANINA, N.S., GU, L-H., RODRIGUEZ ROMERO, W.E., HOWARD. E.F., and HUISMAN, Т.Н.J.: The relative levels of different types of p-mRNA and p-globin in BFU-E derived colonies from patients with p chain variants; further evidence for somatic mosaicism in the Hb Costa Rica carrier [p77(EF)His-*Arg]. HEMOGLOBIN, 20: 199-212, 1996.

17. OKEAGU, J.E., SMETANINA, N.S., and HUISMAN, T.H.J.: Detection of the a-thalassemia-2 (3.7 kb) deletion in DNA extracted from 20-ye^c-old blood smears. HEMOGLOBIN, принята в печать.

18. SMETANINA, N.S., GU, L-H., SIMJANOVSKA, L., MOMIROVSKA, A., PETKOV, G.H., ADEKILE, A.D., EFREMOV, G.D., HUISMAN T.H.J.: a-, p-, And y-mRNA levels in p-thalassemia; transcriptional and translstional differences in heterozygotes, homozygctes, and compound heterozygotes. HEMOGLOBIN, принята в печать.