Автореферат и диссертация по медицине (14.00.28) на тему:Действие изониазида, рифампицина и пиразинамида в культуре интактной и инфицированной микробактериями туберкулеза легочной ткани

РГ6 од

, . Министерство здравоохранения РФ

'Г Л —_

Московский научно-исследовательский институт туберкулёза Ю РФ

на правах рукописи

Шапатава Марина Николаевна

ДЕЙСТВИЕ ИЗОНИАЗИДА, РИФАШИЦИНА И ПИРАЗИНАЩДА ■ В КУЛЬТУРЕ ИНГ АКТ ЮЯ И ИНФИЦИРОВАННОЙ ШКОБАКТЕРИЯШ ТУБЕРКУЛЕЗА ЛЕГОЧНОЯ ТКАНИ

14.00.26 - фтизиатрия

14.00.16 - патологическая физиология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

М'СЧЕА - 1532

Работа выполнена в Московском научно-исследовательском институте туберкулёза Минздрава РФ

Научные руководители: доктор медицинских наук А-Д. Куничан

кандидат медицинских наук Г. Б. Соколова

Официальные оппоненты: профессор, доктор медицинских наук .А. Д. Бенцианов доктор медицинских наук 3. X Корнилова

Ведущая организация; Центральный научно-исследовательский

институт туберкулёза Российской Академии мед. наук

Защита состоится "22," " 1993г. в

часов

на заседании специализированного Ученого Совета при Ыэсковско) научно-исследовательском институте туберкулёза ЦЗ РФ (103030. Москва, ул. Достоевского, 4).

С диссертацией южно ознакомиться в библиотеке института.

Автореферат разослав »11» - 1993г.

Ученый секретарь Специализированного Совета, профессор, доктор медицинских наук, И. И Соловьева

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы.

Эффективность лечения туберкулеза зависит от ряда факторов, среди которых можно выделить основные: рациональный подбор АБП, создание оптимальных и безвредных их концентраций в очагах поражения и оптимальное время контакта лекарства с возбудителем СИ. М. Бондарев, 1973; А.Е. Рабухин , 1976; А. Г. Хоменко, 1980; J. H. Grosset, 1989; L. P. Ormerod. , 1991, К. Bartmann, 1991]. Существенное влияние'на эффективность лечения оказывает также природная чувствительность макроорганизма к инфекции СИ. И. Авербах и соавт., 1976, В. Л. Мзрозов и соавт., 1982]. До настоящего времени отсутствует четкое представление о взаимодействии всех этих факторов, особенно на уровне микроорганизма и его клеточного микроокружения. Естественен интерес к созданию микромодели туберкулёзного поражения в культуре ткани и изучению на ней действия основных противотуберкулёзных препаратов (ПГП).

Метод культуры ткани является одним из наиболее информативных методов изучения изменений, происходящих на клеточном уровне. Еп» в 20-х годах А. А. Шксимов, А. Д. Тимофеевский , пытались воспроизвести туберкулезные изменения в культуре ткани легких экспериментальных животных. Однако толкование наблюдавшихся ими феноменов было затруднительно в связи с низким техническим уровнем микроскопической техники того времени. Изучение действия отдельных ПГП на клеточные элементы культуры ткани из очага туберкулезного воспаления проводилось в Московском НИИ туберкулёза СА.Е Буров, 1981; А. Д. Куничан, 19743. Было, в частности, показано действие различных концентраций изониа-зида на клетки очага туберкулёзного воспаления собак, кроликов, человека. В работах Л. Б. Хейфица и соавт. С1974J в условиях моделирования взаимоотношений между микобактериями туберкулеза (НБТ) и пери-тонеальными макрофагами, изучалось действие различных противотуберкулезных препаратов. Crowl и соавт. С1989] на модели туберкулеза, включавшую зараженные микобактериями туберкулеза моноциты крови человека в культуре, изучал действие пираэияамида и других противоту-fçpKy.-i3HbiX препаратов. Однако эти модели нельзя считать достаточно адекватном»! д.-л изучения лекарственной интерференции на клеточном урсгне, нескольку легочные макрофаги по сзс:к Фут-гкхдсналгкым харак-ггр.^глкз:.! отличается or других СМ. П Грачева, 1383;]. йрсш того, азгс'Ы не изучали на свзих юд-ляз газк^гъссгъ наДлг-лзйкых

ими аффектов от степени резистентности к туберкулёзной инфекции.

Поэтому представляется актуальным^ с научной и с практической точек зрения изучение влияния основных антибактериальных препаратов на клеточном уровне на такой модели, которая, отражала бы с одной стороны взаимодействие микобактерий туберкулёза и легочной ткани при их первичном контакте, а с другой стороны - заключала бы в себе клеточные элементы легочной ткани как устойчивых, так и чувствительных к туберкулезу животных, а.также человека.

В результате многочисленных исследований было показано, что сочетание изониазида, рифампицяна и пиразинамида является наиболее эффективным при лечении больных туберкулёзом С А. Г. Хоменко, 1980; V. Fox, 1983; D. A. Michíson, 19923. Однако у части пациентов не удается достигнуть желаемого аффекта . Выявление причин этого и создание оптимальных режимов химиотерапии при обиры и при местном применении препаратов является актуальной проблемой.

Цедь работа Научное обоснование эффективности и безопасности использования основных ПГП на модели интактной и инфицированной ыи-кобактериями туберкулёза культуры легочной ткани.

Для достижения этой цели были поставлены следующее задачи:

1. Разработать модель культуры интактной легочной ткани разных видов животных и изучить на ней действия различных концентраций основных ИГЕ

2. Разработать и изучить модель первичной туберкулёзной инфекции в культуре легочной ткани разных видов животных, а также культуры инфицированной легочной ткани человека.

а Определить на данной модели влияния различных концентраций изониазида, рифампицина и пиразинамида при изолированном и комбинированном применении на жизнеспособность микобактерий туберкулеза.

Новизна исследования. Разработан и изучен модель культуры интактной легочной ткани разных видов лабораторных животных для изучения токсического действия лекарственных препаратов на клеточном уровне. Разработан и изучен модель первичной.туберкулёзной инфекции устойчивых и чувствительных к туберкулезу животных. Научное обосновано применения максимально эффективных и безвредных концентраций осйоаиых ШП при изолированном и комбинированном их использовании. Дгьа количественная характеристика зависимости бактерицидного эффекта от {актеров продолжительности воздействия препаратов и их концентрации на ииксСактеркальнуЕ популяция в культуре легочной ткани устойчййьа: и чуютягтвльних к туберкулагу животных, а такде поражен-

- Б -

ной туберкулезом легочной ткани человека. Установлен влияние ПГП на^, отдельные аспекты клеточных иммунных взаимодействий, в частности, на межклеточные контакты между лимфоцитами и макрофагами.

Практическая значимость работы. Разработана модель культуры легочной ткани разных видов лабораторных животных для изучения токсического действия препаратов. Определены пороговые концентрации изо-ниазида, рифампицина и пиразинамида, не вызыващие необратимые повреждения в клеточных элементах интактной легочной ткани разных видов животных и пораженной туберкулёзом легочной ткани человека. Разработана модель первичной туберкулёзной инфекции в культуре легочной ткани устойчивых и чувствительных к туберкулёзу животных, позволяющая с учетом действия лекарственных препаратов на клеточном уровне проводить рациональный поиск эффективных режимов химиотерапии.

Полученные данные о действии ПГП на микробную популяцию в культуре инфицированной легочной ткани свидетельствуют о принципиальной возможности выбора оптимальных соотношений концентрации препаратов и зремени их' воздействия в условиях разработанной модели первичной ту-5еркулезной инфекции легкого.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Разработана и изучена модель культуры интактной легочной гкани разных видов лабораторных животных, с помощью которой установ-гены пороговые концентрации иэониаэида, рифампицина и пиразинамида, ге .оказывающие токсического действия на клеточные элементы легкого.

2. Разработана и изучена модель первичной туберкулёзной инфек-щи легочной ткани устойчивых и чувствительных к туберкулёзу живот-

!ЫХ.

3. На модели первичной туберкулёзной инфекции культуры легочной ■кани устойчивых и чувствительных к туберкулёзу животных и поражен-юй туберкулезом легочной ткани человека установлены оптимальные со-;тношения концентрации препаратов и времени их воздействия как при [золироганном, так и при комбинированном их применени, дающие иакси-шшныя бактерицидный эффект.

Апробация работы. Материалы диссертации представлены и обсужде-:ы на: конференции посвяшрнной 70 летию МШИТ, 1988г., на всесоюзной :аучной конференции:" Актуальные проблемы лекарственной токсиколога ¿купавна, 19Э0), на кон£ененции и Экспериментальная и клиническая агмэк:л:гнл ГПП", 1992г. , на 2-ой научно-практической и каучнс-мето-к:н}еренцки "человек - обзэсгвс - природа" с участием

' - 6 -

телей науки стран СНГ и зарубежья, 1993г.

Внедрение в практику. Получена приоритетная справка на заявку на изобретение N5002388/14(066551). Модель первичной туберкулезной инфекции в культуре интактной легочной ткани и способ ускоренной оценки роста микроколоний МВТ внедрены в практику работы Московского научно-исследовательского института U3 РФ.

Положения диссертации используются при обучении студентов методам современной химиотерапии туберкулёза.

Публикации. ГСэ теме диссертации опубликовано 6 статьей.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, главы, характеризующей материалы и методы исследования, 5 глав собственных исследований, заключения и библиографического указателя. Текст изложен на 179 страницах машинописи, иллюстрирован 40 таблицами и 40- рисунками. Указатель литературы включает 180 источника, из них отечественных - 87.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материал и методы исследования. Исследование проведено на 22 мышах, 22 морских свинках, 21 беспородной собаке и на операционном материале - резектатах легкого 5 Сольных, оперированных по поводу фиброго-каверноэного туберкулёза, выделяющих микобактерий туберкулёза чувствительные к изониааиду, рифампицину и пиразин амиду. Изучено 1255 эксплантатов, которые были распределены на 6 групп.

В 1 группе (90 эксплантатов) изучались морфокинетические характеристики клеток интактного легкого мышей, морских свинок и собак. Во 2 группа (90 эксплантатов) оценивалось действие изониазида, ри-фампкцина и пирааинамида на культуру интактной легочной'ткани мышей, морских свинок и собак. 3 группа (120 эксплантатов) была использована для разработки модели первичной туберкулёзной инфекции легкого в культуре легочной ткани мышей, морских свинок и собак. В 4, 5 и б группах (955 эксплантатов) изучалось действие изониазида, рифампици-яа, пиразинаилда в двойной и тройной комбинациях на рост возбудителя я инфицированной микобактериями туберкулеза легочной ткани мышей, морских свинок и собак, а такжа в культуре ткани из очага туберкулезного ь:юсалениа в легюом человека.

Дм pt-achvji поставлекних задач были использованы метод культуры ткани, микробиологические и фармакологические методы. Культивирова-BUff а?гсчз;:й ткаки веля по методике эксплантации. Для наблюдения эз

клеточным составом, морфологией клеток, их поведением использовали/ визуальный контроль с помощью фаэовоконтрастной микроскопии, цейтраф-фернуп микрокиносъемку и микрофотосъемку. Воспроизведение модели первичной туберкулёзной инфекции легочной ткани проводили путем заражения культуры интактной легочной ткани животных микобактериями туберкулёза штамма Н37Яу по специальной технологии , включавший дозирование микробной массы, строго определенные процедуры замены питательной среды, специальный график контакта инокулята с культурой. В дальнейшем учитывали количество выросших микроколоний МЕТ, а также время их появления. В культуре легочной ткани животных микроколонии 1СЗТ подсчитывали отдельно в области выселения клеточных элементов и за ее пределами.

Для оценки действия препаратов на рост МВТ использовали минимальные, промежуточные и максимально переносимые клетками концентрации изониазида, рифампицина и пиразинамида, причем минимальные концентрации соответствовали примерно дозам препаратов, применяемым в клинике. Действие изониазида, рифампицина и пиразинамида изучали как в отдельности, так и при комплексном применении.

Продолжительность контакта с препаратами составляла 30, 60 и 120 мин. В каждой серии экспериментов по изучению действия препаратов на рост МВТ использовался внутренний контроль. Для сопоставления интенсивности роста микроорганизмов в различных сериях экспериментов оценивали абсолютное количество микроколоний и относительные значения, т.е. отношение числа микроколоний в опытных вариантах к их числу в контроле в каждой серии. С целью объективизации данных количественные показатели учитывали слепым методом. Количественные показатели подвергали математической обработке на персональном компьютере с использованием математической программы.

Результаты исследований. Проведеико изучение динамики вьселения и роста клеточных элементов а также их кинетических характеристик в культуре интактной легочной ткани разных видов животных. Показано, что у чувствительных к туберкулезу животных (мьси, морские свинки) отмечается выселение большого количества рано гибнущих лимфоидных клеток уже в первые сутки культивирования . Довольно рано, на 2 сутки культивирования начинался рост фибробластов, который отличался значительной интенсивностью. Макрофаги были немногочисленны. У устойчивы): к туберкулёзу животных (собаки) выселение и рост клеточных элементов нач!шал;!сь значительно псзжг (на 3-4 сутки култкзирсга-пил), причем рано гибнущие лзофидяые клетки почти отсутствовали, а

популяция макрофагов была значительной. Б морфологическом и кинетическом отношении лимфоидные клетки чувствительных и устойчивых животных не отличались. Скорость их движения была одинаковой и составляла в среднем около 28 мкм/мин. ' Существенным было различие в кинетике макрофагов. Так, если скорость движения макрофагов мышей и морских свинок достигала 14-16 мкм/мин, то скорость движения макрофагов собак была 3-4 раза меньше, достигая 4 мкм/мин. Значительные различия были отмечены в отношении контакта лимфоцитов с макрофагами и друг другом. В культуре легкой ткани чувствительных к туберкулезу животньрс поздно гибнущие лимфоциты практически не контактировали с макрофагами и между собой. Иная картина наблюдалась в культуре легочной ткани собак. Большая часть поздно гибнущих лимфоцитов находилась в длительном контакте с макрофагами и образовывала отдельные скопления в результате контакта между собой.

Высокая скорость движения макрофагов и отсутствие контакта между ними и лимфоцитами у чувствительных к туберкулёзу кроликов были раннее отмечены А. Е Буровым,С19813. Полученные нами данные еще у двух чувствительных к туберкулезу животных свидетельствуют о биологической универсальности этого явления. Тем самым разница между иммунными межклеточными взаимодействиями у чувствительных и устойчивых к туберкулезу животных может послужить одним из объяснений механизмов природной резистентности к инфекций.

Выявлены существенные различия видовой чувствительности клеточных элементов к изониазиду и рифампицину. Показано, что клетки легкого мышей отличаются наибольшей чувствительностью к изониазиду, нарушение двигательной активности клеток и морфологические признаки их' дегенерации появлялись уже при концентрации препарата 100 мкг/мл в течение одних суток воздействия. Повышение концентрации до 1000 мкг/ ид вызывало необротимые повреждения клеток в течение 6-12 часов воздействия. Несколько меньшая чувствительность к изониазиду проявлялась у клеточных элементов легкого юрских свинок. Здесь порог переносимости препарата достигал 1000 мкг/мл, однако при этом наблюдалось значительное замедление движения лимфоцитов и макрофагов. Характерным для Действия изониазида в концентрации до 100 мкг/ид било появление контактов между димфоидными клетками и макрофагами мкзей и морских свинок. Наименшая чувствительность к изониа-аеду прокииась у клеточных элементов легкого собаки и человека. Лэ-гс>чньй клетки собак переносили концентрацию 10000 мкг/мл без ыо^с .г: гибких приакакс-в деградации, отмечалось лишь значительное

замедление движения клеток.

В отношении рифампицина наименьшая чувствительность определялась у клеток легочной ткани мышей. Их повреждение наступало лишь при концентрации ZOO мкг/мл в течение 6 час воздействия. Наибольшую чувствительность к этому препарату проявили клеточные элементы морских свинок. Предельно переносимая концентрация для них была 25 мкг/мл, однако и при этой концентрации уже происходило нарушение кинетики клеток. Повышение концентрации до 50 мкг/мл вызывало гибель клеточных элементов в течение 1 часа контакта . Следует отметить, что все клеточные элементы легкого, в том числе и лимфоциты, у мышей и морских свинок были одинаково чувствительны к рифампицину и при его токсических концентрациях погибали одновременно. Клеточные элементы легкого собаки и человека по чувствительности к рифампицину занимали промежуточное положение между клетками легкого мышей и морских свинок. Максимально переносимая концентрация препарата составляла 50 мкг/мл. Характерной была избирательно повышенная чувствительность к рифампицину у Лимфоцитов легкого собаки и человека. Нарушение их кинетики и гибель наступали на фоне сохранения жизнеспособности других клеточных элементов. Пэ нашему мнению этот факт в определенной мере обменяет как возникающую при применении рифампицина лимфопению, так и его иммуннодепресантное действие.

В отношении пираэинамида видовых различий в чувствительности клеточных элементов отмечено не было. Препарат обладал невысокой токсичностью для клеток. Она проявлялась лишь при концентрации 10000 мкг/мл.

Разработана модель первичной туберкулёзной инфекции легочной ткани, включавшая в себя клеточные элементы легкого и МЕГ. У разных видов животных был отмечен ряд характерных особенностей роста МЕТ в зависимости от степени природной резистентности к инфекции. У чувствительных к туберкулёзу животных (мыши, морские свинки) первые ыик-роколонии МВТ появлялись через 4-6 суток после инфицирования, тогда как в культуре легочной ткани собак они обнаруживались через 8-9 суток. Ц?и примерно одинаковой плотности популяции инокулята число микроколоний на пике роста в культуре легочной ткани чувствительных к туберкулёзу животных почти в 5 раз больше, чем в культуре ткани устойчивых к туберкулезу животных.

При изучении действия как отдельных противотуберкулезных препаратов, так и их комбинаций ка рост ЮТ в культуре легочной ткаяк не было выявлено видовых различий в отношении бактерицидной акгизнсстя

туберкулостатиков. Динамика этой активности судя по относительным показателям была статистически не различимой в культуре легочной ткани мышей, морских свинок, собак и в якани из очага туберкулезного воспаления легкого человека. В связи с'этим представлены данные по культуре инфицированной легочной ткани мышей, содействие изониазида на рост микроколоний ЦБТ в культуре легочной ткани мышей представлено в таблицах 1 и 2. При минимальной концентрации препарата в течение первых 30 мин воздействия происходило незначительное уменьшение микробной популяции, однако с увеличением времени контакта до 60 и особенно 120 мин наблюдается резкое уменьшение числа микроколоний. Это свидетельствует о выраженной зависимости действия изониазида от продолжительности контакта с возбудителем. Увеличение концентрации препарата привело к выраженному уменьшению популяции микобактерий уже в первые 30 мин контакта. Этот эффект оказался примерно равным бактерицидному эффекту минимальной концентрации изониазида после 120-минутного воздействия. При концентрации 100 мкг/мл также эаметна выраженная зависимость бактерицидного эффекта от продолжительности контакта. Через 60 мин популяция микобактерий уменьшилась вдвое, а через 120 мин наступил стерилизующий эффект. Концентрация изониазида 1000 мкг/мл была полностью бактерицидной при всех экспозициях. Следует отметить , что активность препарата была одинаково выражена как в пределах клеточного массива, так и за его пределами.

Действие рифампицина представлено в таблицах 3 и 4. Из таблиц видно, что через 30 мин произошло значительное уменьшение микробной популяции при минимальной концентрации препарата - примерно в 7 раз. При увеличении времени воздействия препарата до 120 мин его бактерицидная активность практически не менялась (различия статистически недостоверны, Р>0,1). Увеличение концентрации препарата до 50 и даже до 100 мкг/мл лишь в слабой степени влияло на его бактерицидную активность. Здесь также следует отметить одинаковое действие рифампицина на рост микроколоний UET в пределах клеточного массива и вне его. Таким образом, основной бактерицидный эффект рифампицина проявляется в первые 30 мин воздействия и в дальнейшем мало зависит от концентрации и продолжительности действия препарата.

ДйЛгтвие пиразанамида на рост микроколоний в культуре легочной чгкакя яемонстмру»тся в таСлкцах Б и 6. При минимальной концентрации препарата бактерицидный эффект практически не заметен и по мере уве-хнчгккз ь;гЫ'?кг. вездейетвкя намечается лишь тенденция к уменьвению

- и -

Таблица 1

Рост микроколония ДОГ 8 культуре легочной ткани мышей в зависимости от концентрации иэониаэвда и времени его воздействия в абсолютных показателях

Время контакта (мин Концентрация изониазида, ыкг/ид

15 | 100 | 1000 | контроль

вну |вне | вну | вне | вну | вне | вну | вне

30 343+ 16" 441+ 18" 60+ 6" 111+ 5 - - 62Б+ 36" 710+ 39"

во 127+ 14" 162+ 20" 33+ 3" 92+ 4" - - _Н_ .11.

120 81+ в" 140+ 19" - " 1 " 1 -

Примечание. Здесь и в табл. 2-10 вну - в пределах зоны выселения и роста клеточных элементов, вне - за пределами зоны выселения и роста клеточных элементов

Таблица 2

Рост микрокодоний НЕТ в культуре легочной ткани мышей в зависимости от концентрации изониазида и времени его воздействия в относительных показателях (опыт/контроль)

Время контакта МИН Концентрация изониазида, мкг/мл

15 100 1000

вну вне 1 вну | вне 1 вну 1 вне

30 0,69+ 0,06" 0,68+ 0,09" ¿о Т-1 О оо 0,17+ о,сиг - -

ВО 0,24+ 0,03" 0,23+ 0,04" 0,06+ 0,007 оо 1 ПН - -

120 0,15+ 0,01" 0,21+ 0,01" - - - -

Таблица 3

Рост микроколоний МЕТ в культуре легочной ткани мышей в зависимости от концентрации рифампицина и времени его воздействия в абсолютных показателях

Время контакта мин Концентрация рифампицина, мкг/мл

16 50 100 контроль

вну вне вну вне вну вне вну вне

30 68+ 3~ 95+ 3~ 45+ 2~ 76+ 5" 37+ 1" 50+ 2~ 476+ 16" 656+ 32"

ВО 64+ 3~ 85+ 3~ 35+ 2~ Б1+ 3" 29+ 2~ 57+ 2~

120 46+ 2~ 66+ 2~ 34+ 2~ 59+ 1" 22+ 1" 29+ 2~

Таблица 4

Рост микроколоний МЕТ в культуре легочной ткани мышей в зависимости от концентрации рифампицина и времени его воздействия в, относительных показателях (опыт/контроль)

Время контакта мин Концентрация рифампицина, мкг/мл

15 50 100

вну вне вну вне вну вне

30 0,14+ 0,04" ■ 0,14+ 0,00? 0,09+ 0,005 0,11+ 0,005 0,07+ 0,003 0,08+ 0,007

ВО 0,12+ 0,002Г 0,13+ 0,00? 0,06+ 0,003 0,07+ 0,003 0,05+ 0,005 0,08+ 0,003

120 0,09+ 0,001 0,1+ 0,005 0,07+ 0,005 0,08+ 0,005 0,04+ О.ООГ 0,04+ 0,00?

Таблица 5

Рост микрбколоний ШУТ в культуре легочной ткани мышей в зависимости от концентрации пиразинамида и времени его воздействия в абсолютных показателях

Время контакта мин Концентрация пиразинамида, мкг/ид

25 100 1000 контроль

вну вне вну вне вну вне вну вне

30 516+ 8" 615+ 13" 307+ 13" 598+ 14" 178+ 12" 419+ 15" 542+ 14" 664+ 16"

60 492+ 12" 611+ 10" 266+ 10" 566+ 11" 90+ 5" 345+ 23" _ г? _

120 398+ 12" 699+ 20" 227+ 9" 535+ 16" 61+ 4" 273+ 20" _ !t_ _ t» _

Таблица в

Рост микроколоний МВТ в культуре легочной ткани мышей в зависимости от концентрации пиразинамида и времени его воздействия а относительных показателях (опыт/контроль)

Время | контакта| МИН | _Концентрация пиразинамида, мкг/ид

25 | 100 1000

вну | вне | вну | вне | вну | вне

30 | 0,93+ | 0,92+ | 0.01 1 0,02 | 0,56+ 0,02 1 0,88+ | 1 0,02 | 0,33+ | 0,02 | 0,62+ 0,02~

60 | 0,92+ | 0,91+ | 0,02 | 0,02 | 0,49+ 0,02 1 0,84+ | 1 0,О2~ | 0,16+ | 0,009 | 0,51+ с,оз"

120 | 0,73+ | 0,89+ | 0,02 I 0,03 I 0,41+ 0,С2 1 0,81+ 1 1 0,02 | 0,11+ | 0,01 | 0,41+ 0,03

-1в-

ТаОлица 7

Рост микроколоний УБТ в культуре легочной ткани мышей в зависимости от концентрации И+Р и времени их воздействия в абсолютных показателях

Бремя контакта мин Концентрация И+Р, мкг/мл

1БИ+1БР 100И+100Р 1000И+100Р контроль

вну вне вну вне вну вне вну вне

30 64+ 3~ 99+ 8" Б+ 2~ 1Б+ 3" - - 368+ 17" 669+ 14"

60 35+ 4~ 73+ 3" 2+ 2" 4+ - -

120 19+ 2" 48+ 3" - - - - _ »1 _

Таблица 8

Рост микроколоний МВТ в культуре легочной ткани мышей в зависимости от концентрации И+Р и времени их воздействия в относительных показателях (опыт/контроль)

Время контакта мин Концентрация И+Р, мкг/мл

1БИ+1БР 100И+50Р 1000И+100Р

вну вне вну вне вну вне .

30 0,17+ 0,00? 0.1Б+ 0,01" 0,03+ 0,001 0,02+ 0,007 - -

00 0,09+ 0,01" 0,1 + 0,007 0,01+ 0|005 0,003+ 0,001" - -

1Е0 0,06+ 0,005 0,07+ 0,005 - -

Таблица 9

Рост микроколоний МВТ в культуре легочной ткани мышей в зависимости от концентрации И+Р+П и времени их воздействия в абсолютных показателях

Время контакта мин Концентрация И+Р+П, мкг/мл

15+15+26 100+50+100 1000+100+1ООО| контроль

вну вне вну вне вну вне вну вне

30 54+ 3" 96+ 8" - - - - 328+ 38" 535+ 67"

60 17+ 2" 36+ 3" - - - - -»»- _ м _

120 9+ 1" 11+ 2" - - - -

Таблица 10

Рост микроколоний ЫБТ в культуре легочной ткани мышей в зависимости от концентрации И+Р+П и времени их воздействия в относительных показателях (опыт/контроль)

Время контакта мин Концентрация И+Р+П, мкг/мл

15+15+25 100+50+100 1000+100+1000

вну вне вну вне вну вне

30 0,16+ 0,02" 0,18+ 0,02" - - - -

60 оо оо - - - -

120 0,02+ 0,04" 0,03+ 0,001 - - - -

микробной.популяции. При промежуточной концентрации 100 мкг/мл заметно нарастание бактерицидного эффекта, причем только в пределах клеточного массива, где популяция МВТ уменьшилась примерно на 50£. Этот эффект практически не эависил от продолжительности контакта. Увеличение концентрации пираэинамида до 1000 мкг/мл привело к ещэ большему уменьшению микробной популяции, в основном, в клеточном среде. Таким образом, пираэинамид отличался невысокой бактерицидной активностью, которая проявлялась, главным образом, в клеточной среде и мало зависила от продолжительности его действия. Полученная информация свидетельствует о нецелесообразности монотерапии пиразинами-дом.

Действие комбинации изониаэид+рифампицин на рост микроколоний МВТ представлено в таблицах 7 и 8. В действии этого сочетания отразились свойства каждого из препаратов. Действие рифампицина проявилось в быстром и значительном уменьшении микробной популяции через 30 мин контакта, а действие изониазида - в значительном усилении бактерицидного аффекта при увеличении его концентрации и продолжительности контакта. Суммарный эффект двойной комбинации превышал эффект одного изониазида примерно в 3 раза, а одного рифампицина примерно в 2 раза.

Эффект от добавления пираэинамида к двойной комбинации представлен в таблицах 9 и 10. Рост микроколоний микобактерий туберкулёза сохранялся только при минимальных концентрациях препаратов, причем суммарная активность 3 препаратов при минимальных концентрациях по сравнению суммарной активностью 2 препаратов в таких же концентрациях была примерно в 2,5 раза выше.

Таким образом, полученные результаты могут служить теоретическим и экспериментальным обоснованием для разработки эффективных и безопасных схем и режимов лечения туберкулеза в эксперименте и клинике, в частности при проведении местной терапии. Использование модели культуры ткани разных видов лабораторных животных и разработка подобных моделей для других внутренних органов может быть использована в токсикологии для изучения токсического действия лекарственных препаратов на клеточном уровне, а также для выбора наиболее чувствительных к препарату животных,

выюды

1. Разработана модель культуры ткани интактного легкого разных

видов животных, позволяющая проводить изучение действия лекарственных препаратов на. легочную ткань на клеточном уровне.

2. Разработана модель первичной туберкулёзной инфекции в культуре легочной ткани разных видов животных с целью изучения на ней действия различных противотуберкулёзных препаратов и их сочетаний.

3. Клеточные элементы культуры интактной легочной ткани разных видов животных и человека обладают разной чувствительностью к противотуберкулёзным препаратам: наиболее высока чувствительность к изо-нцазиду у клеточных элементов легочной ткани мышей (ЫПК - 100 мкг/мл), к рифампицину - у морских свинок (ЫПК - 25 мкг/мл). Самая низкая чувствительность к изониазиду определена у собак (ЫПК - 10000 мкг/мл), к рифампицину - у мышей (ЫПК - 100 мкг/мл). Чувствительность клеточных элементов очага туберкулёзного воспаления в легком человека к изониазиду и рифампицину близка к таковой у собак. Клеточные элементы легкого животных и человека обладают одинаково низкой чувствительностью.к пиразинамиду (ЫПК - 1000 мкг/мл). Среди клеточных элементов легочной ткани собак и человека наибольшей чувствительностью к рифампицину обладают лимфоциты.

4. Рост ЫБТ наиболее интенсивен в культуре легочной ткани чувствительных к туберкулёзу животных (мыши, морские свинки), наименее -в культуре легочной ткани устойчивых к туберкулёзу животных (собак).

5. Бактерицидная активность изониазида находится в прямой зависимости от его концентрации в пределах от 15 до 1000 мкг/мл и времени воздействия - от 30 до 120 мин. Максимальная активность изониазида проявляется через 120 мин воздействия препарата на ЫБТ.

Бактерицидная активность рифампицина слабо зависит от его концентрации в пределах от 15 до 100 мкг/мл и продолжительности действия - от 30 до 120 мин. Бактерицидный эффект рифампицина проявляется, в основном, в первые 30 мин воздействия.

Пиразинамид в концентрациях от 25 до 1000 мкг/мл обладает низкой бактерицидной активностью. Она проявляется, главным оСразоы, в клеточной среде и находится в слабой зависимости от продолжительности действия препарата (от 30 до 120 мин).

6. Сочетание И+Р в 3,4 раза активнее одного изониазида и в 1,7 раза активнее одного рифампицина. Добавление к комплексу И«-Р пираэи-намида увеличивает его антибактериальную активность в культуре инфицированной легочной ткани кода в 2 раза, морской свинки в 2,5 paja, собаки в 2 раза, в культуре очага туберкулезного всоналеиия легкого •^ловекз я 3,3 раза.

Практические рекомендации

1. Модель культуры легочной ткани предлагается использовать:

- для изучения повреждающего действия лекарственных препаратов на клетки легкого, особенно при применении местной терапии;

- для выбора видов животных при проведении токсикологических исследований.

2. При лечении туберкулёза рифампицином рекомендуются учитывать данные о том, что:

- максимальное действие этого препарата проявляется в первые 30 мин контакта с возбудителем;

- увеличение концентрации рифампицина выше достигаемых при средних терапевтических дозах не приводит к увеличению его бактерицидного эффекта.

3. Не рекомендуется применять пиразинамид отдельно, например, для химиопрофилактики, ввиду его слабой бактерицидной активности.

4. Предлагается модель первичной туберкулёзной инфекции легкого в культуре ткани для изучения действия противотуберкулёзных препаратов на микобактерии туберкулёза в условиях клеточного микроокружения их органа-мишени.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ГО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Иэрфокинетические особенности клетрчных элементов легочной ткани чувствительных к туберкулёзу животных // В кн.: Современные проблемы фтиэиопульмонологии. - Ы, 1990. - С. 63-64 /в соавторстве с Куничаном А. Д. /

2. Порог токсического действия изониазида и рифампицина на клеточную ткань в культуре //В кн.: Актуальные проблемы лекарственной токсикологии. - Купавна. - 1990. - N2. - С. 57-58 /в соавторстве с Куничаном А. Д. /

3. Тизамид в комплексной терапии туберкулеза // Пробл. тубер- -кулёза. - 1990. - N7. - с. 43-46/ в соавторстве с Онищенко В. Е , Соколовой Г. Б. , Корякимым а А. /

4. Действие иэокиаэида и рифампицина на клеточные элементы культуры интактной хегсчной ткани эксп~р;:ментальк12: животных

//Пробл. туберкулеза. - 1991. - N2. - С. 9-12/ в соавторстве с Куни-чаном А. Д., Соколовой Г. Б. /

Б. Действие,иэониазида на микобактерии туберкулёза в культуре легочной ткани мышей// В кн.: Экспериментальная и клиническая фармакология противотуберкулёзных препататов. - М. 1992. - С. 57-64 / в соавторстве с Куничаном А. Д. /

6. Действие основных противотуберкулёзных препаратов и их комбинаций на модель первичной туберкулёзной инфекции а культуре легочной ткани мыши// В кн.: Человек - обшрство - наука. - Ы. 1993. -с. 65-67.