Автореферат и диссертация по медицине (14.00.36) на тему:Действие бруцелл (убитых) на активность факторов неспецифической резистентности и формирование специфического иммунитета к гетероантигенам

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН

Научно-исследовательский институт эпидемиологии, микробиологии и инфекционных болезней

На правах рукописи

МУРЗАТАЕВА Риза Тулегеновна

УДК 579.841.93:612.017.1

ДЕЙСТВИЕ БРУЦЕЛЛ (УБИТЫХ) НА АКТИВНОСТЬ ФАКТОРОВ НЕСПЕЦИФИЧЕСКОЙ РЕЗИСТЕНТНОСТИ И ФОРМИРОВАНИЕ СПЕЦИФИЧЕСКОГО ИММУНИТЕТА К ГЕТЕРОАНТИГЕНАМ

14.00.36 — аллергология и иммунология 03.00.06 — вирусология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Алма-Ата — 1992

Работа выполнена в НИИ эпидемиологии, микробиологии и инфекционных болезней Минздрава Республики Казахстан

Научные руководители: доктор медицинских наук

АСПЕТОВ Р. Д. доктор медицинских наук АМИРЕЕВ С. А.

Официальные оппоненты: кандидат медицинских наук

ШОРТАНБАЕВ А. А. доктор медицинских наук УКБЛЕВА Т. Д.

Ведущее учреждение: институт региональных проблем

питания АН Республики Казахстан

Защита состоится « ». ^_1992 г.

о ^V час. на заседании специализированного совета

(К 079.05.01) при НИИ эпидемиологии, микробиологии и инфекционных болезней Минздрава Республики Казахстан (480002, Алма-Ата, ул. М. Макатаева, 34)..

Автореферат разослан

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке НИИ эпидемиологии, микробиологии и инфекционных болезней Минздрава Республики Казахстан.

Ученый секретарь специализированного совета канд. мед. наук

Н. М. НУРКИНА

.-,.■•< т 1 0ТГЛ I

"." - I - I дпсо -;-таааЯ]

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Успехи иммунологии последних лет показывают, что многие заболевания, в том числе и неинфекци-онныо, развиваются в условиях дефицита иммунной системы организма. В настоящее время практическая медицина располагает рядом препаратов, оказывающих иммуномодулирующее действие; Однако применение большинства из них не позволяет достигать желаемого результата, а другие еще остаются малодоступными для широкого применения или обнаруживают экономическую нерентабельность. Поэтому необходим поиск новых высокоэффективных нетоксичных общедоступных препаратов, оказывающих модулирую-щео действие на иммунную систему организма.

Обращает на себя внимание иммунокоррегируклцие свойства ряда бактериальных препаратов как БЦК, коринобактерий, коклюшной вакцины ( В.М. Бергольц с соавт., 1978; В.Н.Манин с соавт., 1982; Н.С.Кислшс с соавт., 1982 ), что позволило использовать их для лечения онкологических и вирусных заболеваний. В то не время следует отметить, что некоторые вакцины, например как БЦЖ, представлены живыми микробами, при введении её в организм с ослабленной иммунной реакцией монот развиться генерализованная форма инфекции. Другио, как коринебактерии, пока не значатся в Каталоге микробов ношей страны или на обнаруживают достаточную иммуномодулирующую активность. Сказанное указывает на необходимость поиска высокоэффективных иммуномодулято-ров среди коммерческих бактериальных вакцин.

Недавно было показано, что аптечный препарат бруцеллезной лечебной вакцины ( БЛВ ), применяющий в качестве иммуноге-на для лечения больных бруцеллезом, обладает противовирусным ( Н.В.Пак, 1989 ) и противоопухолевым ( К.С.Досхожаев, 1989 )

деИствиом. Ужо покапано, что этот препарат повышает литичес-кую активность естественных киллерных клеток, стимулирует интерфоронпродуцирующую активность лимфоцитов, увеличивает количество Т- и В-лимфоцитов в периферической крови. Действие БЛВ на другио факторы иммунитета, в том числе и специфи-чоскио к гетероантигонаы, остается не изученным.

Цель и задачи исследования. Целью работы является изучение имыуноыодулирующих свойств коммерческого препарата бру-целезной лочебной вакцины и возможности его использования по новому назначению - для стимуляции иммунного ответа организма детой, больных лимфобластным лейкозом.

Для достижения указанной цели надлежало решить следующие задачи:

- изучить в эксперименте действие БЛВ на неспецифические факторы иммунитета ( активность интерферона, комплемента, лизс циыа и фагоцитарную активность лейкоцитов );

- изучить в эксперименте действие БЛВ на формирование специфического гуморального иммунитета к антигенам бараньих эритроцитов;

- исследовать в эксперименте действие БЛВ на формирование клоточно-опосродованного иммунитета к антигенам микробов и поровпваемых клеток;

- изучить иммуномодулирующее и терапевтическое действие БЛВ у дотей, больных острым лимфобластным лейкозом.

Научная новизна. Установлено, что аптечный препарат БЛВ индуцирует продукцию высокоактивного эндогенного ¿С -интерферона, повышает активность комплемента и лизоцима в сыворотке- крови и фагоцитарную активность лейкоцитов.

Показано, что БЛВ стимулирует формирование специфичес-

кого гуморального и клеточного иммунитета к антигенам про- и эукариотических гаю ток.

Впервые получены, данные об иммуностимулирующем и терапевтическом эффекте БЛВ у детей, больных острым липфобластным лейкозом.

Практическая ценность. Полученные новно данные об иммуно-модулирующем действии общедоступного, экономически рентабельного коммерческого препарата БЛВ могут служить экспериментальным обоснованием для применения этого пропара та по новому назначению - для модуляции иммуного ответа при различных иммунодефи-цитных состояниях организма.

Разработан новый способ лечения лимфоблзстного лейкоза, приоритетность которого подтверждена Решением Государственной научно-технической экспертизы изобретений от 15.02.1989 года о выдаче авторского свидетельства "Способ лечения детей, больных лимфобластным лейкозом", й 1486513. Методика применения БЛВ внедрена в клиническую практику 2-ой городской детской больницы гор. Алма-Аты.

В ходе выполнения диссертационной работы получ^ы 2 удостоверения на рационализаторские предложения.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. БЛВ повышает активность неспецифических факторов иммунитета: комплемента, лизоцима и фагоцитов, индуцирует выработку эндогенного интерферона.

2. БЛВ стимулирует процесс формирования специфического гуморального иммунитета к бараньим эритроцитам и клеточно-опосредованного иммунитета к антигенам про- и эукариотов.

3. БЛВ резко повышает неспецифическую резистентность организма к микробам и вирусвы у детей, больных острым ливфо-

бластным лейкозом.

4. Применение БЛВ для лечения детей, больных лимфобласт-ным лейкозом, повышает эффективность комплексной терапии, сокращая сроки лечения на 12 £ 4,8 дней.

Апробация роботы. Материалы диссертации доложены на I Республиканокон съезде иммунологов и аллергологов ( г.Самарканд, май, 1991 ), на У объединенном съезде гигиенистоь, эпиде миологов, микробиологов, паразитологов и инфекционистов Казахстана ( г.Алма-Ата, сентябрь, 1991 ),

Диссертация апробирована на совместном заседании обществ аллоргологов-иммунологов и вирусологов ( г.Алма-Ата, июнь, 1992 ).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 7 работ, 3 сданы в печать.

Личный вклад автора. Все основные разделы представленной роботы выполнены автором лично. Определение кинетики продукции эндогенного интерферона выполнены совместно с м.н.с. лаборатории противовирусных препаратов, к.б.н. Пак Н.В., изучение терапевтической эффективности БЛВ при лечении детей, больных лимфобластным лейкозом проводили совместно с врачами-клиницистами гематологического отделения 2-ой детской городской больницы гор. Алма-Аты ( зав.отделением Горячева Л.Г. ).

Объем и структура диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, четырех глав собственных исследований, обсуждения полученных результатов, выводов и списка использованной литературы, включающего работ отечественных и зарубежных исследователей. Текст диссертации изложен на страницах машинописного текста, включая 8 рисунков и 13 таблиц ( общий объем страниц ).

СОДЕШНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы

Адъюванты. Бактериальными адъювантами служили м\ на к тиви— рованные ИТЭШШ бруцелл - Br.nolitensir, 16 М, Br.abortus 5И, вакцинный штамм BA-I9, Br.suiri 1330, а также коммерческий препарат бруцеллезной лечебной вакцины Тблисского НИИ вакцин и сывороток. Кроме того, использовали вакцину БЦК производства Ташкентского НИВС ГПО "Узмедбиохимпром".

Культуры бруцелл выращивали на 2% мясопептонном глюкозо-глицериновом агаре в 1,5 литровых матрацах в течение 2-х суток. Смыв производили физиологическим раствором и определяли

g

концентрацию микробных клеток. Суспензию ( 1-2 х 10 микробных клеток - м.к. ) инактивировали при температуре 85° в течение 3% минут, после чего проводили контроль на стерильность.

Микробные аллергены. В работе использовали эталонные штаммы микробов Haenofilun influenzae t ЛЮббЗНО ПреДСТЭВ-ленный старшим научным сотрудником лаборатории инфекционной аллергологии, д.м.н. Добрица В.П. и штамм st-^hiioooocus аигеиз , полученный из коллекции музея живых культур НИИЭМИБ Минздрава Республики Казахстан.

Для постановки кожных проб были использованы растворимые аллергены Н. influenzae , полученные ультразвуковой интеграцией микробной взвеси, содержащей 5 мкг м.к. в I мл, а также коммерческий аллерген гемолитического стафилококка Казанского НИИ эпидемиологии и микробиологии Минздрава РСФСР.

Вирусы. Использовали вирус энцефаломиокардита мышей, полученный из музея вирусных штаммов Института вирусологии им. Ивановского АМН СССР.

Перевиваемые линии клеток. Использовали клетки ь ( клоновый вариант тканевой культуры о-96, полученный из костного мозга больного лейкозом ) и ь 929 ( Фибробласты мыши ). Эти линии были получены из коллекции клеточных культур Института вирусологии им. Ивановского АМН СССР.

Питательные среды. Для культивирования клеток использовали отечественную среду 199 производства Свердловского НИИ вакцин и сывороток Минздрава Российской Федерации, а также ап розу, производства США.

Животные. В работе использовали взрослых беспо родных морских свинок, массой 300-350 граммов ( 174 голов ) и белых мышей, весом 16-18 граммов*( 184 голов ).

Реагенты. Для постановки реакций использовали гемолитическую сыворотку ( титр 1:3000 ) производства Пермско го НИИ вакцин и сывороток Минздрава Российской Федерации.

Использовали комплемент производства Томского НИИ вакци и сывороток Минздрава Российской Федерации.

Эритроциты получали от интактных баранов, содержали их в консерванте Олсвера. Перед употреблением эритроциты трижды отмывали физиологическим раствором от консерванта и плазмы центрифугированием при 1500 об/мин 10 минут.

Использовали фиксированные эритроциты барана и мыши, производства НИИЭМИБ Минздрава Республики Казахстан.

Определение антителообразующих клеток ( АОК ) проводили по мотоду Ерне.

Постановку НСТ-теста проводили с использованием нейтрал ного синого тетразолия ( С.М.Гордиенко с соавт., 1986 ) с некоторыми модификациями ( рацпредложение N2 441, 1990 ).

Определение активности сывороточного лизоцима по отношению к Micrococcus lyaodocticua ( О.В.Бухарин с соавт., 1974 ) изучали двумя способами: путем определения зоны лизиса в агаре, а также титрованием сывороток в жидкой среда.

Определение активности сывороточного комплемента проводили по методу, описанному В.Н.Андреевым, 1975.

Титрование интерферона. Интерферон титровали в клеточных культурах, выращенных в 96-луночных пластиковых панелях фирм "Cooke" или "Linbro" микрометодом, по подавлению цитопатического действия ( ЦПД ) тест-вируса энцефаломиокар-дита мышей.

За титр интерферона принимали число, обратное его наибольшему разведению, вызывающему задержку ЦПД на 50

Активность сывороточных специфических антител к бараньим эритроцитам определяли в реакции гемолиза ( К.П.Студенцов,1975 ).

Определение содержания специфических иммуноглобулинов проводили методом раздельного учета с использованием 2-меркап-тоэтанола ( Методические рекомендации, 1977 ).

Воспроизведение клеточно-опосредованного иммунитета к антигенам микробов и перевиваемых линий клеток у морских свинок. Животных иммунизировали палочкой инфлюенцы, вводя в подушечки обеих задних лап по 10 млрд убитых микробных клеток или по б млрд микробных клеток золотистого стафилококка аналогичным способом.

Перевиваемые линии клеток вводили внуцибрюшинно по

7

10 клеток в 0,1 мл среды 199.

О развившейся реакции судили постановкой внутрикожных аллергических проб, описанной А.Д.Адо и А.А.Польнером ( 1963 ).

Постановку реакции торможения миграции лвйкоцитов (РТЫ! ставили по методу, описанному Д.К.Новиковым и В.Н.Новиковой ( 1979 ) с некоторыми модификациями ( Г.С.Суходоева, 1985 ). Подсчет клеток производили в камере Горяева для подсчета форменных элементов крови.

Постановку реакции розеткообразования лимфоцитов человека проводили по методу, описанному А.И.Саттаровым, 1984.

Статистическую обработку результатов проводили по М.А.Ойвину, 1964.

Результаты исследований

Влияние БЛВ на неспецифические факторы иммунитета. Не-специфичоские факторы иммунитета являются важнейшим звеном сложной системы организма, поддерживающий гомеостаз, так как они образуют первый барьер на пути развития генетически чужеродных агентов. От активности факторов естественной резистент ности организма зависит выраженность последующего формировали; специфического иммунитета ( Лузянина Т.Я., Смородинцев А.А., 1980 ). Поэтому поиск средств, стимулирующих неспецифический иммунитет является актуальным вопросом проблемы иммунологии.

Одним из важнейших факторов неспецифического иммунитета является интерферон. Имеются сведения об интерфероногенной активности бруцолл ( Воиае^ еЬ п1. , 1973; Егиаиг еЪ а1. , 1974 ) и их фракций ( Ре^оил еь а1., 1976; Р.Д.Аспетов, 1985 ). В связи с этим на первых этапах наших исследований мы изучали интерфороногонные свойства бруцелл вида Вг.ше1^епз1[ 16 м, в Г с аЪсг1;иг. 544, вакцинного штамма ВА-19 и Вг.зи±з

1330. При введении мышам внутривенно инактивированные штаммы

9

бруцолл в дозе 10 м.к. установлено, что Вг.тс1^опз1з 16 м индуцирует выработку наиболее высоких титров интерферона, ак-

тивность которого достигает 1120 ± 139 вд/т, тогда как активность сывороточного интерферона при применении Br. aula 1330 составил 360 + 87 ед/ыл ( Р< 0,05 ). Изучение интерферо-ногвншос свойств Br. abortus 544 и вакцинного штамма BA-I9 показало, что титры интерферона были одинаковыми и колебались в пределах 180 + ед/мл ( Р< 0,05 ). Таким образом, из трех известных типов бруцелл, наиболее интерфероногенным оказался Br. melitcnsi3 В последующих опытах наш был исп^аован этот тип бруцелл, а именно аптечный препарат БЛВ, изготовленный В ОСНОВНОМ ИЗ Вг» melitonsis.

Наш проведено выявление интерфароногенных свойств KOif-мерческого препарата БЛВ. Введение БЛВ мышам внутривенно или

q

внутрибрюшинно в дозе 10 м.к. индуцировало выработку высокоактивного эндогенного интерферона, динамика продукции которого соответствовала таковой для интерферона, индуцированного вирусами и некоторыми бактериями. Интерферон обнаруживался в крови уже через 2 часа и достигал 100 + 20,3 ед/мл. В последующие сроки забора крови наблюдалось увеличение уровня интерферона в пробах сыворотки: через 4 часа он достигал 240 + 45,5 ед/ыл, через 6 часов - 820 + 191 ед/мл ( максимальная концентрация интерферона в крови ). Затем активность интерферона постепенно снижалась: через 10 часов до 480 + 92,4 ед/мл, через 12 часов - 140 + 20 ед/мл, через 24 часа - 12 ±'2,5 ед/мл. В пробах сыворотки крови, полученных через 48 часов, интерферон не обнаруживался.

Описанная продукция эндогенного интерферона наблюдалась как при внутривенном, так и при внутрибрюшинном способах введения БЛВ.

Изучение динамики накопления эндогенного интерферона в

различных органах мышей после введения 10 ы.к. БЛВ показало присутствие интерферона в печени, селезенке, легких, сердце и ыозге. При этом активность интерферона в них была гораздо ниже, чес в сыворотке крови ( 960 + 160 ед/мл ). Наибольший уровень интерферона в печени достигал 96 + 18,5 ед/мл, в селезенке - 56 + 8 ед/мл, в мозге -14 + 7 ед/мл ( Р< 0,05 ). Следуе;] отметить, что в органах интерферон обнаруживался в течение дл1 тельного времени ( 48-72 часа ), чем в циркулирующей крови.

При введении мышам различных доз БЛВ ( 10^, Ю5, Юб, Ю7, Ю8 и 10^ м.к. ) была обнаружена прямая зависимость интенсивности интерферонообразования от дозы введенной БЛВ. Миш мальная активность была отмечена в сыворотке крови мышей, получивших наименьшую дозу препарата - 10^ м.к. и равнялась 28+ + 4 ед/мл. Максимальная активность интерферона наблюдалась в

о

сыворотко крови шшей, получивших препарат в дозе 10 м.к. и составила 820 + 204 ед/мл.

При ежедневном, в течение 7 дней, введении БЛВ мышам наблюдалось прогрессирующее падение интенсивности продукции интерферона в ответ на последующие аппликации препарата. Отмеченное явление, по-видимому, связано с развитием состояния гипороактпвности. При этом активность образующегося в ответ на порвое введение БЛВ сывороточного интерферона составила 560 + 65,3 ед/мл, второе - 560 + 65,3 ед/мл, третье - 400 + + 52 ед/мл, четвертое и пятое - 160 + 20 ед/мл, шестое и седьмое - 60 + 11,5 ед/мл. Однако при введении препарата с интервалом 7 дней, в течение месяца, наблюдалась практически одинаковая степень продукции интерферона в ответ на каждое введение БЛВ ( 580 ± 70,5 ед/мл ).

Предварительная обработка БЛВ специфическими антителами

при 37° в течение 2 часов не нейтрализовала интерфероногенность препарата. Полученные результаты позволяют предположить, что специфические иммуноглобулины, образующиеся в организме к антигенам БЛВ, также не будут подавлять интарфероногенную активность препарата при многократном его применении.

Большинство адаювантов различной природы обладают способностью стимулировать активность комплемента. В наших опытах на морских свинках при введении БЛВ в дозе 10 м.к. подкожно, или внутрикожно, или внутривенно, или внутрибрюшинно, чероз 5 дней в сыворотке крови отмечено значительное повышение активности комплемента. Наибольший эффект БЛВ установлен при внутривенном введении препарата ( 1:640 ¿53 ). В ответ на подкожное и внутрикокное введение препарата активность комплемента была одинаковой ( 1:512 + 0 ), несколько ниже были показатели при внутрибрюшинном способе аппликации ( 1:448 + 64 ). Титры комплемента у интактных животных составляли 1:128 £ + 45,2 ( Р<0,05 ).

При введении морским свинках различных доз БЛВ ( 10^ -

д

10 м.к. ), установлено, что все указанные дозы повышают ак-

8 9

тивность комплемента. Дозы 10 и 10 м.к. обладали наибольшей эффективностью ( 1:416 + 36 и 1:418 + 42 соответственно ) .

г 7 '

При введении БЛВ в дозах 10 и 10 м.к. активность комплемента крови была существенно ниже ( 1:320 + 20 и 1:327 + 35 ) ( Р< 0,05 ).

9

Изучение активности коыпломонта после введения 10 м.к. БЛВ морским свинкам в динамике показало, что ужо через 2 дня происходит его повышение ( 1:480 + 39 ). На 5 день наблюдения активность комплемента в сыворотке крови составила 1:608 + 45, на 7 день - 1:413 + 60 и на 15 день - 1:240 + 69 ( Р< 0,05 ).

- 12 -

На 30 дань титры комплемента были практически одинаковыми с показателями контрольной группы и составили 1:152 + 37.

В следующих опытах изучали влияние БЛВ на бактерицидную активность сывороточного лизоцима у морских свинок. В наших исследованиях по определению активности лизоцима в сыворотке крови по отношению к тест-микробу наиболее информативным и объекта ним методом явился метод определения зоны лизиса в агаре с растущим Ы. 1уяоае1с-Ысия.

д

Вазличные способы аппликации БЛВ по 10^ м.к. морским свинкам показали, что выраженная стимуляция активности лизоцима наблюдалась при подкожном и внутривенном ( 2,85 + 0,2 см и 2,8 + 0,2 см ) путях введения препарата. При внутрикожноы введении размеры зоны лизиса равнялись 2,27 + 0,1 см и внутрибрю-шинном - 1,9 + 0,05 сы ( Р<0,05 ). Активность сывороточного лизоцима в контрольных опытах составила 1,5 + 0,1 си.

Определение литической активности сывороточного лизоцима при подкожном введении различных доз БЛВ показало, что все они влияют но активность этого фермента. Высокие дозы БЛВ ( 1С и 10^ м.к. ) повышали ее в 2 и более раза ( 2,77+0,7 см и 2,82 +0,7 см соответственно ) по сравнению с контролем ( 1,1

<7

+0,2 см ). При вводении доз 10 и 10 м.к. БЛВ размеры зон лизиса составили 2,1 + 0,1 см и 2,3 + 0,)' см соответственно.

Нами показано, что после введения БЛВ подъем активности лизоцима в сыворотке крови у морских свинок происходит со 2-го дня ( 2,15 + 0,2 см ). Активность лизоцима на 5 и 7 сутки оставались одинаковыми ( 2,8 + 0,7 см ). В последующие 15 и 30 дни наблюдения отмечалось снижение активности лизоцима и они равнялись 2,2 + 0,2 см и 1,9 + 0,2 см, однако выше контрольных ( 1,25 + 0,1 см ) показателей ( Р-^ 0,05 ).

- 13 -

Нами показано, что БЛВ стимулирует фагоцитарную активность лейкоцитов в НСТ-тесте. Отпечено, что при подкожном введении

о .

БЛВ в дозе 10 м.к. морским свинкам фагоцитарная активность лейкоцитов была наиболее высокая ( 36,0 + 0,9% ). При внутри-кожном и внутривенном путях введения препарата она была одинаковой - 33,1 + 0,8% при внутрибрюшинном - равнялась 30,5 + + 0,7%. В то же время фагоцитарная активность лейкоцитов интак-тных животных составляла 16,0 + 0,2% ( Р<0,05 ).

С увеличением вводимой дозы БЛВ параллельно нарастала фагоцитарная активность лейкоцитов у морских свинок. Так, у

д

животных, получивших 10 м.к.БЛВ показатель фагоцитарной актив-

о

ности составил 43,0 + I %. При введении препарата в дозах 10 ,

7 г

10 и 10 ы.к. процент положительно реагирующих с НСТ тсЯкоци-тов был ниже ( 32,8 + 1,15%, 36,3 ± 0,9% и 32,7 ¿0.7% соответственно ). У контрольных животных она составила 15,3 £ 0,2%.

Ори изучении стимулирующего действия БЛВ на фагоцитарную активность лейкоцитов в динамике в течение месяца отмечено, что максимальные показатели ( 47,5 + 2,25% ) наблюдаются на 7 день после введения БЛВ. Повышение фагоцитарной активности лейкоцитов установлено со 2 дня после введонил препарата ( 34,3 + + 1,2% ). На 5 день количество их равнялось 42,1 + 1,9%, на 15 день - 32,5 + 1,5% и на 30 день - 22,5 + 0,5%. Показатели в контрольной группе составляли 20,1 + 0,5% ( Р<0,05 ).

Исследования влияния БЛВ на активность комплемента, ли-зоцима и фагоцитарную активность лейкоцитов у морских свинок предварительно обработанных циклофосфаном показал, что введение бактериального препарата существенно повышает носпецифические факторы иммунитета. Отмочено, что введение БЛВ в до-

д

зо 10 м.к. усилило активность комплемента в 3,5 роза, лизо-

цшла - и 2,4 1«за и фагоцитарную активность лейкоцитов - в 1,5 раза по сравнению с показателями контрольной группы, получивших только циклофосфан.

Таким образом, коммерческий препарат - БЛВ, обладает свойством повышать активность таких важнейших факторов неспецифического иммунитота как компломент, лизоцим и фагоцитарную активность лейкоцитов. Ценным свойством БЛВ является ее интер фероногенность, так как известно, что интерферон является унИ' кальным белком, обладающим противовирусным, имцуномодулирующи; и противоопухолевым свойством ( В.Д.Соловьев, Т.А.Бектсширов, 1980 ). Принимая во внимание эти результаты, а также данные о способности БЛВ повышать активность естественных киллерных кл' ток ( К.С.Досхожаев, 1989 ), интерфероновую реакцию лимфоцито; а также противовирусную активность неспецифических ингибиторо; можно с большей долей вероятности сказать, что БЛВ может быть использоиан как пропорот, повышающий естественную резистентность о|гинизма.

Изучение влияния БЛВ на формирование специфического имм; питота к готероантигонам. Установив в предыдущих опытах стиц лирующоо влияние БЛВ на неспецифичоские факторы иммунитета в последующих исследованиях изучали действие этого препарата на формирование специфического иммунитета.

При изучении влияния БЛВ на формирование гуморального иммунитета к эритроцитам барана ( ЭБ ), больш мышам внутривенно, или внутримышечно, или подкожно, или внутрибрюшинно вводи ли по Ю' м.к. БЛВ. Через 2 дня эти группы животных получали по 2 у. Ю1! ЭБ. При определении количества антитолообразующих клеток ( ЛОК ) мотодом Ерно выявили, что максимальное накопле-ни о А0;{ щ оисходит щи подкожном введении БЛВ ( 35,5 + 1,5 ).

- 15 -

При внутримышечном введении препарата количество ЛОК было значительно выше ( 30,6 + 1,0 ) по сравнению с внутривенным ( 16,6 + 2,0 ) и внутрибрюшинным ( 21,3 + 3,5 ) способах аппликации ( Р<0,05 ). Количество ЛОК в контрольной группе было существенно ниже ( 6,5 + 0,8 ) но сравнению с таковыми у животных, получивших БЛВ.

д

Введение БЛВ в дозе 10 м.к. за 2, или 5, или 7 дней до иммунизации ЭБ, а также одномоментно или через 2 дня после введения антигена, показало, что формирование АОК зависит от сроков введения тест-антигена ( таблица I ). Наибольшее накопление АОК происходит при введении БЛВ через 2 дня после иммунизации ЗБ и превышает в 7 раз контрольные показатели.

Таблица I.

Зависимость формирования АОК у белых мышей получивших БЛВ, от сроков введения тест-антигена (ЭБ)

Гипки ! Об1Ч08 число ! Число АОК в 0,2 мл ! Число АОК в введения | лимфоцитов { суслензиу разве- ! 1р6 лимфоци_ препарата ! [ доши 1,10 ± ! тов

За 7 дней до введения ЭБ 2,3 х Юб 24 + 3,5 52,0

За 5 дней 2,5 х Ю6 35 + 3,0 70,5

За 2 дня 3,0 х га6 72 + 10,0 120,0

Одновременно 3,4 х юб 68 + 8,5 100,0

Через 2 дня после введения ЭБ 2,5 х ю6 104 + 12,5 185,7

Контрольная группа (без БЛВ) 2,8 х юб 15 + 0,5 26,7

и 9

Изучение действия различных доз (10 - 10 м.к. ) БЛВ на формирование антителообраэовашш к ЭБ у мышой установлено,

что стимулирующее доИствие БЛВ зависит от ее дозы. Минимальное количество АОК образуется при введении наименьшей дозы

препарата - 10^ м.к. и равнялось-16,0 + 0,8, а максимальное -

9

35,0 +2,0 при дозе 10 м.к. При введении бактериального препарата но Ю7 и ЮС м.к. они равнялись 24,5 + 1,4 и 19,7 + 1,2 соответственно.

При изучении влияния БЛВ на формирование специфических сывороточных гемолизинов к ЭБ у морских свинок отмечено, что антитолп появляются чороз б дней и титры равнялись 1:32 + 1,5. Этот э^фокт бил наиб!шее выражен но 9 и 12 дни после введения БЛВ, при птом тит])ы 'лшцифических гемолизинов превышали в 3 и более риза продидущш) показатели ( 1:109 + 26,5 и 1:100 ± 21,4 ' ( IV 0,05 ). Спустя 15 дней после иммунизации наблюдалось сни-жонио активности об^юования антител к ЭБ в крови у морских свинок и титры равнялись 1:48 £ 6,4, а на 30 день ода были близки к показателям контрольной группы ( 1:28 + 1,4 ).

Обработкой проб имцунных сывороток 2-меркаптоэтанолоы установлено, что БЛВ стимулирует синтез специфических иммуноглобулинов как М, т.т и о .

Специфический ¡.щунитет обусловлен сочетанным действием гуио1и/п!ого и клот' ного иммунитета, выполняющих основные за-цитшю ^./нкцип орх'п• ила от генетически чужеродных тел ( На-чи • : 198''; Г.К.Ермакова, 1980 ).

Изучонио влши, БЛВ но формирование клеточно-опосродо-ванпого иммунитета ^ лОП ) к микробам палочки инфлюенцы или золотистого стафило'.'.^ска показал, что одновременное введение мш^ 00Ш.1.-; аллоргено! л БЛВ повысило поздние кожные реакции и проекции лимфоцит.), ' фактора, тормозящего шграцию лейкоцитов.

о

При атоа БЛВ к до:.п ! 1 м.к. обладало болов высоким стимулирую-

щим действием на КОИ ( 0,45 + 0,04 см2, ИМ=0,5 + 0,03 ). При

Я' * 7 С

остальных дозах БЛВ ( 10 , 10 и 10 м.к. ) эти показатели

д

были ниже по сравнению с дозой 10 м.к., однако выше, чем у

р

животных контрольной группы ( 0,2+0,01 смс, 1Ш=1,0 +0,1 ), получивших микробные аллоргены без БЛВ ( Г<0,05 ).

Аналогичные результаты были получены при изучении влияния БЛВ на КОИ к золотистому стафилококку.

При сравнении иммуностимулирующих свойств БЛВ и известных адъювантов - неполного и полного адъювантов Фрейнда ( НАФ и ПАФ ) и их смесей на морских свинках по отношению к микробам палочки инфлюанцы и золотистому стафилококку показали, что у всех животных, получившие микробные антигены в смеси с адъю-вантаыи развились четко выраженные кокно-аллергические реакции во все сроки наблюдения ( спустя I, 2, 3 и 4 месяца ). Сопоставление размеров кожных проб и ИМ лейкоцитов у животных, получивших палочки инфлюенцы с БЛВ и НАФ показали, что последний обладает более выраженным стимулирующим действием на КОЙ. При сравнении показателей КОИ у морских свинок, иммунизированными палочками инфлюенцы в смеси с БЛВ+НАФ или БЦЖ+НАФ отмечено, что спустя I, 2 и 3 месяца они были примерно одинаковыми. Однако на 4 месяц наблюдения отмечалось достоверно высокий КОИ у морских свинок, получивши БЛВ+НАФ по сравношш с БЦК+НАФ. Показатели кожных реакций при введении палочки инфлюенцы с БЛВ+ПАФ были самыми высокими по сравнению с остальными группами ( таблица 2 ).

Аналогичные результаты были получены при сравнительном изучении указанных адъювантов по отношению к золотистому стафилококку.

Таблица 2

Влияние БЛВ, НАФ, ПАФ и их смесей на формирование КОИ к антигенам палочки инфлюенцы спустя 4 месяца у морских свинок

Группы животных

Количес- { Показатели КОИ ( М + м )

тво жи- I кожные реакции ! результаты

вотных

( см2 ) | ИДИ ( ИМ )

Иммунизированные палочками инфлюенцы в смеси с

физиологическим раствором ( контроль ) 4 0,2 + 0,01 1.0 + 0,1

БЛВ 4 0,56 + 0,05 0,7 + 0,05

ПАФ 4 0,67 + 0,02 0,65 + 0,01

ПАФ 4 0,87 + 0,09 0,55 + 0,01

БЛВ+НАФ 4 1,3 + 0,02 0,45 + 0,04

БЛВ+ПАФ 4 1,4 + 0,05 0,5 ± 0,01

Изучение влияния БЛВ на КОИ к антигенам трансформированных клоток человека ( ь ) и мыши ( ь ^¿Э ) показали, что

9

введение этого препарата в дозе 10 м.к. повышает иммунологическую реактивность к взятым в опыт клеточным антигенам. Так, показатели кожных реакций к гетерогенным клеткам Ь ^ через

2 недели составил 2,5+0,1 см2, 3 недели - 1,8 + 0,3 см2 и 4 недели - 1,0 + 0,1 см2. Сопоставление иммуностимулирующих свойств БЛВ и адъювэнтов типа Фрейнда при формировании КОИ к перевиваемым клеткам ь показало, что сочетанное применение БЛВ+НАФ индуцировало стимуляцию клеточного иммунитета в боль-

- 19 -

шей степени ( 2,45 + 0,09 си2-, ИМ=0,5 + 0,03 ) по сравнению с НАФ ( 2,1 + 0,07 см2, ИМ=0,8 + 0,07 ) или с БЛВ ( 1,9 + ± 0,05 см2, ИЫ =0,8 + 0,07'), или БЦД+НАФ ( 2,26 +. 0,05 см2, ИЫ=0,5 +0,06 ). Аналогичный эффект был получен у морских свинок, иммунизированных ъ ^9•

Таким образом, парентеральное введение БЛВ стимулирует формирование как гуморального, так и клеточного иммунитета к антигенам про- и эукариотических ооток. Эти данные позволяют рекомендовать применение БЛВ для стимуляции иммунного ответа организма при различных патологиях, сопровождающихся и развивающихся на фоне иммунодефицита.

Иммуностимулирующее и терапевтическое действие БЛВ у детей, больных лимйобластныы лейкозом. Полученные экспериментальные данные об иммуностимулирующем действии БЛВ на неспецифический и специфический иммунитет в эксперименте открыли перспективу применения этого препарата по новому назначению - для стимуляции иммунной системы больных при различных иммунодефицит-ных состояниях, в частности при лейкозах. При этом заболевании в связи с поражением герминтативных центров лимфопоэза подавляется иммунологическая реактивность организма. Более того, применение агрессивных противолойкозных химпопропаратов обуславливает дальнейшее угнетение организма. Поэтому у больных нередки осложнения в виде сепсисов ( В.В.Голосова с соавт., 1980 ). Назначение антибиотиков больным но всегда достигает цели, так как большинство микробов обнаруживают резистентность к этим препаратам.

Принимая во внимание эти сведения, нами с разрешения Ученого Совета НШШИБ Минздрава Роспублики Казахстан ( протокол заседания № 9 от 16.06.1987 г. ), а также администрации

-202-ой детской клинической больницы гор.Алма-Аты в гематологическом отделении проведены исследования по изучению терапевтической и иммуностимулирующей эффективности аптечного препарата БЛ1 у больных детей острым лимфобластным лейкозом ( ОЛЛ ).

Под наблюдением находилось 77 детей в возрасте от 2 до 14 лет, больных ОЛЛ. Эти больные по возрасту, стадия)! заболева^ ния и течению болезни были равномерно распределены на 2 группы основную ( 26 с первично поставленным диагнозом ОЛЛ, 9 - с рецидивом ) и контрольную, состоящую из 40.детей. Контрольная группа получала традиционные методы лечения - цикловую полихимиотерапию ( ПХТ ) по схема, предложенной Институтом педиатрии АМН СССГ, состоящая из 4 цитостатических химиопрепаратов + пре низалона. Опытная группа, наряду с ПХТ получала внутривенно БЛВ 8-10 кратно, через каждые 3 дня по схеме 6, 8, 10, 10, 10, 10, 10 млн. м.к.

О терапевтическом эффекте БЛВ судили путом сопоставления динамики обратного развития клинических симптомов болезни и данных лабораторных исследований костного мозга и периферической крови с токовыми в контрольной группе.

Они показали, что назначение ПХТ с БЛВ обуславливает более раннее исчезновение гиперпластичаского синдрома по сравнению с группой, получивших только ПХТ. Так, гиперпласти-ческии синдром уменьшился вдвое по сравнению с исходными данными у:.со в первую недолю и полностью исчезал на 2-3 неделе лочония. В контрольной группе нормализация размеров лимфоузлов, печени и селозонки достигли на 5 неделе от начала лечения.

Геморрагический синдром в опытной группе купировался полностью в 1-2 недоле лечения, в контрольной - лишь на 4

подале. При сочетанном лечении БЛВ с ПХТ чорез наделю отмечалось уменьшение бластных клеток в костном мозге, а нормализация их содержания ( не более 5% ) наступало через 3 надели. В то же время при назначении больным только ПХТ количество бластных клеток через 3 недели составляло 22,1$.

В периферической крови опытной группы больных наблюдалось более раннее восстановление количества тромбоцитов ( на 4 неделе лечения ), чем в контрольной ( на 5-6 неделе лечения ).

Параллельно с клиническими и лабораторными данными о лечебном действии БЛВ судили путом иммунологических исследований крови больных до и посла лечения ПХТ или ого сочетании с БЛВ.

До введения БЛВ в крови детей обнаруживался интерферон с активностью 12+8 ед/мл. В ответ на введение БЛВ в организме продуцировался интерферон, активность которого составила 58 + 18 ед/мл.

При сопоставлении активности комплемента до назначения БЛВ отмечено юс низкое содержание ( 1:16 + 5,4 ). Посла соче-танного лечения БЛВ с ПХТ наблюдалось увеличе нив активности комплемента в 2 и болае раза(1:40 + 8,8 ) ( Р^ 0,05 ).

Антибактериальная активность лизоцима в сыворотке крови больных детей ОЛЛ была низкой ( 0,35 + 0,1 см ). Назначение БЛВ с ПХТ повысило активность этого фермента до и,87 + 0,17 см, тогда как лечение только ПХТ сопровождалось дальнейшим снижением бактериальной активности лизоцима у этих больных.

Фагоцитарная активность лейкоцитов у детей, больных ОЛЛ до лечения равнялась 6 + 2%. После окончания курса лечения БЛВ+ПХТ наблюдалось существенное повышение ее активности до 15,7 +3,5%.

- 22 -

Изучение содержания Т- и В-лимфоцитов ( Е-РОК и ЕАС-РОК ) в крови у детей, больных ОЛЛ до лечения показало, что исходное количество их составило 23 + 1,0% и 8,5 + 0,9%. Назначение БЛВ обусловило увеличение в периферической крови иммунокомпетентных клеток и составило Е-РОК 31 + 3,2%, ЕАС-РОК - 15,8 + 3,0%.

Таким образом, применение общедоступного коммерческого препарата БЛВ для лечения детей, больных острым лимфобластныы лейкозом индуцировало выработку интерферона, повышало активное! комплемента и антибактериальное действие лизоцима, увеличивало число фагоцитов, Т- и В-лимфоцитов, сокращало сроки лечения.

ВЫВОДЫ

1. Бруцеллезная лечебная вакцина индуцирует выработку эндогонного интерферона у мышей с активностью до 1280 ед/мл. Установлено, что интерферон циркулирует в крови в течение 2448 часов,, Оптимальный интервал времени между введением БЛВ, обеспечивающий выработку эндогенного интерферона с постоянно высокой противовирусной активностью составляет 7 дней. Выявлена прямая зависимость степени продукции эндогенного интерферона от концентрации ьводимой БЛВ.

2. Парентеральное введение БЛВ морским свинкам повышает в сыворитко крови уровень комплемента и антибактериальную активность лизоцима, а также стимулирует фагоцитарную функцию лейкоцитов. Показано, что этот процесс находится в зависимости от дозы вводимой БЛВ.

3. Подкожное, внутримышечное, внутривенное и внутрибрю-шшшоо введение БЛВ мышам повышает в 2,5 - 5 раз количество антителообразующих клеток в селезенке к антигенам эритроцитов барана. Активация процесса формирования гуморального иммуните-

та при назначении животным БЛВ осуществляется за счет синтеза как ig М, так и ig G.

4. Назначение БЛВ морским свинкам стимулирует процесс развития клеточно-опосредованного иммунитета к антигенам про-И зукариотических клеток ( Ilaomofiluo influenzae, St.aureus , перевиваемые линии клеток человека l^j и мыши l929 )• Способность стимулировать БЛВ КОИ не уступает таковой неполного адъюванта Фрейнда ( НАФ ). Применение смеси НАФ с БЛВ позволяет достигать более высокой степени стимуляции процесса формирования КОИ к микробным антигенам, чем при использовании полного адъюванта Фрейнда, НАФ и БЛВ индивидуально.

5. Применение БЛВ в комплексной терапии детей, больных острым лимфобластным лейкозом индуцирует выработку эндогенного интерферона, повышает уровень комплемента и лизоцима в сыворотка крови, стимулирует фагоцитарную активность лейкоцитов, увеличивает число иммунокомпетентных клеток.

6. Назначение БЛВ детям, больным ОЛЛ, повышает эффективность комплексной терапии, обуславливая ранее купирование гиперпластического синдрома, интоксикации, ускоренное восстановление гематологических и цитохимических показателей, в результате чего достигается сокращение сроков лечения на 12 + 4,8 дней.

V. Полученные экспериментально-клинические данные о высоких интерфероногенных и иммуностимулирующих свойствах БЛВ позволяет рекомендовать применение этого аптечного препарата по новому назначению - для лечения больных, сопровождающихся подавлением иммунной системы, в частности лейкозов.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

I. Сравнение интерфероногенных свойств различных видов бруцелл. / К.С.Досхожаав, С.Ф.Даулбаева, Р.Т.Мурзатаева, Р.Ж. Ицанова, Р.Д.Аспетов. // Материалы 1У съезда гигиенистов, эпидемиологов, паразитологов и инфекционистов Казахстана. - Чимкент. - 1985. - Т.З., - С. 148-149.

2. Изучение продукции эндогенного интерферона, индуцированного бруцеллезной лечебной вакциной у белых мышей. / К.С. Досхожаев, Н.В.Пак, Р.Д.Аспетов, Р.Т.Мурзатаева, РД.Ищанова, И.Х.Шуратов. // Известия АН Каз.ССР. Сер.биол. - 1987. - fö 2. - С.58-61.

3. Способ лечения детей, больных лимфобластныы лейкозом. / Р.Д.Аспетов, Т.Н.Иыанбаева, М.Н.Бытынбаева, Л.Г.Горячева, О.Л.Рязаова, Р.Т.Мурзатаева, Н.В.Пак.// Авторское свидетельство te I4865I3 от 15.02.1989 г.

4. Обнаружение интерфероногенных, иммуностимулирующих, противовирусных и антиклоточных свойств у коммерческого препарата бруцеллезной лечебной вакцины. / Н.В.Пак, К.С.Досхожаев, Г.Т.Мурзатаева, Г.Д.Аспетов. // Сб.научных трудов "Современные аспекты применения интерферонов и других модуляторов. -Москва. - 1990. - С.87.

5..;.1урзотаева Г.'Г., йуматова Б.Х., Пак Н.В., Бытынбаева М.Н Стимуляция бруцеллезной лочебной вакциной клеточного иммунитета к но.опиваемым клоткам человека и мыши у морских свинок./ Мат. У Объединенного съезда гигиенистов, эпидемиологов, микробиологов, паразитологов и инфекционистов Казахстана. - Алма-Ата. - 1991 - Т.5. - С.63.

о. Ыурзатиова Г.Т., Аспетов Р.Д., Курина Е.В. Влияние бруцеллезной лечебной вакцины на фагоцитарную активность лей-

коцитов./ 1.1ат. У съозда гигиенистов, знидомиологов, микробиологов, паразитологов и инфекционистов Казахстана. - Алма-Ата.

- 1991. - Т.5. - С.148.

7. Мурзатаова Р.Т., Аспотов Г.Д., Добрица В.П., Ищанова Р.Ж. Влияние бруцеллезной лечебной вакцины на клеточно-опо-срадованный иммунитет. / Актуальные вопросы клинической иммунологии и региональной аллергологии. Сб.тр. I съозда иммунологов и аллергологов Узбекистана. - Узбекистон. - 1991. C.27I-272.

РАЦИОНАЛИЗАТОРСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

1. Способ стимуляции иммунитета. - Удостоверение № 440. Принято БРИЗ НИИЭМИБ Минздрава Республики Казахстан II.04.1991. ( Мурзатаева Р.Т., Аспетов Р.Д., Добрица В.П., Ищанова P.S. )

2. Способ определения активности фагоцитирующих клеток.

- Удостоверение Кг 441. Принято БРИЗ НИИЭМИБ Минздрава Т)с*пуб-лики Казахстан 11.04.1991 г. ( Мурзатаева Р.Т., Журина Е.В., Сатыбалдиева Ж.А., Цирельсон Л.Е. ).