Автореферат и диссертация по медицине (14.00.23) на тему:Чувствительность IN VITRO доимплантационных зародышей мыши к повреждающему действию некоторых эмбриотоксических факторов

г:" од

■ о ;v.

На правах рукописи

Архангельская Ирина Борисовна

ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТЬ IN VITRO Д01МТЛАНТАЦИ0ННЫХ ЗАРОДЫШЕЙ МЫШИ . К ПОВРЕВДАЭДЕМУ ДЕЙСТВИЮ НЕКОТОРЫХ ЭМБРИОТОКСИЧЕСКИХ ФАКТОРОВ

14. 00. 23 - гистология, цитология, эмбриология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Сэйкт - Петербург

1996

Работа выполнена в Отделе молекулярной генетики Научно-исследовательского института экспериментальной медицины РАМН

Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор В.Ф.Пучков.

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, профессор

В.С.Барвнов

доктор медицинских наук, профессор А.И.Никитин

Ведущее учреждение - Санкт-Петербургский Государственный

Университет

Защита состоится " ^^ • ЭЭ^г.

в часов на заседании диссертационного совета

Д.001.23.03 при Научно-исследовательском институте экспериментальной медицины РАМН.

Адрес: 197376, Санкт-Петербург, ул.Акад. Павлова, 12.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке НИИЭМ РАМН по адресу: 197376, Санкт-Петербург, ул. Акад. Павлова, 12.

Автореферат разослан ^" . ^^Г/^ f!T?T?.. 199 .

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук

Е.С.Петрова

- 1 -

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность теш. В настоящее время существует много руководств по тестированию токсического действия химических веществ в пренатальный период, изданных национальными и международными организациями (PDA,1966,1970; NHW.1973; HAS,1977; US EPA,1978; OESE,1981). Хотя в оценке потенциального риска для потомства достигнут значительный прогресс, имеется очень мало сведений о механизмах возникновения патологий развития. Для более глубокого понимания процессов, лежащих в основе нормального и аномального эмбриогенеза, не обойтись без использования методов in vitro, в частности, культуры доймплаитационшх зародышей мыши, которая позволяет одновременно учитывать мутагенный и эмбриотоксический эффекты (Vogel arifi Spielmann, 1986, 1988, 1989; Kamata et al., 1986; Sumió et al.,1983), а также отражает процессы, протекающие при нормальном развитии дробящихся зародышей in vivo. Направленное изучение особенностей реакции дробящихся зародышей на воздействие проводит небольшое количество авторов (Rutledge et al., 1993 ; Spielmann et al.,1993).И, хотя токсикологические исследования in vitro намного проще, дешевле и быстрее опытов на лабораторных животных, они не получили в настоящее время еще широкого распространения, поскольку остается открытым вопрос о адекватности переноса результатов, полученных в культуре изолированных эмбрионов, на целостный организм животного. Остается до конца не выяснена роль материнского организма в реализации эмбриотоксического эффекта. Использование в качестве Культурэльной среды сывороток крови животных, подвергшихся воздействию (Klein et al.,- 1981), открывает возможности моделировать условия, приближающиеся к таковым in vivo. Но роль организма матери, скорее всего, шире, чем только метаболическая активация или детоксикация веществ, присутствующих в окружающей среде. Несмотря на существующие пробелы в знаниях по этому feonpocy, высока актуальность исследования с использованием этой моделй, которая обусловлена большим Процентом женского бесплодия Неясного гейеза (Пшеййчййкова, 1Э91; Wlger, 1994), честь Которого, вероятно, связана с нарушениями в развитии на самых ранних стадиях эмбриогенеза. Кроме того, в связи с широким применением метода экстракорпорального оплодотворения,

возрастет актуальность изучения особенностей реагирования доимплантеционных зародышей In vitro на любое воздействие внешней среда (Ackrman et al.,1984, 1985).

Цель данной работы изучение чувствительности доимплантаци-онных зародышей мыши, развивающихся In vitro, к повреждающему' действию чужеродных агентов и установление возможности выявления в сыворотке крови человека эмбриотоксических факторов, связанных с патологическим состоянием организма. В связи с поставленной целью решались следующие задачи:

1.Изучить возможности культивирования доимплэнтационных зародышей мыши в цельных сыворотках крови человека и крысы в зависимости от их гормонального статуса.

2.Изучить особенности реагирования In vivo или In vitro допмплантоциошшх зародышей мыши на повреждающее действие как самих препаратов, так и возможных продуктов их метаболизма.

3.Изучить развитие доимплантеционных зародышей мыши в сыворотках крови, получешшх от новорожденных детей и их матерей, с целью выявления токсических факторов, связанных с патологическим состоянием организма.

4.Определить адекватность использования метода культивирования доимплантационных зародышей мыши для выявления эмбриотоксических факторов в крови подопытных животных и человека для предварительного ускоренного тестирования химических веществ на эмбрио- и гепотоксичность.

Научная новизна работы. При использовании метода краткосрочного экспонирования доимплантационных зародышей с веществом, установлена динамика изменения их чувствительности к действию чужеродных агентов в зависимости от стадии эмбрионального развития. Определена роль материнского организма ,в реализации эмбриотоксического эффекта после действия элкилирувдих агентов (циклофосфамид - ЦФА). Впервые использована сыворотка крови новорожденных детей для анализа связи между патологическим состояшюм организма и выявляемыми в культуре доимплэнтационных зародышей эмбриотоксическими факторами.

Практическая ценность работы заключается в разработке комплекса скрининговнх тестов для проведения предварительного тестирования на эмбриотоксичность в культуре доимплантационных зародышей мши. Предложенная модель может быть использована при

- з -

обследованиях женщин детородного возраста в случаях бесплодия неясной этиологии, а также населения, проживающего в районах экологического бедствия, с целью выявления в 1срови факторов токсической природа.

Основные положения, вынооимые на защиту.

I.Чувствительность доимплантационных зародышей мыши In vitro к повреждающему действию Т-2 токсина", циклофосфамида, 2,4Д-АМИНН0Й соли, p-хлормолочной кислоты и эфира (З-ХЛОРМОЛО'ТНОЙ кислоты зависит от концентрации препарата, которая создается в сыворотке крови при прямом добавлении или после введения во взрослый организм крысы.

2.Изменения эмбриотоксической активности препаратов, связанные с их метаболизмом, выявляются в культуре доимплантационных зародышей мыши при использовании в качество питательной среды сыворотки крови крыс после введения им препарата (Т-2 токсин, ЦФА и 2,4Д-Аминная соль).

3.Реализация эмбриотоксического эффекта ЦФА зависит от концентрации токсического агента, длительности экспозиции зародышей с повреждающими факторами и стадии эмбрионального развития, на которой производили воздействие.

4.Прослежена связь между патологическим состоянием организма и наличием в сыворотке крови новорожденных и их матерей факторов, токсичных для раннего эмбриона мши.

Апробация работы и публикации. Основные положения диссертации доложены и обсуждены на конференции молодых ученых в Институте гигиены и профпатологии МЗ СССР (1990г.), на секции токсикологии (Москва, 1990). По материалам диссертации опубликованы 8 печатных работ.

Структура и объем диссертаций. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и использованных методов исследования, результатов собственных наблюдений, изложенных в шести главах. Работа завершается обсуждением полученных данных, выводами и указателем литературы. Текст диссертации изложен ' на страницах машинописи,

Иллюстрирован 13 таблицами и 7 рисунками. Список литературы содержит 204 источника (43 отечественных, 161 иностранных).

- 4 -

Материал и методы исследования

Настоящая работа выполнена на половозрелых мышах-гибридах П (CBA/C57BL) и белых беспородных крысах питомника Рапполово. Для получения беременности самок мышей со стимулированной гормонами суперовуляцией (Getes,i97i) подсаживали к самцам. День обнаружения вагинальных пробок считали первым днем беременности.

В опытах in vitro зародышей второго дня беременности (46-48 часов после HCG) культивировали в опытных и контрольных образцах культуральных сред (сыворотки крови человека или крысы, среда Mi6 + BSA) в течение 48 или 72 часов. По окончанию культивирования проводили оценку морфологического состояния зародышей. Определяли количество погибших и остановившихся в развитии эмбрионов. Для цитологического анализа готовили суховоздушнне препараты по методу А.П.Дыбана (Dyban,1983). Иа препаратах подсчитывали количество бластомеров и метофазных пластинок.

В работе были проанализированы на эмбриотоксичность сыворотки крови самцов и самок крыс, сыворотки крови человека и сыворотки новорожденных, а также следующие препараты: Т-2 токсин, 2,4Д-Аминноя соль, ЦФА, p-хлормолочная кислота и эфир p-хлормолочной кислоты.

' Кровь для получения сывороток брали у белых беспородных крыс (самцов и самок) весом 180-200 г под эфирным наркозом из брюшной аорты в точке соединения двух подвздошных артерий стерильно. Кровь новорожденных брали из пупочной вены в родильном зале. У матерей - из вены. Кровь доноров без консервантов получали из Института гематологии и переливания Крови, готовили из нее сыворотку и хранили при температуре + 4°С.

Для анализа прямого действия изучаемых препаратов на доимплантационные зародыши мыши их добавляли непосредственно в культурпльные среды в испытуемых концентрациях и в обьеме, не превышающем 0,1мл. В качестве растворителя использовали среду Mjg. Испытаны следующие концентрации: Т-2 токсин - Г,0; 0,1; 0,01 и 0,005 мкг/мл; 2,4Д-Амтапгая соль - 400,0; 30,0; 3,0 мкг/мл и ЦФА - 200,0 и 50.0 мкг/мл; р-хлормолочная кислота - 60,0; 6,0 и О,G мкг/мл и эфир p-хлормолочной кислоты - 60,0 и 6,0 мкг/мл.

Для выявления эмбриотоксичэских факторов в крови проводились экспозиции подопытных крыс с испытуемыми препаратами,

после чего в определенные промежутки времени у животных бралй' кровь, готовили сыворотки и культивировали в них зародышей мыши. Т-2 токсин вводили внутрижелудочно в концентрации 1/2 ЛД50 (0,9 мг/кг); кровь брали через I, 3, 6, 12 и 24 часа после введения препарата. 2,4 Д-Аминную соль вводили внутрижелудочно в концентрации ЛД16 (100 мг/кг), кровь брали через I, 3, 6 и 24 часа. ЦФА вводили внутрибрюшшпю в дозах 20,0г 10,0; 5,0; 2,5 и

1 мг/кг; кровь брали через 30 мин и 1,5; 3; 6 и 24 часа. Выбор дозы для ЦФА основан на литературных данных, согласно которым, доказана его эмбриотоксичность и, выбранная нами доза равна 1/2 эмбриональной ЛД50 в опытах In vivo (Spielmann et al., 1986). Выбор доз введения Т-2 токсина и 2,4,Д- Аминной соли определен в токсикологическом эксперименте и обусловлен тем, что при этих дозах не отмечается гибели самок и развития видимых признаков интоксикации при избранной продолжительности введения вещества. Данные дозы соответствуют требованиям предъявляемым при исследованиях по изучению эмбриотоксического действия (Днбан и соавт., 1986). На каждую точку введения брали не меньше 3 самцов крыс. Контролем служила сыворотка крови интактных крыс.

Для определения условий, от которых зависит реализация эмбриотоксического эффекта при воздействиях in vivo и In vitro проводили внутрибрюшинные введения ЦФА (5; 30 и 300 мг/кг) на I,

2 и 3-й дни беременности. Зародышей вымывали из половых путей самки через 3, 5, 24 и 48 часов после введения и помещали в свежую порцию интактной сыворотки крови крыс для культивирования до возраста 120 часов после HCG, после чего проводили анализ результатов развития. При воздействии In vitro проводили краткосрочное культивирование зародышей..(3, 5 или 24 часа) в сыворотке крови крыс, взятой через I час после введения им ЦФА в дозе 20 мг/кг. Затем зародышей помещали в иятактную сыворотку, в которой они культивировались до возраста 120 часов после HCG.

" Для определения гейотоксйческих " свойств препаратов примейяли Метод сестринских хроматидных обменов (СХО). Для Т-2 токсина использовали постимплант8Ш1онных зародышей белых беспородных крыс (9,5-11,5 дни развития),; которых культивировали в течение 24 часов в сыворотках крови Крыс. Кровь брали перез 6 или 12 часов после введения препарата В концентрации 0,9 от/кг или препарат Добавляли в среду с зародышами в концентрации

0,0025 мкг/мл. По окончанию культивирования из клеток висцеральной эктодермы желточного мешка зародышей готовил^ хромосомные препараты (Паткин и соав.1982). Анализировали по 30 метафэз с дифференциальной окраской хроматид. Мутагенный эффект оценивали по числу СХО в клетках зародышей (WolfГ,1977). При анализе СХО на доимплантационных зародышах Т-2 токсин добавляли в среду Mi6 + BSA + ВгDU с зародышами на стадии 8 блзстомеров. Концентрация препарата - 0,005 мкг/мл. Концентрация BrDU -0,004мкг/мл. Хромосомные препараты готовили через 24 часа после начала культивирования. Обработка проводилась также как и для постимплантациошшх зародышей. При определении мутагенных свойств ЦФА его вводили внутрибркшинно мышам в дозе 30 мг/кг. На точку брали по три мыши каждой линии (CBA/C57BL, DBA, C57BL). Хромосомные препараты гстовили из костного мозга к оценивали так же, как описано выше.

В опытах In vivo испытывали тератогенное действие Т-2 токсина и ЦФА на развитие мышиных зародышей. Для этого беременным самкам вводили однократно на 2-й и 8-й дни беременности Т-2 токсин внутрижелудочно в дозе 1/2 ЛД-0. Вскрытие и анализ плодов проводили на 16-й день беременности. У каждой самки определяли число погибших зародышей, число желтых тел, массу плодов и плацент. ЦФА вводили на 1-й, 2-й и 8-й дни беременности внутрибршшцю в дозе 30 мг/кг, анализ плодов проводили на 18-й день беременности.

Для выявления эмбриотоксических факторов в сыворотках крови новорожденных и их матерей доимплантационные зародыши мыши культивировали в течение 48 или 72 часов в этих сыворотках.

Все полученные в экспериментах цифровые данные обрабатывали по правилам вариационной статистики- (Рокитский Г.Ф.,1967) с использованием критериев Стыоденто. Достоверность сравнимых величин "р" определяли по таблицам.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Подбор оптимальных условий для развития доимплантациошмх зародышей мыши в сыворотках крови человека и крысы

В первой серии опытов использовали 473 зародыша. Проанализировали сыворотки самок кебеременких (стадии эструса и диэструса) и беременных крыс, а также сыворотки самцов крыс. Контролем служила с.рода M16+BSA. Культивирование проводили б

стандартных условиях в течение 72 часов. Среднее количество клеток в зародышах на конец культивирования в сыворотках самцов колеблется от 82,9+4,0 до Ю5,0±6,1 (в среднем 91,5±4,9) в сыворотках самок на стадии эструса от 69,7±5,2 до 97,4+5,9 (в среднем 85,8 ±6,6),. на стадий диэструса от 65,0±3,4 до 84,1 ±4,8 (в среднем 75,0±5,5).Наилучшие результаты получены при культивировании в сыворотках беременных самок, где количество блэстомерэв достигало в среднем 103,1±4,9 на эмбрион. По результатам культивирования видно, что все испытанные образцы сывороток могут быть использованы в качестве культуралыюй среды в змбриотоксикологическом эксперименте.

Во второй серии опытов использовали 410 зародышей. Культивирование проводили 48 часов в сыворотках крови человека и в среде Mjg+BSA, служившей в качестве контроля. Развитие зародышей In vitro проходило достаточно успешно. Среднее количество клеток на эмбрион составляло для человеческой сыворотки 33,5±1,2 ; для среды MI6+BSA =-34,5±1,5. Были испытаны сыворотки крови, взятые от женщин с разными характеристиками менструального цикла (25/30 и 8/30) и от мужчины донора. Незначительное достоверное улучшение при культивировании получено в сыворотке женщины с менструальным циклом 8/30, среднее количество клеток на эмбрион 47,3+2,3. В остальных группах : 32,6± 0,9 - менструальный цикл 25/30; 33,9±1,07 -мужчина донор.

Змбриотоксикологические исследования • в культуре доимплэнтационных зародышей мыши

В данной сорт? экспериментов за короткий промежуток времени (48--72 часа) выявляли реактивные изменения зародыша при прямом добавлении препарата в культуральную . среду. Определили его недействующую и пороговую концентрации. В опытах использовали 583 зародыша.

Т-2 токсин обладает наибольшим эмбриотоксическим'действием Пороговая концентрация для этого препарата - 0,01 мкг/мл. Концентрации 1,0 - 0,01 мкг/мл полностью блокировали развитие зародышей in vitro, которые останавливались в своем развитии на стадии эксплантации. Недействующей оказалась концентрация 0,005 мкг/мл. При контакте Т-2 токсина с зародышами в течение одного часа (в опытах использовано 84 зародыша) получено, что при

концентрации 0,01 мкг/мл зародыши в своем развитии не отличались от контроля. Концентрация препарата 0,1 мкг/мл при одночасовой экспозиции оказывает эмбриолетальный эффект.

2,4,Д-Аминная соль. При оценке эмбриотоксических свойств этого пестицида определена пороговая концентрация - 30,0 мкг/мл. Концентрация 3,0 мкг/мл не оказала эмбриотоксического действия и развитие при таком содержании пестицида в среде сравнимо с контролем.

Циклофосфамид(ЦФА) - препарат с высокой пороговой концентрацией (200,0 мкг/мл). При концентрации ЦФА в среде для культивирования 50,0 мкг/мл развитие эмбрионов не отличалось от контрольных результатов. Таким образом эта концентрация является недействующей.

Для препаратов (З-хлормолочная кислота и эфир Р-хлормолочной кислоты пороговые концентрации соответственно равны 6,0 мкг/мл и 60,0 мкг/мл, а недействующие концентрации - 0,6 мкг/мл и 6,0 мкг/мл.

В следующей серии опытов проведена оценка эмбриотоксического действия препарата при возможных метаболических превращениях его в организме крыс. Использовано 743 зародыша, проанализированы следующие препараты: циклофосфамид, Т-2 токсин и 2,4Д - Аминная соль.

Циклофосфамид. Наибольшее количество эмбриотоксических факторов в крови наблюдалось через 30 мин - 1час 30 минут после введения препарата: из 80 эксплантированных в культуру зародышей погибли все 80. В сыворотке взятой через 3 часа после введения гибель зародыиёй отсутствует, но количество клеток на эмбрион достоверно меньше по сравнению с контролем: так, в опыте -59,5±4,8, а в контроле - 88,7*6,5. В сыворотке, взятой через 6 часов после введения, эмбриотоксический эффект не обнаружен, гибель зародышей отсутствует, а количество клеток на эмбрион в опыте (88,5±4,3 ) сравнимо с контролем. То же можно сказать о сыворотке, взятой через 24 часа после введения препарата.

При введении Т-2 токсина крысам в дозе 0,9 мг/кг, кровь брали через I, 3, 6. 12 и 24 часа. Ярко выраженного эмбриотоксического эффекта при культивировании зародышей в этих сыворотках крови не выявлено. Незначительное достоверное

_ д _

снижение пролиферативной активности обнаружено у зародышей, развивающихся в сыворотке крови взятой через 6 часов посла введения в опыте - (66,1*7,0), в контроле - (87,745,30).

При введении 2,4Д- аминной соли - пик эмбриотоксической активности приходится на 3 й 6 часов (гибель - 8,б+_5,53 и 40,7+_5,0 соответственно: пролиферативная активность - 55,1+_5,8 и 58,1+_6,9 соответственно). Сыворотки крови, взятые через I час или через 24 часа после введения препарата, эмбриотоксическим эффектом практически не обладают.

Недействующая и пороговая дозы определены для ЦФА -препарата с наиболее ярко выраженным эмбриотоксическим аффектом. В опытах было использовано 217 зародышей. Обнаружено, что 2,5 мг/кг -пороговая доза. Гибель зародышей, культивируемых в этой сыворотке незначительна - (6,1+4,15), а среднее количество клеток но эмбрион (63,9+3,5) достоверно отличается от контроля (87,7+4,1). Доза I мг/кг - недействующая, отличий между контролем и опытом нет. При дозе 5 мг/кг наблюдается гибель зародышей в конце культивирования (68,7+8,6^) , среднее количество клеток - 46,0+6,6. При дозах 10 и 20 мг/кг наблюдали 100^ гибель зародышей.

Определение зависимости реализации эмбриотоксического эффекта от длительности контакта с змбриотоксическими факторами и от возраста зародышей

В первой серии опытов использовано 129 зародышей. При экспозиции 3 часа зародыши развивающиеся В' опытных образцах сывороток не отличались от контроля (среднее количество клеток в опыте - 80,2+3,9, в контроле - 82,9+4,0).При экспозиции 5 часов в сыворотке после введения ЦФА гибель конце культивирования составляла - 58,6+9,2^, о среднее количество клеток -58,6+9,2, что достоверно отличается от контроля. Экспозиция в течение 24 часов приводит к 1005 гибели зародышей. Во второй серии опытов использован 641 зародыш. При введении ЦФА мышам в 1-й день беременности в дозах 300, 30 или 5 мг/кг зародышей получали через 24 часа и помещали в интактную сыворотку. В конце культивирования обнаружено, что только доза 300 мг/кг оказывает заметное воздействие на последующее развитие зародышей. Гибель составляет 28,1+7,9%, а среднее количество клеток в конеце культивирования было 51,8+5,2, что достоверно

ниже контрольного значения. При введении 30 и 5 мг/кг отсутствует достоверное различие в развитии зародышей с контролем. На 2-й день беременности при дозе введения ЗООмг/кг и последующей 3-часовсй экспозиции зародшей в организме самки наблюдалась 100~с гибель к концу культивирования. При 3-часовой экспозиции после введения 30 или 5 мг/кг отличий от контроля по количеству клеток на ' эмбрион не н а блюдэли ( в опыте соответственно 92,7*4,9 и 78,4*7,1, а в контроле 85,6±3,6). После 5-часовой экспозиции с введением 30 и 5 мг/кг получили 100 о гибель в конце культивирования. При 24-часовой и 48-час.овой экспозиции в организме самки после введения (доза 30 мг/кг) процент гибели снижен 50^ и 71,3? соответственно. При введении ЦФА на 3-й день беременности в дозах 300, 30 и 5 мг/кг гибель зародышей наблюдали уже после 3-часовой экспозиции зародышей, причем при дозе 300 мг/кг, было 1005 гибель. При дозе 30 и 5 мг/кг гибель составляла 80* и 30^ соответственно. После 5-часовой экспозиции 100> гибель наблюдали при всех концентрациях.

Эмбриотоксикологические исследования на раштх зародышах 1п у!уо в опытах с Т-2 токсином и НФА

Однократное, введение Т-2 токсина на 2-й день беременности не индуцировало увеличения доимплантационной . и постимплонтэциотюй гиболи (в опыте соответствешю - I6.0i5.2i и 16,7+5,8~ в контроле - 17,015,9=; и 17,6±6,счО. Однако масса тела плодов была несколько меньшее, чем в контроле (р<0,05), тогда как копчиково-теменной индекс в опыте соответствует контрольным данным (опыт - 1,3*0,1 см, контроль 1,4±0,1см).Такш образом, эмбриолетальный эффект при однократном введении в высоких дозах отсутствует. Выявлено достоверное подавление ростовых процессов. Результаты воздействия но 8-й день беременности согласуются с данными, полученными при введении на 2-й день беременности. Введение ПФА производили беременным самкам мышей на 1-й, 2-й или 8-й дни беременности в дезе 30 мг/кг. Напомним, что эмбриотоксическим эффектом для доимплантационшх зародышей обладала сыворотка крови крысы при введении ЦФА в дозе 5 мг/кг. Однократное введение ЦФА на 1-й и 2-й дни беременности не индуцировало

увеличения доимплянтациошюй (в опыте соответственно - 5,8.т2,7^ и 3,2+2,8*, в контроле 3,7+2,8^) и постимплантационной (в опыте соответственно - 15,0*3,7, 12,9+3,5, в контроле -7,8+3,5) гибели. Масса телэ плодов и копчиково-теменной шщокс в опыте соответствует контрольным донным. Результатом воздействия ЦФА на 1-й и 2-й дни беременности является отсутствие эмбриотоксического эффекта. При введении на 8-й день беременности значение постимплэнтациопной гибели увеличивается в опыте до 92,9+7,5*.

Выявление генотоксических свойств Т-2 токсина и ЦФА методом сестринских хроматидных обменов (CXG)

Для выявления мутагенных свойств Т-2 использовали метод СХО в культуре до- и постимплантационных зародышей. Прежде чем проводить анализ СХО на др-обящихся зародышах была подобрана т токсическая концентрация BrdU, при которой выявляются сестринские хроматидные обмены (0,04мкг/мл). При добавлении в среду Т-2 токсина в концентрации 0,С05мкг/мл число сестринских хроматидных обменов составляло 11,5+0,75, а в контроле -14,37+1,2. При добавлении препарата в среду (сыворотка крови крыс) с постимплэнтоционними зародышам;! (метаболизм исключен) число СХО на клетку составляло 4,4 +0,4 , а в контроле - 3,8 +0,4. При использовагаш в качестве культуральной среда сыворотки крови крыс после воздействия препаратом (сыворотка содержит препарат и продукты ого метаболизма) в случае, когда кр:вь брали через 6 часов после введения, число СХО было 4,2 +0,4 . через 12 часов колпество обменов на клетку - 3,9 +0,4. М::шо сделать вывод, что Т-2 токсин и его возмоише метаболиты не индуцируют увеличение числа СХО в эмбриональных клетках мыши и крысы, з значит препарат и его метаболиты не обладают мутагенными свойствами.

Генотоксичоские свойства ЦФА проверены в опытах in vivo на трех линиях мышей. Анализу после воздействия подвергался костный мозг. В контроле число СХО на клетку костного мозга у DBA/2 -'3,02+0,3, у 057BL - 4,6+3,2 И у CBA/C57BL - 3,5+0,4. В 0пыт6 соответствешго 19,9+1,4" , 19,0+1,5 и 16,7+0,8. Таким образом ЦФА обладает мутагенной активностью и является не только омбрио-, но и генотоксическим препаратом, в то время .как Т-2 токсин - не мутэгенен.

Эмбриотоксикологические исследования в сыворотках крови человека ■

Нами была предпринята попытка изучить влияние сывороток крови больных и здоровых новорожденных на ранние зародыши мыши. По нашим результатам эмбриотоксическим действием обладают образцы сывороток новорожденных от матерей с отягченной беременностью и родами, причем большинство новорожденных от этих матерей были больны в раннем неонатальном периоде. Нельзя не отметить значительного влияния перенесенной гипоксии на выраженность токсического действия сывороток крови. Тек, сыворотки 4 детей, перенесших внутриутробную гипоксию, вызывали гибель эмбрионов от 23 до 100?. В 100е; гибель эмбрионов вызывала сыворотка крови ребенка,перенесшего гемолитическую болезнь новорожденных. На экбриотоксиче скую активность нами были испытаны также 10 образцов сывороток крови новорожденных и их матерей, причем у всех новорожденных, кроме одного случая, наблюдали гемолитическую болезнь, по-видимому, токсической природы. В результате проведенного анализа установлено, что все сыворотки крови больных детей и даже их матерей содержат эмбриотоксические факторы, которые губительны для доимплантационных зародышей мыши, причем токсичность сывороток крови у новорожденных выше, чем у матерей. В сыворотке крови здорового ребенка и его матери развитие ранних. зародышей не отличалось от контрольного.

О Б С У Ж Д Е Н К Е .Р Е 3 У Л Ь Т А Т О В Данная работа представляет собою исследование чувствительности доимплантационных зародышей мыши к повреждающему действию эмбриотоксических факторов. В этом аспекте изучение общей чувствительности доимплантационных зародышей in vivo и in vitro к действию повреждающих агентов следует рассматривать как научную основу дляразработки комплекса методов предварительного ускоренного .тестирования химических веществ на эмбриотоксичность.

При подборе оптимальных условий для культивирования зародышей был проведен анализ цельных сывороток крови крысы и человека на токсичность в зависимости от их гормонального фона. Такое -исследование для цельных сывороток не проводилось. С учйтом полученных нами результатов, можно сделать вывод, что цельные сыворотки крови могут использоваться в эмбриотоксическом

эксперименте для культивирования в них доимплантационных зародышей. Присутствие небольшого количества эстрогенов в крови человека увеличивает пролиферативную активность зародышей 1п vitro, что подтверждается данными Баумана (Bownian et al., 1970).

. При добавлении исследуемых " препаратов в среду с доимплантационными зародышами получена прямая зависимость проявления эмбриотоксического эффекта от концентрации. Подобная зависимость свидетельствует об одноудэрном механизме возникновения повреждений ln vitro, и она обычно прослеживается для большенства соединений, тестируемых ln vitro (Spielmann et al., 1978; Izquierdo and Becker, 1982; Yu et al., 1985, 1986; Vogel and Spielmann 1988). В наших опытах наиболее активный по своему эмбриотоксическому действию Т-2 токсин (ингибитор синтеза белка), менее активный - ЦФА (пролекарство - ингибитор синтеза.ДНК).

Исследование токсичности препаратов с использованием сыворотки крови крыс после введения позволило определить токсические свойства не только самих препаратов, но и возможных метаболитов, а также выявить динамику эмбриотоксических факторов в крови крыс. Опредчлить пороговую и недействующую дозы. Были прослежены следующие изменения в токсических свойствах препаратов при попадании их в организм.

. 1)Препарат с токсическими свойствами, попадая в кровь, подвергается медленной детоксикации ферментными системами организма. Исходя из результатов наших опытов, мы можем предположить, что именно это происходило с 2,4 Д - Аминной солью, т.к. е8 действующая концентрация в сыворотке крови крыс после введения препарата (если принять, что 1грэмм тела соответствует I мл среды) близка действующей концентрации при прямом добавлении 2,4Д-Аминной соли в среду с зародышами, а эмбриотоксический эффект после введения наблюдали в сыворотках взятых через 3 и 6 часов, сыворотки взятыэ через I и 24 часа после введения препарата не обладали эмбриотоксическим эффектом для дробящихся зародышей. Это совпадает с данными по токсикокинетике препарата (Clark et al., 1964). Известно, что хлорфенилуксусные пестицида, к которым относится 2,4Д-Аминная соль, практически полностью выводятся из организма млекопитающих через сутки после введения.

2)Препарат с токсическими свойствами, попадая в кровь очень-быстро подвергается детоксикации и выведению из организма. Исходя из результатов наших опытов мы можем предположить, что именно так происходило с Т-2 токсином. Только в сыворотке, взятой через 6 чесов наблюдали незначительное достоверное снижение пролиферативной активности у развивающихся в ней зародышей, в остальных образцах сывороток развитие сравнимо с контролем. Сходные результаты получены в опытах In vivo. Из литературных данных известно, что скорость превращения Т-2 токсина в менее токсичные производные In vitro, при культивировании его с надосадочной фракцией гомогензта печени крыс составляет 60 минут (Yoshlzawa et al., 1980). Эти данные подтверждают наши результаты, и свидетельствуют о быстром метаболизме препарата в организме.

3)Препарат со слабыми токсическими свойствами, пападая в кровь, быстро подвергается метаболизму с образованием более активных по токсическим свойствам продуктов, которые затем подвергаются детоксикации и выводятся из организма. Исходя из результатов наших опытов, мы можем предположить, что именно так происходило с ЦФА. Наши данные по динамике эмбриотоксических факторов в крови крыс после введения им ЦФА совпадают с данными, полученными при изучении фэрмакокинатики этого препарата в крови у крыс (Brök et al., 1971). Проведённое' нами исследование позволяет сделать вывод, о высокой чувствительности и адекватности используемого метода. Поскольку экспозиция зародышей с повреждающими агентами In vitro значительно дольше чем In vivo, то в результате этого,метод преобретает и большую чувствительность, что очень важно при скрининге. Например, в опытах In vivo до- и постимплантационные зародыши отличаются, по чувствительности к препаратам с.цитостатическими свойствами -ЦФА и 2,4Д-Аминная соль (Сокодак, 1974; Spielmann, et al., 1977; 1978). В опытах In vitro они имеют одинаковую чувствительность к ЦФА за счет более ' длительного экспонирования с ним (Попов с соавт., 1976; Архангельская, 1992). . Таким образом, реализация эмбриотоксического .эффекта . прямо зависит от длительности •контакта с повреждающими /агентами, причем- по нашим данным она также определяется.и; возрастом зародыша. . Рассмотрим подробно "эту "зависимость. ^

ПВлияние длительности контакта с эмбриотоксическими агентами на эффективность воздействия in vivo и in vitro.

При анализе результатов опытов краткосрочного экспонирования зародышей в сыворотке крови крыс после введения ЦФА и в организме матери после введения ЦФА, прослеживается зависимость эффективности воздействия от длительности экспозиции с эмбриотоксическими факторами, которая несколько отличалась в опытах in vivo и in vitro. С увеличением длительности пребывания зародышей с эмбриотоксическими факторами in vitro эффект нарастает до максимально возможного к 24 часам. При увеличен™ экспозиции зародышей в организме матери, максимально возможный эффект наступает через 5 часов. При последующем увеличении времени до 24 или 48 часов - происходит снижение проявления эмбриотоксического эффекта, по сравнению с 5-часовой экспозицией in vivo. Это, вероятно, связано с ролью материнского организма. Таким образом, эффективность воздействия in vitro и in vivu зависит от длительности контакта с эмбриотоксическими факторами. В случае in vivo в реализации эмбриотоксического эффекта принимает участие материнский организм.

Полученное нами улучшение состояния зародышей при увеличении срока пребывания их в организме матери после воздействия, можно объяснить особенностью репаративкых систем клетки, которые неодинаково работают в разных условиях. Например, различную чувствительность к элкилирущим препаратам в постимплантационной культуре зародышей крысы и в органной культуре конечностей зародышей крысы связывают с различной репарацией ДНК в этих системах (Seely and Faustman, 1995). Доказано, что "неплановый синтез ДНК" посла ультрафиолетового облучения зародышей in vitro происходит уже на 2 клеточной стадии (Spielmann, Elbs, 1973), срок - когда мы и производили воздействия. То, что после действия алкилиругацих агентов (нитроэомочевина) репар-штные процессы проходят неодинаково in vivo v. in vitro у ранних зародышей, продемонстрировано в роботе Фогеля с соавторами (Vogel et al., 1989). Наши результаты отражают ту же закономерность при воздействии на зародыши ЦФА.

то:шо предложить и другой механизм исправления повреждений, который основан но композиционной гетерогенности популяции клеток в ранних зародышах мыши (Самошкина, 1978) и способности

дробящихся зародышей мыши, за счет полипотентности бластомеров, . компенсировать свое развитие при потере части погибших клеток (Tarkowski and Wroblewska, 1967: Wllladsen, 1931; Архангельская, 1985). Необходимо подчеркнуть, что гетерогенность в настоящее время выявлена уже на стадии 2 бластомеров (Паткин, 1995), именно на той стадии, на которой мы и производили воздействие. В связи с тем, что скорость пролиферации in vivo, несколько выше, чем in vitro (смотри наш данные), зародыши развивающиеся после повреждения in vivo, могут частично компенсировать повреждения и, таким образом, улучшить общую картину развития. Оба высказанных нами предположения требуют специального исследования. На основании наших результатов мы можем предположить, что различная чувствительность зародышей при увеличении экспозиции in vivo зависит скорее не от различий в механизмах повреждения, а от различий в механизмах репарации этих повреждений, которые по разному происходят in vitro и в организме матери. Яйцевод in vivo не выступает в качестве биологического барьера для метаболитов ЦФА, как это показано для тимидинэ (Дыбан с соавт., 1976), т.к. пятичасовая экспозиции зародышей в организме матери приводит к 100% гибель.

2)Влияние возраста зародышей на эффективность воздействия.

. В литературе* в настоящее время. существуют достаточно противоречивые сведения относительно чувствительности зародышей разных стадий развития к воздействию, что можно объяснить разнообразным механизмом . действия химических или физических .. агентов (O'Hsugi.Yamamura, 1993; Toitzis et al., 1993; Leach et al., 1993) Считается, что стадия зиготы в эмбриогенезе сравнительно устойчива к действию токсических агентов (Generoso . et al., 1988). Однако установлено, что зигота достаточно чувствительна к веществам с мутагенной активностью (Bishop et al., 1989) и обработка, йапример, митомицином С приводит к гибели зародыше^ на доимшштационных стадиях развития (Nagao et al.,1986). Найдены- вещества, пос.-е воздействия которыми на стадий зиготы, эффект обнаруживается в конце эмбрйогейеза в виде пороков развитая и гибелй плодов. Например, нйтрозомочевина .(Nogao et al.,1991) и эТйлен оксйд (Rutledge et al., 1989). МеханйзМ.по которому Мутагены индуцируют патогенез развития этих пороков, пока яе известей. Результаты исследований показывают,

что мышиная зигота является окном для восприимчивости экспериментальной индукции аномалий развития (Rutledge et al., 1993). При анализе результатов после воздействия на стадии зиготы надо учитывать, что биологическое действие алкилирующих соединений, таких как ЦФА или нитрозомочевина, проявляется в нескольких типах клеточных эффектов: I) цитостатический, 2)мутагенннй и 3)цитотоксический (Митрофанов, Олимпиенко, 1930). Проявление эффекта на поздних стадиях эмбриогенеза после воздействия па стадии зиготы очевидно связано с мутогетшм действием препарата, а реакция, выявляемая на доимплантационных зародышах, включает в себя проявление всех трех эффектов. В качестве агента для воздействия мы выбрали ЦФА, так как по нашим и литературным данным (Hanson et al., 1982; Vogel et al.« 1985) он обладает мутагенной активность. При этом известно, что скорость образования алкилиругашх метаболитов ЦФА в печени крыс чрезвычайно высока и малая их концентрация наблюдается уже через 30 минут после введения препарата (Brök, 1971). Эмбриотоксический эф!ект ЦФА у мышей и крыс одинаков (Gibson et al., 1971). Мн производили введение ЦФА беременным самкам через 15-16 часов после спаривания, 8 анализ результатов воздействия проводили на стадии бластоцисты. Полученную наш очень тгакую чувствительность зиготы к алкилирующим продуктам метаболизма ЦФА (определяли по результатам развития in vitro до стадии бластоцисты, а также в опытах in vivo), можно обьяснить наличием в оплодотворенной яйцеклетке запасов белков, критических для начальных стадий развития, а также присутствием в ней всех компанентов трансляции, необходимых для синтеза новых белков (Johnson, 1981). Первые 24-27 часов развития мышей контролируются исключительно предшествующей генетической информацией, трансляция зародышевого генома начинается со стадии двух бластомеров (Bolton et al., 1984; Thompson et al.,1995). По нашим данным усиление чувствительности зародышей к метаболитам ЦФА такте происходит с двухклеточной стадии и несколько увеличивается у зародышей третьего дня развития. Это совпадает с данными по .усилению транскрипции отцовского генома с восьмиклеточной стадта (Dvorak et al., 1995), а также с данными цитогеиетических исследований (Патшпт,. Сорокин, 1983; Dyban et

al., 1990) в которых получено, что с увеличением возраста зародышей на доимплантационных стадиях развития возрастает среднее число ядрдокообразующих районов метафазных хромосом, что является достоверным критерием активного состояния рибосомных генов в предшествующей интерфазе. Таким образом, мы показали корреляцию зависимости реакции зародышей на воздействие ЦФА от их цитогенетических характеристик, которые определяются возрастом зародышей.

Следующая задача нашего исследования - найти связь между ответом, полученным в 'результате тестирования сывороток крови человека , и патологиями, диагностируемыми у новорожденных и их матерей. Известно,что ряд патологических процессов в организме человека и животных приводит к появлению в сыворотке крови эмбриотоксических факторов (Damewood et al., 1990; Toder et al., 1990; Zusrnann et al., 1985). В полученных нами результатах явно просматривается связь токсичности сывороток новорожденных и их здоровья. Из 12 новорожденных, чьи сыворотки крови содержат эмбриотоксические факторы, выявленные с помощью культуры доимплантационных зародышей, только 3 клинически здоровы на момент выписки из родильного дома. Дальнейшая судьба этих детей не прослежена. У % детей с гемолитической болезнью, по-видимому, токсической природы, и их матерей в сыворотках выявлены эмбриотоксические факторы.

Таким образом, полученные данные показывают, что уже на самых начальных стадиях развития зародыши млекопитающих обладают высокой чувствительностью In vitro :с эмбриотоксическим факторам различной природы. Культуру разбивающихся вне материнского организма доимплантационных зародышей мыши можно рекомендовать для изучения повреждающего действия на эмбриогенез различных химических веществ, а также для анализа сывороток крови человека на присутствие эмбриотоксических факторов, являющихся причиной различных . форм бесплодия женп$ин или патологией плода и новорожденного.

- 19 -ВЫВОДЫ

I.Развитие доимплантационшх зародышей мыши в цельных сыворотках крови крысы и человека осуществляется без заметных патологических отклонений от нормы и не зависит от гормонального статуса животных.

2.Чувствительность доимплантационных зародышей мыши in vitro к повреждающему действию Т-2 токсина, ЦФА, 2,4,Д-Аминной соли, (3-хлормолочной кислоты и аб эфира зависит от концентрации препарата, которая создается в сыворотке крови при прямом добавлении или посла введения во взрослый организм крысы.

3.Т-2 токсин обладает сильными эмбриотоксическими свойствами при прямом добавлении в сыворотку крови интактных крыс и теряет их в,организме в результате метаболизма. Сыворотка крови.крыс посла введения им Т-2 токсина на оказывает эмбрио- и генотоксического действия на доимплантационные зародыши мыши.

4.ЦФА на обладает сильными эмбриотоксическими свойствами при прямом добавлении в культуральную среду и приобретает их в организме в результата метаболизма. Сыворотка крови крыс посла введения им ЦФА оказывает на развитие зародышей сильное повреждающее действие. Препарат обладает ганотоксическими свойствами.

5.Чувствительность зародышей к ЦФА зависит от концентрации препарата, длительности экспозиции, и стадии развития зародышей, на которой происходит воздействие.

6.Ослабление чувствительности -зародышей к действию повреждающих факторов при увеличении времени экспозиции в организме матери с 5 до 48 часов после введения ЦФА, свидетельствует о том, что материнский организм ослабляет повреждающее действие препарата.

7.В сыворотках крови, полученных от больных матерей и больных новорожденных детей, присутствуют эмбриотоксические факторы, которые выявляются при культивировании в mix доимплонтациошшх зародышей мыши.

8.Сыворотка крови новорожденных и их матерей может быть использована для скрининга в ней эмбриотоксических факторов.

Список работ опубликованных по тема диссертации:

1.Попов В.Б., Архангельская И.Б., Танюхина O.A. Эмбриотоксические. исследования In vitro: подхода к выявлению оценки химических тератогенов окружающей среда. В сб.:"Экология и токсикология", Материалы IV пленума правления ВНОТ, Л.1990, стр.147 - 150.

2.Попов В.Б., Архангельская И.Б.,Танюхина С.А. Выявление в крови женщин эмбриотоксических факторов, индуцированных вредным воздействием или заболеванием. Материалы конференции "Профилактическая медицина'. Состояние и перспективы".Л.I991, стр.107.

3.Попов В.Б., Архангельская И.В.,Танюхина С.А. Экспресс-оценка in vitro и прогнозирование эмбрио- и генотоксических исследований химических воздействий. Тезисы доклада Всесоюзн.конф. "Токсикологические проблемы химических катастроф", Л.1991, стр.85.

4.Попов В.Б., Архангельская И.Б., Ташшша С.А. Тератогены и мутагены, окружащей среда: оценка при их биотрансформации in vitro.-'' Тезисы доклада Межреспубликанской конференции "Экологическая оценка последствий техногенного изменения окружающей среда в регионе"ЛЛ991, стр.93-94.

Б.Попов В.Б., Архангельская И.Б. Эндогенные факторы сыворотки крови и развитие эмбрионов in vitro. Тезисы доклада 4 Всес.конф. "Эндокринное системы организма и вредные факторы окружающей среда." I5-I9C6HT. 1991, стр. 988.

6.Архангельская И.Б'. Экспресс-оценка эмбриотоксических свойств веществ В культуре предимплантационных зародышей. Гигиена и санитария, N 5-6, 1992, стр.68-70.

7.Архангельская И.Б., Штильбанс В.И., Чеботарь H.A., Котин A.M. Влияние сывороток крови новороаденных на раннее эмбриональное развитие Мышей In vitfro. Ёюлл.экс.биол.и Мед. 1994, т.118, N 7, стр.6-8.

в.ВасильэВа З.Ф., Штильбаас В.И., Муратова H.H., Архангельская И.Б. Антиорганше антитела. в Крови матерей и йоворождейных, сенсибилизированных эритроцитарными антигенами. Тезисы докладе Российской конференций " Актуальные вопросы службы крови й трансфизиологии". 6-8 июня 1995 года. СПб., стр. 74-76.

Тчп РНшф,, Ш. St.г №. Iff Q'ii-