Автореферат и диссертация по медицине (14.00.14) на тему:Биотехнология иммуномагнитных сорбентов для онкологии

На правах рукописи

ГОЛБНКИНА Екатерина Александровна

БИОТЕХНОЛОГИЯ ИММУНОМАГНИТНЫХ СОРБЕНТОВ ДЛЯ ОНКОЛОГИИ

14.00.14 - онкология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 2003 г.

Работа выполнена в ГУ Российском Онкологическом Научном Центре им. H.H. Блохи на РАМН (директор - академик М.И. Давыдов)

Научные руководители:

доктор медицинских наук, профессор АЛО. Барышников доктор медицинских наук П.К.Иванов

Официальные оппоненты:

Доктор медицинских наук, профессор З.Г. Кадагидзе Доктор биологических наук A.B. Филатов

Ведущее учреждение:

Московский Научно-исследовательский Онкологический Институт им. П.А. Герцена МЗ РФ

Защита состоится 'хУ " 2003 г. в /Г часов на заседании диссер-

тационного совета по защите диссертаций (К.001.017.01) при ГУ Российском Онкологическом Научном Центре им. Н.Н. Блохина РАМН (115478, Москва, Каширское ш., 24)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГУ Российского Онкологического Научного Центра им. H.H. Блохина РАМН,

Автореферат разослан iffi." йа^С^^'2003 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор медицинских наук, профессор

Ю.А. Барсуков

дСООВ-^

ЫЗЗ

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ АКТУАЛЬНОСТЬ

Одним из направлений повышения эффективности терапии злокачественных новообразовании является поиск путей преодоления побочных эффектов, связанных с отсутствием строгой избирательности действия противоопухолевых препаратов. Использование этих препаратов в высоких дозах не только позволяет остановить прогрессию опухоли, но и вызывает значительную регрессию

новообразования, а также предотвращает возможность развития рецидивов заболевания. Однако цнтотоксичность, которая обуславливает противоопухолевое действие подавляющего большинства химиотерапевтических средств, применяемых в онкологии, одновременно является и основным ограничением их применения. Терапия мощными цитостатиками не может проходить бесследно для нормальных клеток организма. Наиболее серьезные осложнения связаны с гибелью стволовых гемопоэтическнх клеток костного мозга, приводящей к нарушению естественных процессов обновления крови, анемии, прогрессирующей потере иммунитета.

Эффективным подходом к преодолению данного естественного ограничения терапии цитотокснческимн агентами является трансплантация аллогенных или аутологичиых клеток периферической крови или костного мозга. При этом, однако, проведению аутологичиой трансплантации, вследствие высокой вероятности наличия в костном мозге и кровотоке опухолевых клеток, сопутствует риск рецидивов основного заболевания. Пересадка аллогенных гемопоэтическнх клеток может сопровождаться развитием реакции «траисплантат-против-хозяина» (РТПХ).

Одно из возможных решений перечисленных проблем заключается в предварительной сепарация трансплантатов, целью которой может являться удаление нежелательных клеток (опухолевых, аллореактивных) или выделение из исходно гетерогенного материала определенных тип

Среди многочисленных методов направленного разделения клеток наиболее эффективным является иммуномагнитная сепарация (ИМС). Этот подход основан на одновременном использовании строгой избирательности взаимодействия моноклопальных антител (МКА) с антигенными детерминантами клеток-мишеней и магнитоуправляемости корпускулярных носителей - магнитных микросфер.

От других способов селекции биологического материала технологию ИМС выгодно отличает уникальное сочетание специфичности и чувствительности с высокой скоростью разделения исходных клеток. Эти качества обеспечивают преимущественное использование именно иммуномагнитной сепарации для предтрансплантационной обработки гемопоэтических клеток.

Данные научных исследований и результаты клинических испытаний, проведенных за рубежом, свидетельствуют об эффективности использования позитивной иммуномагнитной селекции при изоляции стволовых кроветворных клеток для дальнейшего культивирования и манипуляций in vitro и, что особенно важно, для дальнейшей трансплантации онкологическим больным. Магни-тоуправляемые сорбенты широко используются для полной или частичной деп-леции Т-лимфоцитов из костного мозга и периферической крови доноров, а также для удаления опухолевых клеток из аутологичных трансплантатов. Вместе с тем, на сегодняшний день нет единого мнения относительно характеристик сорбента, сепарирующих устройств и условий осуществления селекции. Хотя преимущества метода ИМС делают его использование наиболее предпочтительным, прочное внедрение метода в научно-исследовательскую и клиническую практику все еще требует решения ряда вопросов. Дальнейшее развитие и широкое использование этого перспективного подхода в нашей стране ограничивается высокой стоимостью расходных материалов и сепарирующих устройств зарубежных фирм-производителей. Таким образом, создание на основе отечественных материалов и оборудования системы иммуномагнитной сепарации и внедрение ее в практику являются очень актуальными задачами.

ЦЕЛЬ ИССЛЕДОВАНИЯ

Целью данного исследования явилось создание системы и мму но магнитной

сепарации, обеспечивающей возможность эффективного разделения гемопоэтических клеток человека.

ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ

1. Разработать комплекс аналитических методов исследования и стандартизации магнитных микроносителей н иммуномзгнитиых сорбентов.

2. Получить опытную партию магнетитовых полистироловых микросфер (МПМ) и охарактеризовать их физико-химические свойства.

3. Выявить оптимальную технологию создания иммуномагнитных сорбентов на основе синтезированных микроносителей и МКА.

4. Создать панель имму нос пе ц и ф ич ее к и х магнитоуправляемых конъюгатов (ИМК) для направленного разделения гемопоэтических клеток человека.

5. Оценить эффективность селекции гемопоэтических клеток человека с использованием полученных конъюгатов.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА

1. Получены экспериментальные подтверждения соответствия магнитных свойств синтезированных МПМ всем требованиям, предъявляемым к магни-тоуправляемым микроносителям для создания биомагнитных сорбентов.

2. Выявлены оптимальные условия иммобилизации векторных молекул на поверхности МПМ. Продемонстрирована возможность получения иммуномагнитных конъюгатов путем пассивной адсорбции и с помощью ковалентного связывания МКА с магнитным носителем.

3. Показано, что оптимальным подходом к созданию иммуномагнитных конъюгатов является ковалентное присоединение МКА к поверхностным гидро-ксильным группам, активированным избытком /?-толуолсульфонилхлорида.

4. Получены иммуномагнитные сорбенты на основе магнитных микроносителей и МКА против мембранных антигенов лимфоцитов человека СОЗ. СР4,

CDS, CD20 и CD34. Экспериментально показано, что использование созданных конъюгатов обеспечивает высокую эффективность иммуномагнитного разделения гемопоэтическнх клеток человека. 5. Разработан комплекс физико-химических методов, адаптированных в соответствии с особенностями используемого материала, который позволяет осуществлять качественный и количественный контроль за свойствами им-муномагнитных конъюгатов на каждом этапе получения.

НАУЧНО-ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ

Предполагаемое клиническое применение полученных сорбентов, в первую очередь, связано с сепарацией клеток костного мозга, предназначенного для трансплантации онкологическим больным.

Экспериментально показанная эффективность сепарации С034+-клеток с помощью иммуномагнитного конъюгата МПМ-iСО-115 открывает перспективу дальнейшего применения этого сорбента для получения чистых популяций стволовых кроветворных клеток методом позитивной селекции. Негативная селекция с использованием конъюгатов МПМ с МКА ICO-90, ICO-31, ICO-86 и ICO-180, может быть использована для элиминации опухолевых клеток из костного мозга больных Т- и В-клеточными лимфомами перед аутологичной трансплантацией. Им мун о магнитное истощение Т-клеточной популяции донорского костного мозга может стать способом предотвращения развития реакции "трансплантат-против-хозянна". Созданные сорбенты могут использоваться и при получении дендритных клеток для создания противоопухолевых вакцин.

Предлагаемый комплекс аналитических методов, модифицированных с учетом специфики исследуемого материала, и определенные оптимальные физико-химические критерии могут стать основой для стандартизации биомагнитных сорбентов.

Апробация работы

Апробация работы состоялась 09 июня 2003 г. на совместной научной конференции с участием лабораторий медицинской биотехнологии, фармакоцитокинетики экспериментальной диагностики и биотерапии опухолей, клинической иммунологи, фармакологии и токсикологии, отдела экспериментальной химиотерапии НИИ ЭДиТО, отделения трансплантации костного мозга, интенсивной химиотерапии и реанимации, отделения изучения новых противоопухолевых лекарств НИИ КО РОНЦ им.H.H. Блохина РАМН,

Основные положения диссертации представлены на 9-й и 10-й Международных конференциях по магнитным жидкостям (Плес, Россия, 2000 и 2002 г.г.), V Всероссийском Съезде онкологов (Казань, Россия, 2000), 1-м симпозиуме "Применение биомагнитных носителей в медицине" (Москва, Россия, 2002 г.), 4-й международной конференции "Scientific and clinical applications of magnetic carriers" (Tallahassee, США, 2002 r.)

Публикации

Материалы, изложенные в диссертации, оформлены в виде 9 публикаций.

Объем и структура диссертации

Диссертационная работа изложена на 119 страницах машинописного текста. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, результатов собственных исследований и их обсуждения, заключения, выводов, списка литературы. Работа иллюстрирована 5 таблицами, 34 рисунками. Список литературы включает 110 работ, в том числе 9-отечественных авторов и 101 -иностранных,

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Синтез магнитных поянстнроловых микросфер

МПМ получали методом эмульсионной полимеризации сополимеров с коллоидом магнетита.

Получение магнетита

Магнетит (РезО^) синтезировали путем реакции солей железа (РеС^ и РеЗС^) • аммиаком в водном растворе. Продукт реакции осаждали в поле постоянного маг нита и несколько раз промывали декантацией. После отмывки заменяли водиув фазу этиловым спиртом, осаждали центрифугированием и проводили пептизацик частиц магнетита в смеси органического растворителя и ПАВ.

Проведение эмульсионной полимеризации

В 400 мл дистиллированной воды с 0,25% додецилсульфата натрия (ДСН) вносили отдельно приготовленную смесь мономеров (20 г стирола, 2 г диви-нилбензола) и коллоида магнетита (4,5 г). Для получения МПМ с поверхностными карбоксильными группами к смеси мономеров и коллоида магнетита при синтезе добавляли 1 г сополимера - малеинового ангидрида. Получали эмульсию путем интенсивного перемешивания смеси в течение 10 мин при комнатной температуре с последующей обработкой ультразвуком (22 кГц, 40 вт/смг) в течение 30 секунд.

Для проведения полимеризации к полученной эмульсии добавляли 100 мл 1% персульфата калия и инкубировали смесь в течение 24 часов при 60°С и постоянном перемешивании. После этого температуру увеличивали до 70°С и продолжали полимеризацию еще 60 минут. После охлаждения смесн полученные МПМ осаждали центрифугированием (500 g) 15 минут), промывали раствором ДСН и концентрировали МПМ в поле постоянного магнита с напряженностью 2000 Э в течение 30 минут. Очищенную таким образом суспензию МПМ в растворе ДСН фильтровали через фильтр с диаметром пор 3 мкм и профильтрованные МПМ суспендировали в растворе ДСН до конечной концентрации 10 мг/мл и хранили до использования при температуре 4 °С.

Исследование физико-химических свойств магнитных полистнроловых микросфср

Магнетометрическое исследование МПМ проводили на вибрационном магнетометре 7000А (Вгикег, США), определяя следующие характеристики: оста-

точное намагничивание (Вг); намагничивание насыщения (В5); текущее намагничивание (В,,); коэрцитивная сила (Не); магнитная восприимчивость (ц) и величина текущего магнитного поля (НД Удельное намагничивание МПМ определяли из формулы:

(Т) = К. х Вк/т,

где Вх - показания прибора, т - масса навески образца, К - коэффициент пропорциональности, равный удельному намагничиванию калибровочного образца.

Для качественного определения функциональных групп МПМ на основе мономеров и магнетита анализировали методом инфракрасной спектроскопии на спектрофотометре Зресогс! М80 (ГДР).

Измерение диаметров, а также оценку распределения частиц по размеру проводили методом корреляционной спектроскопии светорассеяния (динамического лазерного светорассеяния (ДЛС)) на устройстве МСОМР 380 (США), при длине волны гелий-неонового лазера 632,8 им.

Получение нммуиомагнитных конъюгатов

Получение МКА

Все МКА выделяли из асцитической жидкости мышей ВАЬВ/с, которым внутрибрюшинно инокулировали клетки соответствующей продуцирующей гибридомы.

МКА 1СО-115 получали из асцитической жидкости путем осаждения сульфатом аммония. Непосредственно перед выделением иммуноглобулинов проводили осаждение альбуминовой фракции, внося каприловую кислоту до конечной концентрации 2,5%. Выпавший осадок отделяли центрифугированием (7800 g, 30 мин), а к супернатанту добавляли сульфат аммония до 50%-ного насыщения соли. Осадок, полученный после центрифугирования реакционной

смеси (2000 g, 10 мин), растворяли в фосфатно-солевом буферном растворе (ФСБ) и удаляли сульфат аммония путем диализа против того же буфера.

МКА ICO-90, ICO-86, 1СО-31 и ICO-180 получали с помощью аффинной хроматографии на колонке с протеином А на сефарозе CL-4B (Pharmacia,'Швеция). В качестве стартового буфера использовали 0,02 М Na-фосфэтный буфер, рН 7.0. Элюировали IgG 0,01М Na-цитратным буфером (рН 3.0) при УФ-детекции выхода компонентов. Полученный раствор IgG сразу нейтрализовали 10 М Трис-HCl (рН 9.0) до конечного значения рН 7.4.

Активация поверхностных гидроксильных групп МПМ р-толуолсульфонилхлоридом fp-TCXI

Непосредственно перед проведением активации МПМ ступенчато переводили из водной эмульсии в диоксан путем последовательного центрифугирования Í ресуспендирования в смеси дистиллированная вода: диоксан = 2:1, 1:1,1:2 и в чистом диоксане. Суспензию МПМ в суспензии в чистом диоксане центрифугировали (600 g, 5 мин), к осадку добавляли раствор р-ТСХ в смеси пиридина с диоксаном (соотношение растворителей 5:1). Смесь инкубировали 1 ч при комнатной температуре, после чего отделяли частицы центрифугированием (900 g, 7 мин) и ступенчато переводили из органического растворителя в водную фазу. Доводили концентрацию активированных МПМ в суспензии до 10 мг/мл.

Конъюгиросание иммуноглобулинов с МПМ

Получение шшуномагнитных конъюгатов путем пассивной адсорбции и путем ковалентного связывания после активации р-ТСХ

Для определения оптимальных условий конъюгации изучали разные составы буферных растворов (0,025М боратно-солевой буфер, рН 8,5; 0,05М карбонат-но-солевой буфер, рН 9,5 и 0,05М и 0,015М фосфатно-солевой буфер, рН 7,4) и разное время инкубации (от 30 мин до 24 час).

10 мг МПМ (неактивированные - для пассивной адсорбции, активированные />-ТСХ - для ковалентного связывания) в соответствующем буфере смешивали с раствором МКА (500 мкг в 1 мл буферного раствора). Полученную смесь ин-

кубировали в течение разного времени при 4°С и постоянном перемешивании. По окончании инкубации микросферы отмывали и блокировали свободные участки связывания бычьим сывороточным альбумином (БСА) (инкубация в 0,1% растворе БСА в 0,05М ФСБ в течение 30 мин, после чего в 0,1% БСА в 0,2 М Трис-НС1-буфере (рН 8.5) в течение 24 ч при 4°С), Готовые конъюгаты хранили в ФСБ (рН 7.4), содержащем 0,1% БСА и 0,05%

В качестве негативного контроля для оценки нсспецифического связывания частиц сорбента с клетками использовали магнитные микросферы, обработанные только блокирующими реагентами.

Содержание МКА в сунернатантах определяли, измеряя поглощение раствора белка (А2яо) (методика Варбурга и Кристиана), а также методом простой радиальной иммунодиффузии по Манчини (2).

Конъюгирование МКА с карбоксилированпыми магнитными микросферами

Иммобилизацию МКА на поверхности МПМ, синтезированных на основе мономеров и малеинового ангидрида, проводили в буферном растворе, содержащем 2-(М-морфолино)этансульфоновуто кислоту (МЕ5) (рН 7.2). Для активации функциональных групп МПМ обрабатывали 1-этил-3-(2-диметиламинопропил)карбодиимндом (ЕЭС) (10 мг ЕЭС на 10 мг носителя) в течение 15 мин при комнатной температуре с постоянным перемешиванием. Активированные МПМ дважды отмывали ФСБ и смешивали с раствором МКА в том же буфере. Смесь инкубировали в течение 4 ч при комнатной температуре с постоянным перемешиванием. По окончании инкубации микросферы отмывали и блокировали свободные участки связывания путем инкубации с 0,1% раствором бычьего сывороточного альбумина (БСА) в 0,05М ФСБ в течение 30 мин и затем с 0,1% БСА в 0,2 М Трис-НС1-буфере (рН 8.5) в течение 24 ч при 4°С. Готовые конъюгаты хранили в ФСБ (рН 7.4), содержащем 0,1% БСА и 0,05% №N3.

Иммуиомагннтная сепарация (ИМС)

Эксперименты по ИМС клеток осуществляли с использованием мононукле-арных клеток периферической крови человека (для тестирования МКА ICO-90, ICO-86, ICO-31 и ICO-1SO) и культуры клеток острого миелоидного лейкоза человека KG-1 (для тестирования МКА ICO-115).

Мононуклеарные клетки периферической крови выделяли путем центрифугирования (400g, 45 мин) в градиенте плотности фиколл-верографина (1,077 г/см). Собирали клетки, концентрирующиеся в виде кольца в интерфазе, отмывали несколько раз в ФСБ (рН 7,4) путем центрифугнрова-ния/ресуспендирования и подсчитывали клетки в камере Горяева общепринятым методом.

Клетки линии KG-1 отмывали от культуральной среды центрифугировани-ем/ресуспендированием в ФСБ несколько раз и получали конечную суспензию клеток в ФСБ.

Иммуномагнитиая селекция клеток

Перед проведением селекции клеток магнитные микросферы дважды отмывали рабочим раствором (в 0,01М ФСБ (рН 7,4) с 0,5% БСА и 2шМ EDTA), концентрируя в неоднородном магнитном поле постоянного магнита. Клетки-мнщени (10х106 клеток/1 мл рабочего раствора) смешивали с МПМ, конъюги-рованными с МКА, в соотношении 3:1 и инкубировали при медленном постоянном перемешивании. Для определения оптимальных условий сепарацию проводили в условиях разной температуре (от 4 до 22°С) и продолжительности (от 15 до 60 мин) инкубации. Для разделения образец помещали в неоднородное поле постоянного магнита на 5-10 мин, концентрируя связавшиеся с частицами сорбента клетки в виде узкой полосы на стенке пробирки (позитивная фракция), и осторожно удаляя супернатант (негативная фракция). Эффективность селекции (долю антиген-положительных клеток до и после ИМС) определяли путем прямой и непрямой реакции иммунофлуоресценции (РИФ).

Иммунофлуоресцентный анализ

Непрямой метод иммунофлуоресцентного анализа

В непрямой реакции иммунофлуоресценции (РИФ) клетки в количестве от 300 тыс до 1 млн на пробу инкубировали с МКА в течение 30 мин при комнатной температуре. Несвязавшиеся МКА удаляли однократной отмывкой I мл ФСБ, после чего добавляли Р(аЬ)гфрагмелтов IgG, конъюгированных с флуо-ресцеин-изотиоцианатом (FITC). Инкубировали 30 мин при 4°С, несвязавшиеся Р(аЬ)2-фрагменты удаляли отмывкой в ФСБ и фиксировали образцы 200 мкл 1% формальдегида.

Прямой метод иммуноресиентного анализа

В прямой РИФ клетки инкубировали с МКА, конъюгированными с FITC или с фикоэритрином (РЕ) в течение 30 мин при 4 °С. Несвязавшиеся МКА удаляли двукратной отмывкой ФСБ и фиксировали образцы 1% формальдегидом.

Во всех случаях флуоресценцию клеток регистрировали методом проточной цитофлуориметрии на проточном цитофлуориметре FACScan (Becton Dickinson) согласно инструкции по эксплуатации прибора.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ОБСУЖДЕНИЕ

Исследование физико-химических свойств магннтных полистироловых

мнкросфер

Комплексное исследование физико-химических свойств микросфер, синтезированных по разработанной технологии, включало анализ магнитных свойств, размеров и формы частиц, а также функциональных качеств поверхности.

Световая микроскопия показала, что метод эмульсионной полимеризации позволяет получать микрочастицы сферической формы (рис. 1).

Анализ образцов на магнетометре показал, что уровень насыщения намагничивания достигается уже при 1500 - 2000 эрстед. Это означает, что концентрирование как самих микросфер, так н комплексов микросфер с клетками - мишенями возможно в неоднородных магнитных полях доступной напряженности.

о

• •

1 Л1КЛ)

Рисунок 1, Световая микроскопия МПМ. Общее увеличение х 1 ООО

Невысокое значение остаточной индукции (соответственно, слабое остаточное намагничивание) предупреждает спонтанное агрегирование микросфер после извлечения из магнитного поля.

Сравнение с коммерчески доступными аналогами показывает, что по наиболее важным магнето метрическим характеристикам МПМ, синтезированные по разработанной технологии, не уступают продукции ведущих мировых производителей (табл. 1).

Таблица 1. Магнетометрические характеристики синтезированных микросфер в сравнении с коммерческими аналогами

Микросферы Состав микросфер Намагничивание насыщения, (кА/м) Остаточное намагничивание, (кА/м)

Dynabeads®; Dy-nal Biotech, Норвегия Полистирол магнетит 22 U

COMPEL™; Bangs laboratories, Inc., СШЛ Полистирол магнетит 23 1Д

МПМ; РОНЦ РАМН Полистирол магнетит 30 1,5

Лазерная корреляционная спектроскопия первых полученных образцов микросфер выявила широкий разброс диаметров частиц, что, по всей видимости, обусловлено агрегацией частиц в водном растворе за счет взаимодействия гидрофобных участков поверхностей частиц. В дальнейшем было показано, что добавление в раствор неионогеиных детергентов (Тшееп-20, 50%-ный изопро-пиловый спирт), приводит к диссоциации агрегатов и позволяет получать стабильные коллоидные растворы МПМ. Таким образом, фракционирование МПМ путем центрифугирования в растворе, содержащем иеиоиогенный детергент, позволило получить партию МПМ со средним диаметром 660±100 нм.

Кроме того, позднее было обнаружено, что иммобилизация иммуноглобулинов на поверхности микросфер также приводит к разобщению конгломератов, вероятно, за счет экранирования гидрофобных участков, и позволяет получать суспензию МПМ однородного размера (рис.2).

пеь шше мл К1С0МГ тк м ннилох

1

= н1 =

ъш юд гот бой 1К гк кк 1ок га«

ь|ыл |п*п| ■> с1п 1мрг*гег) 04с а*иэ«1ап '

ОГитеЧГ(*иЦ: 72Э 1 пт

: »1 (гип (11.9*1 регсеы ' щ» 0*

Рисунок 2, Результаты лазерной корреляционной спектроскопии МПМ, конъюгированных с МКА

Вначале предполагалось синтезировать химически инертные МПМ для иммобилизации МКА путем пассивной адсорбции. ПК-спектроскопия МПМ, синтезированных сополимеризацией стирола и дившшлбензола, показала наличие

гидроксильиых групп, которые, возможно, обусловлены спонтанной гидратацией частиц, происходящей при эмульсионной полимеризации. Дополнительная активация поверхностных ОН-групп реагентами типа р-ТСХ или бромциа-на делает возможным эффективное связывание первичных аминогрупп белковых молекул.

Таким образом, в результате проведенного исследования было показано, что разработанная технология синтеза позволяет получать частицы сферической формы с равномерно распределенными по объему гранулами магнетита. По характеру поведения в магнитном поле (нелинейная зависимость между намагничиванием образца и напряженностью магнитного поля, наличие узкой петли гистерезиса) МПМ могут быть отнесены к мягким ферромагнетикам. Водные суспензии микросфер характеризуются агрегативной неустойчивостью. Коагуляцию частиц, обусловленную гидрофобными взаимодействиями, легко устранить добавлением неионогенных ПАВ. Диссоциации агломератов способствует также образование поверхностного протеинового слоя. Экспериментально подобранные условия фракционирования позволили получить партию МПМ, гомогенную по магниточувствительности и размеру, со средним диаметром частиц 0,бб±0,1 мкм.

Свойства поверхности синтезированных магнитных микросфер обеспечивают возможность поверхностного связывания векторных молекул двумя основными способами. Первый основан на неспецифической адсорбции протеинов, происходящей за счет взаимодействий между полистироловой поверхностью носителя и гидрофобными участками белковых молекул. Второй заключается в иммобилизации, происходящей по механизму ковалентного связывания лиган-дов с поверхностными функциональными группами. Реакционная способность МПМ, синтезированных сополимеризацией стирола и дивинил бензол а, связана с наличием поверхностных гидроксильиых групп, способных взаимодействовать с ЫНз-группами протеинов. Другой тип частиц с функционально-активной поверхностью был получен путем сополимеризации мономеров с малеиновым

ангидридом. Такая модификация метода позволила получить микросферы с поверхностными карбоксильными группами для копалсмтпого связывания протеинов с помощью кросс-сшиватощих реагентов.

Получение им мун о магнитных конъюгатов

При выборе условий для осуществления пассивной адсорбции МКА на поверхности магнитных частиц, а также при получении ИМК на основе магнитных микросфер с поверхностными карбоксильными группами руководствовались данными литературы.

Проанализированные литературные источники не содержали однозначных рекомендаций по поводу ковалентного присоединения протеинов к активированным ОН-группам носителям. Поэтому условия получения иммуномагпит-них конъюгатов этого типа были подобраны экспериментально. Основным критерием эффективности связывания векторных молекул служила величина сорбционной емкости получаемых конъюгатов (8) (количество МКА, приходящееся на единицу массы магнитного носителя). Было показано, что решающее влияние на иммобилизацию МКА оказывают следующие факторы:

• Кислотность и состав буферных систем, используемых при конъюгации

Использование в качестве рабочего раствора при инкубации магнитных микросфер с МКА буферной системы, содержащей карбонат натрия - бикарбонат натрия (рН 9.5), полностью ингибировало присоединение иммуноглобулинов. При инкубации в боратном буферном растворе (рН 8.5) количество связавшихся МКА не превышало 2 мкг/мг носителя. Достигаемая сорбциониая емкость была максимальной при проведении конъюгации в ФСБ (рН 7.4). Дальнейшие исследования проводились в этом буфере.

• Количество используемого для активации р-ТСХ

При активации МГГМ избытком /?-ТСХ (500 мкг реагента на 1 г носителя) максимальная сорбциониая емкость составляла, в среднем, 17 мкг/мг, что в 1,1-

1,2 раза превышало значение, достигаемое при использовании 100 мкг р-ТСХ на 1 г носителя.

• Продолжительность инкубации МКА с магнитным носителем

Согласно полученным результатам, динамика иммобилизации векторных молекул на МПМ варьируют при переходе от одного клона МКА к другому. Достижение сорбционной емкости насыщения происходило, в среднем, через 9-12 ч инкубации носителя с МКА. Вместе с тем, анализ супернатантов, декантируемых на вссх этапах получения, методом простой радиальной иммунодиф-фузии, позволил обнаружить явление частичной десорбции МКА при обработке блокирующими реагентами и количественно оценить связанное с этим уменьшение сорбционной емкости микросфер. Было показано, что обусловленные десорбцией потери иммуноглобулинов можно существенно снизить увеличением продолжительности конъюгирования до 24 ч и более. При условии столь длительной инкубации потери МКА (в процентах от количества исходно иммобилизованных) составляют 4,4 % для МКА ICO-J15, 13-14% для МКА ICO-86, 31 и 90 и 33,6 % для МКА ICO-180.

Чтобы определить, какой способ связывания иммуноглобулинов наиболее эффективен при создании сорбентов, были получены и охарактеризованы конъюгаты на основе МПМ разных типов и МКА против мембранных антигенов CD3 (клон ICO-90) и CD8 (ICO-31). Оказалось, что химические свойства поверхности частиц заметно влияют на их способность к связыванию иммуноглобулинов. При получении иммуномагнитных конъгогатов путем неспецифической сорбции МКА на поверхности МПМ, была выявлена низкая протеин-связывагощая способность неактивированных микросфер. Максимальное количество адсорбируемых иммуноглобулинов составило 6,6 мкг/мг и 4,0 мкг/мг для МКА анти-СОЗ и анти-CDS. Обработка р-ТСХ повышала сродство микросфер к МКА в 3,5-4,2 раза (в зависимости от количества активирующего реагента), обеспечивая возможность связывания до 17-20 мкг МКА/мг носителя.

Конъюгаты с самым высоким значением Этах, около 30 мкг/мг для обоих МКЛ, получены при использовании карбоксил ированных частиц.

Полученные экспериментальные данные позволяют рекомендовать как наиболее оптимальную следующую технологию получения иммуномагнитных сорбентов. Связывание МКА на поверхности магнитных частиц должно быть ковалентным. В качестве магниточувствительной матрицы наиболее целесообразно использовать МПМ, синтезированные с о полимеризацией стирола и ди-винилбензола и активированные избытком р-ТСХ. Инкубацию магнитного носителя с МКА следует проводить в 0,015М фосфатно-солевом буферном растворе. Для уменьшения потери МКА при конъюгации и получения стабильных в хранении иммуномагнитных сорбентов, обеспечивающих высокую эффективность сепарации, продолжительность инкубации иммуноглобулинов с МПМ при температуре 4°С должна составлять 24 - 48 ч. Определяя количество поверхностно-связанных МКА, следует учитывать частичную диссоциацию конъгогатов, происходящую при обработке блокирующими реагентами.

Им му нома шит пая сепарация гемо поэтических клеток человека Определение оптимальнойсорбционной емкости частиц

В начале исследований основным вопросом было определение оптимального количества МКА, иммобилизованных на поверхности МПМ. Для проведения этой серии экспериментов были использованы сорбенты ИМК-1СО-90 (против СОЗ-антигена Т-лимфоцитов) и ИМК-1ССМ 80 (против С020-антигена В-лимфоцитов), полученные при разной продолжительности конъюгирования МКА с магнитным носителем и, следовательно, характеризующиеся различными значениями сорбционной емкости. Для негативной селекции Т-лимфоцитов использовали конъюгаты с сорбционной емкостью 4,4, 11,6 и 16,8 мкг/мг, а для деплеции В-лимфоцитов - конъюгаты с сорбционной емкостью 7,6, 13,6 и 19,0 мкг/мг.

Проведенное исследование показало, что наиболее полное удаление Т-лимфоцитов обеспечивается использованием ИМК-1СО-90 с сорбционной емкостью И,6 мкг/мг. Такая величина S соответствует иммобилизации TgG в количестве, необходимом и достаточном для формирования протеинового монослоя на поверхности частиц носителя. Эффективность сепарации заметно снижается при уменьшении или увеличении количества поверхностно-связанных МКА.

Вместе с тем величина сорбционной емкости микросфер не влияла на эффективность негативной селекции В-клеток по антигену CD20, что не совпадает с данными, полученными для Т-клеточной деплеции. В случае заведомо избыточного количества МКА (19 мкг/мг), возможно, это объясняется большим, по сравнению с МКА ICO-90, сродством молекул МКА ICO-180 к поверхности микрочастиц, что предотвращало их отщепление. Сравнение параметров эффективности сорбции МКА ICO-180 и ICO-90 подтверждает такое предположение. Высокая эффективность сепарации при условии предполагаемого недостатка количества МКА ICO-I80 может объясняться высокой аффинностью МКА ICO-180 к антигену CD20, обеспечивающей достаточно прочное связывание частиц сорбента с клеткам и-мишенями даже при мал<?м количестве молекул иммуноглобулина.

Определение оптимального типа частиц

Чтобы определить, насколько существенное влияние оказывает механизм связывания иммуноглобулинов с магнитным носителем на эффективность им-муномагнитной селекции, была проведена серия экспериментов по селекции гемопоэтнческих клеток человека по мембранным антигенам CD3 и CD8. Для сепарации по каждой из указанных антигенных детерминант использовали сорбенты следующих типов:

■ ИМК, полученные путем пассивной адсорбции МКА на поверхности неах-тивированных МПМ (тип А);

■ ИМК, полученные путем ковалентного связывания МКА с поверхностными гидроксильиымн группами, активированными р-ТСХ. Были исследованы 2 образца таких частиц, различающиеся количеством добавляемого активирующего агента (100 и 500 мкг /?-ТСХ на 1 г носителя) (типы В и С);

■ ИМК на основе МПМ с поверхностными карбоксильными группами для ковалентного связывания МКА с использованием карбодиимида (тип О).

Кроме того, анализировали эффективность селекции клеток при проведении инкубации клеток с МПМ при разной температуре (4°С, 13°С или 22°С). Анализ результатов негативной селекции с использованием конъюгатов с МКА ан-ти-СОЗ (клон 1СО-90) показал, что на эффективность деплеции С 03клеток заметно влияют механизм иммобилизации иммуноглобулинов и температурный режим инкубации. Максимальная эффективность селекции (удаление 72 % антиген-положительных клеток) достигнута при использован ии МПМ типа С и температуре инкубации 4°С. При более высокой температуре, по-видимому, происходит отщепление МКА от магнитных частиц при взаимодействии с антигеном.

При тестировании конъюгатов с МКА анти-С08 (клон 1СО-31) при комнатной температуре мы обнаружили в равной степени высокую эффективность селекции клеток при использовании МПМ типов В, С и О (78-87%). Снижение температуры инкубации до 13°С незначительно увеличивало долю удаленных клеток (до 80-96%), а дальнейшее снижение температуры инкубации до 4<|С приводило к резкому ухудшению качество селекции. Степень удаления клеток-мишеней в этих условиях не превышала 5, 26,28 и 27% для сорбентов А, В, С и О, соответственно.

Результаты экспериментов по негативной селекции Т-лимфоцитов по мембранным антигенам СЭЗ и С08 стали еще одним подтверждением предпочтительности использования при получении иммуномагнитных конъюгатов маг-ниитных микросфер, активированных избытком/>ТСХ.

Селекция клеток с использованием нммуномагнитных конъюгатов, полученных путем ко валентного связывания МКА с магнитными микросферами, активированными р-толуолсульфонилхлоридом

Оптимальной технологией получения нммуномагнитных конъюгатов было показано ковапентное связывание МКА с магнитными микросферами, активированными р-ТСХ. Этот подход был использован при получении сорбентов для и мму но магнитной сепарации гемопоэтических клеток человека по мембранным антигенам CD3, CD4, CDS, CD20 и CD34.

Основными критериями качества разделения служили выявляемые при им-мунофенотипировании изменения уровня экспрессии антигена-мишени и состава популяции в целом. При негативной селекции СОЗ+-клеток оценивали уровень экспрессии антигенов CD4 и CD8. При негативной селекции по антигенам CD4 и CD8 оценивали изменение соотношение соответствующих субпопуляций Т-лимфоцитов. Показателем эффективности негативной селекции Hi-лимфоцитов, кроме изменения экспрессии мембранных антигенов В-клеток CD20 и CD19, служило увеличение доли Т-клеток. Для анализа образцов использовали меченые FITC или РЕ моноклонапьные антитела против соответствующих антигенных детерминант. Кроме того, также оценивали интенсивность иммунофлуоресценции клеток негативной фракции, окрашенных конъюгатами антивидовых антител с FITC (F(ab)rFITC).

Тестирование ИМК-1СО-31 показало высокую эффективность специфического удаления CD 8+-Т-л им фоцитов при использовании этого сорбента, подтвердив ранее полученные результаты. Достижению максимального уровня депле-ции (удаление из исходной популяции 97% CD8+-клеток) способствовало проведение инкубации клеток с сорбентом в прохладном помещении (13-17°С), что также соответствовало данным предшествующих экспериментов. При проведении негативной селекции по антигену CD8 анализировали не только негативную фракцию, но и клетки, связавшиеся с частицами сорбента. Было показано отсутствие в составе позитивной фракции В-лимфоцитов и принадлежность абсолютного большинства клеток к числу Т-лимфоцитов (об этом свиде-

тельствовала выявляемая для 98,3% клеток экспрессия антигена СИЗ), Полученные результаты явились подтверждением высокой специфичности разделения.

Схожие результаты, как по качеству разделения, так и по характеру зависимости эффективности от температурного режима, были получены при иммуно-магнитной селекции по мембранному антигену СЭ4 с использованием сорбента ИМК-1СО-86. Как и в случае деплеции С08+-лимфоцитов, оптимальной для проведения сепарации была показана температура 13°С, В этих условиях уровень деплеции составил 97%, Увеличение температуры снижало эффективность разделения до 88%. При проведении селекции клеток на холоду (4°С) субпопуляция С£)4+-лимфоцитов сокращалась лишь на 40%,

Селекция с использованием ИМК-1СО-180 приводила к удалению из исходного материала 98% С020+-клеток при всех температурных режимах инкубации. О высокой эффективности разделения свидетельствовало уменьшение числа клеток, экс премирующих общие антигенные детерминанты В-лимфоцитов СЭ19 и С020. В исходной популяции эти мембранные рецепторы были выявлены на 10,6 и 11,3% клеток, соответственно. После иммуномагнит-ной деплеции содержание СЭ19+ и СО20+-клеток в негативной фракции составляло 0,9 и 0,6%. Об эффективности специфического удаления В-лимфоцитов свидетельствовал рост относительного количества Т-клеток.

Анализ результатов негативной селекции с использованием конъюгата с МКА 1СО-90 показал, что максимальная эффективность деплеции Т-лимфоцитов по мембранному антигену СОЗ, достигаемая при условии проведения инкубации на холоду (4°С), составляет 75%.

В качестве наиболее вероятной причины низкого качества разделения при использовании ИМК-1СО-90 рассматривали частичную диссоциацию этого сорбента при взаимодействии с мембранным рецептором СЭЗ в результате погружения последнего в толщу мембраны. Разрыв связи между МКА и магнитным носителем приводит к освобождению клетки-мишени, которая с этого мо-

мента становится «невидимой» для частиц сорбента. Возможный подход к устранению проблемы заключается в использовании «универсальных» конъюга-тов, несущих на поверхности спейсерные участки для связывания МКА. Увеличение расстояния между молекулой антитела и поверхностью магнитной частицы должно способствовать сохранению связи между клеткой и микросферой при интернализации антигена. В настоящий момент начата работа по созданию таких конъюгатов и определению условий метода непрямой иммуномагнитной селекции. Был получен конъюгат на основе активированных р-ТСХ микросфер и поликлональных антител барана против Рс-фрагментов мыши. Для направленного разделения сорбент инкубировали с клетками, предварительно мечеными моноклональными антителами. Использованием полученного конъюга-та в сочетании с МКА анти-СБЗ удается достичь удаления 87% Т-лимфоцитов.

Для селекции СБ34+-клеток использовали ИМК-1СО-115. Модельными системами для разделения служили искусственные смеси клеточных линий К01 и с различным содержанием С034+-клеток. Разделение проводили при температуре 22-25"С. Было показано, что независимо от количества антиген-положительных клеток в образце, использование разработанной методики н сорбента позволяет достичь почти 100%-ной элиминации СР34+-клеток линии (рис. 3). Аналогичные результаты были получены и при извлечении С034+-клеток из периферической крови больного хроническим миелоидным лейкозом в стадии властного криза. В исходном образце мононуклеарных клеток содержание С034+-гемопоэтических предшественников составляло 80%. После селекции антиген-положительные клетки в популяции не были выявлены.

Чтобы дополнительно удостовериться в строгой избирательности связывания иммуномагнитных микросфер, МПМ-МКА 1СО-П5 инкубировали с мононук-леарными клетками периферической крови здоровых доноров, где содержание С034+-клеток не превышает 1%. Специфичность связывания составила более 98%.

I; СР34 ПТС

I -

IV.....Го' (V й*......*)

I С014 РГГС

I 3% »',

Ж ,_.

10' 10* 10г 10* II 4.3 Мв)дЧ

СОИ РГГС 0,1%

СОМ РГГС 0,1%

Рисунок 3. Эффективность негативной селекции С034+-клеток из смесей клеточных линий и .(У при исходном содержании С034+-клеток 11% или 3%

Ферментативное отщепление клеток позитивной фракции от частиц сорбента

Наиболее распространенным способом отщепления клеток от частиц сорбента при позитивной селекции является ферментативная обработка. Происходящее при этом расщепление иммуноглобулинов приводит к разобщению клеток-мишеней и микросфер. Основным требованием к процедуре является сохранение жизнеспособности клеток.

Исходя из этого, начальные эксперименты проводили для определения концентрации фермента (химопапаина) и температурного режима обработки, обеспечивающих расщепление молекул МКА.

В проведенных экспериментах в качестве субстрата использовали МКА 1СО-115, так как эти антитела предполагается использовать при создании магнито-управляемых сорбентов для позитивной селекции ГСК. Чтобы определить необходимую для расщепления концентрацию фермента, образцы объемом 1 мл, содержащие по 1 мг МКА 1СО-115, инкубировали с разными количествами химопапаина. Ферментативное расщепление проводили в течение 30 мин при 37°С или при комнатной температуре. После ферментативной реакции прово-

дили качественный анализ образцов методом DISC-электрофореза в ПААГ, Было показано, что, независимо от температуры инкубации, полное расщепление 1 мг МКА ICO-IJ 5 происходит при обработке химопапаином в количестве 1 мг.

Следующим этапом работы стало определение влияния ферментативной обработки на выживаемость клеток с помощью МТТ-теста. После обработки химопапаином в концентрации, достаточной для эффективного расщепления МКА (1 мг/мл), при комнатной температуре отмечено сохранение жизнеспособности 96,6% клеток. Повышение концентрации фермента, равно как и увеличение температуры инкубации, приводило к заметному снижению доли живых клеток в образце.

К сожалению, эксперименты по расщеплению комплексов микросфер МПМ-МКА 1СО-115 с CD34+-клеткам и не увенчались успехом. Обработка химопапаином в количестве 1 мг/мл суспензии клеток с частицами не обеспечивала освобождения клеток. На данном этапе начата работа по созданию иммуномаг-нитных конъюгатов со спейсерными участками, чувствительными к действию специфических расщепляющих реагентов. Для получения таких сложных сорбентов использовали МПМ, ковалентно связанные с молекулами стрептавиди-на, и конъюгаты моноклональных антител с биотиновым зондом. В состав зонда входит углеводородный участок, легко разрушающийся под действием расщепляющего реагента. Эффективность освобождения клеток-мишеней экспериментально показана для конъюгатов на основе МКА ICO-180.

Результаты экспериментов по негативной селекции гемопоотических клеток человека по мембранным антигенам CD3, CD4, CD8, CD20 и CD34 позволяют утверждать, что созданные иммуномагнитные конъюгаты специфично взаимодействуют с клетками-мишенями. Полнота удаления CD3+-, CD4+- и CD8+-лимфоцитов зависит от температурного режима инкубации клеток с сорбентом. Экспериментально показано, что максимальная эффективность селекции по антигенам CD4 и CD8 достигается при температуре 13°С и составляет 97%. Каче-

ство деплеции СОЗ+-клеток с использованием МГТМ-МКА ICO-90 было наиболее высоким (удаление 75% клеток-мишеней) при температуре 4°С. Использование сорбентов МПМ-МКА ICO-180 и МПМ-МКА ГСО-115 обеспечивает удаление 98% и 99% CD20+- и С0344-клеток, соответственно, при всех исследованных температурных режимах.

Эффективность негативной селекции Т-лимфоцитов по мембранному антигену CD3 возрастает до 87% при использовании «универсалыtoro» конъюгата МПМ с поликлональными антителами барана против Fc-фрагментов IgG мыши. Мы полагаем, что дальнейшая оптимизация условий селекции позволит достичь более полного удаления CD3*- клеток.

Дальнейшая работа в направлении оптимизации условий позитивной имму-номагнитной селекции гемопоэтических клеток требует решения вопроса о способе разобщения освобождения клеток от частиц сорбента. Обработка комплексов клеток с микросферами химопапаином в количестве, достаточном для расщепления свободных МКА ICO-115 (1 мг фермента на 1 мг МКА), оказалась нерезультативной. Возможная причина неудачи связана с тем, что в результате иммобилизации на носителе молекулы МКА претерпевают конформационные изменения и приобретают устойчивость к ферментативному воздействию. Кроме того, активность фермента в отношении МКА, входящих в состав сложного комплекса «микросросфера-МКА-клетка», может заметно снижаться из-за сте-рических затруднений. Возможным решением проблемы может стать использование при позитивной селекции модифицированных иммуномагнитных копъю-гатов, характеризующихся наличием спейсерного участка углеводородной природы. В настоящий момент исследования в зтом направлении продолжаготся.

ВЫВОДЫ

1. Разработана технология синтеза магнитных микросфер диаметром от 0,2 до 1,5 мкм. Получены опытные партии гомогенных по размерам микросфер с

высоким намагничением насыщения (30 кА/м) и незначительным остаточным магнетизмом (1,5 кА/м).

2. Выявлены частичная гидрофобность поверхности и наличие связанных гидроксильных групп для МПМ на основе стирола, дивинилбензола и магнетита. Это делает возможным иммобилизацию моноклональных антител как путем пассивной адсорбции, так и с помощью ковалентного связывания.

3. Величина сорбционной емкости и стабильность иммуномагнитных конъюгатов зависят от механизма иммобилизации МКА на поверхности магнитного носителя. Наиболее эффективным способом получения иммуномагнитных сорбентов является ковалентное связывание МКА с поверхностными ОН-группами, активированными избытком р-ТСХ.

4. Определены оптимальные условия ковалентного связывания МКА с магнитным носителем: инкубация в течение 48 ч в фосфатно-солевом буферном растворе (рН 7,4) при 4 °С с постоянным перемешиванием.

5. Создана панель иммуномагнитных сорбентов для направленного разделения гемопоэтических клеток человека по мембранным антигенам CD3, CD4, CD8, CD20 и CD34 (МПМ-1СО-90, МПМ-1СО-86, МПМ-1СО-31, МПМ-1СО-180 и-МПМ-ICO-l 15).

6. Эффективность негативной селекции гетерогенных клеточных популяций составляет 95 - 98% при использовании иммуномагнитных конъюгатов на основе МКА 1С О-86, ICO-31, ICO-180 и ICO-U5, и 72% для МПМ-1СО-90. Для удаления антиген-позитивных клеток температура инкубации клеток с сорбентом составляет 13°С при селекции по мембранным антигенам CD4 и CD8, 4®С при деплецин СОЗ*-клеток. Высокое качество разделения по антигенам CD20 и CD34 показано для всех экспериментальных температурных режимов (4°С, 13 *С и 22 ®С).

7. Экспериментально показано, что применение модифицированного метода ИМС с использованием конъюгата магнитных микросфер с антивидовыми

антителами позволяет увеличить эффективность деплеции Т-лимфоцитов до 87%.

8. Разработан комплекс аналитических методов и выявлены оптимальные фихико-химические характеристики магнитных микроносителей и иммуномагнитных конь гагатов. Эти характеристики могут быть использованы при создании фармстатьи на иммуномагнитные сорбенты для

* клинического применения.

»

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Иванов П.К., Брусенцов H.A., Блохин Д.Ю., Голенкина Е.А., Барышников А.Ю. "Физико-химические критерии и технологические приемы создания нетоксичных иммуномагнитных препаратов". Сб. Докл. 9-й Международ. Конф. по магнитным жидкостям,. Т И, Плес, Россия, 2000; 303-308

2. Иванов П.К., Голенкина ЕА, Полосухина ЕР, Донская ОН. "Иммуномагнитная сепарация СОЗО-положительных лимфоцитов как первый этап в получении дендритных клеток". Мат. V Всерос. Съезда онкологов, Казань, 2000:243-244

3. Голенкина ЕА, Иванов ПК, Полосухина ЕР, Филиппов ВИ, Ершов ОЛ. "Иммуномагнитная сепарация гемопоэтических клеток человека". "Мед Иммунол", 2001; 3(2): 144

4. Е.А. Голенкина, A.A. Буркова, В.И. Филиппов, О.Г. Ершов, П,К. Иванов. "Иммуномагнитные сорбенты в селекции Т-лимфоцитов человека". Рос. Био-

X терапевт. Журн., 2002; 3(1): 341-48

5. Н.Г, Мошечков, P.C. Махлин, А.Ю. Барышников, ДЮ. Блохии, Е.А. Голен-кина, П,К. Иванов, В.И. Филиппов, О.Л. Ершов. "Создание магнитного сепаратора МСК-1 и нммуномагнитного сорбента при лечении онкологических и других заболеваний". "Мат. 10-й Междунар. Плесской Конф. по магн. жидк.", Плес (Россия), 2002: 343-346

6. Е.А. Голенкина "Получение иммуномагнитных сорбентов на основе моно-клональных антител против антигенов Т-лимфоцитов человека". "Рос. Биотерапевт. Журн.", 2002; 2(1): 176-177

7. В.И. Филиппов, А.А. Кузнецов, JI.A. Гончаров, П К. Иванов, Д.Ю. Блохин, Е.А. Голенкина, О.Л. Ершов, Г.Я. Жигалин. "Микросферы для биомедицинского применения. Области применения и способы получения". "Мат. 1-го Симп. Применение биомзгнитных носителей в медицине", Москва, 2002: 1520

8. П.К. Иванов, Е.А. Голенкина. "Иммуномагнитные сорбенты в онкологии". "Мат. 1-го Симп. Применение биомагнитных носителей в медицине", Москва, 2002:39-49

9. Е. Golenkina. Р, Ivanov. D.Blokhin, V, Philippov, О. Ershov, "Development of ¡mmunomagnetic reagents for human hemapoietic cell sorting". "Mat. 4th Intl.Conf. "Scientific end clinical applications of magnetic carriers", Tallahassee, USA, 9-11 May, 2002, p.174-176

Служба мшикитеяшоВ техники гуронцим. H.H Блох ииа РАМН

Заказ JftJ 92 • Тираж 100 эю.

д

РНБ Русский фонд

2006-4 37585

28 OKI 2003

Актуальность

Одним из направлений повышения эффективности терапии злокачественных новообразований является поиск путей преодоления побочных эффектов, связанных с отсутствием строгой избирательности действия противоопухолевых препаратов. Использование этих препаратов в высоких дозах не только позволяет остановить прогрессию опухоли, но и вызывает значительную регрессию новообразования, а также предотвращает возможность развития рецидивов заболевания. Однако цитотоксичность, которая обуславливает противоопухолевое действие подавляющего большинства химиотерапевтических средств, применяемых в онкологии, одновременно является и основным ограничением их применения. Терапия мощными цитостатиками не может проходить бесследно для нормальных клеток организма. Наиболее серьезные осложнения связаны с гибелью стволовых гемопоэтических клеток костного мозга, приводящей к нарушению естественных процессов обновления крови, анемии, прогрессирующей потере иммунитета.

Эффективным подходом к преодолению данного естественного ограничения терапии цитотоксическими агентами является трансплантация аллогенных или аутологичных клеток периферической крови или костного мозга. При этом, однако, проведению аутологичной трансплантации, вследствие высокой вероятности наличия в костном мозге и кровотоке опухолевых клеток, сопутствует риск рецидивов основного заболевания. Пересадка аллогенных гемопоэтических клеток может сопровождаться развитием реакции «трансплантат-против-хозяина» (РТПХ).

Одно из возможных решений перечисленных проблем заключается в предварительной сепарация трансплантатов, целью которой может являться удаление нежелательных клеток (опухолевых, аллореактивных) или выделение из исходно гетерогенного материала определенных типов клеток.

Среди многочисленных методов направленного разделения клеток наиболее эффективным является иммуномагнитная сепарация (ИМС). Этот подход основан на одновременном использовании строгой избирательности взаимодействия моноклональных антител с антигенными детерминантами клеток-мишеней и магнитоуправляемости корпускулярных носителей -магнитных микросфер.

От других способов селекции биологического материала технологию ИМС выгодно отличает уникальное сочетание специфичности и чувствительности с высокой скоростью разделения исходных клеток. Эти качества обеспечивают преимущественное использование именно иммуномагнитной сепарации для предтрансплантационной обработки гемопоэтических клеток.

Данные научных исследований и результаты клинических испытаний, проведенных за рубежом, свидетельствуют об эффективности использования позитивной иммуномагнитной селекции при изоляции стволовых кроветворных клеток для дальнейшего культивирования и манипуляций in vitro и, что особенно важно, для дальнейшей трансплантации онкологическим больным. Магнитоуправляемые сорбенты широко используются для полной или частичной деплеции Т-лимфоцитов из костного мозга и периферической крови доноров, а также для удаления опухолевых клеток из аутологичных трансплантатов. Вместе с тем, на сегодняшний день нет единого мнения относительно характеристик сорбента, сепарирующих устройств и условий осуществления селекции. Хотя преимущества метода ИМС делают его использование наиболее предпочтительным, прочное внедрение метода в научно-исследовательскую и клиническую практику все еще требует решения ряда вопросов. Дальнейшее развитие и широкое использование этого перспективного подхода в нашей стране ограничивается высокой стоимостью расходных материалов и сепарирующих устройств зарубежных фирм-производителей. Таким образом, создание на основе отечественных материалов и оборудования системы иммуномагнитной сепарации и внедрение ее в практику являются очень актуальными задачами.

Цель исследования

Целью данного исследования явилось создание системы иммуномагнитной сепарации, обеспечивающей возможность эффективного разделения гемопоэтических клеток человека.

Задачи исследования

1. Разработать комплекс аналитических методов исследования и стандартизации магнитных микроносителей и иммуномагнитных сорбентов.

2. Получить опытную партию магнетитовых полистироловых микросфер (МПМ) и охарактеризовать их физико-химические свойства.

3. Выявить оптимальную технологию создания иммуномагнитных сорбентов на основе синтезированных микроносителей и моноклональных антител.

4. Создать панель иммуноспецифических магнитоуправляемых конъюгатов для направленного разделения гемопоэтических клеток человека.

5. Оценить эффективность селекции гемопоэтических клеток человека с использованием полученных конъюгатов.

Научная новизна

1. Получены экспериментальные подтверждения соответствия магнитных свойств синтезированных магнетитовых полистироловых микросфер всем требованиям, предъявляемым к магнитоуправляемым микроносителям для создания биомагнитных сорбентов.

2. Выявлены оптимальные условия иммобилизации векторных молекул на поверхности магнитных микросфер. Продемонстрирована возможность получения иммуномагнитных конъюгатов путем пассивной адсорбции и с помощью ковалентного связывания моноклональных антител с магнитным носителем.

3. Показано, что наиболее оптимальным подходом к созданию иммуномагнитных конъюгатов является ковалентное присоединение моноклональных антител к поверхностным гидроксильным группам, активированным избытком р-толуолсульфонилхлорида.

4. Получены иммуномагнитные сорбенты на основе магнитных микроносителей и моноклональных антител против мембранных антигенов лимфоцитов человека CD3, CD4, CD8, CD20 и CD34. Экспериментально показано, что использование созданных конъюгатов обеспечивает высокую эффективность иммуномагнитного разделения гемопоэтических клеток человека.

5. Разработан комплекс физико-химических методов, адаптированных в соответствии с особенностями используемого материала, который позволяет осуществлять качественный и количественный контроль за свойствами иммуномагнитных конъюгатов на каждом этапе получения.

Научно-практическая значимость

Предполагаемое клиническое применение полученных сорбентов, в первую очередь, связано с сепарацией клеток костного мозга, предназначенного для трансплантации онкологическим больным.

Экспериментально показанная эффективность сепарации CD34+-клеток с помощью МПМ-1СО-115 открывает перспективу дальнейшего применения этого конъюгата для получения чистых популяций стволовых кроветворных клеток методом позитивной селекции. Негативная иммуномагнитная селекция с использованием ИМС на основе МКА ICO-90, ICO-31, ICO-86 и 1СЮ-180 может быть использована для элиминации опухолевых клеток из костного мозга больных Т- и В-клеточными лимфомами перед аутологичной трансплантацией. Иммуномагнитное истощение Т-клеточной популяции донорского костного мозга может стать способом предотвращения развития реакции "трансплантат-против-хозяина". Созданные сорбенты могут использоваться и при получении дендритных клеток для создания противоопухолевых вакцин.

Предлагаемый комплекс аналитических методов, модифицированных с учетом специфики исследуемого материала, и определенные оптимальные физико-химические критерии могут стать основой для стандартизации биомагнитных сорбентов.

ВЫВОДЫ:

1. Разработана технология синтеза магнитных микросфер диаметром от 0,2 до 1,5 мкм. Получены опытные партии гомогенных по размерам микросфер с высоким намагничением насыщения (30 кА/м) и незначительным остаточным магнетизмом (1,5 кА/м).

2. Выявлены частичная гидрофобность поверхности и наличие связанных гидроксильных групп для МПМ на основе стирола, дивинилбензола и магнетита. Это делает возможным иммобилизацию моноклональных антител как путем пассивной адсорбции, так и с помощью ковалентного связывания.

3. Величина сорбционной емкости и стабильность иммуномагнитных конъюгатов зависят от механизма иммобилизации МКА на поверхности магнитного носителя. Наиболее эффективным способом получения иммуномагнитных сорбентов является ковалентное связывание МКА с поверхностными ОН-группами, активированными избытком р-Ts-Cl.

4. Определены оптимальные условия ковалентного связывания МКА с магнитным носителем: инкубация в течение 48 ч в фосфатно-солевом буферном растворе (рН 7,4) при 4 °С с постоянным перемешиванием.

5. Создана панель иммуномагнитных сорбентов для направленного разделения гемопоэтических клеток человека по мембранным антигенам CD3, CD4, CD8, CD20 и CD34 (ИМК-1СО-90, ИМК-1СО-86, ИМК-1СО-31, ИМК-ICO-180 и ИМК-1СО-115).

6. Эффективность негативной селекции гетерогенных клеточных популяций составляет 95 - 98 % при использовании иммуномагнитных конъюгатов на основе МКА ICO-86, ICO-31, КЮ-180 и ICO-115, и 72 % для ИМК-1СО-90. Для удаления антиген-позитивных клеток температура инкубации клеток с сорбентом составляет 13 °С при селекции по мембранным антигенам CD4 и CD8, 4 °С при деплеции СЭЗ+-клеток.

Высокое качество разделения по антигенам CD20 и CD34 показано для всех экспериментальных температурных режимов (4 °С, 13 °С и 22 °С).

7. Экспериментально показано, что применение модифицированного метода ИМС с использованием конъюгата магнитных микросфер с антивидовыми антителами позволяет увеличить эффективность деплеции Т-лимфоцитов до 87 %.

8. Разработан комплекс аналитических методов и выявлены оптимальные фихико-химические характеристики магнитных микроносителей и иммуномагнитных конъюгатов. Эти характеристики могут быть использованы при создании фармстатьи на иммуномагнитные сорбенты для клинического применения.