Автореферат и диссертация по медицине (14.00.46) на тему:Биохимические параметры синовиальной жидкости в клинико-лабораторной оценке эффективности хондромодулирующей терапии при остеоартрозе

На правах рукописи

РЯБКОВ Андрей Борисович

БИОХИМИЧЕСКИЕ ПАРАМЕТРЫ СИНОВИАЛЬНОЙ ЖИДКОСТИ В КЛИНИКО-ЛАБОРАТОРНОЙ ОЦЕНКЕ ЭФФЕКТИВНОСТИ ХОНДРОМОДУЛИРУЮЩЕЙ ТЕРАПИИ ПРЕПАРАТОМ ХОНДРОИТИНСУЛЬФАТА ПРИ ОСТЕОАРТРОЗЕ

14.00.46 - клиническая лабораторная диагностика

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Санкт-Петербург 2005

Работа выполнена в Санкт-Петербургском государственном университете и Санкт-Петербургской клинической больнице Российской Академии Наук

Научные руководители: доктор медицинских наук профессор

ШИШКИН Виктор Иванович

доктор биологических наук профессор КУДРЯВЦЕВА Галина Васильевна

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук профессор

НАЗАРОВ Петр Григорьевич

доктор медицинских наук профессор ЖИРКОВ Анатолий Михайлович

Ведущая организация: Санкт-Петербургская педиатрическая медицинская академия МЗ РФ

t -

Защита состоится «•/г » 'ZY/éP^-f 2005 г. в у час. на заседании диссертационного совета Д 205.001.01 при Федеральном государственном учреждении здравоохранения «Всероссийский центр экстренной и радиационной медицины» МЧС России (194044, Санкт-Петербург, ул. Лебедева, д.4/2).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Федерального государственного учреждения здравоохранения «Всероссийский центр экстренной и радиационной медицины» МЧС России (194044, Санкт-Петербург, ул. Лебедева, д.4/2).

Автореферат разослан « -/(£» лл&Л 2005 г.

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат медицинских наук

Алексанин С.С.

Актуальность темы. Остеоартроз (ОА) становится одним из самых распространенных хронических заболеваний в высокоиндустриальных странах. Ввиду преобладания этого недуга у пожилых людей тенденция к росту заболеваемости принимает мировой масштаб как следствие увеличения продолжительности жизни. В то же время, изучение ОА все еще финансово ограничивается в рамках биомедицинского исследования, а молекулярно-биологические механизмы развития болезни и ее прогрессирования во многом остаются невыясненными (Насонова В.А.,

Актуальность изучения этиологии и патогенеза ОА, а также поиска эффективных методов лечения этой патологии на основе сопоставления клинических, иммунологических и биохимических данных определяют следующие факторы:

1. Социально-экономические:

- увеличение заболеваемости остеоартрозом;

- увеличение средней продолжительности жизни в индустриально развитых странах;

- увеличение заболеваемости ожирением, артериальной гипертензией, сахарным диабетом с нарушением микроциркуляции и трофики различных органов и тканей, в том числе тканей сустава;

- высокие экономические затраты при лечении побочных эффектов и осложнений от терапии нестероидными противовоспалительными препаратами (НПВП), рост заболеваемости язвенной болезнью желудка и двенадцатиперстной кишки, тубулоинтерстициальным НПВП-нефритом (Насонов Е.Л., 2000; \Volf М.М. еХ а!., 1999).

- появление новой группы препаратов - хондропротекторов в виде хондроитинсульфата с возможностью промышленного производства достаточного количества чистого вещества;

- клинически доказанная эффективность хондроитинсульфата в лечении больных ОА.

2. Методологические:

недостаточное количество данных о биохимических механизмах патогенеза ОА у человека;

- необходимость изучения молекулярных механизмов действия хондромодуляторов на основе хондроитинсульфата при ОА у человека для направленного поиска более эффективных препаратов.

В последние годы медицинская и социально-экономическая значимость ОА заметно возросла. ОА является наиболее распространенной формой суставной патологии. На долю этого заболевания приходится 6070% всех ревматических болезней.

Необходимость проведения длительной терапии для получения стойкого эффекта и снижения инвалидизации больных ОА представляет серьезную проблему, причем не только в России, но и в экономически развитых странах. ОА болеют 10-12% на.селения.США.и.Европы. Проблема

2000).

ОА чрезвычайно актуальна и для России. Так, из 11 млн. обращений пациентов в связи с ревматическими заболеваниями, зарегистрированными в 1996 г., по меньшей мере, 16% были связаны с ОА (Насонова В. А., Эрдес Ш.О. и соавт., 2000). По данным ежегодных Государственных отчетов МЗ РФ за период с 1994 по 1998 годы в России установлен рост показателей болезненности и заболеваемости при ОА на 44,3% и 25,0% соответственно (Насонова В.А. и соавт., 2000).

ОА представлен во всех возрастных группах. Отдельные случаи заболевания отмечены уже у молодых лиц 16-25 лет. С возрастом частота заболевания увеличивается - у лиц старше 50 лет она составляет 27%, старше 60 лет - 97% (Насонова В.А. и соавт., 2000). До 45-летнего возраста ОА чаще встречается среди мужчин, после 54 лет - среди женщин. При этом до 80% больных ОА имеют ограничения подвижности разной степени, а 25% - не могут выполнять домашнюю повседневную работу.

Сегодня для объективизации получаемых данных во время клинических испытаний препаратов при ОА все чаще применяются альгофункциональные индексы (Lequesne M.G., 1997). Их эффективность и достоверная корреляция с клиническими фазами ОА доказана в ряде крупных многоцентровых исследований (Насонова В.А. и соавт., 2001 ). Тем не менее, подобные методики оценки все же достаточно субъективны по своей сути и не могут в полной мере свидетельствовать о реальных процессах на уровне суставных тканей при ОА.

Синовиальную жидкость (СЖ) можно рассматривать как интегральный показатель состояния суставных структур. Выполняя не только защитную, но и обменную функцию, непосредственно соприкасаясь со всеми микро- и макроструктурами сустава, СЖ может дать более точную информацию об их текущем состоянии. Поэтому именно изучение особенностей СЖ при ОА, по нашему мнению, будет способствовать расшифровке тонких механизмов этиопатогенеза этого заболевания.

Согласно данным английских исследователей, для дифференциальной диагностики при суставной патологии чаще всего используются результаты поляризационной световой микроскопии (70%) СЖ; несколько реже специалисты обращаются к микробиологическим методам исследования СЖ (66%) (Amer H., Swan A. et al., 2001). Клеточный состав СЖ помогает определиться с диагнозом в 26% случаев.

Острая необходимость в более точной диагностике суставной патологии с применением биохимических методов исследования высказывается многими авторами (Amer H., Swan A. et al., 2001 ; Pal В., Nash J. et al., 1999). Это связано как с ростом нозологических форм заболеваний суставов, так и с необходимостью объективизации данных клинических испытаний лекарственных препаратов, которые в последнее время находят широкое применение в терапии артритов и артрозов. Особенно это актуально для группы слабовоспалительных артропатий, к которым относится ОА.

Все изложенное выше свидетельствует о своевременности и актуальности изучения вопросов ранней диагностики, профилактики, лечения и прогнозирования ОА на основе углубленного биохимического анализа СЖ.

Цель исследования - выявление и клинический анализ взаимосвязей между особенностями динамики биохимических параметров СЖ коленного сустава человека и клинической активностью ОА под влиянием хондромодулирующей терапии препаратом хондроитинсульфата (ХС) «Структум».

Задачи исследования. Цель исследования достигалась последовательным решением ниже перечисленных основных задач:

1. Оценить в целом клинико-биохимическое значение обмена гликозаминогликанов (ГАГ) в СЖ коленного сустава человека при ОА и на фоне хондромодулирующей терапии препаратом ХС.

2. Изучить динамику скорости поглощения кислорода клетками СЖ коленного сустава человека при ОА, а также степень влияния на этот процесс препарата «Структум».

3. Дать клинико-биохимическое истолкование изменениям углеводно-фосфорного метаболизма СЖ при ОА и оценить влияние на этот процесс препарата «Структум» путем анализа активности ферментов в СЖ коленного сустава человека при ОА.

4. Охарактеризовать количественно содержание простагландинов (ПГ) в СЖ коленного сустава человека при ОА и выявить их динамику на фоне лечения препаратом «Структум». Дать клиническую интерпретацию полученным экспериментальным материалам.

5. Определить степень корреляции между изменением биохимических параметров СЖ и клинической активностью ОА.

Основные научные положения, выносимые на защиту.

1. I и 11 стадии ОА характеризуются усилением процессов энергетического метаболизма в клетках СЖ, выражающемся в повышении активности ферментов углеводно-фосфорного обмена (креатинфосфокиназы, глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы и сукцинатдегидрогеназы) и скорости поглощения кислорода, что может служить ранними биохимическими критериями патологических изменений в суставе.

2. Одним из основных патогенетических механизмов разрушения суставного хряща при ОА является активизация процессов распада кислых мукополисахаридов вследствие снижения рН СЖ.

3. Хондромодулирующая терапия препаратом ХС сопровождается нормализацией основных биохимических параметров гомеостаза С'Ж

4. Наличие корреляции между биохимическими параметрами СЖ (скоростью поглощения кислорода, активностью ферментов энергетического метаболизма, обмена ГАГ и содержанием ПГ) и клинической активностью ОА позволяет использовать эти биохимические параметры как объективные

критерии эффективности хондромодулирующей терапии ХС на ранних стадиях ОА.

Научная новизна.

1. Впервые применен новый подход к изучению патогенеза ОА с позиций анализа биоэнергетики СЖ.

2. Выявлены биохимические особенности энергетического метаболизма клеток СЖ коленного сустава человека в зависимости от клинической активности ОА.

3. Определена степень корреляции между количественными изменениями биохимических параметров СЖ (активностью Р-гиалуронидазы, содержанием гиалуроновой и глюкуроновой кислот, простагландинов, скоростью поглощения кислорода клетками СЖ, активностью креатинфосфокиназы, сукцинатдегидрогеназы и глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы) и клинической активностью ОА коленного сустава человека под влиянием хондромодулирующей терапии препаратом ХС «Структум».

Практическая значимость работы.

Основные теоретические положения диссертации могут быть использованы в лекционных курсах «Клиника и патогенез ревматологических заболеваний», «Молекулярные механизмы иммунитета и иммунопатология», рекомендуемых для слушателей Институтов усовершенствования врачей, студентов медицинских ВУЗов и медико-биологических факультетов университетов. Определение активности ферментов углеводно-фосфорного метаболизма, скорости поглощения кислорода клетками СЖ, уровня простагландинов и активности кислых гидролаз в СЖ может быть рекомендовано к применению в клинической лабораторной диагностике ОА и для оценки эффективности структурно-модифицирующей терапии ОА при клинических испытаниях препаратов хондроитинсульфата.

Апробация работы.

Результаты исследования доложены и обсуждены на Третьем съезде ревматологов России (Рязань, 2001 г.); на Ежегодном Конгрессе европейской ревматологической ассоциации (Швеция, Стокгольм, 2002 г.); на Третьей северо-западной конференции по ревматологии (Псков, 2003 г.); на Четвертой конференции по ревматологии Северо-Западного федерального округа РФ (Великий Новгород, 2004), на Четвертом съезде ревматологов России (Казань, 2005 г.). По материалам диссертации опубликовано шесть работ.

Структура и объем диссертации. Материалы диссертации изложены на 123 листах машинописного текста. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, методического раздела, главы с результатами собственного исследования, заключения, выводов, практических рекомендаций, списка использованной литературы (207 источников). Текст иллюстрирован 19 таблицами и 14 рисунками.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы к методы исследований

Исследование было проведено на базе Санкт-Петербургской клинической больницы Российской Академии Наук и Санкт-Петербургского Государственного университета.

Решение задач диссертационной работы проводилось в ходе комплексного исследования, включавшего клиническое, инструментальное и лабораторное обследование пациентов с ОА коленного сустава 1-П рентгенологической стадии. Диагноз подтверждался при физикальном обследовании больных, рентгенологически и при использовании биохимических, иммунологических и общеклинических критериев, удовлетворяющих диагностическим критериям ОА Американской коллегии ревматологов (АНшап Я., 1991). Характеристика исследуемых пациентов приведена в таблице 1.

Таблица 1

Характеристика больных ОА коленного сустава_

Критерий Группа ОА(п=30)

Рентгенологическая стадия по Келлтрену-Лоуренсу (Kellgren-Lawrence) 1,2

Индекс Лекена (Lequesne), баллов 11,0:1,3

Индекс KOOS (Knee injury and Osteoarthritis Outcome Score), баллов 179,2±3,1

Пол: м/ж 14/16

Средний возраст, лет 52,2±4,2

Индекс массы тела 26,12±0,32

Всем пациентам была объяснена схема исследования, возможные риски и осложнения, после чего у каждого пациента было получено письменное согласие на участие в исследовании. Оценка клинического течения ОА проводилась с помощью альгофункциональных индексов Лекена (Lequesne M.G., 1997) и KOOS (Roos Е.М. et al., 1998). В исследование были включены пациенты, которые не принимали в течение года до включения в исследование хондропротекторы. Из сопутствующей терапии допускалось применение нестероидного противовоспалительного препарата нимесулид в суточной дозе 100 мг, причем эта доза должны была быть стабильной на протяжении четырех недель до включения пациента в исследование и не меняться на протяжении всего исследования. Общая схема исследования представлена в таблице 2.

Биохимический анализ СЖ коленного сустава человека в норме связан с техническими трудностями извлечения СЖ из здоровых суставов ввиду

Таблица 2

Общая схема исследования

Визит День Группа Процедуры

Скрининг 0±3 Больные ОА (п=30) - подписание информированного согласия

- клиническое обследование

- оценка качества жизни (индексы Лекена, KOOS)

- рентгенография коленных суставов

Визит 1 7±3 До лечения ХС (п=30) - оценка качества жизни (индексы Лекена и KOOS)

анализ СЖ (9 параметров)

- назначение ХС («Структум») в дозе 1500 мг/сут (по 1 таб. 3 раза в день)

Визит 2 96±3 3 месяца лечения ХС (п=30) - оценка качества жизни (индексы Лекена и KOOS)

анализ СЖ (9 параметров)

- отмена ХС

Визит 3 126±3 Спустя 1 месяц после отмены ХС (п=30) - оценка качества жизни (индексы Лекена и KOOS)

анализ СЖ (9 параметров)

ее исключительно малого количества и инвазивности процедуры (Johnson J.S., Freemont A.J., 2001). В то же время в литературе имеется информация о значениях ряда биохимических параметров СЖ, полученной у здоровых добровольцев разного возраста (Heilmann H.H. et al., 1996).

Тем не менее, эти данные, по нашему мнению, нуждались в уточнении. В связи с этим мы сочли возможным использовать в качестве условной нормы данные анализа трупной СЖ. Оказалось, что такой методический подход вполне оправдан, поскольку полученные нами значения параметров трупной СЖ не выходили за пределы таковых у здоровых. Кроме того, наши данные не противоречили таковым, полученным рядом авторов при изучении трупной СЖ (Madea В., Kreuser С., Banaschak S.,2001).

СЖ извлекалась из коленных суставов людей (возраст от 30 до 55 лет), умерших в результате острой травмы, не связанной с повреждением коленных суставов (в основном - тяжелые черепно-мозговые травмы). СЖ извлекалась в течение 4 часов после смерти и немедленно обрабатывалась.

Аспирацию СЖ у испытуемых из полости сустава производили с помощью тонкой иглы в стерильных условиях. С помощью метода дифференциального центрифугирования из цельной СЖ выделяли клетки и фракцию цитозоля, которую использовали в дальнейшем для определения активности ферментов и уровня метаболитов.

Синовиальная жидкость исследовалась до начала лечения, через три месяца от начала лечения ХС и спустя 1 месяц после отмены ХС. Сразу после извлечения в цельной синовиальной жидкости измерялась скорость поглощения кислорода. Определение активности ферментов и уровня интермедиатов углеводного обмена проводили в бесклеточных фракциях синовиальной жидкости при оптимальных условиях (при оптимуме рН и температуры, насыщающей концентрации субстрата и в зоне линейной зависимости скорости ферментативной реакции от концентрации ферментного белка в пробе). рН СЖ определяли потеициометрическим методом на рН-метре «рН-105М» с использованием стеклянных электродов «ЭСЛ-48-11».

Для определения активности креатинфосфокиназы был использован унифицированный метод определения общей активности КФК с использованием в качестве субстрата креатина (Enner-Rosenberg, 1952); сукцинатдегидрогеназа (Zinger, Kearney, 1957) определялась фотометрически при 420 нм на спектрофотометре СФ-16 в среде С1 с добавлением антимицина А (1 мкМ), цианида (1 мМ) и феррицианида калия (1мМ); глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназа определялась фотометрически при 340 нм на спектрофотометре СФ-16 в 0,015 М пирофосфатном буфере с рН 8,5, содержащим 0,03 М арсената натрия (Velick, 1955). Глицеральдегид-З-фосфат в качестве субстрата был нами синтезирован по методике Кочетова. Для адекватного анализа результатов на разных этапах эксперимента активность ферментов выражали в нмолях субстрата (или продукта) реакции за 1 мин. в расчете на 1 мг внесенного в пробу белка. С этой целью синовиальная жидкость подвергалась центрифугированию в течение 10 минут при 3000 об/мин, после чего из супернатанта готовились разведения с одинаковым содержанием белка (в среднем 5 мг) на каждом из этапов исследования. Белок определяли по методу Лоури (Lowry et al., 1951) в модификации Гартри (Hartree, 1972).

Скорость потребления кислорода регистрировали в клетках синовиальной жидкости. Скорость восстановления кислорода определяли в полярографической ячейке с закрытыми платиновыми электродами типа электрода Кларка с рабочим объемом 1 мл амперометрическим методом на полярографе «ОН-Ю2» (ВНР).

Таблица 4

Содержание гиалуроновой кислоты в синовиальной жидкости коленного сустава человека при остеоартрозе и на фоне лечения препаратом «Структум», мг/100 мл

Стадия эксперимента Содержание гиалуроновой кислоты

Контроль 321±22

До лечения 85±10*

3 месяца лечения ХС 236±24**

Спустя 1 месяц после отмены ХС 284±18

При ОА события на молекулярном уровне могут развиваться в следующем направлении. В результате нарушения функции гемато-гистологических барьеров организма происходит активация протеолитической системы плазминоген-плазмин, которая высвобождает гиалуроновую кислоту из ее связи с белковым компонентом. Далее подключается система кислых протеаз, где гиалуронидаза воздействует на ставший доступным для нее субстрат - гиалуроновую кислоту и катализирует процесс деполимеризации последней до свободных гексоз, нарушая тканевую проницаемость и снимая защитные барьеры.

Таким образом, ферментативная функциональная система «гиалуроновая кислота - гиалуронидаза» является одним из важных компонентов гуморального гомеостаза соединительной ткани. Каскад изучаемых ферментативных реакций довольно сложен, но он практически расшифрован (рис. 2):

Рис. 2. Ферментативная деградация гиалуроновой кислоты

Параллельно с этим возрастает концентрация глюкуроновой кислоты, являющейся конечным продуктом распада гиалуроновой кислоты, в среднем на 134% (или в 2,3 раза).

При лечении препаратом «Структум» имеет место достоверное снижение как активности р-гиалуронидазы, так и концентрации глюкуроновой кислоты в среднем на 53% и 48% соответственно.

Необходимо отметить, что влияние препарата «Структум» на активность Р-гиалуронидазы и содержание глюкуроновой кислоты в СЖ сохраняется не менее 1 месяца после прекращения хондромодулирующей терапии (рис. 1).

2,5

г о о

к

к а

св

х и а

1,5

о 0,5

о

1

1

1

т 1.6 1,4 1,2 1

0,8 0,6 0,4 0,2 0

Норма До лечения ХС 3 мес 1 мес после

________отмены

ШШ Глюкуронат —♦— Гиалуронидаза

Рис. 1. Динамика содержания глюкуроновой кислоты и активности бета-гиалуронидазы в СЖ при О А на фоне терапии препаратом хондроитинсульфата "Структум"

Нами отмечено выраженное снижение концентрации гиалуроновой кислоты в СЖ коленного сустава больных ОА в среднем в 3,7 раза по сравнению с условной нормой (табл. 4).

Проведенные нами эксперименты показали, что под влиянием хондромодулирующей терапии препаратом ХС «Структум» имеет место достоверное повышение концентрации гиалуроновой кислоты уже через три месяца от начала терапии в среднем на 164% (или в 2,6 раза).

Через один месяц после отмены препарата «Структум» продолжалась тенденция к дальнейшему повышению содержания гиалуроновой кислоты в СЖ, что может свидетельствовать о наличии периода последействия в фармакокинетике данного препарата.

Количественный анализ простагландинов в синовиальной жидкости осуществляли радиоиммунологическим методом с использованием набора реактивов и методических прописей фирмы «Clinical Assay» (США). Радиоактивность проб измеряли на жидкостном сцинтилляционном счетчике «Mark-5» «Nuclear Chicago» (США) в диоксановом сцинтилляторе.

Таким образом, на всех этапах исследования у каждого пациента определяли 9 биохимических параметров СЖ. В общей сложности в ходе экспериментов было проведено 810 лабораторных исследований.

Математические расчеты и статистический анализ полученных экспериментальных материалов проводили по общепринятым статистическим алгоритмам. Также был применен корреляционный анализ (коэффициент корреляции (Vxy)) и дисперсионный анализ силы влияний [Плохинский H.A., 1970].

Собственные данные 1. Динамика активности ß-гиалуронидазы, содержание гиалуроновой и глюкуроновой кислот в СЖ коленного сустава человека при OA и на фоне хондромодулирующей терапии препаратом ХС «Структум» Согласно полученным нами данным, в СЖ коленного сустава у больных OA отмечается достоверное повышение активности ß-гиалуронидазы в среднем на 287% (или в 3,7 раза), по сравнению с условной нормой (табл. 3)

Таблица 3

Активность бета-гиалуронидазы и содержание глюкуроновой кислоты в синовиальной жидкости коленного сустава человека при остеоартрозе и на фоне лечения препаратом «Структум»

Стадия эксперимента Бета-гиалуронидаза (Ед/л) Глюкуроновая кислота (мг/100 мл)

Контроль(п=25) <0,31 0,81 ±0,20

До лечения (п=30) 1,21±0,23* 1,86±0,21*

3 месяца лечения (п=30) 0,58±0,11** 0,96±0,15**

Спустя 1 месяц после отмены ХС (п=30) 0,42±0,10 0,83±0,10

Примечание: значения представлены в формате M±m; п - количество испытуемых: * - достоверность различий с контролем - р<0,05; ** - достоверность различий с предыдущей стадией - р<0,05

Использованные биохимические подходы позволяют судить в целом не только об активности Р-гиалуронидазы, но и суммарно об активности лизосомальных гидролаз (по уровню гиалуроновой кислоты как субстрата).

Терапия ХС при ОА сопровождается нормализацией обмена гиалуроновой кислоты, а следовательно, и улучшением вязкостных свойств СЖ коленного сустава. Нормализация механических свойств СЖ, в свою очередь, приводит к снижению интенсивности деструктивных процессов в хряще и других тканях сустава, способствуя тем самым относительному преобладанию репаративных процессов, что лежит в основе улучшения клинической картины заболевания.

2. Содержание простагландинов в СЖ коленного сустава человека при ОА и на фоне хондромодулирующей терапии препаратом ХС

«Структум»

Поскольку ПГ являются медиаторами лихсрадки, боли и воспаления, значительный интерес представляла оценка их содержания в СЖ при ОА, а также в ходе лечения экзогенным ХС в форме препарата «Структум».

Согласно полученным нами данным, при ОА имеет место достоверное повышение суммарной концентрации ПГ в СЖ по сравнению с условной нормой в среднем в два раза (табл. 5).

Таблица 5

Содержание простагландинов в синовиальной жидкости коленного сустава человека при остеоартрозе и на фоне лечения препаратом «Структум»,

нг/мл

Стадия эксперимента ПГА ПГЕ ШТ2альфа ПГ

Контроль 1,(Ы),1 1,5±0,2 0,7*0,2 3,7±0,3

До лечения 2,3±0,3* 3,4±0,4* 0,9±0,2 7,1 ±0,4*

3 месяца лечения ХС 1,2±0,3*' 2,0*0,2*" 0,8±0,1 4,3±0,4**

Спустя 1 месяц после отмены ХС 1,1±0,2 1,7±0,3 0,7±0,1 3,6±0,4

Обращает на себя внимание тот факт, что уже через три месяца от начала терапии экзогенным ХС в форме препарата «Структум» происходит значительное (в среднем на 38%) снижение общего уровня ПГ в СЖ коленного сустава практически до уровня условной нормы (см. табл. 5).

Интересно, что через один месяц после окончания терапии ХС тенденция к снижению продолжает сохраняться.

Зафиксированное нами в опытах возрастание суммарной фракции ПГ при обострении OA косвенно свидетельствует об активации двух изоформ циклооксигеназы (ЦОГ) - ЦОГ-1 и ЦОГ-2. ЦОГ, как известно, осуществляют синтез ПГ и некоторых других производных арахидоновой кислоты: в этом процессе участвуют две молекулы кислорода. Продуктом циклооксигеназного пути является эндопероксидное производное, которое затем превращается в ПГ D, Е, F, а также в тромбоксан и простациклин (Шишкин В.И, Кудрявцева Г.В., 1987).

В целом ряде работ показано, что ИЛ-1-ß и ФНО-а являются основными провоспалительными цитокинами, синтезирующимися при OA (Attur M.G., Patel I.R., 1998). Известно, что добавление ИЛ-1-ß к культуре хондроцитов in vitro увеличивает дозозависимую экспрессию ЦОГ-2, что сопровождается параллельным повышением концентрации ПГЕ2 (Hardy М.М. et а!., 2002; Kaneyama К., Segami N. et al., 2002). По мнению некоторых авторов, экзогенный ХС способен оказывать противовоспалительное действие, сходное по своим клиническим проявлениям с таковым у НПВП (in vitro доказано его антагонистическое влияние по отношению к эффектам ИЛ-1-ß) (Bodo М. et al., 1997).

Таким образом, наши результаты не противоречат данным предшествующих исследований и позволяют предположить, что снижение концентрации ПГ в СЖ может происходить, в том числе, за счет непосредственного подавляющего действия ХС на циклооксигеназную ферментативную систему. Судить о степень селективности препаратов ХС в отношения изоформ циклооксигеназы на основании имеющихся в литературе данных можно лишь косвенно. Учитывая отсутствие побочных эффектов (столь характерных для неселективных НПВП) со стороны желудочно-кишечного тракта и почек даже при длительной (в течение 3 лет в ходе многоцентровых исследований (Насонова В.А., Алексеева Л.И. и соавт., 2001) терапии ХС, можно думать о селективности этого препарата в отношении ЦОГ-2.

При OA наблюдается иная динамика СДП. Так, согласно полученным нами данным, при OA имеет место повышение содержания ПГА в 1,9 раза, ПГЕ в 1,7 раза, а содержание ШТ^а остается практически неизменным (рис. 3).

Некоторые авторы действительно отмечают повышение концентрации различных типов ПГ в СЖ при OA, в частности ПГЕ2 который, очевидно, проявляет при этом заболевании свои провоспалительные свойства (Alstergren Р., Kopp S., 2000).

На фоне терапии ХС мы наблюдаем достоверное снижение концентрации фракций ПГА и ПГЕ до нормальных значений. В то же время

я х

о

Контроль

До лечения

НПГА ППГЕ йПГР2-альфа

3 месяца Спустя 1 месяц лечения ХС после отмены препарата

Рис. 3. Динамика уровня простагландинов в СЖ при ОА на фоне терапии препаратом хондроитинсульфатг "Структум"

содержание ПГр2<х не претерпевает существенных изменений и остается на исходном уровне (см. рис. 3).

Итак, наши результаты свидетельствуют о значительном возрастании суммарного содержания ПГ в СЖ при ОА. Учитывая, что ОА характеризуется признаками усиления воспалительных процессов в суставе, можно говорить о преимущественном повышении уровня ПГ за счет фракций провоспалительных ПГ с депрессорной активностью (ПГА и ПГЕ). В этом мы видим еще одно коренное отличие патогенетических механизмов ОА от других заболеваний суставов, таких как ревматоидный артрит, системная красная волчанка или системная склеродермия.

Терапия ХС, в свою очередь, положительно сказывается на динамике прессорных фракций ПГ благодаря непосредственному ингибирующему влиянию препарата на ферментативные пути их синтеза, что находит свое отражение в нормализации клинического состояния больных ОА.

3. Скорость поглощения кислорода клетками СЖ коленного сустава человека при ОА и влияние на этот процесс хондромодулирующей терапии препаратом ХС «Структум

Многие авторы отмечают наличие минимальных изменений в клеточном составе СЖ при ОА (Amer H., Swan А., 2001 ). Анализ клеточного состава СЖ при ОА показывает, что примерно 80-90% всех клеток представлены лейкоцитами и лимфоцитами. Соотношение между этими двумя типами клеток независимо от активности заболевания остается

практически неизменным (в отличие от большинства других воспалительных артропатий) (Эо^аёоз М., 1996). Более того, нередко клеточный состав СЖ при ОА практически не отличается от нормы (Рипг1 и 01тего 2003).

Как показал проведенный нами полярографический анализ скорости поглощения кислорода клетками СЖ, при синовите коленного сустава, связанном с ОА, скорость поглощения кислорода по сравнению с условной нормой возрастает на 115% (или в 2,1 раза) (табл. 6).

Таблица 6

I

Скорость поглощения кислорода клетками синовиальной жидкости коленного сустава человека при остеоартрозе и на фоне лечения препаратом «Структум», наноатомов 02/мин. на 1 мг белка

Стадия эксперимента Скорость поглощения кислорода

Контроль 35,8±4,4

До лечения 76,3±5,4*

3 месяца лечения ХС 52,6±5,1**

Спустя 1 месяц после отмены ХС 42,4±4,3

Хондромодулирующая терапия препаратом ХС «Структум» уже через три месяца от начала лечения позволяет добиться снижения скорости поглощения кислорода клетками СЖ коленного сустава у больных ОА в среднем на 31 %, что достоверно меньше, чем значение этой величины до начала терапии ХС.

Через один месяц после окончания перорального введения ХС нами отмечена дальнейшая тенденция к снижению скорости потребления кислорода клетками СЖ (см. табл. 6).

Наблюдаемое различие значений этого показателя свидетельствует о преобладании в фазе клинического обострения ОА окислительных биохимических процессов с участием кислорода. Это могут быть, прежде всего, процессы клеточного дыхания, а также синтеза цитокинов и ПГ. Известно также, что при воспалении кислород как акцептор электронов, расходуется на образование своих активных форм, в частности, радикалов и эндоперекисей (Dimock A.N., Siciliano P.D., Mcllwraith C.W., 2000). Активные формы кислорода могут самостоятельно оказывать дезинтегрирующее действие как на клеточные элементы синовиальной оболочки и хряша, так и на макромолекулы хрящевого матрикса и СЖ (Jahn М. et al., 1999).

Весьма позитивной в этом отношении оказывается роль испытываемого нами фармакологического агента - ХС. Под его влиянием активность СДГ в клетках СЖ имеет отчетливую тенденцию к нормализации (см. табл. 7). С учетом описанного выше факта, касающегося регуляторного влияния ПГ на СДГ, можно предположить, что при терапии ХС гуморальное воздействие «ПГ-подобных субстанций» на СДГ снижается. И это, в свою очередь обусловлено ингибирующим эффектом препарата на циклооксигеназную систему иммунных клеток СЖ, в частности на изофермент ЦОГ-2, ответственный за патофизиологические воспалительные процессы при ОА.

Таким образом, активность ряда ферментов энергетического метаболизма, в частности СДГ, при ОА можно рассматривать как интегральный показатель напряженности энергообразующих ферментативных систем в клетках суставных тканей, зависящий от степени выраженности деструктивных процессов, а также от эффективности и скорости репаративных процессов.

5. Динамика рН СЖ коленного сустава человека при ОА на фоне хондромодулирующей терапии препаратом ХС «Структум

Возрастание энергетических затрат в клетках суставных тканей для своевременной репарации структурных повреждений при ОА на фоне гипоксии СЖ, хряща и синовиальной оболочки сустава приводит к активизации ферментативных систем гликолитического пути углеводного обмена. Вследствие накопления лактата происходит смещение рН СЖ в более кислую область. Если в норме рН СЖ колеблется в пределах 7,4-7,6, то при ОА регистрируется снижение рН до 6,9 (табл. 8).

Таблица 8

Значения рН синовиальной жидкости коленного сустава человека при остеоартрозе и на фоне лечения препаратом _«Структум»_

Стадия эксперимента рН

Контроль 7,53±0,06

До лечения 6,92±0,07*

3 месяца лечения ХС 7,3 1 ±0,07**

Спустя 1 месяц после отмены ХС 7,49±0,05

Являясь линейным полимером, гиалуроновая кислота только при рН=7 содержит полностью ионизированные карбоксильные группы,

Под влиянием хондромодулирующей терапии препаратом ХС «Структум» через три месяца от начала лечения отмечается достоверное снижение активности СДГ в среднем на 35%, что косвенно может свидетельствовует о снижении степени напряженности энергообразующих ферментативных клеточных систем (см. табл. 7).

Через один месяц после окончания терапии препаратом «Структум» имеет место тенденция к дальнейшему снижению активности СДГ. На этом этапе ее активность практически не отличается от нормы.

Являясь катализатором окисления янтарной кислоты в цикле Кребса, СДГ играет одну из ключевых ролей в образовании макроэргических фосфатов. Таким образом, ее активность может служить показателем скорости протекания энергетических процессов в клетке в зависимости от степени ее синтетической активности.

Увеличение в этих условиях концентрации сукцината способствует субстратной активации СДГ, которая может «монополизировать» дыхательную цепь и поставлять за единицу времени больше АТФ, чем при окислении других субстратов (Mobasheri A. et al., 2002). В свою очередь, СДГ является одним из наиболее тонко регулируемых ферментов цикла трикарбоновых кислот.

Значительное повышение активности СДГ в клетках СЖ больных OA свидетельствует об интенсификации окислительно-восстановительных процессов в митохондриальной цепи дыхательных ферментов, что в определенной степени подтверждается и выявленным нами возрастанием скорости потребления кислорода клетками СЖ (см. табл. 6). Повышение активности СДГ, по нашему мнению, может быть связано как с повышением каталитической активности самого фермента, так и с увеличением количества ферментативного белка вследствие гиперфункции и увеличения количества митохондрий в активизированных клетках при воспалительных процессах, в частности при OA.

На основании полученных нами данных по динамике активности СДГ при OA можно заключить, что при развитии заболевания в клетках СЖ интенсифицируются процессы свободного окисления в митохондриях, мало сопряженного с окислительным фосфорилированием. По сути, наблюдается некое разобщение процессов дыхания и окислительного фосфорилирования.

Кроме того, в СЖ при OA происходит нарастание концентрации «разобщающих» факторов, таких как ПГ. Нами достоверно показано, что при OA резко увеличивается содержание ПГА, ПГЕ, а также суммарной фракции ПГ. Интересно, что, обладая «разобщающим» эффектом, ПГ способны одновременно активировать in vitro целый ряд ферментов, в том числе КФК и СДГ (Кудрявцева Г.В., 1979).

Важно отметить, что каталитический эффект ЦОГ-1 и ЦОГ-2 осуществляется только при наличии кислорода. Усиление процессов образования ПГ при ОА свидетельствует о повышении активности ферментов-оксигеназ. Ферменты этой группы катализируют включение кислорода в молекулу субстрата. Действительно, мы наблюдаем определенный параллелизм между возрастанием скорости потребления кислорода клетками СЖ и увеличением уровня ПГ в ней при ОА, а также тенденцию к нормализации этих показателей на фоне лечения (см. табл. 5, табл. 6).

Таким образом, препарат «Структум» нормализует скорость потребления кислорода клетками, входящими в СЖ, снижает уровень ПГ в очаге воспаления, тем самым препятствуя увеличению спонтанной генерации свободных радикалов и купируя динамику воспалительного процесса в целом.

В связи с обнаруженными биохимическими изменениями в СЖ в рамках настоящего исследования представляло интерес оценить интенсивность процессов углеводно-фосфорного метаболизма в клеточной и внеклеточной фракциях СЖ, а также степень влияния на этот процесс хондромодулирующей терапии препаратом ХС «Структум».

4. Активность ферментов энергетического метаболизма в СЖ коленного сустава человека при ОА и на фоне хондромодулирующей терапии препаратом ХС «Структум» на примере сукцинатдегидрогеназы

Как показали проведенные нами опыты, в клетках СЖ больных ОА имеет место повышение активности СДГ в среднем в 3,3 раза по сравнению с условной нормой (табл. 7).

Таблица 7

Активность сукцинатдегидрогеназы в синовиальной жидкости коленного сустава человека при остеоартрозе и на фоне лечения препаратом «Структум», нмоль/мин. на 1 мг белка

Стадия эксперимента Активность сукцинатдегидрогеназы

Контроль 1,1 ±0,2

До лечения 3,6±0,2*

3 месяца лечения ХС 2,5±0,2**

Спустя 1 месяц после отмены ХС 1,8±0,2

несущие отрицательный заряд и образующие с диполями воды растворы очень высокой вязкости. Наиболее интенсивно ферментативный процесс снижения концентрации и молекулярного веса гиалуроната протекает при pH-оптимуме лизосомальных кислых гидролаз (рН=4,5-5,0). Вот почему смещение pH СЖ при ОА в более кислую область следует отнести к основным пусковым патогенетическим механизмам развития этого заболевания.

Хондромодулирующая терапия препаратом ХС «Структум» вызывает компенсаторное повышение pH СЖ до нижней границы нормы (см. табл. 8).

6. Корреляционные взаимосвязи между биохимическими параметрами СЖ и степенью активности клинических проявлений при ОА на примере индексов Лекена и KOOS

Полученные нами данные подтверждают, что в фазе обострения клиническая картина ОА характеризуется сравнительно высокими значениями индексов Лекена и KOOS.

На фоне терапии препаратом ХС мы наблюдали снижение клинической активности заболевания. После трех месяцев хондромодулирующей терапии препаратом ХС «Структум» 62% больных ОА коленного сустава отмечали исчезновение боли в покое, 18% больных -боли в движении. Отсутствие клинического эффекта терапии наблюдалось только у 5% больных.

В процессе лечения больных ОА мы наблюдаем достоверное снижение индекса Лекена почти в 2 раза (табл. 9).

Таблица 9

Индекс Лекена при остеоартрозе и на фоне лечения препаратом «Структум», баллы

Стадия эксперимента Индекс Лекена

До лечения 11,6t 1,3

3 месяца лечения ХС 5,7±1,4**

Спустя 1 месяц после отмены ХС 6,1±1,3

Общая сумма баллов индекса KOOS в фазе обострения превышает таковую после трехмесячной терапии препаратом «Структум» почти на 100% (табл. 10).

Таблица 10

Индекс KOOS при остеоартрозе и на фоне лечения препаратом __«Структум», баллы_

Субшкалы KOOS Стадии эксперимента

До лечения 3 месяца лечения ХС Спустя 1 месяц после отмены

Боль 42,2±5,8 15,3±3,7** 16,3±3,5

Симптомы ОА 57,1±7,1 18,6±2,9** 21,6±2,3

Общая нетрудоспособность 45,8±4,9 14,1±2,3** 15,1 ±2,1

Ограничение занятий спортом 10,3±3,1 6,2±1,3 7,1±1,2

Низкое качество жизни 25,4±4,2 15,0±3,1 ** 17,0±2,8

Общая сумма 179,2±8,1 68,5±7,9** 66,3±7,8

Как можно видеть из таблицы максимальные различия имеют место в шкалах, характеризующих деструктивно-воспалительные процессы (шкала «Боль», «Симптомы ОА» и «Общая нетрудоспособность»). Хондромодулирующая терапия препаратом ХС позволила снизить показатели этих шкал в 2,8, в 3,2 и в 3,3 раза, соответственно.

Необходимо отметить, что клинический эффект препарата ХС «Структум» сохраняется даже спустя один месяц после прекращения терапии.

Указанные индексы в первую очередь отражают степень выраженности клинических проявлений деструктивно-воспалительных процессов в пораженных суставах. Наши данные полностью согласуется с проведенными ранее исследованиями с применением указанных индексов (Насонова В.А. е1 а1„ 1998; Ьеяиезпе КЮ., 1997).

Нам удалось обнаружить высокую степень корреляции между клинической картиной и биохимическими изменениями СЖ при ОА (табл. 11).

Как видно из таблицы максимальная корреляция имеет место с активностью бета-гиалуронидазы, содержанием гиалуроновой кислоты, скоростью поглощения кислорода, активностью СДГ и содержанием ПГ в СЖ. По нашему мнению, эти ключевые параметры являются интегральными

Таблица 11

Коэффициент корреляции между биохимическими параметрами СЖ и клиническими индексами при остеоартрозе

Параметр Индекс К008 Индекс Лекена

Бета-гиалуронидаза 0,82 0,81

Глюкуроновая кислота 0,77 0,74

Гиалуроновая кислота -0,88 -0,82

Креатинфосфокиназа 0,63 0,67

Сукцинатдегидрогеназа 0,72 0,74

Глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназа 0,64 0,62

Скорость поглощения кислорода 0,85 0,83

Простагландины 0,84 0,82

показателями активности основных патогенетических звеньев при ОА и адекватно отражают степень деструктивно-воспалительных изменений в тканях сустава.

Механизмы воздействия ХС на рассмотренные выше механизмы патогенеза ОА, по всей видимости, разнообразны и во многом связаны с особенностями молекулярного строения ХС. Можно предполагать, что высокое содержание сульфатных групп в молекуле ХС, способных взаимодействовать с активными формами кислорода, приводит к снижению концентрации последних и, следовательно, к уменьшению процессов дезинтеграции тканей сустава. Терапия ХС приводит к параллельному снижению скорости потребления кислорода клетками СЖ и уровня ПГ в очаге воспаления, тем самым препятствуя увеличению спонтанной генерации свободных радикалов и купируя динамику воспалительного процесса в целом.

Являясь важным компонентом протеогликанов, ХС способен непосредственно участвовать в синтезе надмолекулярных структур СЖ, повышая ее хондропротекторные свойства. Подавляя выработку провоспалительных цитокинов в хряще, ХС снижает и степень деградации полимерных молекул хрящевого матрикса и СЖ, о чем мы можем косвенно судить по выявленному нами повышению концентрации гиалуроновой кислоты и снижению активности (3-гиалуронидазы.

Заключение

На основании представленных нами в настоящей работе экспериментальных материалов можно заключить, что на 1-П стадиях ОА синовиальная жидкость коленного сустава характеризуются целым рядом патологических изменений, происходящих на молекулярном уровне.

Одним из основных патологических процессов, развивающихся при ОА, является нарушение метаболизма ГАГ. Разрушение суставного хряща сопровождается при этом высвобождением гиалуроновой кислоты и кислых мукополисахаридов, что приводит к закономерному снижению рН СЖ и возрастанию, на этом фоне, активности кислых гидролаз.

Нами обнаружено, что вследствие повышения ферментативной активности Р-гиалуронидазы значительно снижается содержание гиалуроновой кислоты в СЖ (см. табл. 3, табл. 4). Разрушение этого мукополисахарида сопровождается нарушением основных физиологических свойств СЖ, что способствует, в свою очередь, усугублению процесса разрушения суставного хряща. Таким образом замыкается один из порочных кругов патогенеза ОА.

На фоне лечения ХС нами обнаружено резкое снижение активности лизосомальных гидролаз в СЖ, происходящее параллельно с нормализацией содержания гиалуроновой кислоты. По сути, ХС структурирует измененную при ОА СЖ, нормализуя в ней обменные процессы и опосредованно подавляя активность (3-гиалуронидазы. Использованные биохимические подходы позволяют, таким образом, судить не только об активности р-гиалуронидазы, но и суммарно об активности лизосомальных гидролаз (см. табл. 3, рис. 1).

В ходе данного исследования нами обнаружено, что воспалительный процесс при ОА находит свое выражение в активизации процессов энергетического метаболизма СЖ. В клетках СЖ интенсифицируются окислительные процессы с участием кислорода, о чем свидетельствует зарегистрированное нами повышение скорости потребления кислорода клетками СЖ и повышение активности СДГ (см. табл. 6, табл. 7). Выявленное в ходе настоящего исследования повышение концентрации провоспалительных фракций ПГ (ПГА и ПГЕ), может являться одним из прямых следствий повышения синтетической активности клеток СЖ (см. табл. 5, рис. 3).

В ходе настоящего исследования установлено, что применение ХС в форме препарата «Структум» сопровождается не только нормализацией обмена ГАГ в СЖ (как было указано выше), но и снижением интенсивности метаболических процессов в клетках СЖ. С учетом полученных нами, а также литературных данных, можно предполагать, что эти эффекты ХС связаны с его воздействием на цитокиновое и ферментативные звенья патогенеза ОА (рис. 4).

Снижение устойчивости хряща и С Ж к механической нагрузке

Активация лейкоцитов

дегрануляция, респираторный взрыв

Активные

формы кислорода

Лизосомальные

гидролазы (гиалуронидаза, глюкуронидаза, гексозаминидаза, сульфатазы)

Разрушение гиалуроновой кислоты и других ГАГ, снижение рН СЖ

Синтез ИЛ-1-Р, ФНО-альфа и других цитокинов

Активация лимфоцитов

Рост энергопотребления гипертрофия митохондрий и усиление синтеза АТФ

Повышение потребления кислорода

Выход внутриклеточных ферментов в СЖ

Повышение внутриклеточной концентрации КФК, СДГ и ГА-1-ФДГ

Гибель и разрушение фибробластов, синовиоцитов, лейкоцитов, лимфоцитов

Рис 4 Возможные точки приложения действия препарата ХС «Структум» на патогенетический механизм ОА

пг - простагландины, хс - хондроитинсульфат, КФК - креатинфосфокиназа, СДГ -сукцинатдегидрогенача, ГА-З-ФДГ - глицеральдегид-3-фосфат дегидрогеназа, ИЛ -интерлейкин, ФНО - фактор некроза опухолей, ГАГ - гликозаминогликаны

Некоторые биохимические параметры СЖ (активность Р-гиалуронидазы, скорость поглощения кислорода клетками СЖ, ферментативная активность СДГ, концентрация ПГ, содержание гиалуроновой кислоты) обнаруживают высокую степень корреляции с клинической активностью ОА. Следовательно, определение этих параметров СЖ может быть рекомендовано для клинико-лабораторной оценки эффективности хондромодулирующей терапии при ОА.

Выводы

1. Клиническая активность ОА коленного сустава на 1-П стадиях заболевания

взаимосвязана с патологическими изменениями биохимических параметров СЖ:

а) во внеклеточной фракции СЖ:

- возникают нарушения метаболизма кислых мукополисахаридов: в

результате повышения в 3,7 раза ферментативной активности I-гиалуронидазы происходит снижение концентрации гиалуроновой кислоты в 3,7 раза, и в 2,3 раза повышается содержание глюкуроновой кислоты;

- возрастает активность ферментов энергетического метаболизма: в 2,7

раза увеличивается общая активность КФК, и на 81% повышается общая активность ГА-З-ФДГ;

- повышается содержание провоспалительных фракций простагландинов:

ПГА в 1,9 раза, ПГЕ в 1,7 раза.

- статистически достоверно снижается рН СЖ;

б) в клетках СЖ возрастает интенсивность окислительных процессов,

что выражается в повышении скорости поглощения кислорода клетками СЖ в 2,1 раза и повышении ферментативной активности СДГ в 3,3 раза.

2. Через три месяца терапии препаратом хондроитинсульфата «Структум»

происходит нормализация гомеостатических параметров СЖ, что выражается:

- в снижении активности Р-гиалуронидазы (на 53%) и повышении

содержания гиалуроновой кислоты (в 2,6 раза);

- в снижении активности ферментов энергетического метаболизма - КФК

(на 31,5%) и ГА-З-ФДГ (на 24%);

- в снижении скорости поглощения кислорода клетками СЖ (на 31%) и

активности СДГ (на 35%);

- в снижении содержания провоспалительных фракций ПГ - ПГА и ПГЕ;

- в повышении рН СЖ до нижней границы нормы, причем показатель

силы влияния препарата «Структум» на этот параметр СЖ достигает 85%.

Через один месяц после прекращения терапии ХС указанные параметры СЖ остаются в пределах нормальных значений.

3. Исследуемые биохимические параметры СЖ (активность р-гиалуронидазы, скорость поглощения кислорода клетками СЖ, ферментативная активностью СДГ, концентрация простагландинов и содержание гиалуроновой кислоты) обнаруживают высокую степень корреляции с клинической активностью ОА.

4. Определение активности Р-гиалуронидазы, скорости поглощения кислорода клетками СЖ, ферментативной активности СДГ, концентрации простагландинов, содержания гиалуроновой кислоты и рН СЖ может быть рекомендовано для клинико-лабораторной оценки эффективности хондромодулирующей терапии при ОА.

Практические рекомендации

1. Основные теоретические положения диссертации могут быть использованы в лекционных курсах «Клиника и патогенез ревматологических заболеваний», «Молекулярные механизмы иммунитета и иммунопатология», рекомендуемых для слушателей Институтов усовершенствования врачей, студентов медицинских ВУЗов и медико-биологических факультетов университетов.

2. Определение активности ферментов углеводно-фосфорного метаболизма, скорости поглощения кислорода клетками СЖ, уровня простагландинов и активности кислых гидролаз в СЖ может быть рекомендовано к применению:

а) в клинической лабораторной диагностике при I, II стадиях остеоартроза;

б) для оценки эффективности структурно-модифицирующей терапии остеоартроза при клинических испытаниях препаратов хондроитинсульфата.

Список работ, опубликованных по материалам диссертации

1. Рябков А.5., Шишкин В.И., Кудрявцева Г.В. "Влияние терапии хондроитинсульфатом на биохимические параметры синовиальной жидкости коленного сустава человека при остеоартрозе" Электронный журнал "Исследовано в России", 250, стр. 2684-2695, 2004 г., http:// zhurnal.ape.relarn.ru/articles/2004/250.pdf.

2. Шишкин В.И., Кудрявцева Г.В., Рябков А.Б. Действие препарата структум (хондроитинсульфат) на биоэнергетические характеристики синовиальной жидкости при остеоартрозе // Научно-практическая ревматология. - 2001. - № 5. - С. 11 -14.

3. Шишкин В.И., Кудрявцева Г.В., Рябков А. Б. Активность кислых гидролаз в синовиальной жидкости больных остеоартрозом при лечении хондроитинсульфатом (структум) // Тезисы докл. III съезда ревмат. России. - Рязань, 2001. - С. 137.

4. Шишкин В.И, Рябков А.Б. Клинико-биохимические показатели эффективности лечения больных остеартрозом препаратом хондроитинсульфат (структум) // Тезисы докл. научно-практической конференции, посвященной 40-летию Санкт-Петербургской клинической больницы РАН. - Санкт-Петербург, 2002. - С.91.

5. Shishkin V., Kudriavtseva G., Riabkov A. The effect of structum (chondroitin sulphate) on the bioenergetical characteristics of synovial fluid in osteoarthritis //Ann. Europ. Congr. of Rheumatology EULAR: Book of abstr. -Stockcholm, 2002.-P.513.

6. Биохимические параметры синовиальной жидкости при остеоартрозе на фоне хондромодулирующей терапии // Тезисы докл. III Северо-Западной конференции по ревматологии, Псков, 2003 г. - С.7-8.

»13618

РНБ Русский фонд

2006-4 9742

Остеоартроз (OA) — хроническое прогрессирующее дегенеративно-дистрофическое заболевание суставов, характеризующееся первичной дегенерацией суставного хряща с последующими изменениями субхондральной кости и развитием краевых остеофитов, что приводит к деформации суставов, сопровождается явным или скрыто протекающим синовитом [2].

OA становится одной из самых распространенных хронических болезней в высокоиндустриальных странах. Ввиду преобладания этого недуга у пожилых людей тенденция к росту заболеваемости принимает мировой масштаб как следствие увеличения продолжительности жизни. В то же время, изучение OA все еще финансово ограничивается в рамках биомедицинского исследования, а молекулярно-биологические механизмы развития болезни и ее прогрессирования во многом остаются невыясненными [21].

Характеризующийся длительным и прогрессирующим характером течения, OA редко угрожает жизни, но ассоциирован с высокой частотой формирования инвалидности у взрослых по суставному синдрому.

Актуальность изучения этиологии и патогенеза OA, а также поиска эффективных методов лечения этой патологии на основе сопоставления клинических, иммунологических и биохимических данных определяют следующие факторы:

1. Социально-экономические:

- увеличение заболеваемости остеоартрозом;

- увеличение средней продолжительности жизни в индустриально развитых странах;

- увеличение заболеваемости ожирением, артериальной гипертензией, сахарным диабетом с нарушением микроциркуляции и трофики различных органов и тканей, в том числе тканей сустава;

- высокие экономические затраты при лечении побочных эффектов и осложнений от терапии НПВП, рост заболеваемости язвенной болезнью желудка и двенадцатиперстной кишки, тубулоинтерстициальным НПВП-нефритом [25,203];

- появление новой группы препаратов — хондропротекторов в виде хондроитинсульфата с возможностью промышленного производства достаточного количества чистого вещества;

- клинически доказанная эффективность хондроитинсульфата в лечении больных OA.

2. Методологические:

- недостаточное количество данных о биохимических механизмах патогенеза OA у человека;

- необходимость изучения молекулярных механизмов действия хондромодуляторов на основе хондроитинсульфата при OA у человека для направленного поиска более эффективных препаратов.

В последние годы медицинская и социально-экономическая значимость OA заметно возросла. OA является наиболее распространенной формой суставной патологии. На долю этого заболевания приходится 60-70% всех ревматических болезней.

Необходимость проведения длительной терапии для получения стойкого эффекта и снижения инвалидизации больных OA представляет серьезную проблему, причем не только в России, но и в экономически развитых странах. OA болеют 10-12% населения США и Европы. Проблема OA чрезвычайно актуальна и для России. Так, из 11 млн. обращений пациентов в связи с ревматическими заболеваниями, зарегистрированными в 1996 г., по меньшей мере, 16% были связаны с OA [32]. По данным ежегодных Государственных отчетов МЗ РФ за период с 1994 по 1998 годы б России установлен рост показателей болезненности и заболеваемости при OA на 44,3% и 25,0% соответственно [31].

OA представлен во всех возрастных группах. Отдельные случаи заболевания отмечены уже у молодых лиц 16-25 лет. С возрастом частота заболевания увеличивается - у лиц старше 50 лет она составляет 27%, старше 60 лет - 97% [31]. До 45-летнего возраста OA чаще встречается среди мужчин, после 54 лет — среди женщин [34]. При этом до 80% больных OA имеют ограничения подвижности разной степени, а 25% - не могут выполнять домашнюю повседневную работу [11].

Костно-суставные синдромы сопровождаются тяжкими болевыми ощущениями, нарушением функциональной активности костно-мышечного аппарата и приводят к ранней и тяжелой инвалидизации и смертности.

Все выше изложенное свидетельствует о своевременности и актуальности изучения вопросов ранней диагностики, профилактики, лечения и прогнозирования OA.

Сегодня для объективизации получаемых данных во времч клинических испытаний препаратов при OA все чаще применяются альгофункциональные индексы [116]. Их эффективность и достоверная корреляция с клиническими фазами OA доказана в ряде крупных многоцентровых исследований [28, 30]. Тем не менее, подобные методики оценки все же достаточно субъективны по своей сути и не могут в полней мере свидетельствовать о реальных процессах на уровне суставных тканей при OA.

В то же время в качестве объективных методов контроля до сих пор предлагается использовать различные методы лучевой визуализации суставов и артроскопию [63, 94]. В первом случае вероятность ошибки повышается из-за отсутствия стандартизации такой оценки: нет единой концепции, касающейся углов съемки, выбора сустава и проч. [185]. С другой стороны, изменения структуры сустава, как правило, происходят на значительном временном промежутке, достигающем нескольких месяцев или даже лет постоянного лечения. На ранних этапах терапии получить этими методами достоверные данные о существенных изменениях макроструктур сустава практически невозможно. Относительно атроскопических методов следует отметить, что их использование в клинических испытаниях ограничивается этическими нормами в связи с инвазивностыо процедур и высоким риском осложнений [94].

Кровь и тем более моча несут лишь опосредованную информацию о состоянии сустава, которая в достаточной степени искажается информационным шумом из других источников-органов и тканей всего организма. Это не позволяет судить о функциональном состоянии конкретного сустава, особенно при изолированных поражениях, которые нередко встречаются при OA.

СЖ можно рассматривать как интегральный показатель состояния суставных структур. Выполняя не только защитную, но и обменную функцию, непосредственно соприкасаясь со всеми микро- и макроструктурами сустава, СЖ может дать более точную информацию об их текущем состоянии. Поэтому именно изучение особенностей СЖ при OA, по нашему мнению, будет способствовать расшифровке тонких механизмов этиопатогенеза этого заболевания.

Согласно данным английских исследователей [46], для дифференциальной диагностики при суставной патологии чаще всего используются результаты поляризационной световой микроскопии (70%) СЖ; несколько реже специалисты обращаются к микробиологическим методам исследования СЖ (66%). Клеточный состав СЖ помогает определиться с диагнозом в 26% случаев.

Что же касается биохимических методов исследования СЖ, то на сегодняшний день их популярность среди практикующих врачей не превышает 10%, что связано с отсутствием стандартизации СЖ, с трудоемкостью биохимических методик и с определенными трудностями в интерпретации полученных данных. В то же время насущная необходимость в более точной диагностике суставной патологии с применением биохимических методов исследования высказывается многими авторами [46,151]. Это связано как с ростом нозологических форм заболеваний суставов, так и с необходимостью объективизации данных клинических испытаний лекарственных препаратов, которые в последнее время находят широкое применение в терапии артритов и артрозов [151]. Особенно это актуально для группы слабовоспалительных артропатий, к которым относится OA.

Анализ традиционных параметров СЖ, таких как содержание общего белка, общее число клеток и процентное содержание лейкоцитов и лимфоцитов в СЖ показывает, что на ранних стадиях OA эти параметры меняются незначительно, несмотря на существенные различия в клинической картине заболевания в разных фазах течения OA [184]. Многие исследователи отмечают относительно слабую корреляцию между указанными параметрами и клинической картиной OA [159].

Следовательно, содержание общего белка и синовиоцитограмма не могут служить адекватными критериями клинической активности OA. Кроме того, они мало пригодны и в оценке эффективности противовоспалительной и структурно-модифицирующей терапии при OA, в частности, при клинических испытаниях новых препаратов.

Все изложенное выше свидетельствует о своевременности и актуальности изучения вопросов ранней диагностики, профилактики, лечения и прогнозирования OA на основе углубленного биохимического анализа СЖ.

Цель настоящего исследования заключалась в выявлении и клиническом анализе взаимосвязей между особенностями динамики биохимических параметров СЖ коленного сустава человека и клинической активностью OA под влиянием хондромодулирующей терапии препаратом ХС «Структум». Цель исследования достигалась последовательным решением ниже перечисленных основных задач:

1. Изучить динамику скорости поглощения кислорода клетками СЖ коленного сустава человека при OA, а также степень влияния на этот процесс препарата «Структум».

2. Дать клинико-биохимическое истолкование изменениям углеводно-фосфорного метаболизма СЖ при OA и оценить влияние на этот процесс препарата «Структум» путем анализа активности ферментов в СЖ коленного сустава человека при OA.

3. Охарактеризовать количественно содержание простагландинов (ПГ) в СЖ колсешого сустава человека при OA и выявить их динамику на фоне лечения препаратом «Структум». Дать клиническую интерпретацию полученным экспериментальным материалам.

4. Оценить в целом клинико-биохимическое значение обмена ГАГ в СЖ коленного сустава человека при OA и на фоне хондромодулирующей терапии препаратом ХС.

5. Определить степень корреляции между изменением биохимических параметров СЖ и клинической активностью OA.

Научная новизна настоящего исследования заключается в следующем:

1. Впервые применен новый подход к изучению патогенеза OA с позиций анализа биоэнергетики СЖ.

2. Выявлены биохимические особенности энергетического метаболизма клеток СЖ коленного сустава человека в зависимости от клинической активности OA.

3. Определена степень корреляции между количественными изменениями биохимических параметров СЖ (активностью (З-гиалуронидазы, содержанием гиалуроновой и глюкуроновой кислот, простагландинов, скоростью поглощения кислорода клетками СЖ, активностью креатинфосфокиназы, сукцинатдегидрогеназы и глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы) и клинической активностью OA коленного сустава человека под влиянием хондромодулирующей терапии препаратом ХС «Структум».

Практическая значимость работы:

Основные теоретические положения диссертации могут быть использованы в лекционных курсах «Клиника и патогенез ревматологических заболеваний», «Молекулярные механизмы иммунитета и иммунопатология», рекомендуемых для слушателей Институтов усовершенствования врачей, студентов медицинских ВУЗов и медико-биологических факультетов университетов. Определение активности ферментов углеводно-фосфорного метаболизма, скорости поглощения кислорода клетками СЖ, уровня простагландинов и активности кислых гидролаз в СЖ может быть рекомендовано к применению в клинической лабораторной диагностике OA и для оценки эффективности структурно-модифицирующей терапии при OA.

Основные научные положения, выносимые на защиту:

1. I и II стадии OA хараюеризуются усилением процессов энергетического метаболизма в клетках СЖ, выражающемся в повышении активности ферментов углеводно-фосфорного обмена (креатинфосфокиназы, глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы и сукцинатдегидрогеназы) и скорости поглощения кислорода, что может служить ранними биохимическими критериями патологических изменений в суставе.

2. Одним из основных патогенетических механизмов разрушения суставного хряща при OA является активизация процессов распада кислых мукополисахаридов вследствие снижения рН СЖ.

3. Хондромодулирующая терапия препаратом ХС сопровождается нормализацией основных биохимических параметров гомеостаза СЖ

4. Наличие корреляции между биохимическими параметрами СЖ (скоростью поглощения кислорода, активностью ферментов энергетического метаболизма, обмена ГАГ и содержанием ПГ) и клинической активностью OA позволяет использовать эти биохимические параметры как объективные критерии эффективности хондромодулирующей терапии ХС на ранних стадиях OA.

Апробация работы и внедрение в практику. Результаты исследования доложены и обсуждены на Третьей северо-западной конференции по ревматологии (Псков, 2003 г.); на Ежегодном Конгрессе европейской ревматологической ассоциации (Швеция, Стокгольм, 2002 г.); на Третьем съезде ревматологов России (Рязань, 2001 г.); на Четвертой конференции по ревматологии Северо-Западного федерального округа РФ (Великий Новгород, 2004), на Четвертом съезде ревматологов России (Казань, 2005 г.). По материалам диссертации опубликовано 6 работ.

Структура диссертации. Материалы диссертации изложены на 123 листах. Диссертация состоит из трех глав, указателя использованной литературы (207 источников). Текст иллюстрирован 19 таблицами и 14 рисунками.

Выводы:

1. Клиническая активность OA коленного сустава на I—11 стадиях заболевания взаимосвязана с патологическими изменениями биохимических параметров СЖ: а) во внеклеточной фракции СЖ:

- возникают нарушения метаболизма кислых мукополисахаридов: в результате повышения в 3,7 раза ферментативной активности р-гиалуронидазы происходит снижение концентрации гиалуроновой кислоты в 3,7 раза, и в 2,3 раза повышается содержание глюкуроновой кислоты;

- возрастает активность ферментов энергетического метаболизма: в 2,7 раза увеличивается общая активность КФК, и на 81% повышается общая активность ГА-З-ФДГ;

- повышается содержание провоспалительных фракций простагландинов: ПГА в 1,9 раза, ПГЕ в 1,7 раза.

- снижается рН СЖ на 8 % б) в клетках СЖ возрастает интенсивность окислительных процессов, что выражается в повышении скорости поглощения кислорода клетками СЖ в 2,1 раза и повышении ферментативной активности СДГ в 3,3 раза.

2. Через три месяца терапии препаратом хондроитинсульфата «Структум» происходит нормализация гомеостатических параметров СЖ, что выражается:

- в снижении активности Р-гиалуронидазы (на 53%) и повышении содержания гиалуроновой кислоты (в 2,6 раза);

- в снижении активности ферментов энергетического метаболизма - КФК (на

31,5%) и ГА-З-ФДГ (на 24%);

- в снижении скорости поглощения кислорода клетками СЖ (на 31%) и активности СДГ (на 35%);

- в снижении содержания провоспалительных фракций ПГ - ПГА и ПГЕ;

- в повышении рН СЖ до нижней границы нормы, причем показатель силы влияния препарата «Структум» на этот параметр СЖ достигает 85%. Через один месяц после прекращения терапии ХС указанные параметры СЖ остаются в пределах нормальных значений.

3. Исследуемые биохимические параметры СЖ (активность Р-гиалуронидазы, скорость поглощения кислорода клетками СЖ, ферментативная активностью СДГ, концентрация простагландинов и содержание гиалуроновой кислоты) обнаруживают высокую степень корреляции с клинической активностью OA.

4. Определение активности Р-гиалуронидазы, скорости поглощения кислорода клетками СЖ, ферментативной активности СДГ, концентрации простагландинов, содержания гиалуроновой кислоты и рН СЖ может быть рекомендовано для клинико-лабораторной оценки эффективности хондромодулирующей терапии при OA.

Заключение

На основании представленных нами в настоящей работе экспериментальных материалов можно заключить, что на I-II стадиях OA синовиальная жидкость коленного сустава характеризуются целым рядом патологических изменений, происходящих на молекулярном уровне.

Одним из основных патологических процессов, развивающихся при OA, является нарушение метаболизма ГАГ. Разрушение суставного хряща сопровождается при этом высвобождением гиалуроновой кислоты и кислых мукополисахаридов, что приводит к закономерному снижению рН СЖ и возрастанию, на этом фоне, активности кислых гидролаз (см. табл. 3.8, рис. 3.11).

Нами обнаружено, что вследствие повышения ферментативной активности p-гиалуронидазы значительно снижается содержание гиалуроновой кислоты в СЖ (см. табл. 3.2, рис. 3.2). Разрушение этого мукополисахарида сопровождается нарушением основных физиологических свойств СЖ, что способствует, в свою очередь, усугублению процесса разрушения суставного хряща. Таким образом замыкается один из порочных кругов патогенеза OA.

На фоне лечения ХС нами обнаружено резкое снижение активности лизосомальных гидролаз в СЖ, происходящее параллельно с нормализацией содержания гиалуроновой кислоты. По сути, ХС структурирует измененную при OA СЖ, нормализуя в ней обменные процессы и опосредованно подавляя активность (3-гиалуронидазы. Использованные биохимические подходы позволяют, таким образом, судить не только об активности |3-гиалуронидазы, но и суммарно об активности лизосомальных гидролаз (см. табл. 3.1, рис. 3.1).

В ходе данного исследования нами обнаружено, что воспалительный процесс при OA находит свое выражение в активизации процессов энергетического метаболизма СЖ. Во внеклеточной фракции СЖ заметно повышается активность ферментов углеводно-фосфорного метаболизма, в частности, КФК и ГА-З-ФДГ (см. табл. 3.5,3.6). В то же время в клетках СЖ интенсифицируются окислительные процессы с участием кислорода, о чем свидетельствует зарегистрированное нами повышение скорости потребления кислорода клетками СЖ и повышение активности СДГ (см. табл. 3.7, рис. 3.10). Выявленное в ходе настоящего исследования повышение концентрации провоспалительных фракций ПГ (ПГА и ПГЕ), может являться одним из прямых следствий повышения синтетической активности клеток СЖ (см. табл. 3.3, рис. 3.5).

В ходе настоящего исследования установлено, что применение ХС в форме препарата «Структум» сопровождается не только нормализацией обмена ГАГ в СЖ (как было указано выше), но и снижением интенсивности метаболических процессов в клетках СЖ. С учетом полученных нами, а также литературных данных, можно предполагать, что эти эффекты ХС связаны с его воздействием на цитокиновое и ферментативные звенья патогенеза OA (рис. 3.14).

По современным представлениям, процессы, происходящие при OA, характеризуются активацией иммунной системы с соответствующим повышением концентрации провоспалительных цитокинов (ИЛ-l-p, ФНО-а и др.). Цитокины запускают каскад реакций в иммунокомпетентных клетках, клетках синовиальной оболочки и хондроцитах. Это приводит к локальному повышению концентрации ряда ферментов-ЦОГ-2, индуцированной NO-синтазы, металлопротеаз, эластазы, гексозаминидазы, кислых гидролаз с соответствующим увеличением концентрации продуктов биохимических реакций, катализируемых этими ферментами, в первую очередь оксида азота (NO), простагландина Е2, продуктов деградации макромолекул хрящевого матрикса и синовиальной жидкости.

В хондроцитах цитокины вызывают изменение митотической активности и всего клеточного цикла, сдвиг фенотипа клеток хряща в сторону более примитивной формы и синтез неполноценных по своим физико-химическим свойствам компонентов матрикса, в частности проколлагена типов ПА и III. Под действием провоспалительных цитокинов происходит активация процесса апоптоза хондроцитов с последующей гибелью клеток.

Изменение, а затем и прекращение синтеза хондроцитами вещества хрящевого матрикса неизбежно приводит к снижению механической устойчивости хряща к физическим нагрузкам и его ускоренному разрушению. Повышенное потребление кислорода клетками СЖ в зоне воспаления, связанное с усиленным синтезом активных форм кислорода и перекисным окислением липидов, способствует усилению гипоксии суставного хряща и нарушению синтетической активности хондроцитов.

Рис. 3.14. Возможные точки приложения действия препарата ХС «Структум» на патогенетический механизм OA

Некоторые биохимические параметры СЖ (активность (З-гиалуронидазы, скорость поглощения кислорода клетками СЖ, ферментативная активность СДГ, концентрация ПГ, содержание гиалуроновой кислоты) обнаруживают высокую степень корреляции с клинической активностью OA. Следовательно, определение этих параметров СЖ может быть рекомендовано для клинико-лабораторной оценки эффективности хондромодулирующей терапии при OA.