Автореферат и диссертация по медицине (14.00.11) на тему:Применение гелевых форм хитозана для профилактики платинозов кожи

Новосибирский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию

На правах рукописи

БОРГОЯКОВА МАРИНА ГЕОРГИЕВНА

ПРИМЕНЕНИЕ ГЕЛЕВЫХ ФОРМ ХИТОЗАНА ДЛЯ ПРОФИЛАКТИКИ ПЛАТИНОЗОВ КОЖИ (ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНО- КЛИНИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ)

14 00 11 - Кожные и венерические болезни

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

ООЭ159В51

Новосибирск - 2007

003159951

Работа выполнена в Красноярской государственной медицинской академии Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию

Научный руководитель:

Доктор медицинских наук, профессор Прохоренков Виктор Иванович Научный консультант:

доктор медицинских наук, профессор Большаков Игорь Николаевич Официальные оппоненты:

Доктор медицинских наук, профессор Позднякова Ольга Николаевна Доктор медицинских наук Охлопков Виталий Александрович

Ведущая организация:

Сибирский государственный медицинский университет Росздрава (г Томск)

Защита диссертации состоится « 02 » ноября 2007 г в 12 00 часов на заседании диссертационного совета К 208 062 03 в Новосибирском государственной медицинском университете Росздрава по адресу 630091, г Новосибирск, Красный проспект, 52

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке Новосибирского государственного медицинского университета

Автореферат разослан «

2007 г

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор медицинских наук, профессор

Т Б Решетникова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы.

В дерматологии значительное место занимают заболевания, обусловленные воздействием производственных факторов В 92% случаев их вызывают химические вещества, особенно комплексные соединения металлов Платина и платиноиды относятся к металлам, соединения которых обладают сенсибилизирующим действием Контактная гиперчувствительность к ним возникает у лиц, связанных с их производством, очисткой и использованием В течение первых трех лет большинство рабочих, имеющих контакт с соединениями платины, заболевали платинозом большей или меньшей степени тяжести (Антоньев А А и соавт, 1992, Колпаков ФИ, 1974, Макаренко ВД, 1975, Рапопорт Ж Ж и соавт, 1976, Calverley АЕ et al, 1999, Merget R et al, 2000, LmnettPJ et al, 1999)

Плати н 03 ы чаше всего развиваются на незащищенных участках кожи Несмотря на автоматизацию, механизацию и герметизацию производственных процессов ряд технологических операций в процессе обработки платиновых металлов производится вручную Поэтому в комплексе лечебно-профилактических мероприятий защитные мази являются незаменимым средством предохранения открытых участков кожи от производственных вредностей

Достаточно хорошо изучены особенности проницаемости кожи для металлов платиновой группы, механизмы связывания со структурами кожи, их элиминация (Колпаков ФИ, 1973, Макаренко ВД, 1975) Изучены иммунные реакции, которые лежат в основе формирования гиперчувствительности замедленного типа при развитии контактных аллергодерматозов (КАД) у рабочих производства платины, их динамика под влиянием иммунокорригирующей терапии (Прохоренков В И и соавт, 1995, Колпаков ФИ и соавт, 1977, Рубанович В М и соавт, 1986, Schuppea Н С et al, 1997)

Учитывая то, что главным звеном развития платинозов остается непосредственный контакт кожи рабочих с соединениями платиноидов и, как следствие, развитие контактных аллергических дерматозов, нами начато изучение эффективности природных сорбентов в качестве лечебных и профилактических средств

В последнее время большое внимание уделяется изучению свойств хитина и его производных Этот биополимер является главным структурным компонентом панцирей ракообразных и клеточных стенок микроскопических грибов Одним из активных производных хитина является хитозан й его модификации Хитозан, обладая низким уровнем токсичности, имеет высокие сорбционные, антибактериальные, иммуномодулирующие, регенерирующие, рассасывающие и другие свойства (Chandy Т et al, 1990, Draelos Z D, 2000, Felt О et al, 1998, Muzzarelh R A, 1973) Кроме того, хитин, хитозан и их производные образуют прочные хелатные связи с металлами, вследствие чего селективно извлекают ионы ртути, кобальта, золота, серебра, хрома, иридия,

палладия, свинца, кадмия, никеля, железа и других металлов из сточных вод, солевых растворов и морской воды (Опкоуеп Е е! а1, 1990, Мавп МБ ег а1, 1977, Нудьга Л А и соавт, 2000)

Применение хитозана при аллергических дерматозах до настоящего времени не изучалось Особую актуальность приобретает изучение способности хитозана защищать кожу от воздействия соединений металлов платиновой группы и предотвращать развитие контактных аллергических дерматозов

Цель исследования.

Изучить особенности сорбционных свойств гелевых форм хитозана и определить эффективность его применения в качестве защитного средства для профилактики платинозов кожи

Задачи исследования:

1 Изучить уровень заболеваемости и особенности клинической картины контактных аллергических дерматозов у рабочих платинового производства

2 Определить особенности кинетики гелевых форм хитозана (коллоидного и водорастворимого) в коже экспериментальных животных

3 Оценить сорбционные свойства различных биополимеров в отношении платиноидов, а также способность хитозана инактивировать соли платины на поверхности кожи

4 Изучить патологогисгологические изменения в коже при моделировании платиноза у экспериментальных животных при использовании гелевых форм хитозана в качестве наружных защитных средств и, на основании полученных результатов, разработать и внедрить методы инактивации соединений платины на поверхности кожи у рабочих платинового производства

Научная новизна.

Впервые в эксперименте установлено, что при нанесении на кожу коллоидный раствор хитозана слабо пенетрирует в дерму, длительно сохраняясь на поверхности эпидермиса, а водорастворимая форма хитозана свободно проникает, равномерно распределяется и фиксируется во всех слоях кожи

Впервые проведены исследования, которые показали, что у гелевых форм хитозана сорбционная активность в отношении солей платины значительно больше, чем у коллагена кожи

Впервые патогенетически обосновано применение коллоидного раствора хитозана в качестве защитного средства для профилактики контактных аллергических дерматозов, вызванных соединениями платины

Практическая значимость.

Проведенными исследованиями показана возможность применения гелевых форм хитозана в качестве наружного защитного средства у рабочих платинового производства Для профилактики контактных аллергических

дерматозов возникающих при контакте с соединениями платиноидов, рекомендовано применение коллоидного хитозана, а для инактивации соединений платиноидов в коже - водорастворимый хитозан

Научные положения, выносимые на защиту:

1 Проникновение и распределение в коже различных форм хитозана имеют свои особенности Коллоидный хитозан остается на поверхности кожи и слабо проникает в кожу, а водорастворимая форма свободно проникает во все слои кожи и длительно сохраняется в дерме

2 Сорбционные свойства коллоидной формы хитозана в чистом виде и в комплексе с коллагеном в отношении соединений платины при исследовании т \ntro и с помощью контактной биомикроскопии превосходят таковые свойства водорастворимого хитозана, коллагена и их комплекса

3 Для профилактики платинозов кожи у рабочих платинового производства целесообразно применение коллоидного хитозана, а для инактивации соединений платиноидов в коже - водорастворимый хитозан

Апробация работы.

Основные положения диссертации доложены на VI Международной конференции «Новые достижения в исследовании хитина и хитозана» (22-24 октября 2001 г, Москва-Щелково), научно-практической конференции дерматовенерологов Сибири и Дальнего Востока «Актуальные проблемы дерматологии и венерологии» (8-9 октября 2004г), заседаниях Красноярского краевою общества дерматовенерологов (2001-2003 гг), проблемной комиссии по дерматовенерологии КрасГМА (Красноярск, 2007г )

Публикации.

По материалам диссертации опубликовано 5 печатных работ, в том числе 2 в центральной печати, заявка на изобретение «Способ профилактики платиноза кожи» приоритет №2007123409 (025490) от 21 06 2007, заявка на изобретение «Способ профилактики платиноза кожи» приоритет №2007126153 (128468) от 09 07 2007 Подготовлена к изданию монография «Платинозы кожи»

Объем и структура работы.

Диссертация изложена на 127страницах машинописного текста, иллюстрирована 12 таблицами и 33 рисунками, состоит из введения, 5 глав, обсуждения результатов исследований, выводов, практических рекомендаций, списка литературы, включающего 192 источников 91 отечественных и 101 иностранных авторов

Личный вклад.

Весь материал диссертации собран, обработан и проанализирован лично

автором

Внедрение результатов исследований.

Результаты исследований внедрены в практику работы поликлиники Красноярского завода цветных металлов им В Н Гулидова, ОАО

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследования

Для изучения уровня заболеваемости дерматозами были обследованы рабочие цехов аффинажного производства платины, палладия, родия, рутения, осмия и иридия на ОАО «Красноярский завод цветных металлов им ВН Гулидова» Для изучения уровня заболеваемости контактными аллергическими дерматозами было обследовано 1218 рабочих, контактирующих с соединениями металлов платиновой группы При обработке данных о больных дерматозами учитывались нозологическая форма, профессия, стаж работы, течение заболевания, методы лечения и профилактики аллергодерматозов

Изучение кинетики гелевых форм хитозана проводилось с помощью люминесцентной микроскопии на аппарате «ЛЮМАМ-ИЗ» Для этого использовались водорастворимый (ВХз) и коллоидный (КХз) хитозан, меченный флюоресцеином изотиоцианатом (ФИТЦ) Исследования проводились на 7 группах белых лабораторных крыс серии Вистар по 2 животных в каждой Распределение в группах соответствовало времени экспозиции препаратов на коже, т е в I группе - экспозиция составляла 1 час, во П группе - 2ч, в III группе -4ч, в IV группе - 8ч, в V группе - 12ч, в VI группе - 24ч У всех животных под внутрибрюшинной нейролептоанальгезией область спины освобождалась от волосяного покрова (методом бритья) и разделялась на 3 зоны Внутри каждая зона разделялась на 3 участка - интактный, со скарификацией, с полнослойной раной На каждую зону наносили испытуемый раствор - ВХз-ФИТЦ, КХз-ФИТЦ, ФИТЦ Кожные дефекты закрывались марлевыми компрессными салфетками и фиксировались

Биопсия кожи проводилась соответственно группам через определенные интервалы времени 1, 2, 4, 8, 12 и 24 часа Для определения естественной флюоресценции кожи крысы была проведена также биопсия кожи в интактной зоне (контроль) Биоптаты фиксировались в нейтральном 10% растворе формалина, затем приготавливались срезы кожи При проведении эксперимента было приготовлено и проанализировано 108 препаратов Микроскопия и микрофотографирование проводилась с помощью люминесцентного микроскопа марки «ЛЮМАМ И-3» и устройства «ФМН-11А» непосредственно после приготовления препаратов

Оценка сорбционных свойств природных полимеров в отношении солей платины т vitro и с помощью прижизненной биомикроскопии, используя метод гистохимического выявления платины

Определение скорости сорбции и сорбционной емкости водорастворимой, коллоидной форм хитозана и коллагена проводилось в отношении раствора гексахлорплаггината аммония с массовой долей платины 10,5хЮ"3мг/мл, 21,0*10" Змг/мл, 52,5хЮ"эмг/мл, 105,0хЮ"3мг/мл, 210,0х1О'3мг/мл Исследование проводилось в условиях т \ntro при смешивании в равных объемах раствора платины со следующими ингредиентами. 1% коллоидный ацетатный раствор бычьего коллагена (Белкозин, Луга) (50 проб), 1% коллоидный водонерастворимый хитозан «Амидан» (Мм 10 кДа, СД 94%) (50 проб), 1% водорастворимый хитозан (Мм 70 кДа, СД 87%) (50 проб) Определение характера сорбции коллаген-хитозановых комплексов, в объемных соотношениях 1 1, 5.1, 9 1 соответственно, проводилось в условиях т \ntro при смешивании в равных объемах раствора гексахлорплатината аммония с массовой долей платины 52,5><10"3мг/мл с 1% коллаген-КХз комплексом (30 проб) и 1% коллаген-ВХз комплексом (30 проб).

Перед началом сорбции платины все образцы полимеров инкубировались 2 часа при 37°С Время сорбции в каждой серии опытов составило 5 мин, 15 мин, 30 мин, 1, 2, 3, 4, 8, 12 и 24 часа при ЗТС и периодическом перемешивании образцов Далее в пробы добавлялся раствор гидроокиси натрия в объеме 300 мкл, полимеры выпадали в осадок, пробы центрифугировались при 1500 об/мин 5-7 мин, над осадок забирался для определения остаточной массовой доли платины методом масс-спектрометрии (ЕЬАИ 9000, НИИГиМС г Красноярск)

Изучение сорбционных свойств гелевых форм хитозана в отношении соединений платины на коже проводилось методом контактной биомикроскопии (КЕМ) кожи в сочетании с методом гистохимического выявления платаны (визуализация металла после обработки кожи раствором тиомочевины и сульфата натрия в виде желто-оранжевых кристаллов) С этой целью использовался люминесцентный контактный микроскоп серии «ЛЮМАМ И-3» с устройством для микрофотографирования «ФМН-11 А» Рабочие аффинажного производства в количестве 18 человек, были разделены на 3 группы, по б человек в каждой. «Платина», «КХз», «ВХз» Перед сменой рабочие в группах «КХз», «ВХз» обрабатывали кожу рук коллоидным и водорастворимым хитозаном соответственно Во всех группах после 8-часовой смены кожу рук тщательно промывали с мылом и щеткой и проводили последовательную обработку раствором тиомочевины и сульфата натрия После высыхания кожи проводилась КЕМ и микрофотографирование

Определение характера патологогисгологических изменений в коже при наружном применении водорастворимой и коллоидной формы хитозана, а также его защитных свойств проводилось в условиях моделирования контактного аллергического дерматита у морских свинок Животные были распределены на 6 групп по 6 животных в каждой Из них 4 гр были контрольными I - интакгные животные, II - контроль по платине, III - контроль по КХз, IV - контроль по ВХз Остальные две группы были опытные - по определению защитных свойств КХз (V группа) и ВХз (VI группа) В межлопаточной области каждого животного удалялся волосяной покров площадью 3x4 см У животных П-У1 групп

подготовленная кожа условно разделялась на две половины - левую и правую (Табл 1)

Животные I гр. - интактные морские свинки Во II гр. - на правую часть наносился 0,1 мл 0,1% раствора гексахлорплатината аммония (каждые 24 часа в течение 10 дней) В Ш гр - на правую часть наносился 0,1 мл 2% раствора КХз (каждые 24 часа в течение 10 дней). ВIV гр - аналогично наносился 1% ВХз В V гр животных - на правую часть наносился 0,1 мл КХз и, с интервалом в 12 часов, раствор платины, в течение 10 дней В VI гр - справа наносился 0,1 мл ВХз и,

Таблица 1

Характеристика групп при моделировании контактного

аллергического дерматита у морских свинок_

Группа Нанесение препарат в течение 10 дней на правую часть Нанесение разрешающей дозы препарата на 12-й день на левую часть

П 0,1 мл 0,1% раствора гексахлорплатината аммония через каждые 24 часа 0,1 мл 0,1% раствора гексахлорплатината аммония

III 0,1 мл 2% КХз (Мм 10 кДа, СД 94%),через каждые 24 часа 0,1 мл 2% КХз

IV 0,1 мл 1% ВХз (Мм 15-20 кДа, СД 87%)через каждые 24 часа 0,1 мл 1% ВХз

V 0,1 мл КХз и, с интервалом в 12 часов, 0,1 мл 0,1% раствора гексахлорплатината аммония 0,1 мл 0,1% раствора гексахлорплатината аммония

VI 0,1 мл ВХз и, с интервалом в 12 часов, 0,1 мл 0,1% раствора гексахлорплатината аммония 0,1 мл 0,1% раствора гексахлорплатината аммония

с интервалом в 12 часов, раствор платины, также в течение 10 дней Для определения степени сенсибилизации организма солями платины на 12-е сутки эксперимента животным П, V, VI групп на левый участок кожи однократно наносилась разрешающая доза препарата платины В Ш и IV группах на 12-е сутки с целью определения сенсибилизирующих свойств хитозана также на левые участки кожи были нанесены разрешающие дозы КХз и ВХз соответственно На 15-е сутки все животные выведены из эксперимента путем искусственного пневмоторакса под внутрибрюшинной нейролептаналгезией

Все исследуемые участки кожи были забраны, и приготовлены 216 гистологических препаратов Проводился качественный и количественный морфологический анализ срезов кожи, окрашенных гематоксилин-эозином Для морфометрического анализа клеточного состава кожи использовался окуляр со встроенной сеткой Автандилова для цитогистостереометрических исследований

(объектив *40) Подсчет клеточного состава каждого препарата производился визуально в 5 полях зрения в расчете на 1 мм2 кожи.

Результаты исследований были оценены согласно общепринятым методам статистического анализа Анализ проводился с использованием персонального компьютера ЮМ PC/AT Проведены расчеты среднеарифметических значений (М), ошибки средней (ш). Достоверность оценивалась для относительных показателей по критерию Стьюдента, уровень значимости составил 0,001, 0,01 и 0,05 (р<0,001, р<0,01, р<0,05) Элементарная и графическая часть выполнена с помощью табличного процессора «Microsoft Excel 2001»

Результаты собственных исследований и их обсуждение

По итогам профосмотра у рабочих аффинажного производства аллергодерматозы (контактный аллергический дерматит, кожный зуд, токсидермия и экзема) диагностированы у 238 человека (19,5% всех обследованных и 89,1% больных дерматозами) Псориаз, красный плоский лишай, болезни сальных желез встречались в единичных случаях, что соответствует относительным показателям заболеваемости в популяции Псориаз был выявлен у 13 (1,1% всех обследованных), болезни сальных желез - у 11 (0,9%), красный плоский лишай - у 2 (0,2%) Проявления атонического дерматита были выявлены всего у 3 человек (0,2%). У 155 человек в анамнезе были проявления платиноза кожи различной степени выраженности в виде кожного зуда, сухости и шелушения открытых участков кожи, дерматита и экземы Остальные рабочие, несмотря на длительный контакт с солями платиноидов, клинических проявлений аллергодерматозов никогда не отмечали

Число мужчин в цехах очистки платины в 1,5 раза превышало число женщин. Несмотря на это, женщины болели аллергическими дерматозами в 1,2 раза чаще. Соотношение клинических форм платиноза у мужчин и женщин имеет одинаковые тенденции, но кожный зуд у женщин в 2 раза реже встречался Это обусловлено более быстрым развитием проявлений дерматита при кожном зуде у женщин, что, вероятно, объясняется специфическими биологическими и бытовыми причинами (более тонкий роговой слой эпидермиса, гормональные колебания, контакт с бытовой химией и пр) Возраст обследованных больных колебался от 20 до 64 лет Количество больных в возрасте 30-49 лет значительно превышает показатели в других возрастных группах и составляет 67,6% от общего числа больных КАД.

Среди обследованных рабочих были представители различных профессий Наибольшее количество составляют аппаратчики первичных продуктов (32,8%), лаборанты (26,1%), имеющие наибольший контакт с соединениями платиноидов Среди плавильщиков больных было 7,1%, ИГР, приемщиков сырья и контролеров - по 6,7%, электромонтеров - 5,9%, слесарей -5,5%, подсобных рабочих - 2,5% Отмечено, тяжесть развития аллергических дерматозов тесно связана с периодом прямого контакта человека с

производственной пылью, содержащей частицы металлов Чем больше стаж работы на производстве металлов или их обработки, тем выше частота тяжелых форм КАД. Было отмечено, чгго при стаже до 1 года у рабочих встречались острые формы заболевания, в последующие года работы проявления дерматозов были слабые и редкие, либо проявления отсутствовали полностью Когда стаж работы достигал 5-10 лет частота и разнообразие проявлений КАД резко увеличивалось. Наблюдались случаи длительного подострого течения заболевания с сопутствующими проявлениями аллергического конъюнктивита, вазомоторного ринита

С помощью люминесцентной микроскопии удалось изучить и выявить особенности кинетики гелевых форм хитозана в коже в течение 24 часов Проведенные исследования показали, что водорастворимый хитозан способен проникать в неповрежденную и скарифицированную кожу в первые 1-2 ч трансфолликулярно, трансгландулярно, трансэпидермапьно и через эпидермальные дефекты Далее, в течение 24 ч, ВХз-ФИТЦ равномерно распределяется во всех слоях кожи, связываясь с межклеточным веществом и коллагеновыми волокнами дермы Кинетика коллоидной формы хитозана имеет свои значимые отличия. КХз-ФИЩ до 1-4 ч проникает лишь в верхние слои кожи и устья волосяных фолликулов. Через 8-12 ч равномерно распределяется в дерме А уже через 24 ч после нанесения КХз-ФИТЦ практически полностью выводится из дермы Раствор ФИТЦ проникает в кожу равномерно и, в течение 24 ч, выводится, накапливаясь лишь в клетках Лангерганса эпидермиса Из чего следует, что ФИТЦ, применявшийся в качестве метки для хитозана, не влияет на пути, время проникновения биополимеров и характер распределение его в коже

Изучение in vitro сорбционных свойств биополимеров методом масс-спектрометрии показало, что 1% раствор коллагена способен извлекать из раствора до 20-30% металла. Скорость сорбции достаточно высока в первый час контакта с металлом (34-40% массы), насыщение полимера происходит через 2-3 ч, возникает эффект равновесия и десорбции. Независимо от первоначальной массовой доли платины коллаген к 24 ч сорбции способен извлечь до 37% массы металла

При контакте водонерастворимого хитозана в условиях in vitro с солью платины в течение 24 часов происходит активная сорбция линейного характера независимо от первоначальной массы металла, начиная с первых минут контакта. Полнота извлечения металла близка к 100%

События временной сорбции соли платины 1% водорастворимым хитозаном показали, что полимер независимо от первоначальной концентрации соли металла способен в первые 30 мин извлекать из раствора свыше 65% платины. Через 12-24 ч степень извлечения металла остается очень высокой и составляет около 90% от первоначальной массы Сорбция протекает более уверенно при малых концентрациях металла (10-55-10"3мг/мл), а при очень высоких концентрациях - характер сорбции прерывистый, указывает на быстрое насыщение полимера, смещение равновесия в сторону десорбции. Емкость и

скорость сорбции соли платины у водорастворимого хитозана существенно превышают соответствующие характеристики коллагена.

Важным результатом исследования является способность коллаген-хитозанового комплекса, в состав которого входит водорастворимый хитозан, присоединять к себе очень несущественное количество платины. Если водорастворимый хитозан обладает способностью присоединять до 90% платины, то, вступая во взаимодействие с коллагеном, теряет эту способность в течение всего периода наблюдения. Такая зависимость характерна для любого из предложенных объемных соотношений двух полимеров. Если предположить, что при нанесении водорастворимого хитозана на кожу рабочих образование такого комплекса будет происходить в глубоком слое дермы, то можно рассчитывать на слабое оседание металла в коже и увеличение его клиренса из дермы. Экспериментальное подтверждение такого эффекта позволит претендовать на новый метод профилактики и лечения металлодерматоза (рис. 1).

Смешивание растворов коллагена и водонерастворимого хитозана в соотношении 1:1 показало, что сорбционный эффект комплекса сохраняется на высоком уровне, достигая к 24 ч сорбции 82,7% от первоначальной массы металла. Увеличение доли коллагена в этом комплексе (5:1 и 9:1) в 3,5 раза снижает объем и скорость сорбции, особенно через 2 ч экспозиции. При создании условий конкуренции за металл между коллагеном и водонерастворимым хитозаном, где связь с металлом у коллагена менее прочна, чем у хитозана, можно

100,00% -J 80,00% 60,00% 40,00% 20,00% 0,00% -20,00%

1 1 1 1 1 1

---ВХз 1

- - - КХэ 1

-ВХз 5

-КХз 5

— - ВХз9 --КХз 9

Рис. 1. Показатели in vitro сорбционной активности комплексов коллагена с водорастворимым и водонерастворимым хитозаном в отношении раствора гексахлорплатината аммония в объемных соотношениях 1:1,5:1,9:1(массовая доля платины 52,5*10"3мт/мл).

предположить, что хитозаи становится «ложной мишенью» для платины и инакгивирует ее, предотвращая развитие сенсибилизации.

При изучении барьерных свойств гелевых форм хитозана у рабочих платинового производства методом контактной биомикроскопии кожи было выявлено, что коллоидная форма хитозана значительно в большей степени предотвращает проникновение платаны в кожу, чем водорастворимая.

По результатам исследования в группе «Коллоидный хитозан» после рабочей смены количество кристаллов платины на коже составило 0,9±0,01 (р<0,001) в поле зрения, в группе «Водорастворимый хитозан» - 8,03±0,2 (р<0,001) (в контроле - 11,5±0,28) Следовательно, 1% коллоидный хитозан почти полностью удаляет с поверхности эпидермиса платину, предотвращает проникновение металла в кожу и запуск каскада иммунологических реакций с развитием гиперчувствительности замедленного типа (рис. 2).

Рис. 2. Количество кристаллов плагины на коже рабочих после 8 часовой смей« (* - р<0,001).

Для определения гистологических изменений в коже при моделировании К АД платиновой этиологии проводился морфологический и морфомегрический анализ патологогистологических препаратов кожи.

При сравнительном анализе клеточного состава кожи в I, Ш и IV группах (контрольных по КХз и ВХз) статистически достоверных различий не установлено, также как и при нанесении разрешающей дозы полимеров в Ш и IV группах. Это свидетельствует о том, что при нанесении на кожу гелевые формы хитозана не обладают раздражающим и сенсибилизирующим действием (табл. 2,3).

В биоптатах правых участков кожи П группы животных с высокой степенью достоверности выявлены гистологические изменения, характерные для КАД Наблюдаются значительный отек эпидермиса и дермы, разрыхление коллагеновых волохон, выраженная диффузная макрофагально-лимфоцитарная инфильтрация дермы - лимфоцитов 2,4±0,22 (р<0,01), макрофагов 5,23±0,56 (р<0,01) Макрофаги крупные, с обильными включениями темного цвета в цитоплазме (состояние активного фагоцитоза) Сосуды дермы расширены, эндотелий набухший, стенки отечные В биоптатах левых участков кожи -выраженная реакция на разрешающую дозу препарата платины, характеризующаяся также массивной лимфоциггарно-макрофагальной инфильтрацией и отеком Доминирующим клеточным элементом инфильтрата являлся лимфоцит (4,5±0,37, р<0,01) В то же время отмечается и повышение количества макрофагов (3,87±0,39, р<0,01)

Сравнительный анализ гистологических изменений в коже лабораторных животных VI группы, где исследовались барьерные свойства водорастворимого хитозана в отношении платины, с высокой степенью достоверности показывает наличие признаков развития контактного аллергического дерматита с проявлениями реакции гиперчувствительности замедленного типа. В препаратах наблюдается отек эпидермиса и дермы, разрыхление коллагеновых волокон, макрофагально-лимфоцитарная инфильтрация дермы, но менее выраженные, чем

Таблица 2

Количество лимфоцитов в коже при моделировании _^_КАД платиновой этиологии_

Группы животных Количество лимфоцитов через 10 дней после нанесения препарата Шт Количество лимфоцитов после нанесения разрешающей дозы препарата М±ш

I группа (п=6) 0,87±0,26 0,87±0,26

П группа (п=6) 2,4±0,22* 4,5±0,37*

III группа (п=6) 1,0±0,16 0,9±0,17

IV группа (п=6) 0,97±0,15 0,9±0,12

V группа (п=6) 1,27±0,14 1,5±0,19

VI группа (п=6) 1,9±0,3** 2,4±0,27*

Примечание * - р< 0,01, ** - р< 0,05

Таблица 3

Количество макрофагов в коже при моделировании

_КАД платановой этиологии_

Группы животных Количество макрофагов через 10 дней после нанесения препарата М±ш Количество макрофагов после нанесения разрешающей дозы препарата М±т

I группа (п=6) 1,26*0,18 1,26±0,18

П группа (п=6) 5,23±0,56* 3,87±0,39*

Ш группа (п=6) 1,6±0,19 1,57±0,19

IV группа (п==6) 1,6±0,17 1,57±0,17

V группа (п=6) 1,13±0,15 1,23*0,17

VI группа (п=6) 3,03±0,24* 3,13±0,4*

Примечание- * - р< 0,01

в контрольных препаратах П группы (лимфоциты - 1,9±0,3, р<0,05, макрофаги -3,03±0,24, р<0,01) При нанесении разрешающей дозы раствора платины у животных VI группы также развивается реакция гиперчувствительности замедленного типа, а именно, в коже наблюдается выраженная клеточная инфильтрация и отек дермы (лимфоциты - 2,4±0,27, макрофаги - 3,13±0,4, р<0,01).

В препаратах V опытной группы достоверно значимых различий клеточного состава кожи не было выявлено. Определялись в сосочковом слое дермы скудные периваскулярные инфильтраты из лимфоцитов (1,27±0,14), единичных макрофагов (1,13±0,15) Явления отека эндотелия сосудов дермы здесь не наблюдались. В сетчатом слое дермы определялись единичные фибробласга и лимфоциты, располагающиеся среди коллагеновых волокон При нанесении разрешающей дозы раствора платины не наблюдается какой-либо значимой клеточной реакции (лимфоциты -1,5±0,19, макрофаги -1,23±0,17) (Рис 3)

Таким образом, качественные и количественные патологогистологические исследования показали, что при моделировании контактного аллергического дерматита платановой этиологии в эксперименте на лабораторных животных коллоидный раствор хитозана значительно уменьшает патологическое воздействие солей платины на кожу, а также способен предотвращать развитие реакции контактной гиперчувствипгельности замедленного типа. По сравнению с интактной группой животных достоверно значимых различий клеточного состава

I II III IV V VI

■ количество лимфоцитов после нанесения препарата в течение 10 дней Q количество лимфоцитов после нанесения разрешающей доты препарата Q количество макрофагов после нанесения препарата в течение 10 дней И количество макрофагов после нанесения разрешающей дозы препарата

Рис. 3. Сравнительный анализ клеточного состава инфильтрата дермы.

кожи выявлено не было. Водорастворимая форма хитозана слабо препятствует проникновению раствора платины в кожу и не предотвращает развитие сенсибилизации (р< 0,01, р< 0,05).

Этот эксперимент также показал, что водорастворимая и коллоидная формы хитозана при нанесении на кожу в течение 10 дней не вызывает каких-либо значимых патологических изменений в коже и не формирует контактной гиперчувствительности. Это указывает на безопасность хитозана при наружном применении и отсутствие сенсибилизирующих свойств биополимера, а также на перспективность использования раствора хитозана в качестве профилактического защитного средства при дерматозах платиновой этиологии

выводы

1 Проведенное клиническое обследование показало, что у рабочих платинового производства, несмотря на улучшение технологических процессов, их модернизацию, проведение лечебно-профилактических мероприятий, наблюдается высокий уровень распространенности аллергическими дерматозами (контактными аллергическими дерматитами и экземой), и составляет 21,9% от общего числа осмотренных и 75,8% от числа выявленных больных с дерматозами

2 Исследования показали, что нанесенный на кожу водорастворимый хитозан достаточно быстро и полностью проникает во все слои кожи и сохраняется там более 24 часов Кинетика коллоидной формы хитозана имеет свои особенности, а именно, наблюдается только частичное проникновение вещества в кожу в течение 8-12 часов, и полное освобождение дермы от препарата через 24 часа

3 Водорастворимая и коллоидная формы хитозана имеют высокие сорбционные характеристики по отношению кгексахлорплатинату аммония Извлечение металла из раствора in vitro составляет 90-100% Определение сорбционной емкости по платине коллагена и комплекса коллагена и водорастворимого хитозана показало их слабую активность Комплекс же коллагена с коллоидным хитозаном сорбирует до 80% платины из раствора При изучении сорбционной активности хитозана на поверхности кожи у рабочих платинового производства с помощью метода контактной биомикроскопии выявлено, что коллоидный хитозан, в отличие от водорастворимого, удаляет с поверхности кожи значительно больше металла

4 Проведение патологогистологического исследования биолтатов кожи при моделировании платиноза на лабораторных животных, показало, что препараты хитозана не обладают местно раздражающим и сенсибилизирующим действием Качественный и количественный патологогистологический анализ выявил, что гелевые формы хитозана уменьшают патологическое воздействие солей платины на кожу и предотвращают развитие реакции гиперчувствительности замедленного типа Исследования также показали, что защитные, инактивирующие свойства коллоидного формы хитозана значительно превосходят таковые водорастворимой формы Полученные данные позволяют рекомендовать применение коллоидного хитозана для профилактики платиноза кожи, а водорастворимой формы - для инактивации солей платиноидов в коже

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1 Рекомендуется использовать метод контактной биомикроскопии для прижизненной диагностики и контроля эффективности лечения контактных аллергических дерматозов платиновой этиологии

2 На основании экспериментально-клинических исследований рекомендуется рабочим платинового производства использовать 2% коллоидный раствор хитозана (Мм 10 кДа, СД 94%) в качестве наружного защитного средства для профилактики контактных аллергических дерматозов, а 1% водорастворимый хитозан (Мм 15-20 кДа, СД 87%) - для инактивации соединений платиноидов в коже

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1 Боргоякова M Г, Прохоренков В И, Большаков И H, Насибов СМ К вопросу о кинетике водорастворимого хитозана в коже // Новые достижения в исследовании хитина и хитозана матер VI междурнар конф - M -Щелково, 2001 - С 223-225

2 Боргоякова M Г, Прохоренков В И, Большаков И H Перспективы использования хитозана и его продуктов при заболеваниях кожи (обзор литературы) // Сибирское медицинское обозрение - 2002, №1 - С 51-54, №2 -С 45-58

3 Боргоякова M Г, Прохоренков В И, Большаков И H, Кузнецова Ю А, Карачева Ю В , Левкович А О Влияние хитозана на развитие контактной гиперчувствительности при формировании аллергодерматоза платиновой этиологии в эксперименте // Актуальные вопросы дерматовенерологии сб науч тр , посвящ 60-леггию каф дематовенерологии Красноярской гос мед академии - Красноярск, 2003 - С 29-33

4 Боргоякова M Г, Грищенко А А, Карачева Ю В , Кузнецова Ю А, Левкович АО К вопросу о патогенезе дерматоплатинозов Сорбционные характеристики природных полимеров // Актуальные вопросы медицины и новые технологии - 2005 сб науч статей, посвящ конфер им академика Б С Гракова-Красноярск, 2005 -С 134-141

5 Боргоякова M Г, Прохоренков В И Ппатинозы // Вестник дерматологии и венерологии - 2006, №2 - С 12-15

Список сокращений

ВХз - водорастворимый хитозан

КАД - контактный аллергический дерматит

КБМ - контактная биомикроскопия

кДа - килоДальтон

КХз - коллоидный хитозан

Мм - молекулярная масса

сд - степень деацетилирования

ФИТЦ - флюоресцеина изотиоцианат

Изготовлено ООО Папирус, 660079, г Красноярск, ул 60 лег Октября 124к № заказа 185, тираж 100 шт, формат А5