Автореферат и диссертация по медицине (14.00.36) на тему:Гликозиды мурамилдипептида: иммуномодулирующая активность и возможность использования при вирусных болезнях.

иис540Б466

На правах рукописи

ЛОБАНОВ ДМИТРИЙ СЕРГЕЕВИЧ

ГЛИКОЗИДЫ МУРАМИЛДИПЕПТИДА: ИММУНОМОДУЛИРУЮЩАЯ АКТИВНОСТЬ И ВОЗМОЖНОСТЬ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ ПРИ ВИРУСНЫХ БОЛЕЗНЯХ

14.00.36 - аллергология и иммунология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

- 3 ЛЕН 2009

Москва 2009

003486466

Работа выполнена в Учреждении Российской академии медицинских наук Научно-исследовательском институте морфологии человека РАМН и Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования Московской медицинской академии им. И.М.Сеченова

Научные руководители:

член-корреспондент РАМН, Заслуженный деятель науки РФ, доктор медицинских наук, профессор Караулов Александр Викторович

доктор медицинских наук, профессор Калюжин Олег Витальевич

Официальные оппоненты:

Заслуженный деятель науки РФ, доктор медицинских наук, профессор Винницкий Леонид Ильич

Заслуженный деятель науки РФ, доктор медицинских наук, профессор Афанасьев Станислав Степанович

Ведущая организация:

Государственный научный центр Институт иммунологии Федерального медико-биологического агентства РФ

Защита диссертации состоится 15 декабря 2009 г. в 14.00 на заседании диссертационного совета Д 208.040.08 при Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования Московской медицинской академии им. И.М.Сеченова по адресу: Москва, ул. Б.Трубецкая, д.8, стр.2.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГОУ ВПО ММА им. И.М.Сеченова по адресу: 117998, г. Москва, Нахимовский пр., д. 49.

Автореферат разослан «_»_2009 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор медицинский наук,

профессор Миронов Андрей Юрьевич

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы

Бактериальные иммуномодуляторы были и остаются одной из наиболее перспективных групп иммунотропных препаратов (Караулов A.B., Калюжин О.В., 2007; Рахмилевич A.JL, 1990; Хаитов P.M., Пинегин Б.В., 2000). Благодаря наличию высококонсервативных структур - патоген-ассоциированных молекулярных паттернов, или образов, - препараты бактериального происхождения через образраспознающие рецепторы (partem recognition receptors, PRR) эффективно стимулируют защитные механизмы макроорганизма, в первую очередь звенья врожденного иммунитета (Афанасьев С.С. и др., 2009; Лебедев К.А., Понякина И.Д., 2009; Beutler В. et al, 2006). По этой же сигнальной системе реализуется один их филогенетически выработанных механизмов антагонизма бактерий-представителей нормальной микрофлоры по отношению к патогенным вирусам.

Исторически первые бактериальные иммуномодуляторы представляли собой целые бактериальные клетки (БЦЖ, ОК432). Следующим поколением стали бактериальные лизаты и их фракции. В настоящее время предпочтение отдается низкомолекулярным иммуномодуляторам с известной химической структурой и механизмом действия - очищенным или синтетически воспроизведенным компонентам микробных клеток (Караулов A.B., Калюжин О.В., 2007).

Ы-ацетилмурамил-Ь-аланил-О-изоглутамин (мурамилдипептид; МДП) -компонент пептидогликана группы А клеточной стенки бактерий - уже более 35 лет является объектом пристального внимания иммунофармакологов как молекула, модификации химической структуры которой привели к созданию нескольких иммунотропных препаратов и большой группы перспективных фармакологических веществ, активирующих противоинфекционный и противоопухолевый иммунитет (Винницкий Л.И. и соавт., 1997; Калюжин О.В., 1998; Пинегин Б.Ф. и соавт., 1997; Хаитов P.M. и соавт., 1998; Bahr G.M. & Chedid L., 1986; Kotani S. et al, 1986). Раскрытие молекулярных механизмов действия МДП и его производных, включающих агонизм внутриклеточных PRR NOD-2 (Inohara N. et al, 2003), послужило новым стимулом для поиска эффективных и безопасных синтетических аналогов МДП.

Известно, что ß-гликозидирование ведет к увеличению биологической активности молекулы МДП. Сформулированы предпочтительные направления синтеза высокоэффективных ß-гликозидов МДП с алифатическими и адамантильными агликонами (Земляков А.Е., 2000; Калюжин О.В., 2002).

В эксперименте показана способность ß-гептилгликозида МДП стимулировать основные звенья противоопухолевого и противоинфекционного, в том числе противовирусного, иммунного ответа (Калюжин О.В., 2002; Kalyuzhin O.V. et al, 1996). Многообещающими выглядят первые результаты

применения этого гликопептида в комплексной терапии хронического гепатита С (ХГС) (Нелюбов М.В. и соавт., 2009). Остается открытыми вопросы о влиянии ß-гептилгликозида МДП на продукцию интерферона-a (ИФН-а) и репликацию лимфотропных вирусов, а также возможности использования этого соединения при других вирусных болезнях, в том числе герпесе.

На моделях септических состояний и опухолевых заболеваний in vivo ß-адамантилгликозид МДП проявил себя как стимулятор антибактериальной резистентности и противоопухолевого иммунитета (Калюжин О.В., 2002). Наличие адамантанового радикала в структуре этого гликопептида и схожесть противовирусных и противоопухолевых защитных механизмов говорят о том, что он a prirori может обладать прямыми и/или опосредованными противовирусными свойствами (Арцимович Н.Г. и соавт., 2000). Тем не менее, данных о влиянии ß-адамантилгликозида МДП на репликацию вирусов и противовирусный иммунитет в доступной литературе не обнаружено.

Предпринятые ранее попытки присоединения циклических структур к гликозидному центру молекулы МДП в одних случаях приводили к увеличению биологической активности гликопептида (ß-циклогексилгликозид МДП) (Калюжин О.В., 2003), в других - существенно не изменяли или даже снижали ее (а- и ß-циклододецилгликозиды МДП) (Земляков А.Е. и соавт., 2005). Продолжение поиска эффективных стимуляторов противоинфекционного, в том числе противовирусного, иммунитета среди циклоалифатических гликозидов МДП выглядит целесообразным, в частности с точки зрения определения зависимости биологической активности производных МДП от структуры агликона и его подвижности по отношению к гликозидному центру молекулы.

В пользу целесообразности проведения настоящей работы говорит и тот факт, что французский аналог МДП - мурабутид - уже зарекомендовал себя как стимулятор противовирусного иммунного ответа и, кроме того, в эксперименте и клинике подавлял репликацию вируса иммунодефицита человека (ВИЧ) (Bahr G.M., 2003).

Цель работы - в сравнительном исследовании выявить наиболее эффективные иммуномодуляторы из группы новых и уже изученных ß-гликозидов МДП с алифатической, трициклической и циклоалифатической структурой агликона и определить возможность их использования при вирусных болезнях. Задачи исследования

1. Исследовать способность ß-гептил-, ß-адамантил-, ß-циклогексилметил-, ß-циклогексилэтил- и ß-4-трет-

бутилциклогексилгликозидов МДП стимулировать резистентность мышей к инфекциям, вызванным грамположительными и грамотрицательными бактериями.

2. Изучить влияние р-гептил-, [3-адамантил-, Р-циклогексилметил-, р-циклогексилэтил- и Р-4-«рет-бутилциклогексилгликозидов МДП на продукцию ИФН-а, ИФН-у, ИЛ-ip, ИЛ-4, ИЛ-6 и ФНО-а мононуклеарными клетками человека in vitro.

3. Определить действие р-гептил- и Р-адамантилгликозидов МДП на репликацию ВИЧ-1 в культуре Т-лимфобластоидных клеток СЕМ SS, а также на жизнеспособность и пролиферацию этих клеток.

5. Изучить клиническую эффективность и иммуномодулирующую активность БАД глимурида, включающего в качестве активного компонента Р-гептилгликозид МДП, у больных хроническим рецидивирующим лабиальным герпесом. Научная новизна

Впервые изучена иммуномодулирующая активность новых циклоалкилгликозидов МДП: Р-циклогексилметил-, Р-циклогексилэтил- и р-4-мреяз-бутилциклогексилгликозидов МДП. Продемонстрировано, что первые два соединения стимулируют антибактериальную резистентность мышей и продукцию ряда ключевых цитокинов эффективнее, чем немодифицированный МДП, тогда как P-4-иг/эе/я-бутилциклогексилгликозид МДП уступал по активности МДП.

Впервые показана способность Р-гептил-, р-адамантил- и р-циклогексилэтилгликозидов МДП стимулировать продукцию ИФН-а.

Впервые продемонстрировано, что р-гептилгликозид МДП подавляет репликацию ВИЧ-1 в культуре ВИЧ-1-чувствительных Т-лимфобластоидных клеток. При этом в дозе 100 мкг/мл гликопептид, не оказывая цитотоксических эффектов, угнетал репликацию вируса на 100%.

Впервые показана клиническая и иммуномодулирующая эффективность Р-гептилгликозида МДП (глимурида) в комплексной терапии хронического рецидивирующего лабиального герпеса. Доказана способность глимурида потенцировать терапевтический эффект ациклических нуклеозидов. Теоретическая и практическая значимость

В результате наших исследований получены данные об иммунотропных эффектах 3 оригинальных производных МДП, дополнена информация о биологической активности 2 известных соединений, что имеет научную ценность с точки зрения определения влияния структуры и подвижности агликона на биологическую активность гликозидов МДП.

Теоретическая ценность работы заключается в описании факта подавления р-гептилгликозидом МДП репликации ВИЧ-1 в культуре чувствительных к этому вирусу лимфобластоидных клеток.

Этот факт имеет и практическую значимость, так как делает это соединение объектом внимания со стороны разработчиков средств

специфической (как адъюванта в составе вакцин) и неспецифической иммунотерапии ВИЧ/СПИД-инфекции.

Теоретическую и практическую ценность имеет обоснование принципиальной возможности использования гликозидов МДП при вирусных болезнях, в частности вызванных лимфотропными вирусами.

Прикладное значение имеют сформулированные в работе практические рекомендации по использованию Р-гептилгликозида МДП (глимурида) в комплексной терапии хронического рецидивирующего лабиального герпеса. Основные положения, выносимые на защиту

1. Р-Гептил-, р-адамантил- и Р-циклогексилэтилгликозиды МДП стимулируют устойчивость животных к заражению летальными дозами грамположительных и грамотрицательных бактерий, превосходя по эффективности немодифицированный МДП.

2. р-Гептил-, Р-адамантил- и р-циклогексилэтилгликозиды МДП усиливают продукцию ИФН-у, HJI-ip, ИЛ-4, ИЛ-6 и ФНО-а мононуклеарными клетками человека in vitro. Эти гликопептиды, в отличие от немодифированного МДП, р-циклогексилэтил- и fi-4-mpem-бутилциклогексилгликозидов МДП, усиливают выработку ИФН-а.

3. р-Гептилгликозид МДП, не проявляя цитотоксичности, подавляет репликацию ВИЧ-1 в культуре Т-лимфобластоидных клеток СЕМ SS. В дозе 100 мкг/мл это соединение угнетает репликацию вируса на 100%. Р-Адамантилгликозид МДП проявляет тенденцию к подавлению репликации ВИЧ-1.

4. р-Гептилгликозид МДП как активный компонент БАД глимурида существенно снижает продолжительность и тяжесть рецидива лабиального герпеса, а также увеличивает безрецидивный период и корригирует иммунные нарушения. Глимурид потенцирует терапевтическое действие ациклических нуклеозидов при герпесе.

Практическое внедрение полученных результатов

Материалы диссертационной работы внедрены в учебный процесс на кафедре клинической иммунологии и аллергологии факультета последипломного профессионального образования врачей ГОУ ВПО Московской медицинской академии им. И.М.Сеченова и используются в исследовательской практике в лаборатории клеточной иммунопатологии и биотехнологии НИИ морфологии человека РАМН.

Результаты настоящей работы, касающиеся применения глимурида при герпесе, внедрены в клиническую практику в Центре современной медицины ГОУ Московской академии рынка труда и информационных технологий Департамента по науке и промышленной политике г. Москвы. Апробация работы

Основные положения диссертации были представлены на XVI

Российском национальном конгрессе "Человек и лекарство" (Москва, 2009) и научной конференции с международным участием «Актуальные вопросы инфекционной патологии» (Анапа, 2009).

Апробация диссертации состоялась 30 сентября 2009 года на совместной конференции лаборатории иммуноморфологии воспаления и лаборатории клеточной иммунопатологии и биотехнологии НИИ морфологии человека РАМН, кафедры клинической иммунологии и аллергологии факультета последипломного профессионального образования ММА им. И.М.Сеченова, Центра современной медицины ГОУ ВПО Московской академии рынка труда и информационных технологий.

Публикации

По теме диссертации опубликована 5 печатных работ, в том числе 1 статья в рецензируемом журнале, рекомендованном ВАК Российской Федерации.

Структура и объем диссертации

Диссертация состоит из следующих разделов: введение, обзор литературы (2 главы), материалы и методы, результаты собственных исследований (4 главы), обсуждение, выводы, практические рекомендации, библиографический указатель литературы.

Указатель литературы содержит 123 отечественных и 276 иностранных источников.

Диссертация изложена на 99 страницах, иллюстрирована 13 рисунками и содержит 4 таблицы и 3 схемы.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Гликозиды МДП и методы их синтеза

Исследуемые в настоящей работе р-гликозиды Ы-ацетилмурамил-Ь-аланил-О-изоглутамина синтезированы и любезно предоставлены для испытаний профессором кафедры органической химии Таврического национального университета им. В.И.Вернадского (г. Симферополь, Украина) А.Е.Земляковым. Методика получения этих гликопептидов описана в работах (Земляков А.Е. и соавт., 1991; Земляков А.Е., 2000). Структура подвергнутых биологическим испытаниям (З-гликозидов МДП представлена на рисунке 1. Материалы и методы экспериментальных исследований in vitro и in vivo

Эксперименты проведены в НИИ морфологии человека РАМН, ЦНИИ вакцин и сывороток им. И.И.Мечникова РАМН, НИИ вирусологии им. Д.И.Ивановского РАМН.

Всего при изучении биологической активности производных МДП проведено 10 серий экспериментов in vitro, 4 серии - in vivo. Каждая серия включала не менее 3 независимых экспериментов. Общее количество животных, использованных для опытов in vivo, - 650 мышей.

Рисунок 1

Структура р-гликозидов МДП

.ОН

oA-^N^or

Ме~~\ H NHAc

>-N 0

0 Л, 0 \ CONH2 Me N * 1

L-AIa H

D-iGln C00H

Для р-циклогексилметилгликозида МДП R =

Для р-циклогексилэтилгликозида МДП R =

Для Р-4-от/?ет-бутилциклогексилгликозида МДП R =

Для р-адамантилгликозида МДП R =

Для р-гептилгликозида МДП R =

В опытах использовали беспородных белых мышей массой 12-14 г возрастом 20-25 дней (филиалы «Андреевка» и «Столбовая» ГУ Научного центра биомедицинских технологий РАМН). Животных содержали в пластмассовых клетках на естественной диете в вивариях НИИ морфологии человека РАМН и ЦНИИ вакцин и сывороток им. И.И.Мечникова РАМН.

Для культивирования клеток использовали среду RPMI 1640 (Flow Lab.),

содержащую 2 мМ L-глутамина, 10 мМ буфера HEPES (Flow Lab.), 5х10"5 M 2-меркаптоэтанола (Serva) и 50 мкг/мл гентамицина (KRKA). Для функциональных тестов и поддержания клеточных культур в эту среду добавляли 5% и 10% инактивированной эмбриональной телячьей сыворотки (Flow Lab.), соответственно (полная среда RPMI 1640). Культуры инкубировали при 37°С в атмосфере увлажненного воздуха с 5% С02.

ВИЧ-1-чувствительную клеточную Т-лимфобластоидную линию СЕМ SS поддерживали in vitro в пластиковых флаконах, субкультивируя ее каждые 3-4 дня (исходная плотность посева - 2х 105 клеток/мл).

Исследование протективной активности гликозидов МДП проводили на моделях сепсиса в соответствии с рекомендациями по изучению иммунотропных эффектов фармакологических веществ (Хаитов P.M. и соавт., 2000). Исследуемые препараты, растворенные в 0,9% NaCl, вводили внутрибрюшинно белым беспородным мышам в конечном объеме 0,5 мл. Животным контрольной группы вводили по 0,5 мл 0,9% NaCl. Через 24 часа мышей заражали 18-ти часовой культурой Staphylococcus aureus (штамм Wood 46) или Escherichia coli (штамм 264). Для усиления вирулентных свойств микроорганизмов культуры вводили в 0,2% голодном агаре. Для приготовления голодного агара 200 мг очищенного агара (Difco) суспендировали в 100 мл дистиллированной воды и нагревали на водяной бане до полного растворения агара. После охлаждения до 37-39°С в агар добавляли бактериальные культуры. Наблюдение за животными вели в течение 10 дней. Эффективность препаратов оценивали по проценту выживших животных. В предварительных опытах определяли необходимое для заражения количество микробных тел (109 для S. aureus и 2x107 для Е. coli), составляющее минимальную дозу, вызывающую при внутрибрюшинном введении 100% гибель животных в течение первых 3 дней.

Гликопептиды исследовали в дозах 0.15, 1.5 и 15 мг/кг или 3.75 мкг/кг; 75 мкг/кг и 1.5 мг/кг на моделях сепсиса, вызванного соответственно S. aureus или Е. coli.

Для изучения влияния гликозидов МДП на продукцию цитокинов выделяли мононуклеарные клетки из венозной крови здоровых доноров по общепринятой методике на градиенте плотности Ficoll-Paque (Pharmacia) и культивировали в конечной концентрации 2-106 клеток/мл в полной среде RPMI-1640 в течение 24 часов. Исследуемые вещества вносили в среду в начале инкубации в конечной концентрации 0.2, 2 и 20 мкг/мл. В культуру клеток, служившую положительным контролем, добавляли 1 мкг/мл фитогемагглютинина (ФГА) (Difco). Концентрацию ИФН-а, ИФН-у, ИЛ-lß, ИЛ-4, ИЛ-6 и ФНО-а в супернатантах культур мононуклеаров определяли с помощью твердофазного иммуноферментного анализа (ИФА), используя наборы производства ЗАО «Вектор-Бест» в соответствии с прилагаемыми инструкциями.

Цитотоксические свойства мурамилпептидов изучены на Т-лимфобластоидных клетках СЕМ SS. Клетки (исходная плотность посева -2x105 клеток/мл) культивировали в полной среде RPMI-1640 в присутствии тестируемых соединений в концентрациях 0.1, 1, 10 и 100 мкг/мл в течение 4 суток. По окончании инкубации оценивали жизнеспособность клеток либо с помощью МТТ-теста (Mossman Т., 1983), либо путем подсчета живых и мертвых клеток в камере Горяева после окрашивания трипановым синим (0.2%).

Для изучения антивирусных свойств гликозидов МДП клетки СЕМ S S (2x105 клеток/мл) заражали штаммом ВИЧ-1 BRU с множественностью инфекции 100 TCID50 и культивировали в полной среде RPMI-1640 в присутствии тестируемых гликопептидов в концентрациях 0.1, 1, 10 и 100 мкг/мл в лунках 96-луночного круглодонного планшета. На 2-е, 3-е, и 4-е сутки из лунок убирали по 160 мкл среды с несвязавшимся вирусом и добавляли в том же объеме свежую среду, содержащую те же концентрации мурамилпептидов. По истечении 6 суток культивирования в супернатантах определяли концентрацию внутреннего белка вируса р24 с помощью твердофазного ИФА, используя тест-системы производства ЗАО «Вектор-Бест». Индекс ингибиции (ИИ) репликации рассчитывали по формуле: ИИ = (1 - ОП1/ОП2) х 100%, где ОП1 - оптическая плотность при определении р24 в культурах с добавлением гликозидов МДП, а ОП2 - в культурах зараженных клеток без мурамилпептидов. Материалы и методы клинических исследований

Биологически активная добавка к пище (БАД) глимурид представлена на испытание ООО «Кристалл-Мед» в герметичной упаковке по 10 желатиновых капсул, каждая из которых содержит по 0.1 мг р-гептилгликозида МДП.

Клинические исследования целесообразности использования глимурида в комплексной терапии герпесвирусной инфекции проведены в Центре современной медицины ГОУ Московской академии рынка труда и информационных технологий у больных, находившихся на амбулаторном лечении. Пациенты дали свое согласие на участие в исследовании.

В рандомизированном исследовании участвовали 45 больных рецидивирующим лабиальным герпесом со средней продолжительностью ремиссии 1,5±0,5 месяца, частотой рецидивов 6 и более раз в год. Длительность рецидивов составляла 8,9±1,5 дней. У всех пациентов диагноз подтверждался определением ВПГ-1 методом ПЦР в соскобе из участков высыпаний и содержимом везикул. Основными критериями исключения были ВИЧ-инфекция; аутоиммунные заболевания; заболевания внутренних органов, которые могут отразиться на состоянии противоинфекционной защиты организма. Среди больных было 27 женщин и 18 мужчин в возрасте от 21 до 55 лет.

Пациенты были рандомизированы на 3 группы:

1) 15 человек, которые при первом же рецидиве получали базовую противовирусную терапию в течение 10 дней: внутрь - валтрекс по 0.5 г 2 раза в сутки; местно - крем ацикловир 5 раз в сутки;

2) 15 пациентов, которые при рецидиве, помимо вышеописанной стандартной терапии, получали глимурид по 2 капсулы ежедневно в течение первых 3 суток, затем по 2 капсулы через день в течение следующих 8 суток и далее по 1 капсуле через день еще в течение 20 суток;

3) 15 человек, которые получали только глимурид по вышеописанной схеме.

Кроме того, для сравнения изучаемых показателей с их значениями в норме мы обследовали 15 здоровых лиц, тщательное обследование которых позволило исключить существенные заболевания, способные повлиять на функциональное состояние внутренних органов и иммунной системы. Эти лица были сопоставимы по полу и возрасту с обследованными больными.

Клиническими критериями эффективности проводимой терапии служили изменения выраженности, длительности и частоты рецидивов. За больными наблюдали в течение 1 года.

Иммунологические показатели определяли и оценивали на 1-3-е сутки рецидива герпеса и через 30 суток после его купирования в соответствии с принципами и методами, описанными в работах (А.М.Земсков и соавт., 1999, Р.В.Петров и соавт., 1994). Количество в периферической крови CD3+, CD3+CD4+, CD3+CD8+, CD3-CD16+CD56+, CD3+CD16+56+ и CD19+ клеток определяли с использованием проточных цитофлюориметров Cytomics FC 500 (Beckman Coulter) и BD FACSCalibur System (Becton Dickinson & Company). Поглотительную активность моноцитов и нейтрофилов (долю активно фагоцитирующих клеток, %) оценивали в гепаринизированной цельной крови по способности захватывать FITC-меченые опсонизированные бактерии Е. coli, используя набор реагентов Phagotest (Orpegen Pharma). Уровень иммуноглобулинов A, G и М в сыворотке крови определяли методом радиальной иммунодиффузии (Mancini G. et al, 1965)

Статистическая обработка полученных данных производилась при помощи программы STATISTICA 7.0 в соответствии с рекомендациями по статистической обработке фармакологических экспериментов (Салимов P.M., 2000). Количественные данные представлены как среднее ± стандартное отклонение, качественные - в виде доли в выборочной совокупности. Достоверность различий между двумя независимыми выборками количественных показателей при их нормальном распределении оценивали, используя двусторонний вариант i-критсрия Стьюдента, при распределении, отличном от нормального, - ¿/-критерий Манна-Уитни. Сравнение связанных выборок проводили с помощью парного /-критерия Стьюдента или критерия Вилкоксона в зависимости от вида распределения. Для выявления различий

между группами по качественным признакам использовали критерий Фишера и критерий х2- Статистически значимыми считали различия при р<0.05. Связь нескольких переменных анализировали с помощью коэффициента корреляции Пирсона для количественных переменных с нормальным распределением значений. Коэффициент ранговой корреляции Спирмена применяли для анализа связи интервальных и порядковых переменных, не подчиняющихся нормальному распределению.

РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Опираясь на полученные ранее данные, для сравнительных исследований были отобраны как гликозиды МДП с уже доказанной способностью стимулировать противоинфекционных иммунитет с алифатическим и трициклическими агликонами ф-гептил- и р-адамантилгликозиды МДП), так и вновь синтезированные циклоалкилгликозиды МДП (P-циклогексилметил-, р-циклогексилэтил- и p-4-отрети-бутилциклогексилгликозиды МДП).

Учитывая то, что исследуемые производные МДП незначительно различались по молекулярному весу, во всех тест-системах in vitro и in vivo вещества исследовались в эквиграммовых концентрациях и дозах. Влияние гликозидов МДП на неспецифическую резистентность мышей

Целью первого этапа исследований было выявить наиболее биологически активные гликозиды МДП для их дальнейшего изучения как потенциальных средств стимуляции противовирусного иммунитета. На . этом этапе использованы модель сепсиса с введением исследуемых веществ внутрибрюшинно для определения их влияния на неспецифическую резистентность.

Несмотря на то, что в этой модели в качестве патогенов используются грамотрицательные и грамположительные бактерии, ее выбор для первичного скрининга биологической активности гликозидов МДП не случаен. Во-первых, эта методика входит в перечень обязательных тест-систем для оценки иммунотропной активности фармакологических веществ. Во-вторых, в условиях модели in vivo с внутрибрюшинным введением веществ, в значительной степени нивелируется влияние их растворимости и особенностей фармакокинетики на результаты сравнительных исследований. В-третьих, область потенциального применения исследуемых веществ не ограничивается вирусными болезнями: полученные с использованием этой тест-системы данные могут быть использованы и для создания эффективных средств иммунотерапии бактериальных инфекций.

Профилактическое введение всех гликозидов МДП приводило к увеличению выживаемости мышей, зараженных культурой S. aureus (рис. 2).

Максимальный протективный эффект проявили Р-гептил- и Р-

адамантилгликозиды МДП: во всех 3 дозах они снижали летальность зараженных животных до нуля. Высокой биологической активностью обладал также [3-циклогексилэтилгликозид МДП, который и в высоких (15 мг/кг), и в низких дозах (0.15 мг/кг) в 2 из 3 проведенных экспериментов предотвращал гибель 100% животных. р-Циклогексилметилгликозид МДП тоже обладал широким диапазоном эффективных доз, однако уровень увеличения выживаемости инфицированных животных был несколько ниже, чем у предыдущего соединения. Активность, близкую к немодифицированному МДП, проявил (3-4-т/?еда-бутилциклогексилгликозид МДП, который в дозе 1.5 мг/кг достоверно снижал летальность, а в других дозах проявлял лишь тенденцию к увеличению выживаемости.

Рисунок 2

Влияние р-гликозидов МДП на резистентность животных к внутрибрюшинному заражению S. aureus

Примечание: представлены данные 1 типичного из 3 независимых экспериментов. Светлые столбики - 0.15 мг/кг, темные - 1.5 мг/кг, заштрихованные - 15 мг/кг.

* - р<0.05 по сравнению с контролем; " - р<0.05 по сравнению с референц-контролем (МДП).

С учетом результатов предыдущей серии экспериментов, принимая во внимание 100% проективный эффект ß-гептил- и ß-адамантилгликозидов МДП во всех использованных дозах, в условиях экспериментального сепсиса, индуцированного внутрибрюшинным введением культуры Е. coli, гликозиды МДП исследовались в более широком диапазоне в целом несколько меньших доз. Это а priori позволило бы увидеть зависимость биологического действия от дозы.

Рисунок 3

Влияние ß-гликозидов МДП на резистентность животных к внутрибрюшинному заражению Е. coli

Примечание: представлены данные 1 типичного из 3 независимых экспериментов. Светлые столбики - 0.15 мг/кг, темные - 1.5 мг/кг, заштрихованные - 15 мг/кг.

* - р<0.05 по сравнению с контролем; " - р<0.05 по сравнению с референц-контролем (МДП).

И в этой тест-системе р-гептилгликозид МДП вновь оказался наиболее действенным стимулятором антибактериальной устойчивости (рис. 3). Это соединение увеличивало выживаемость на 60% в дозе 3.75 мкг/кг, 80% - 75 мкг/кг и 100% - 1.5 мг/кг. Р-Адамантилгликозид МДП предотвращал гибель

мышей в 60% случаев в дозах 3.75 мкг/кг и 75 мкг/кг, в 100% - в дозе 1.5 мг/кг. Среди циклоалкилгликозидов наиболее активным был р-циклогексилэтилгликозид МДП. В дозе 1.5 мг/кг этот гликопептид предотвращал гибель мышей в 100% случаев, достоверно превышая эффект МДП. Р-Циклогексилметилгликозид МДП в этой же дозе повышал выживаемость зараженных животных до 60%. МДП и Р-4-трегп-бутилциклогексилгликозид МДП проявляли тенденцию к снижению летальности инфицированных мышей.

Таким образом, сравнительное исследование гликозидов МДП на септических моделях выявило, что наибольшей биологической активностью обладают Р-гептил- и р-адамантилгликозиды МДП. Перспективным соединением также представляется Р-циклогексилэтилгликозид МДП. Действие гликозидов МДП на продукцию ключевых цитокинов мононуклеарами периферической крови здоровых доноров

Задачей следующего этапа было оценить влияние гликозидов МДП на продукцию мононуклеарами человека ряда ключевых цитокинов, инициирующих и регулирующих иммунный ответ на различные патогены, в том числе вирусы. Изучено действие гликозидов МДП на ИФН-а и ИФН-у, которые через STAT-1-сигнальную систему направляют дифференцировку посттимических Т-клеток-предшественников по Thl-пути, ведущему к реализации клеточных реакций в отношении вирус-инфицированных клеток. Помимо этого, ИФН-а обладает прямым противовирусным действием, подавляя трансляцию вирусных матриц и активируя синтез эндогенной рибонуклеазы . Также исследовали выработку важнейших провоспалительных медиаторов - ФНО-а, ИЛ-ip и ИЛ-6, - играющих центральную роль в защите организма не только от вирусных агентов, но и от болезнетворных бактерий, грибов, простейших и гельминтов, а также от злокачественной трансформации клеток. Кроме того, изучено влияние производных МДП на продукцию ИЛ-4, стимулирующего ТЬ2-зависимые гуморальные иммунные реакции.

Р-Гептил-, Р-циклогексилэтил- и р-адамантилгликозиды МДП в отличие от других гликопептидов во всех концентрациях проявляли выраженную тенденцию к стимуляции продукции ИФН-а (рис. 4). При этом первые два соединения в достоверно усиливали выработку этого цитокина в концентрации 20 мкг/мл, а третий гликозид - в концентрации 2 мкг/мл, превосходя эффект немодифицированного МДП.

Те же 3 гликозида МДП оказались наиболее эффективными стимуляторами продукции ИФН-у мононуклеарами здоровых доноров in vitro (рис. 5). р-Циклогексилметилгликозид МДП активировал выработку этого цитокина лишь в концентрации 2 мкг/мл и не отличался по эффективности от немодифицированного МДП. P-4-трет-бутилциклогексилгликозид МДП не изменял значимо продукцию ИФН-у, уступая по биологической активности

МДП и другим его производным.

Рисунок 4

Действие гликозидов МДП на продукцию ИФН-а мононуклеарными

Примечание для рисунков 4-7: представлены средние 3 независимых экспериментов. Стандартное отклонение не превышало 25%. Светлые столбики - 0.2 мкг/мл, заштрихованные - 2 мкг/мл, темные - 20 мкг/мл. * - р<0.05 по сравнению с контролем; + - р<0.05 по сравнению с референс-контролем (МДП).

Практически все гликозиды МДП за исключением р-4-трет-бутилциклогексилгликозида МДП обладали сходной способностью стимулировать выработку ФНО-а. Однако следует отметить, что наибольший уровень этого цитокина обнаружен в супернатантах культур мононуклеаров, инкубированных в присутствии Р-гептил- и р-циклогексилэтилгликозидов МДП. Также как и в предыдущих случаях, Р-4-трет-бутилциклогексилгликозид МДП не оказывал влияния на продукцию ФНО-а.

Р-Циююгексилэтилгликозид МДП в большей степени, чем другие гликопептиды, стимулировал выработку ИЛ-1Р (рис. 6). В достаточно высокой степени этот цитокин продуцировали мононуклеарные клетки, культивированные в среде с добавлением р-гептилгликозида МДП. р-4-трет-Бутилциклогексилгликозид МДП существенно не влиял на выработку ИЛ-ф.

клетками человека

Рисунок 5

Действие гликозидов МДП на продукцию ИФН-у мононуклеарными клетками человека

Рисунок 6

Действие гликозидов МДП на продукцию ИЛ-1р мононуклеарами

человека

Р-Циклогексилметилгликозид-МДП оказался самым эффективным активатором выработки ИЛ-4, статистически значимо превышая действие референс-контроля в концентрации 2 мкг/мл (рис. 7). В высокой концентрации (20 мкг/мл) (3-циклогексилэтил- и (3-гептилгликозиды МДП сопоставимо с ФГА стимулировали выработку мононуклеарами ИЛ-4. р-4-трет-Бутилциклогексилгликозид МДП лишь в концентрации 20 мкг/мл усиливал продукцию этого цитокина.

Рисунок 7

Действие гликозидов МДП на продукцию ИЛ-4 мононуклеарными клетками человека

В сравнении с ФГА немодифицированный мурамилдипептид в концентрациях 2 и 20 мкг/мл незначительно стимулировал выработку ИЛ-6. (3- ¡ Циклогексилэтил-, P-циклогексилметил-, (3-адамантил- и (5-гептилгликозиды j МДП во всех использованных дозах существенно превышали эффект МДП по индукции продукции последнего цитокина. Следует отметить, что способность J вышеуказанных гликопептидов в концентрациях 2 и 20 мкг/мл усиливать продукцию ИЛ-6 была сопоставима с таковой ФГА (1 мкг/мл). Так же, как и в большинстве экспериментов in vitro и in vivo, Р-4-трет-бутилциклогексилгликозид МДП уступал по биологической активности другим гликозидам МДП, а в концентрации 2 мкг/мл - и немодифицированному гликопептиду.

Таким образом, результаты изучения влияния гликозидов МДП на продукцию цитокинов мононуклеарами человека in vitro коррелировали с

результатами исследований in vivo: p-гептил-, Р-адамантил- и Р-циклогексилэтилгликозиды МДП в большинстве случаев превышали по цитокин-индуцирующей активности МДП, а fl-4-mpem-бутилциклогексилгликозид МДП выглядел «аутсайдером». Из 3 наиболее биологически активных соединений для дальнейших исследований целесообразности использования при вирусных заболеваниях были выбраны первые два соединения, индуцировавших несколько большую выработку ИФН-у. Помимо выявленной в настоящее работе способности стимулировать неспецифическую резистентность и продукцию ряда ключевых цитокинов, эти вещества и ранее в тест-ситемах in vitro и in vivo проявляли высокую биологическую активность, превышающую таковую МДП и многих его аналогов. Кроме того, р-гептилгликозид МДП уже внедрен в практику как активный компонент парафармацевтичесого препарата глимурида, что открывает возможности его клинических исследований при вирусных заболеваниях. А р-адамантилгликозид МДП представляет особый интерес в связи с адамантильной структурой агликона, которая a priori должна добавить молекуле гликопептида определенные противовирусные свойства. Отметим, что Р-циклогексилэтилгликозид МДП, не включенный в дальнейшие испытания в настоящей работе, тем не менее, выглядит перспективным соединением, заслуживающим внимания иммунофармакологов.

Действие р-гептил- и /?-адамантилгликозидов МДП на репликацию вируса иммунодефицита человека 1 в клетках перевиваемой Т-лимфобластоидной линии СЕМ SS

В связи с особой социальной значимостью ВИЧ/СПИД-инфекции представлялось целесообразным изучить влияние отобранных в предварительных исследованиях гликозидов МДП на репликацию ВИЧ-1 в клетках перевиваемой Т-лимфобластоидной линии СЕМ SS, часто используемой для изучения эффективности антиретровирусных средств. Полученные в такой тест-системе данные могли быть интересны при их экстраполяции на другие вирусы, обладающие в той или иной степени лимфотропностью, в частности на герпесвирусы 4, 6, 7 типов и др. Была поставлена задача ответить на следующие вопросы. В каком направлении измениться репликация вирусов в лимфоидных клетках, подверженных активирующему влиянию мурамилпептидов? Не простимулирует ли активация клеток гликозидами МДП репликацию содержащихся в них вирусов?

В начале мы оценили влияние р-гептил- и р-адамантилгликозидов МДП на жизнеспособность и пролиферацию клеток СЕМ SS.

В широком диапазоне концентраций оба гликопептида как в отдельности, так и в комбинации с ФГА не влияли существенно на жизнеспособность клеток ВИЧ-1 -чувстительной Т-лимфобластоидной линии, оцененную как путем подсчета доли живых клеток в камере Горяева после окраски трипановым

синим, так и с помощью МТТ-теста.

Также присутствие гликозидов МДП в культуре клеток СЕМ SS не влияла на их пролиферацию: концентрация клеток через 4 суток инкубации не изменялась в зависимости от присутствия/отсутствия как гликозидов МДП, так и ФГА в концентрации 1 мкг/мл.

При заражении лимфобластоидных клеток штаммом BRU ВИЧ-1 с множественностью инфекции 100 TCID50 внесение Р-гептилгликозида МДП в культуральную среду дозозависимо подавляло репликацию вируса, о чем судили по снижению уровня ядерного антигена ВИЧ-1 р24 в супернатанте 6-суточных клеточных культур (рис. 8).

Рисунок 8

Влияние р-гептил- и р-адамантилгликозидов МДП на репликацию ВИЧ-1

в клетках СЕМ SS

Концентрация гликозидов МДП, мкг/мл

Примечание: представлены данные 3 независимых экспериментов.

* - р<0.001 по сравнению с репликацией в отсутствии гликозидов МДП;

I - р<0.001 по сравнению с р-адамантилгликозидом МДП.

Особого внимания заслуживает факт 100% угнетения репликации ВИЧ-1 под влиянием этого гликопептида в концентрации 100 мкг/мл. Напомним, что в этой концентрации р-гептилгликозид МДП не обладал цитотоксической активностью по отношению клеткам СЕМ ББ. Вероятно, существует специфический механизм, по которому реализуется прямое противовирусное действие гликопептида.

Что касается р-адамантилгликозида МДП, то можно говорить о

выраженной тенденции к угнетению (р=0,07) репликации при использовании вещества в высокой концентрации. Достаточно высокий индекс ингибиции (21,4%) позволяет предположить, что дальнейшее «тиражирование» экспериментов выявит достоверное подавление репликации ВИЧ-1 под влиянием (3-адамантилгликозида МДП в дозе 100 мкг/мл. Так же, как и в предыдущем случае в этой концентрации данный гликопептид не обладал цитотоксическими свойствами по отношению к ВИЧ-1-чувствительным клеткам.

I Таким образом, испытываемые вещества не только не усиливали . репликации ВИЧ-1 в культуре Т-лимфобластоидных клеток, но и проявляли | выраженный прямой противовирусный эффект. Самый изученный на текущий момент гликозид МДП - Р-гептилгликозид МДП - оказался более мощным супрессором репликации этого лимфотропного вируса.

Иммуномодулирующая и терапевтическая активность р~гептилгликозид-| МДП при хроническом рецидивирующем лабиальном герпесе

Рисунок 9

Снижение продолжительности и тяжести рецидива герпеса под влиянием

глимурида

И Продолжительность рецидива, сутки

□ Тяжесть рецидива, у.е.

<ь

¿г

Примечание: * - различие с показателями группы больных, получающих только базовую терапию валтрексом достоверно (р<0,05).

Выраженная иммуномодулирующая активность (3-гептилгликозида МДП, показанная в настоящей и предыдущих работах, в частности способность

усиливать продукцию ИФН-а и ИФН-у, а также выраженная прямая противовирусная активность, выявленная на зараженных ВИЧ-1 Т-лимфобластоидных клетках СЕМ ББ, послужили основанием для проведения клинических исследований этого гликопептида у больных герпесом.

Больные всех групп хорошо перенесли проводимое лечение. Ни в одном случае не отмечено развития значимых побочных эффектов.

Глимурид вызывал существенное снижение продолжительности и тяжести рецидива лабиального герпеса, сопоставимое по выраженности с действием ациклических нуклеозидов. Кроме того, при сочетанном использовании препараты проявляли взаимопотенцирующее действие (рис. 9).

Эти данные коррелировали с результатами изучения действия глимурида на продолжительность безрецидивного периода. Следует отметить, что базовое лечение только ациклическими нуклеозидами практически не изменяло длительности ремиссии, тогда как глимурид и особенно его комбинация с валтрексом существенно удлиняли безрецидивный период.

В крови больных рецидивирущим герпесом выявлено снижение числа СОЗ+, СБЗ+С04+, СБЗ+С08+, С03-С016+СБ56+ и СВЗ+СБ16+СБ56+ клеток, иммунорегуляторного индекса С04/С08 и поглотительной активности моноцитов (таблица). Концентрации ^А и ^М были выше, чем у здоровых доноров. Лечение рецидива валтрексом не приводило к восстановлению измененных иммунологических показателей. У пациентов, получавших глимурид и его комбинацию с валтрексом, через 1 месяц после купирования рецидива выявили нормализацию большинства показателей клеточного и гуморального иммунитета. Следует отметить, что в этих группах больных оставался сниженным индекс СВ4/СБ8, а поглотительная активность моноцитов и гранулоцитов увеличивалась до уровня, превосходящего значения этих показателей у здоровых доноров. Также у пациентов, принимавших только глимурид, существенно повышалось число СОЗ+СЭ16+СВ56+ клеток в крови, а у больных, получавших этот иммуномодулятор вместе с валтрексом, значительно увеличивалось количество СБЗ+СБ8+ лимфоцитов.

Таким образом, в настоящей работе решена важная в научно-практическом отношении задача - в сравнительном исследовании определена способность 5 гликозидов МДП стимулировать неспецифическую резистентность и продукцию ряда цитокинов, а также обоснована целесообразность применения наиболее биологически активных веществ при вирусных болезнях.

Таблица

Иммунологические показатели больных лабиальным герпесом на фоне приема валтрекса, глимурида и их комбинации

Показатели Здоровые лица, п=15 Исходные показатели (1-3-е сутки рецидива) Показатели через 1 месяц после купирования рецидива

Валтрекс, п=15 Глимурид, п=15 Валтрекс+ Глимурид, п=15 Валтрекс, п=15 Глимурид, п=15 Валтрекс+ Глимурид, п=15

СОЗ+ клетки, х10®/л 1,4 ± 0,2 1,2 ± 0,2* 1,1 ±0,2* 1,3 ±0,1 1,1 ± 0,3* 1,4 ±0,2 1,5 ± 0,2+$

СБЗ+СП4+ клетки, х109/л 0,92 ± 0,12 0,72 ± 0,07* 0,67 ± 0,08* 0,73 ± 0,07* 0,68 ± 0,08* 0,86 ± 0,101"$ 0,90 ±0,11|$

СБЗ+С08+ клетки, х109/л 0,51 ±0,06 0,45 ± 0,04* 0,46 ± 0,05* 0,46 ± 0,04* 0,43 ± 0,07* 0,54 ± 0,06+$ 0,57 ± 0,07*+$

СП4+/СБ8+ 1,8 ±0,2 1,6 ± 0,2* 1,5 ± 0,2* 1,6 ± 0,2* 1,6 ±0,02* 1,6 ±0,02* 1,6 ±0,2*

СШ9+ клетки, хЮ'/л 0,30 ± 0,05 0,32 ± 0,04 0,31 ± 0,05 0,33 ± 0,06 0,31 ± 0,04 0,28 ± 0,04 0,27 ± 0,05+$

СВЗ-СБ16+СВ56+ клетки, х109/л 0,33 ± 0,05 0,22 ± 0,04* 0,24 ± 0,05* 0,25 ± 0,03* 0,24 ± 0,04* 0,30 ± 0,04+$ 0,31 ±0,05+$

С03+СБ16+С056+ клетки, % 3,4 ± 0,6 2,0 ± 0,8* 2,3 ± 0,5* 2,4 ± 0,5* 2,3 ± 0,7* 4,0 ± 0,8*|$ 3,8 ± 0,8+$

А, г/л 2,1 ± 0,4 3,0 ± 0,4* 2,7 ± 0,4*$ 2,8 ± 0,4* 2,8 ± 0,3* 2,4 ±0,3*1$ 2,3 ± 0,5+$

1ц в, г/л 11+2 13 + 4 12 ±3 13 ±3* 12 ±2 12 ±4 11 ±3

^ М, г/л 1,3 ± 0,3 1,7 ± 0,4* 1,6 ± 0,3* 1,8 ±0,4* 1,7 ± 0,3* 1,2 ±0,4+$ 1,3 ± 0,4+$

Поглотительная активность гранулоцитов, % 82 ±7 77 ±8 79 ±6 78 ±5 76 ±9* 88 ±8*+$ 87 ±6*+$

Поглотительная активность моноцитов, % 81 ±6 75 ±6* 76 ±8 74 ±6* 78 ±5* 91 ±7*|$ 89 ±7*+$

Примечание: * - р<0,05 в сравнении показателями здоровых доноров; +- р<0,05 в сравнении с исходными показателями;

$- р<0,05 в сравнении показателями больных, получавших лечение только валтрексом.

ВЫВОДЫ

1. Профилактическое внутрибргошинное введение гликозидов мурамилдипептида (МДП) увеличивало выживаемость мышей, зараженных культурой Stapylococcus aureus в минимальной дозе, вызывающей стопроцентную гибель животных. Максимальный протективный эффект проявили ß-гептил- и ß-адамантилгликозиды МДП, в широком диапазоне доз снижавшие летальность мышей до нуля. Высокой активностью обладал также ß-циклогексилэтилгликозид МДП, несколько меньшей - ß-циклогексилметилгликозид МДП, а Р-4-т/?е/я-бутилциклогексилгликозид МДП был близок по эффективности к немодифицированному МДП.

2. На модели сепсиса, вызванного внутрибрюшинным введением культуры Escherichia coli, протективная активность гликозидов МДП увеличивалась в ряду: Р-4-/ире/и-бутилциклогексилгликозид МДП —> ß-циклогексилметилгликозид МДП —> ß-циклогексилэтилгликозид МДП —» ß-адамантилгликозид МДП —> ß-гептилгликозид МДП. Последние 3 соединения в дозе 1.5 мг/кг увеличивали до 100% выживаемость животных, зараженных летальной дозой бактерий, превышая действие МДП.

3. ß-Гептил-, ß-циклогексилэтилгликозиды МДП в концентрации 20 мкг/мл и ß-адамантилгликозид МДП в концентрации 2 мкг/мл усиливали выработку ИФН-а мононуклеарами крови здоровых доноров in vitro. Также эти 3 гликозида МДП были наиболее эффективными стимуляторами продукции ИФН-у, ФНО-а и ИЛ-lß. ß-Циклогексилметилгликозид-МДП оказался самым действенным активатором выработки ИЛ-4, в концентрации 2 мкг/мл превышая эффект МДП. Все вышеуказанные производные МДП в концентрациях 2 и 20 мкг/мл усиливали продукцию ИЛ-6 в сопоставимой с фитогемагглютинином (1 мкг/мл) степени. Р-4-/я/>ет-Бутилциклогексилгликозид-МДП уступал по способности активировать выработку цитокинов МДП и другим его производным, лишь в концентрации 20 мкг/мл стимулируя продукцию ИЛ-4 и ИЛ-6.

4. ß-Гептилгликозид МДП в концентрации 100 мкг/мл подавлял на 100% репликацию ВИЧ-1 в культуре Т-лимфобластоидных клеток СЕМ SS, не изменяя жизнеспособности и пролиферации последних. ß-Адамантилгликозид МДП в этой концентрации проявлял тенденцию к угнетению репликации вируса.

5. ß-Гептилгликозид МДП как активный компонент Б АД глимурида существенно снижал продолжительность и тяжесть рецидива лабиального герпеса, увеличивал безрецидивный период, восстанавливал до нормальных значений исходно сниженное число CD3+, CD3+CD4+, CD3+CD8+, CD3-CD16+CD56+ и CD3+CD16+CD56+ клеток в периферической крови и усиливал поглотительную активность моноцитов и гранулоцитов. В сочетании с пероральным приемом валтрекса и местным применением ацикловира в форме

крема глимурид потенцировал терапевтическое действие ациклических нуклеозидов.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

При рецидивах хронического лабильного герпеса рекомендуется назначать глимурид по 2 капсулы ежедневно в течение первых 3 суток, затем по 2 капсулы через день в течение следующих 8-10 суток и далее (при наличии лабораторных и клинических признаках недостаточности противоинфекционной защиты) по 1-2 капсулы через день еще в течение 20 суток.

Начинать прием глимурида нужно как можно раньше, желательно с продромальной стадии. Использование глимурида следует комбинировать с применением других противовирусных средств, в частности с пероральным назначением валтрекса или ацикловира в суточной дозе 1 г (или фамцикловира в суточной дозе 750 мг) и местным применением 5% крема ацикловира в течение 7-10 дней от начала рецидива.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Калюжин О.В., Лобанов Д.С., Мулик Е.Л., Артемьева К.А., Болтовская М.Н., Макарова О.В. Противовирусный иммунитет и возможности его стимуляции мурамилпептидами. // Материалы IV научно-практической конференции южного федерального округа с международным участием «Актуальные вопросы инфекционной патологии». - Ростов-на-Дону-Краснодар-Майкоп: ОАО «Полиграф-ЮГ». - 2009. - С. 87-88.

2. Лобанов Д.С., Кимпаева Д.С., Мулик Е.Л., Артемьева К.А., Шкалев М.В., Нелюбов М.В., Калюжин О.В. Глимурид корригирует иммунные расстройства и снижает частоту и выраженность рецидивов у больных герпесвирусной инфекцией. // Материалы IV научно-практической конференции южного федерального округа с международным участием «Актуальные вопросы инфекционной патологии». - Ростов-на-Дону-Краснодар-Майкоп: ОАО «Полиграф-ЮГ». - 2009. - С. 112-113.

3. Нелюбов М.В., Лобанов Д.С., Мулик Е.Л., Шкалев М.В., Калюжин О.В. Стойкость терапевтических эффектов комбинации лайфферон+рибапег+глимурид при хроническом гепатите С. // Сборник материалов XVI Российского национального конгресса "Человек и лекарство" (Тез. докл.) - М. - 2009. - С. 196.

4. Нелюбов М.В., Мулик Е.Л., Лобанов Д.С., Артемьева К.А., Шкалев М.В., Калюжин О.В. Комбинация лайфферона, рибапега и глимурида при хроническом гепатите С: стойкость терапевтических эффектов. // Материалы IV научно-практической конференции южного федерального округа с международным участием «Актуальные вопросы инфекционной патологии».

- Ростов-на-Дону-Краснодар-Майкоп: ОАО «Полиграф-ЮГ». - 2009. - 1 136.

5. Калюжин О.В., Лобанов Д.С., Мулик Е.Л., Кимпаева Д.С., Земляков A.I Калина Н.Г., Караулов A.B. Действие циклоалкилгликозидс мурамилдипептида на антибактериальную резистентность мышей продукцию цитокинов мононуклеарами человека. // Бюллете! экспериментальной биологии и медицины. - 2009. - Т. 148. - № 10. - С. 42i 429.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

БАД - биологически активная добавка к пище

БЦЖ - bacillus Calmette-Guerin

ИЛ-1, -2 ... -интерлейкин-1, -2...

ИФН - интерферон

ИФА - иммуноферментный анализ

ИИ - индекс ингибиции

МДП - К-ацетилмурамил-Ь-аланил-О-изоглутамин (мурамилдипептид)

ОП - оптическая плотность

ПЦР - полимеразная цепная реакция

ФГА - фитогемагглютинин

ФИО - фактор некроза опухоли

ХГС - хронический гепатит С

FITC - флюоресцеина изотиоционат

HCV - вирус гепатита С

Ig- иммуноглобулин

PRR - pattern recognition receptors

TCID50 - tissue culture infective dose

Thl- Т-хелпер 1 типа

Th2 - Т-хелпер 2 типа

Treg - регуляторные Т-клетки

Заказ № 296. Объем 1 п.л. Тираж 100 экз. Отпечатано в ООО «Петроруш». г.Москва, ул.Палиха 2а.тел.250-92-06 www.postator.ru

Актуальность проблемы

Бактериальные иммуномодуляторы были и остаются одной из наиболее перспективных групп иммунотропных препаратов [60, 95, 126, 127]. Благодаря наличию высококонсервативных структур — патоген-ассоциированных ■молекулярных паттернов, или образов, — препараты бактериального происхождения через образраспознающие рецепторы (pattern recognition receptors, PRR) эффективно стимулируют защитные механизмы макроорганизма, в первую очередь звенья врожденного иммунитета [5, 81, 154]. По этой же сигнальной системе реализуется один их филогенетически выработанных механизмов антагонизма бактерий-представителей нормальной микрофлоры по отношению к патогенным вирусам.

Исторически первые бактериальные иммуномодуляторы представляли собой целые бактериальные клетки (БЦЖ, ОК432). Следующим поколением стали бактериальные лизаты и их фракции. В настоящее время предпочтение отдается низкомолекулярным иммуномодуляторам с известной химической структурой и механизмом действия - очищенным или синтетически воспроизведенным компонентам микробных клеток [60].

Ы-ацетилмурамил-Ь-аланил-О-изоглутамин (мурамилдипептид; МДП) -компонент пептидогликана группы А клеточной стенки бактерий — уже более 35 лет является объектом пристального внимания иммунофармакологов как молекула, модификации химической структуры которой привели к созданию нескольких иммунотропных препаратов и большой группы перспективных фармакологических веществ, активирующих противоинфекционный и противоопухолевый иммунитет [18, 45, 105, 122, 123, 144, 223, 224]. Раскрытие молекулярных механизмов действия МДП и его производных, включающих агонизм внутриклеточных PRR NOD-2 [205], послужило новым стимулом для поиска эффективных и безопасных синтетических аналогов МДП.

Известно, что p-гликозидирование ведет к увеличению биологической активности молекулы МДП. Сформулированы предпочтительные направления синтеза высокоэффективных Р-гликозидов МДП с алифатическими и адам антильны ми агликонами [28, 54].

В эксперименте показана способность р-гептилгликозида МДП стимулировать основные звенья противоопухолевого и противоинфекционного, в том числе противовирусного, иммунного ответа [47,49, 52, 55, 58, 59, 210]. Многообещающими выглядят первые результаты применения этого гликопептида в комплексной терапии хронического гепатита С (ХГС) [116]. Остается открытыми вопросы о влиянии Р-гептилгликозида МДП на продукцию интерферона-а (ИФН-а) и репликацию лимфотропных вирусов, а также возможности использования этого соединения при других вирусных болезнях, в том числе герпесе.

На моделях септических состояний и опухолевых заболеваний in vivo р-адамантилгликозид МДП проявил себя как стимулятор антибактериальной резистентности и противоопухолевого иммунитета [54, 57]. Наличие адаман ганового радикала в структуре этого гликопептида и сходство противовирусных и противоопухолевых защитных механизмов говорят о том, что он a prirori может обладать прямыми и/или опосредованными противовирусными свойствами [3]. Тем не менее, данных о влиянии Р-адамантилгликозида МДП на репликацию вирусов и противовирусный иммунитет в доступной литературе не обнаружено.

Предпринятые ранее попытки присоединения циклических структур к гликозидному центру молекулы МДП в одних случаях приводили к увеличению биологической активности гликопептида (Р-циклогексилгликозид МДП) [51, 56], в других - существенно не изменяли или даже снижали ее (а- и Р-циклододецилгликозиды МДП) [31]. Продолжение поиска эффективных стимуляторов противоинфекционного, в том числе противовирусного, иммунитета среди циклоалифатических гликозидов МДП выглядит целесообразным, в частности с точки зрения определения зависимости биологической активности производных МДП от структуры агликона и его подвижности по отношению к гликозидному центру молекулы.

В пользу целесообразности проведения настоящей работы говорит и тот факт, что французский аналог МДП - мурабутид - уже зарекомендовал себя как стимулятор противовирусного иммунного ответа и, кроме того, в эксперименте и клинике подавлял репликацию вируса иммунодефицита человека (ВИЧ) [143, 145,

Цель работы — в сравнительном исследовании выявить наиболее эффективные иммуномодуляторы из группы новых и уже изученных Р-гликозидов МДП с алифатической, трициклической и циклоалифатической структурой агликона и определить возможность их использования при вирусных болезнях.

Задачи исследования

1. Исследовать способность р-гептил-, Р-адамаптил-, Р-циклогексилметил-, Р-циклогексилэтил- и Р-4-трет-бутилциклогексилгликозидов МДП стимулировать резистентность мышей к инфекциям, вызванным грамположительными и грамотрицательными бактериями.

2. Изучить влияние Р-гептил-, Р-адамантил-, Р-циклогексилметил-, Р-циклогексилэтил- и Р-4-трет-бутилциклогексилгликозидов МДП на продукцию ИФН-а, ИФЫ-у, ИЛ-ip, ИЛ-4, ИЛ-6 и ФНО-а мононуклеарными клетками человека in vitro.

3. Определить действие Р-гептил- и Р-адамантилгликозидов МДП на репликацию ВИЧ-1 в культуре Т-лимфобластоидных клеток СЕМ SS, а также на жизнеспособность и пролиферацию этих клеток.

5. Изучить клиническую эффективность и иммуномодулирующую активность БАД глимурида, включающего в качестве активного компонента Р-гептилгликозид МДП, у больных хроническим рецидивирующим лабиальным герпесом.

Научная новизна

Впервые изучена иммуномодулирующая активность новых циклоалкилгликозидов МДП: Р-циклогексилметил-, Р-циклогексилэтил- и Р-4-трет-бутилциклогексилгликозидов МДП. Продемонстрировано, что первые два соединения стимулируют антибактериальную резистентность мышей и продукцию ряда ключевых цитокинов эффективнее, чем немодифицированньтй МДП, тогда как Р-4-ш/7е/и-бутилциклогексилгликозид МДП уступал по активности МДП.

Впервые показана способность Р-гептил-, Р-адамантил- и Р-циклогексилэтилгликозидов МДП стимулировать продукцию ИФН-а.

Впервые продемонстрировано, что Р-гептилгликозид МДП подавляет репликацию ВИЧ-1 в культуре ВИЧ-1-чувствительных Т-лимфобластоидных клеток. При этом в дозе 100 мкг/мл гликопептид, не оказывая цитотоксических эффектов, угнетал репликацию вируса на 100%.

Впервые показана клиническая и иммуномодулирующая эффективность р-гептилгликозида МДП (глимурида) в комплексной терапии хронического рецидивирующего лабиального герпеса. Доказана способность глимурида потенцировать терапевтический эффект ациклических нуклеозидов.

Теоретическая и практическая значимость

В результате наших исследований получены данные об иммунотропных эффектах 3 оригинальных производных МДП, дополнена информация о биологической активности 2 известных соединений, что имеет научную ценность с точки зрения определения влияния структуры и подвижности агликона на биологическую активность гликозидов МДП.

Теоретическая ценность работы заключается в описании факта подавления Р-гептилгликозидом МДП репликации ВИЧ-1 в культуре чувствительных к этому вирусу лимфобластоидных клеток.

Этот факт имеет и практическую значимость, так как делает это соединение объектом внимания со стороны разработчиков средств специфической (как адъюванта в составе вакцин) и неспецифической иммунотерапии ВИЧ/СПИД-инфекции.

Теоретическую и практическую ценность имеет обоснование принципиальной возможности использования гликозидов МДП при вирусных болезнях, в частности вызванных лимфотропными вирусами.

Прикладное значение имеют сформулированные в работе практические рекомендации по использованию Р-гептилгликозида МДП (глимурида) в комплексной терапии хронического рецидивирующего лабиального герпеса.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Р-Гептил-, Р-адамантил- и Р-циклогексилэтилгликозиды МДП стимулируют устойчивость животных к заражению летальными дозами грамположигельных и грамотрицательных бактерий, превосходя по эффективности немодифицированный МДП.

2. р-Гептил-, р-адамантил- и р-циклогексилэтилгликозиды МДП усиливают продукцию ИФН-у, ИЛ-ip, ИЛ-4, ИЛ-6 и ФНО-а мопопуклеарными клетками человека in vitro. Эти гликопептиды, в отличие от немодифированного МДП, Р-циклогексилэтил- и Р-4-т/?ет-бутилщ1клогексил гликозидов МДП, усиливают выработку ИФН-а.

3. Р-Гептилгликозид МДП, не проявляя цитотоксичности, подавляет репликацию ВИЧ-1 в культуре Т-лимфобластоидных клеток СЕМ SS. В дозе 100 мкг/мл это соединение угнетает репликацию вируса на 100%. Р-Адамантилгликозид МДП проявляет тенденцию к подавлению репликации ВИЧ-1.

4. р-Гептилгликозид МДП как активный компонент БАД глимурида существенно снижает продолжительность и тяжесть рецидива лабиального герпеса, а также увеличивает безрецидивпый период и корригирует иммунные нарушения. Глимурид потенцирует терапевтическое действие ациклических нуклеозидов при герпесе.

Практическое внедрение полученных результатов

Материалы диссертационной работы внедрены в учебный процесс на кафедре клинической иммунологии и аллергологии факультета последипломного профессионального образования врачей ГОУ ВПО Московской медицинской академии им. И.М.Сеченова и используются в исследовательской практике в лаборатории клеточной иммунопатологии и биотехнологии НИИ морфологии человека РАМН.

Результаты настоящей работы, касающиеся применения глимурида при герпесе, внедрены в клиническую практику в Центре современной медицины ГОУ Московской академии рынка труда и информационных технологий Департамента по науке и промышленной политике г. Москвы.

Апробация работы

Основные положения диссертации были представлены на XVI Российском национальном конгрессе "Человек и лекарство" (Москва, 2009) и научной конференции с международным участием «Актуальные вопросы инфекционной патологии» (Анапа, 2009).

Апробация диссертации состоялась 30 сентября 2009 года на совместной конференции лаборатории иммуноморфологии воспаления и лаборатории клеточной иммунопатологии и биотехнологии НИИ морфологии человека РАМН, кафедры клинической иммунологии и аллергологии факультета последипломного профессионального образования ММА им. И.М.Сеченова, Центра современной медицины ГОУ ВПО Московской академии рынка труда и информационных технологий.

Публикации

По теме диссертации опубликована 5 печатных работ, в том числе 1 статья в рецензируемом журнале, рекомендованном ВАК Российской Федерации.

Структура и объем диссертации

Диссертация состоит из следующих разделов: введение, обзор литературы (2 главы), материалы и методы, результаты собственных исследований (4 главы), обсуждение, выводы, практические рекомендации, библиографический указатель литературы.

Указатель литературы содержит 134 отечественных и 193 иностранных источников.

Диссертация изложена на 109 страницах, иллюстрирована 13 рисунками и содержит 4 таблицы и 3 схемы.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

ВЫВОДЫ

1. Профилактическое внутрибрюшиниое введение гликозидов мурамилдипептида (МДП) увеличивало выживаемость мышей, зараженных культурой Stapylococcus aureus в минимальной дозе, вызывающей стопроцентную гибель животных. Максимальный протективный эффект проявили р-гептил- и р-адамаптилгликозиды МДП, в широком диапазоне доз снижавшие летальность мышей до пуля. Высокой активностью обладал также Р-циклогексил э гилгликозид МДП, несколько меньшей - р-циклогексилметилгликозид МДП, а р-4-трет-бутилциклогексилгликозид МДП был близок по эффективности к немодифицироваиному МДП.

2. На модели сепсиса, вызванного внутрибрюшинным введением культуры Escherichia coli, протектнвная активность гликозидов МДП увеличивалась в ряду: Р-4-шреш-бутилциклогексилгликозид МДП —> р-циклогексилметилгликозид МДП —> р-циклогексилэтилгликозид МДП —> р-адамантилгликозид МДП —>■ р-гептилгликозид МДП. Последние 3 соединения в дозе 1.5 мг/кг увеличивали до 100% выживаемость животных, зараженных летальной дозой бактерий, превышая действие МДП.

3. р-Гептил-, Р-циклогексилэтилгликозиды МДП в концентрации 20 мкг/мл и Р-адамантилгликозид МДП в концентрации 2 мкг/мл усиливали выработку ИФН-а мононуклеарами крови здоровых доноров in vitro. Также эти 3 гликозида МДП были наиболее эффективными стимуляторами продукции ИФН-у. ФНО-а и ИЛ-ip. Р-Циклогексилметилгликозид-МДП оказался самым действенным активатором выработки ИЛ-4, в концентрации 2 мкг/мл превышая эффект МДП. Все вышеуказанные производные МДП в концентрациях 2 и 20 мкг/мл усиливали продукцию ИЛ-6 в сопоставимой с фитогемагглютинином (1 мкг/мл) степени. Р-4-т/?ет-Бутилциклогексилгликозид-МДП уступал по способности активировать выработку цитокинов МДП и другим его производным, лишь в концентрации 20 мкг/мл стимулируя продукцию ИЛ-4 и ИЛ-6.

4. р-Гептилгликозид МДП в концентрации 100 мкг/мл подавлял на 100% репликацию ВИЧ-1 в культуре Т-лимфобласгоидных клеток СЕМ SS, не изменяя жизнеспособности и пролиферации последних. Р-Адамантилгликозид МДП в этой концентрации проявлял тенденцию к угнетению репликации вируса.

5. |3-Гептилгликозид МДП как активный компонент Б АД глимурида существенно снижал продолжительность и тяжесть рецидива лабиального герпеса, увеличивал безрецидивный период, восстанавливал до нормальных значений исходно сниженное число CD3+, CD3+CD4+, CD3+CD8+, CD3-CD16+CD56+ и CD3+CD16+CD56+ клеток в периферической крови и усиливал поглотительную активность моноцитов и гранулоцитов. В сочетании с пероральным приемом валтрекса и местным применением ацикловира в форме крема глимурид потенцировал терапевтическое действие ациклических нуклеозидов.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

При рецидивах хронического лабильного герпеса рекомендуется назначать глимурид по 2 капсулы ежедневно в течение первых 3 суток, затем по 2 капсулы через день в течение следующих 8-10 суток и далее (при наличии лабораторных и клинических признаках недостаточности противоинфекционной защиты) по 1-2 капсулы через день еще в течение 20 суток.

Начинать прием глимурида нужно как можно раньше, желательно с продромальной стадии. Использование глимурида следует комбинировать с применением других противовирусных средств, в частности с пероральным назначением валтрекса или ацикловира в суточной дозе 1 г (или фамцикловира в суточной дозе 750 мг) и местным применением 5% крема ацикловира в течение 710 дней от начала рецидива.