Автореферат и диссертация по медицине (14.01.04) на тему:Бактериальное обострение хронической обструктивной болезни лёгких

На правах рукописи

КОЛОСОВА Ксения Юрьевна

БАКТЕРИАЛЬНОЕ ОБОСТРЕНИЕ ХРОНИЧЕСКОЙ ОБСТРУКТИВНОЙ БОЛЕЗНИ ЛЁГКИХ: РОЛЬ МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКОГО МЕТОДА ИДЕНТИФИКАЦИИ ВОЗБУДИТЕЛЕЙ

14.01.04 - Внутренние болезни

Автореферат на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

- 7 ИЮН 2012

Москва - 2012

005045603

Работа выполнена в ГБОУ ВПО Первый Московский государственный медицинский университет им. И.М. Сеченова Минздравсоцразвития России

Научный руководитель:

доктор медицинских наук, профессор Цветкова Ольга Александровна

Официальные оппоненты:

Синопальников Александр Игоревич, доктор медицинских наук, профессор, ГБОУ ДПО «Российская медицинская академия последипломного образования» Минздравсоцразвития России, заведующий кафедрой пульмонологии

Морозова Татьяна Евгеньевна, доктор медицинских наук, профессор, ГБОУ ВПО Первый Московский государственный медицинский университет им. И.М. Сеченова Минздравсоцразвития России, заведующая кафедрой клинической фармакологии и фармакотерапии ФППОВ

Ведущая организация:

ФГУ «Научно-исследовательский институт пульмонологии» Федерального медико-биологического агентства России

Защита состоится «19» июня 2012 г. в 14 часов 00 минут на заседании диссертационного совета Д 208.040.13 при ГБОУ ВПО Первый Московский государственный медицинский университет им. И.М. Сеченова Минздравсоцразвития России (119991, г. Москва, ул. Трубецкая, д.8, стр. 2)

С диссертацией можно ознакомиться в медицинской библиотеке ГБОУ ВПО Первый МГМУ им. И.М.Сеченова Минздравсоцразвития России (117198, г. Москва, Нахимовский проспект, д.49)

Автореферат разослан «_» мая 2012 г.

Учёный секретарь

диссертационного совета доктор медицинских наук

Архипов Владимир Владимирович

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность темы

Хроническая обструктивная болезнь легких (ХОБЛ) является одной из важнейших причин заболеваемости и смертности в мире. ХОБЛ поражает около 5% взрослого населения, является четвертой ведущей причиной смерти во всем мире, и остается единственной причиной смерти, частота которой растет. По данным Всемирной Организации Здравоохранения (ВОЗ) 80 млн человек в мире страдают ХОБЛ средней и тяжелой степени, в 2005г ХОБЛ стала причиной смерти 3 млн человек [GOLD, 2010]. В России приблизительно 11 млн человек страдают ХОБЛ [А.Г. Чучалин] и, по прогнозам специалистов, в будущем будет отмечен неуклонный рост данной патологии как в развитых, так и в развивающихся странах. ХОБЛ приводит к инвалидизации в среднем через 10 лет после установления диагноза и более чем в половине случаев это лица моложе 50 лет.

Заболеваемость и смертность пациентов с ХОБЛ, в основном, связана с обострениями ХОБЛ, которые приводят к стойкому ухудшению состояния пациентов, прогрессированию заболевания, и постоянно требуют увеличения затрат здравоохранения, направленных на борьбу с ХОБЛ [Connors А., 1996].

К развитию обострений приводят бактерии, вирусы и факторы окружающей среды. По данным ряда исследований 80% обострений ХОБЛ имеют инфекционную природу [Bürge S., 2003]. Для успешного лечения бактериальных обострений ХОБЛ необходимо раннее назначение антибактериального препарата, т.к. позднее начало терапии приводит к развитию осложнений и неблагоприятному исходу заболевания [Celli R., 2007]. С позиций доказательной медицины выбор антибактериального препарата зависит от выявленного возбудителя. Микробиологическая диагностика требует времени, дополнительных средств и фактически возможна лишь у 50-60% больных [Авдеев С.Н., 1998]. В большинстве случаев выбор исходного антибактериального препарата осуществляется эмпирическим путем на основании характерной клинической картины заболевания, данных анамнеза и сопутствующей патологии.

Для принятия оптимальных решений необходимо знание этиологической структуры инфекционных обострений ХОБЛ, выявление факторов, ассоциированных с выделением определенных возбудителей и внедрение в практику новых «быстрых» методов диагностики.

Цель исследования

Определить микробный профиль и факторы риска бактериального обострения ХОБЛ, ассоциированного с грамотрицательными энтеробактериями и P. aeruginosa, сравнить информативность микробиологического метода и ПЦР для идентификации бактериальных возбудителей обострения ХОБЛ.

Задачи исследования

1. Определить частоту встречаемости бактериального обострения ХОБЛ.

2. Установить качественный состав микрофлоры при обострении ХОБЛ.

3. Выявить факторы риска обострения ХОБЛ, ассоциированного с грамотрицательными энтеробактериями и Pseudomonas aeruginosa.

4. Сравнить информативность микробиологического исследования бронхиального секрета и ПЦР для выявления Streptococcus pneumoniae, Haemophilus influenzae, Staphylococcus aureus, Mycoplasma pneumoniae, Chlamydia pneumoniae, Enterobacteriacaeae, Pseudomomonas aeruginosa у больных с обострением ХОБЛ.

5. Определить место метода ПЦР в этиологической диагностике бактериального обострения ХОБЛ.

Научная новизна

Впервые показано, что при бактериальном обострении ХОБЛ, грамотрицательная микрофлора и Р. aeruginosa встречаются чаще, чем было показано в предшествующих исследованиях. Современные молекулярно-генетические методы (ПЦР) продемонстрировали свою высокую эффективность

при идентификации наиболее широко распространенных возбудителей обострений ХОБЛ.

Научно-практическая значимость

Результаты проведенного исследования дают возможность объективизировать этиологический фактор инфекций нижних дыхательных путей и, соответственно, позволяют осуществить выбор антибактериальных препаратов первого ряда для успешной терапии. Полученные результаты позволяют рекомендовать использование ПЦР диагностики таких возбудителей обострений ХОБЛ как S. pneumoniae, Н. influenzae, Enterobacteriacaeae, P. aeruginosa в повседневной практике.

Положения, выносимые на защиту

1. Обострение ХОБЛ бактериальной этиологии встречается в 80% случаев. Наиболее частыми возбудителями являются: S. pneumoniae, Н. influenzae, Enterobacteriacaeae, P. aeruginosa.

2. Спектр возбудителей обострений ХОБЛ зависит от стадии заболевания.

3. Предикторами бактериального обострения, ассоциированного с грамотрицательной флорой и P. aeruginosa, могут служить частые обострения ХОБЛ в анамнезе, предшествующая длительная терапия ИГКС, повышение уровня С-РБ в сыворотке во время обострения ХОБЛ.

4. Метод ПЦР высоко эффективен в идентификации таких возбудителей как S. pneumoniae, Н. influenzae, Enterobacteriacaeae, P. aeruginosa. ПЦР более эффективен, чем микробиологический метод, у пациентов, получавших частые курсы антибактериальной терапии или получавших антибактериальную терапию в течение трех месяцев до настоящей госпитализации.

Апробация диссертации: Основные результаты доложены и обсуждены на научно-практической конференции кафедры госпитальной терапии №1 лечебного факультета ГБОУ ВПО Первый МГМУ им. И.М. Сеченова 16 февраля 2012 г.

Личный вклад автора. Автору принадлежит ведущая роль в выборе направления исследования, статистической обработке, анализе и обобщении полученных результатов. Вклад автора является определяющим и заключается в непосредственном участии на всех этапах исследования: от постановки задач, их теоретической и клинической реализации до обсуждения результатов в научных публикациях и докладах и их внедрения в практику.

Внедрение в практику результатов исследования. Основные результаты работы используются в клинической практике пульмонологического отделения УКБ №1 Первого московского государственного медицинского университета им. И.М. Сеченова для лечения больных с ХОБЛ.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 3 печатных научных работы в отечественных и зарубежных изданиях, из которых 1 статья в журнале, входящем в перечень ведущих рецензируемых научных журналов и изданий, рекомендованных ВАК РФ.

Структура и объём работы. Диссертация изложена на 94 страницах машинописи. Состоит из введения, глав: обзор литературы, материалы и методы исследования, результаты собственных исследований, обсуждение результатов, заключения, выводов, практических рекомендаций. Иллюстрирована 13 рисунками и 6 таблицами. Библиографический указатель содержит 22 отечественных и 90 зарубежных источников. Диссертация изложена на русском языке.

СОДЕРЖАНИЕ ДИССЕРТАЦИОННОГО ИССЛЕДОВАНИЯ Материалы и методы исследования

В исследование было включено 78 пациентов, госпитализированных по поводу обострения ХОБЛ в пульмонологическое отделение Госпитальной терапевтической клиники ММА им. И.М. Сеченова (УКБ №1 ПМГМУ им. И.М. Сеченова) с 2005 по 2008гг. Под обострением ХОБЛ, согласно рекомендациям GOLD 2008, мы понимали ухудшение состояния пациента с ХОБЛ, связанное с прогрессирующим нарастанием одышки, увеличением количества и/или степени гнойности мокроты в течение нескольких дней, более выраженное по сравнению с

б

обычным ежедневным колебанием самочувствия, заставившее пациента обратиться за медицинской помощью. Обязательным было получение у каждого больного информированного согласия для участия в исследовании.

Критериями исключения были тяжелое состояние пациента, требующее проведения неинвазивной или инвазивной вентиляции легких, госпитализация в ОРИТ, наличие инфильтративных изменений по данным рентгенографии органов грудной клетки, сопутствующая бронхиальная астма, бронхоэктатическая болезнь как ведущая патология, наличие тяжелой конкурирующей патологии, невозможность проведения фибробронхоскопии (ФБС) (или отказ пациента от проведения ФБС).

В исследование было включено 78 пациентов с ХОБЛ I-IV стадии в фазе обострения, 76 мужчин (97,4%) и 2 женщины (2,6%). Средний возраст пациентов 61,2 ± 9,3 года. Все пациенты, включенные в исследование, были курильщиками, или курили ранее, средний индекс курильщика составил 45,6 ± 16,3 пачко-лет. Контакт с профессиональными вредностями (контакт с химическими раздражителями, газами, пылью, воздействие высоких температур) имели 24 пациента (30,8%). Больше 2-х госпитализаций в год по поводу обострения ХОБЛ и/или пневмонии отмечались у 16 пациентов (20,5%), а диагностическая/санационная ФБС в течение последнего года проводилась у 26 пациентов (33,3%).

По типам обострения ХОБЛ согласно классификации N.R. Anthoniensen (1987г.), больные распределялись следующим образом: I тип имел место у 24 (30,8%) больных, когда имелись все 3 основных симптома, такие как усиление одышки, увеличение объема мокроты, появление гнойной мокроты; II тип - у 36 (46,2%) больных, когда имелись 2 из 3 основных симптомов и III тип - у 18 (24,0%) больных, у которых имелся только 1 из основных симптомов и какой-либо дополнительный симптом (лихорадка, усиление кашля, увеличение количества хрипов в легких).

По результатам исследования ФВД среднее значение постбронходилятационного ОФВ) составило 58,1± 22,0%.

7

Терапия системными ГКС (курсовое лечение) проводилась у 4 пациентов (5,1%), базисная терапия ингаляционными ГКС у 18 (23,1%). Указания на частые курсы антибактериальной терапии (больше 2-х раз в год) или недавнюю (в течение 3-х месяцев до настоящей госпитализации) антибактериальную терапию имелись у 54 пациентов (69,2%).

Таблица 1

Клиническая характеристика больных ХОБЛ, включенных в исследование

Пол

Мужчины 76

Женщины 2

Возраст, лет 61,2 ±9,3

ИК, пачко/лет 45,6 ± 16,3

Проф. вредности 24 (30,8%)

Предшествующая терапия:

Системные ГКС 4 (5,1%)

Ингаляционные ГКС* 18 (23,1%)

Антибактериальная терапия** 54 (69,2%)

Тип обострения по Anthoniensen:

I 24 (30,8%)

II 36 (46,2%)

III 18 (24,0%)

ср. ОФВ1 пост,% от должного 58,1± 22,0%

При проведении рутинного лабораторного обследования средний уровень

лейкоцитов крови составил 8,68 ± 1,7 х 109/л, СОЭ 15,3 ± 13,5 мм/ч, С-РБ 2,0 ± 1,9

мг/дл. При цитологическом анализе образцов мокроты (п=78) гнойный характер

(лейкоцитоз мокроты больше 15 лейкоцитов в 1 поле зрения) был подтвержден в

82,0%, а присутствие эозинофилов в мокроте отмечалось в 23,1%.

При анализе результатов МСКТ органов грудной клетки признаки

хронического бронхита (утолщение/уплотнение стенок бронхов, единичные

8

бронхоэктазы) и эмфиземы легких были выявлены в 78 случаях (100%). Наличие распространенных бронхоэктазов было подтверждено у 30 пациентов (38,5%). Участки консолидации легочной паренхимы, не выявленные при рентгенографии грудной клетки, обнаружены у 14 пациентов (17,9%). Очаговые изменения в легких выявлены (неспецифические очаги диаметром менее 5 мм) в 12 случаях (15,4%). КТ-признаки бронхиолита («дерево с почками») определялись у 12 пациентов (15,4%).

С-реактивный белок плазмы крови определяли с использованием количественной методики. Количественное содержание С-РБ в плазме крови на автоматическом анализаторе "Array" (США).

Пациентам было выполнено спирометрическое исследование функции внешнего дыхания на приборе Sensor Medics (США) с определением форсированной жизненной емкости легких (ФЖЕЛ), объема форсированного выдоха за 1 секунду (ОФВ0, и соотношение ОФВ1/ФЖЕЛ (модифицированный индекс Тиффно). Стадия заболевания устанавливалась согласно классификации GOLD 2010 года.

Всем пациентам проводилась фибробронхоскопия по стандатртному протоколу исследования. Образцы бронхиального смыва каждого пациента исследовались с помощью традиционного микробиологического метода и полимеразной цепной реакции.

Анализ образцов бронхиального секрета микробиологическим методом проводился в бактериологической лаборатории ММА им. И.М. Сеченова, куда образцы (5,0 мл) доставлялись не позднее 6 часов от момента их получения. Идентификация возбудителей проводилась согласно стандартному микробиологическому протоколу в строгом соответствии с положениями, изложенными в «Основных методах лабораторных исследований в клинической микробиологии», ВОЗ, 1994.

Вторые образцы бронхиального секрета (5,0 мл) замораживались при температуре -20°С, и затем, отправлялись в Лабораторию Молекулярной Генетики Микроорганизмов НИИ Физико-химической медицины РАМН (зав. лаб., д.б.н.

9

E.H. Ильина), где проводилось исследование каждого образца с помощью ПЦР для определения наличия в образце ДНК изучаемых возбудителей: Streptococcus pneumoniae, Haemophilus influenzae, Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa, Enterobacteriaceae, Mycoplasma pneumoniae, Chlamydia pneumoniae.

Для идентификации микрофлоры использовался подход сочетания ПЦР с последующей гибридизацией продуктов амплификации с видоспецифичными зондами. Последовательности генов 16S РНК, использованные в исследовании, были отобраны из GENEBANK - базы данных NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov). Консервативные участки использовались для подбора универсальных праймеров, вариабельные - для поиска видоспецифических зондов. Анализ олигонуклеотидных зондов и праймеров осуществляли с помощью программы OLIGO 6. Специфичность подобранных уникальных олигонуклеотидов для видовой идентификации бактерий оценивали с использованием поиска гомологий в базе данных NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov).

Полученные данные подвергались статистической обработке при помощи программы STATISTICA 6.0 for Windows. Количественные показатели представлены в виде (*±SD). Для показателей, характеризующих качественные признаки, указывалось абсолютное число и относительная величина (%). При проверке совпадения распределения исследуемых количественных показателей с нормальным в группах пользовались критерием согласия Колмогорова-Смирнова. Достоверность различий в случае, если закон распределения исследуемых числовых показателей отличался от нормального, проверяли при помощи U-критерия Манна - Уитни, Н-критерия Краскалла-Уоллиса и точного теста Фишера (для качественных признаков). Различия считали достоверными при р<0,05. Для определения существования функциональных связей между параметрами вычисляли коэффициент корреляции R Спирмана, который считали достоверным при р<0,05. Для выявления независимых факторов риска определенных возбудителей использовали логистический регрессионный анализ.

Результаты исследования и их обсуждение

По результатам микробиологического исследования бронхиального секрета рост микрофлоры в диагностически значимом титре (> 102 КОЕ/мл) был получен в 64 образцах (82%).

На основании результатов микробиологического исследования образцов бронхиального секрета мы выделили группу пациентов с бактериальным обострением ХОБЛ (п=64) и небактериальным обострением ХОБЛ (п=14).

Этиологическая структура бактериального обострения ХОБЛ представлена на рисунке 1.

pneumoniae aureus 10% 10%

HJnfluenzae 6%

Enterobacteriacae ае 6%

. aeruginosa 6%

Прочие

3%

В S. pneumoniae В S. aureus

■ H.influenzae

■ Enterobacteriacaeae в P. aeruginosa

В Прочие Ш Микст-инфекция

Рисунок 1. Монокультуральная структура бактериального обострения по данным микробиологического исследования образцов бронхиального смыва (п=64).

Как видно из приведенной диаграммы более половины (59%) обострений связаны с микст-инфекций. Преобладающими возбудителями при моно-инфекции были S. pneumoniae (10%), S. aureus (10%), реже грамотрицательная флора (Н. influenza 6%, Enterocateriacaeae 6%, P. aeruginosa 6%).

При анализе частоты выделения каждого возбудителя, в том числе в составе микст-инфекции, получены следующие результаты (рис.2): S. pneumoniae 22 (34,4%), H.influenzae 10 (15,6%), М. cattarhalis 2 (3,1%), S. aureus 16 (25,0%), Enterobacteriacaeae 22 (34,4%), P. aeruginosa 16 (25,0%), прочие: 22 (34,4%).

Рис. 2. Частота выделения возбудителей бактериального обострения ХОБЛ по данным микробиологического исследования образцов бронхиального смыва, (п=64)

При сравнении пациентов с бактериальным обострением ХОБЛ и небактериальным обострением ХОБЛ не было выявлено достоверных различий между ними по индексу курения, контактам с профессиональными вредностями, предшествующим обострениям, проводившейся антибактериальной терапии, терапии системными и ингаляционными ГКС (р>0,01). В группе пациентов с бактериальным обострением ХОБЛ чаще имело место обострение I и II типов по Anthoniensen (84,3%), чем в 2 группе небактериального обострения (42,9%) (р < 0,01). В группе бактериального обострения ХОБЛ показатели функции внешнего дыхания были достоверно ниже, чем группе небактериального обострения (ОФВ! 55,5% vs 70,0%, р< 0,01).

Выявлена тенденция к повышению вероятности выделения бактериальных возбудителей в диагостически значимом титре, по мере усугубления стадии заболевания, однако полученные результаты не достигают статистической значимости (р > 0,05). (рис. 3)

В группе бактериального обострения преобладали пациенты III и IV стадии ХОБЛ (56,3%), по сравнению с группой небактериального обострения (28,6%). (р = 0,06).

120,00% 100,00% 80,00% 60,00% 40,00% 20,00% 0,00%

Рис. 3. Частота выделения возбудителей в диагностически значимом титре при разных стадиях ХОБЛ

При проведении анализа качественного состава микрофлоры в зависимости от стадии ХОБЛ было выявлено, что грамположительные возбудители преобладают при более ранних стадиях заболевания, тогда как грамотрицательные возбудители и микст-инфекция чаще встречаются при III и IV стадиях ХОБЛ (р < 0.01 при сравнении I и II стадии с III и IV стадиями) (рис. 4).При III и IV стадиях ХОБЛ в составе микст-инфекции преобладали грамотрицательные энтеробактерии и Р.aeruginosa.

В Грам+ □ Грам- ■ Микст-инфекция

I стадия, n=14 II стадия, n=24 III стадия, n=20 IV стадия, п=20

Рис. 4. Структура распределения микрофлоры (окраска по Граму) по стадиям ХОБЛ

При анализе спектра возбудителей в зависимости от стадии ХОБЛ получены следующие результаты (табл.2):

100%

оло/

75%

............71;40%............................... • ..........................................................

Ill

I стадия II стадия III стадия IV стадия

Таблица 2

Спектр возбудителей при бактериальном обострении ХОБЛ в зависимости от

стадии ХОБЛ

II III IV

I стадия, стадия, стадия, стадия,

n=10 n=18 n=16 n=20

S. pneumoniae 60% 44,40% 25% 20%

S.aureus 0 22,20% 0 60%

M.catarhalis 0 11,10% 0 0

Н. influenzae 20% 22,20% 25% 0

Enterobacteriacaeae 20% 22,20% 25% 60%

P. aeruginosa 0% 0,00% 50% 40%

Прочие 40% 33,30% 50% 20%

*в т.ч. микст-

инфекция 40% 33,30% 75% 80%

С-реактивный белок и СОЭ являются чувствительными, но неспецифичными маркерами воспаления. Данные о повышении концентрации С-РБ в сыворотке при бактериальном обострении ХОБЛ противоречивы. При анализе результатов собственного исследования оказалось, что в группе пациентов с бактериальным обострением ХОБЛ уровень С-РБ достоверно выше, чем в группе небактериального обострения. (2,6 мг/дл уб 0,8 мг/дл, р<0.05). Уровень СОЭ также был достоверно повышен в группе пациентов с бактериальным обострением (17 мм/ч уэ 8 мм/ч, р<0.05).

Проведенный сравнительный анализ уровня лейкоцитов в периферической крови не выявил статистически значимых различий в группе бактериального и небактериального обострения ХОБЛ (р>0,05).

Полученные результаты свидетельствуют о важной диагностической роли такого универсального воспалительного маркера как С-РБ в ранней диагностике бактериального обострения ХОБЛ.

По результатам нашего исследования не выявлено достоверной связи между «гнойным» характером мокроты по субъективной оценке пациентов и бактериальным обострением ХОБЛ. Тогда как выявление лейкоцитов в мокроте (более 20 в поле зрения) был достоверно связан с бактериальным обострением ХОБЛ. (93% в группе бактериального обострения 93% vs 4% в группе небактериального обострения, р<0,001).

При сопоставлении группы бактериального и небактериального обсотрения ХОБЛ по результатам МСКТ органов грудной клетки не было выявлено достоверных различий по частоте встречаемости бронхоэктазии, очаговых изменений и бронхиолита. При анализе результатов МСКТ органов грудной клетки пациентов с бактериальным обострением ХОБЛ бронхоэктазы были выявлены у 28 пациентов (43,8%). При наличии бронхоэктазов наиболее часто встречались следующие возбудители: S. pneumonia 35,7%, Enterobacteriacaeae 35,7%, S. aureus 28,6%, P. aeruginosa 28,6%, H.influenzae 7,1%, M. catarrhalis 7,1%. Микст-инфекция в этой группе пациентов встречалась в 50% случаев, (рис.5)

40,00%

Рис. 5. Спектр возбудителей обострения ХОБЛ у больных с бронхоэктазами

Наиболее частыми возбудителями в виде монокультур при бронхоэктазиях были S.aureus 21,4% и P.aeruginosa 14,2%. Не было получено достоверных различий по спектру возбудителей в группах пациентов с бронхоэктазами и без.

P. aeruginosa была выделена в 16 случаях (25,0%) бактериального обострения ХОБЛ. Причем, в 75% случаев в составе микст-инфекции: в сочетании с 1 возбудителем в % случаев, в сочетании с 2 и более возбудителями в % случаев.

Мы провели логистический регрессионный анализ для выявления клинических предикторов обострения, ассоциированных с P.aeruginosa. Такими факторами риска оказались: госпитализации по поводу обострения ХОБЛ в течение предшествующего года или больше 2-х госпитализаций в год за последние 5 лет (0111=4,35; 95%ДИ [9,524-198,675]), причем этот параметр не зависел от степени тяжести ХОБЛ; частые курсы антибактериальной терапии или предшествующая антибактериальная терапия в течение 3-х месяцев до госпитализации (ОШ=8,84; 95%ДИ [3,524-71,434]); степень вентиляционных нарушений (ОШ=0,15, 95%ДИ [0,24-0,878]). Причем, у пациентов с тяжелым и крайне тяжелым течением ХОБЛ независимым фактором риска выделения Р. aeruginosa была предшествующая терапия системными и/или ИГКС в течение не менее 1 года были (ОШ=15,5, 95%ДИ [1,484-161,888] и ОШ=17,286, 95%ДИ [4,62664,554]).

Грамотрицательные энтеробактерии семейства Enterobacteriacaeae были выделены у 22 больных (34,4%), из них: Klebsiella pneumoniae (6), Serratia sp. (6), Escherichia coli (2), Enterobacter sp. (6), Proteus sp. (2), причем в в 18 случаях (81,8%) в составе микст-инфекции. Для выявления факторов, ассоциированных с выделением грамотрицательных энтеробактерий при обострении ХОБЛ, был проведен логистический регрессионный анализ. Оказалось, что такими факторами являются: частые курсы антибактериальной терапии или предшествующая антибактериальная терапия в течение 3-х месяцев до госпитализации (0111=3,8, 95%ДИ [1,003-14,403]); индекс курильщика, количество пачко/лет (0111=0,982, 95%ДИ [0,981-0,998]) и степень вентиляционных нарушений (ОФВ1, %) (0111=0,879, 95%ДИ [0,579-0,987]). Так, у больных со снижением ОФВ, < 30% от должного достоверно выше частота выделения бактерий семейства Enterobacteriacaeae, чем у больных с ОФВ] > 50% от должного (60,0% vs 16,7%, р < 0,05) (рис. 6)

Рис. 6 Частота выделения бактерий семейства Enterobacteriacaeae в зависимости от степени вентиляционных нарушений

Все образцы бронхиального смыва были исследованы методом полимеразной цепной реакции. Фрагменты бактериального генома (16SPHK) обнаружены в 100% образцов бронхиального смыва.

ДНК изучаемых возбудителей (S.pneumoniae, H.influenzae, P. aeruginosae, Enterobacteriacaeae, M. pneumoniae) была обнаружена в 70 (89,7%) образцов бронхиального секрета, в т.ч. ДНК М. pneumonia была обнаружена в 2-х образцах бронхиального секрета. Всего каждый из возбудителей методом ПЦР был обнаружен в следующем проценте случаев: S.pneumoniae 20 (25,7%), H.influenzae 22 (28,2%), S. aureus 12 (15,4%), Enterobacteriacaeae 40 (51,3%), P. aeruginosa 22 (28,2%). Всего у 2-х пациентов была обнаружена ДНК M.pneumoniae (2,6%), а ДНК С. pneumoniae не было ни в одном из образцов, (рис 7)

60,00% 50,00% 40,00% 30,00% 20,00% 10,00% 0,00%

51,30%

_15,40%

2,60%....................■■......

1

2570%..... 28.20% 28,20%

R 1 1

В

■ ш

Рис. 7 Частота выделения возбудителей методом ПЦР при обострении ХОБЛ,

п=78.

Микст-инфекция при обострении ХОБЛ по результатам ПЦР была обнаружена в 40 (51,2%) образцах бронхиального секрета. Моно-инфекция по результатам ПЦР была выявлена в 30 образцах (38,5%): S.pneumoniae 8 (10,3%), Н.influenzae 12 (15,4%), Enterobacteriacaeae 8 (10,3%), P. aeruginosa 2 (2,6%), M.pneumoniae 2 (2,6%). (рис. 8)

Рис. 8 Частота выделения отдельных возбудителей при обострении ХОБЛ методом PCR, п=78

С учетом того, что микробиологический метод является «золотым стандартом» идентификации бактериальных возбудителей, мы провели анализ чувствительности и специфичности метода ПЦР для определения бактерий.

Диагностическая чувствительность ПЦР в целом для выявления бактерий в образцах бронхиального секрета составила: 100%. При этом прогностическая ценность положительного результата 82,1%. В группе изучаемых методом ПЦР бактерий диагностическая чувствительность ПЦР составила 93,8%, при этом прогностическая ценность положительного результата - 85,7%. Проведен анализ точности метода ПЦР для идентификации каждого из изучаемых возбудителей (табл. 3). Диагностическая чувствительность и специфичность ПЦР для S.pneumoniae составили 100%. Диагностическая чувствительность ПЦР для S.aureus составила 75%, диагностическая специфичность 100%, диагностическая эффективность 87,5%, прогностическая ценность положительного результата 100%, прогностическая ценность отрицательного результата 93,9%. Диагностическая чувствительность ПЦР для Н.influenzae составила 100%,

18

a Enterobacteriacaeae

я P.aeruginosa

BS. pneumoniae 1Н. influenzae

В M. pneumoniae В Микст-инфекция

pneumoniae 10,3%

Н. influenzae

10,3% .aeruginosa 2,6%

Микст-имфекция

диагностическая специфичность 82,4%, диагностическая эффективность 91,2%, прогностическая ценность положительного результата 45,5%, прогностическая ценность отрицательного результата 100%. Диагностическая чувствительность ПЦР для Enterobacteriacaeae составила 100%, диагностическая специфичность 67,8%, диагностическая эффективность 83,9%, прогностическая ценность положительного результата 55%, прогностическая ценность отрицательного результата 100%. Диагностическая чувствительность ПЦР для P.aeruginosa составила 100%, диагностическая специфичность 90,3%, диагностическая эффективность 95,15%, прогностическая ценность положительного результата 27,3%, прогностическая ценность отрицательного результата 100%. Диагностическая чувствительность ПЦР при микст-инфекции составила 73,7%, диагностическая специфичность 90,3%, диагностическая эффективность 82%, прогностическая ценность положительного результата 73,7%, прогностическая ценность отрицательного результата 90,3%.

Таблица 3

Сравнительные результаты исследования образцов бронхиального секрета у больных с обострением ХОБЛ микробиологическим методом и методом ПЦР, п=78

Микробиологический

метод ПЦР Р

S. pneumoniae 28,20% 25,70% ns

S. aureus 20,50% 15,40% ns

M. catarhalis 2,60% X -

M. pneumoniae X 2,60% -

H. influenzae 12,80% 28,20% ns

Enterobacteriacaeae 28,20% 51,30% <0,05

P. aeruginosa 20,50% 28,20% ns

Микст-инфекция 48,70% 51,2% ns

Возбудитель не выявлен* 17,90% 10,30%

*для возбудителей, изучаемых по PCR

Полученные результаты сравнения двух методов свидетельствуют о более высокой чувствительности ПЦР для выявления грамотрицательных возбудителей, особенно Enterobacteriacae и Н.influenzae.

120,0%

Рис. 9. Частота выделения возбудителей обострений ХОБЛ микробиологическим методом и PCR в группе бактериального обострения ХОБЛ, п=64

В группе пациентов с небактериальным обострением ХОБЛ (п=14) была выделена подгруппа пациентов (п=10), у которых по результатам ПЦР была обнаружена бактериальная ДНК изучаемых возбудителей: H.ifluenzae 2, М. Pneumonia 2, Enterobacteriacaeae 4, P. aeruginosa 2, причем все они были представлены как моноинфекция.

При анализе этих подгрупп оказалось, что пациенты отличались по предшествовавшей терапии. Так, частые или недавние курсы антибактериальной терапии и прием системных ГКС достоверно чаще встречались в группе пациентов, у которых микробиологический анализ был отрицательный, а при исследовании методом ПЦР была выявлена ДНК изучаемых возбудителей (80% vs 20%, и 20% vs 0% р<0,05, соответственно), (рис. 10)

Рис. 10. Сравнение группы небактериального обострения ХОБЛ при положительных и отрицательных результатах ПЦР по предшествующей терапии

Причем оказалось, что в подгруппе пациентов с небактериальным обострением ХОБЛ, у которых при ПЦР обнаружены ДНК патогенных возбудителей, уровень лейкоцитов в периферической крови (9,6±2,1 х 10% vs 6,8±1,2 х 109/л) и С-РБ (1,12±0,52 мг/дл vs 0,1 ± 0,12 мг/дл) были достоверно выше, по сравнению с пациентами, у которых возбудитель не был выявлен ни одним из методов. В то же время уровень СОЭ достоверно не отличался в этих подгруппах(8,8±9,6 мм/ч vs 6,0±2,3 мм/ч, р > 0,05). (рис. 11)

С-РБ, ыг/дп 1,5 1 0,5 О

Р<0.05

СОЭ, ММ/Ч Р > 0.05

1,1

8,5 illilil

в ¡¡¡¡¡¡¡II

■ ...................0.1.............. Я

ПЦР {+) ПЦР(-) ПЦР (+) ПЦРН

Рис. 11 Лабораторные маркеры воспаления в группе пациентов с небактериальным обострением ХОБЛ

А. Уровень СОЭ (мм/ч) в группе небактериального обстрения ХОБЛ при положительных и отрицательных результатах ПЦР; Б. Уровень лейкоцитов крови (х109/л) в группе небактериального обстрения ХОБЛ при положительных и отрицательных результатах ПЦР; В. Уровень С-РБ (г/л) в группе небактериального обстрения ХОБЛ при положительных и отрицательных результатах ПЦР.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Принимая во внимание широкую распространенность ХОБЛ, существенный вклад обострений в прогрессирование заболевания и прогноз для жизни пациентов, а также затраты здравоохранения направленные на борьбу с обострениями ХОБЛ, изучение этиологической структуры обострений ХОБЛ остается крайне актуальной проблемой. Современный молекулярно-генетический метод: полимеразная цепная реакция, практически не изучался в нашей стране для идентификации бактериальных возбудителей при обострении ХОБЛ. В исследовании проведено сравнение традиционного микробиологического метода и полимеразной цепной реакции для идентификации бактериальных возбудителей обострения ХОБЛ.

Впервые показано, что при бактериальном обострении ХОБЛ, грамотрицательная микрофлора и P. aeruginosae встречаются чаще, чем было показано в предшествующих исследованиях. Современные молекулярно-генетические методы (ПЦР) продемонстрировали свою высокую эффективность при идентификации наиболее широко распространенных возбудителей обострений ХОБЛ.

В исследовании проведен анализ клинической картины обострений ХОБЛ, ассоциированных с бактериальными возбудителями. Определены факторы риска бактериального обострения ХОБЛ, ассоциированного с грамотрицательными энтеробактериями и P. aeruginosa.

Результаты проведенного исследования дают возможность объективизировать этиологический фактор инфекций нижних дыхательных путей и, соответственно, позволяют осуществить выбор антибактериальных препаратов первого ряда для успешной терапии. Полученные результаты позволяют рекомендовать использование ПЦР диагностики таких возбудителей обострений ХОБЛ как S. pneumoniae, Н. influenzae, Enterobacteriacaeae, P. aeruginosa в повседневной практике.

выводы

1. Большинство обострений ХОБЛ (больше 80%) связано с бактериальной инфекцией.

2. Качественный состав микрофлоры бронхиального секрета зависит от стадии ХОБЛ: при I и II ХОБЛ преобладают грамположительные бактерии (S. pneumoniae), а при III и IV стадии ХОБЛ возрастает доля грамотрицательной флоры, в т.ч. Р.aeruginosa и микстинфекции.

3. Факторы риска бактериального обострения ХОБЛ, ассоциированного с Р. aeruginosa: предшествующие обострения ХОБЛ, требующие госпитализации чаще двух раз в год, частые и/или недавние курсы антибактериальной терапии, степень вентиляционных нарушений. Факторами риска бактериального обострения ХОБЛ, ассоциированного с грамотрицательными энтеробактериями, являются: предшествующая антибактериальная терапия, индекс курильщика и степень вентиляционных нарушений.

4. Метод ПЦР оказался более информативным, чем микробиологический метод для идентификации грамотрицательных возбудителей: Н.influenzae, бактерий семейства Enterobacteriacaeae (р<0,05) и Р. aeruginosa.

5. У пациентов, получавших частые курсы антибактериальной терапии и/или системных ГКС по поводу обострений ХОБЛ в течение предшествующего года, целесообразно использовать метод ПЦР с целью идентификации потенциальных возбудителей обострения ХОБЛ, как наиболее быстрый и чувствительный метод для более раннего начала адекватной антибактериальной терапии.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Применение ПЦР для этиологической диагностики бактериального обострения ХОБЛ целесообразно в качестве метода быстрой (экспресс-диагностики) возбудителя при наличии факторов риска грамотрицательной инфекции, в т.ч. Р. aeruginosa, что позволит начать антибактериальную терапию в возможно ранние сроки обострения;

2. Применение ПЦР для этиологической диагностики бактериального обострения ХОБЛ целесообразно в качестве дополнительного (уточняющего метода) у пациентов, получавших частые курсы антибактериальной терапии и/или курсы терапии системными ГКС, когда результаты микробиологического исследования скорее всего будут малоинформативны.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Цветкова O.A., Колосова К.Ю. Роль бактериальной инфекции в развитии обострений и прогрессировании хронической обструктивной болезни легких // Уральский медицинский журнал. - 2007. - №8(36) - с. 21-29.

2. Kolosova К, Tsvetkova О, Ilina Е, Atroshkina М. The role of bacterial pathogens in exacerbation of COPD assessed by microbiological method and polymerase chain reaction // European Respiratory Journal. - 2008. - V.32. - Suppl.52. - p.2750.

3. Колосова К.Ю. Бактериальное обострение хронической обструктивной болезни легких: место молекулярно-генетического метода идентификации возбудителей // Научно-практическая конференция «Аспирантские и докторантские чтения: дерзания нового времени - поиск инноваций». Сборник Материалов конференции. - М.: Издательство Первого МГМУ им. И.М. Сеченова -2012.-с. 90-91.

Подписано в печать: 16.05.2012 Объем: 1,0 п.л Тираж: 100 экз. Заказ № 153 Отпечатано в типографии «Реглет» 119526, г. Москва, Страстной бульвар, д. 6, стр. 1 (495) 978-43-34; www.reglet.ru