Автореферат и диссертация по медицине (14.00.11) на тему:Ассоциация эпителиальных опухолей кожи с вирусами папилломы человека

На правах рукописи

КЛАДОВА Анна Юрьевна

АССОЦИАЦИЯ ЭПИТЕЛИАЛЬНЫХ ОПУХОЛЕЙ КОЖИ С ВИРУСАМИ ПАПИЛЛОМЫ ЧЕЛОВЕКА.

14.00 11.- кожные и венерические болезни

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

иизоБ167Б

Москва-2007

003061676

Работа выполнена в ГОУ ВПО Московской медицинской академии имени И М Сеченова и на базе Центра молекулярной диагностики ФГУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора, Москва

доктор медицинских наук, профессор Молочков Владимир Алексеевич доктор биологических наук, профессор Киселев Всеволод Иванович

доктор медицинских наук, профессор Халдин Алексей Анатольевич доктор медицинских наук, профессор Сергеев Юрий Валентинович ВЕДУЩАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ: Московский Государственный Медико-Стоматологический Университет (МГМСУ)

Защита диссертации состоится » 2007 г в_

часов на заседании диссертационного Совета Д 208.040.10 при Московской медицинской академии имени И.М Сеченова по адресу 119991, г. Москва, ул Трубецкая, д 8, стр.2

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ММА имени И М Сеченова по адресу. 117998, г Москва, Нахимовский проспект, д 49

Автореферат разослан 2007 г

НАУЧНЫЕ РУКОВОДИТЕЛИ

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор медицинских наук, профессор

Эрдес Светлана Ильинична

Актуальность проблемы.

Эпителиальные опухоли кожи (ЭОК) - одна из самых распространенных групп опухолей человека, отличающаяся значительным разнообразием Отмечаемый в последние годы неуклонный рост заболеваемости ЭОК некоторые авторы называют «бесшумной эпидемией» [Holme S et al, 2000, Nguen T et al 2002] Этиология и патогенез ЭОК изучены не достаточно Вместе с тем, исследования в данном направлении представляют значительный интерес с точки зрения оптимизации лечения и профилактики этих опухолей [Сергеев ЮВ и соавт, 1999, Снарская Б С ,

2004, Галил-Оглы Г А и соавт, 2005, Мол очков В А и соавт, 2006, Kaplan В et al, 2000, Ariette J et al, 2004]

К факторам, способствующим развитию ЭОК, относят длительную инсоляцию, химические канцерогены, а также ионизирующее излучение [Tolbert Р et al, 1997, Armstrong В et al, 2001] Определенную роль отводят наследственным и иммунологическим нарушениям [Молочков В А, 1993, Снарская ЕС, 2004, Галил-Оглы ГА и соавт, 2005, Grossman D et al, 1997] В последние годы благодаря достижениям в области молекулярной биологии сложились предпосылки для изучения новых аспектов этиологии и патогенеза ЭОК В частности, предпринимаются попытки определить роль вируса папилломы человека (ВПЧ) в развитии отдельных вариантов ЭОК -кератоакантомы, себорейного кератоза, актинического кератоза, болезни Боуэна, базальноклеточного и плоскоклеточного рака кожи [Shamamn V et al, 1996, Berkhout R et al, 2000, Harwood A. et al, 2000, Weissenborn S et al,

2005, de Vffliers E , 2004]

Число больных, страдающих заболеваниями, ассоциированными с ВПЧ, продолжает непрерывно увеличиваться [Киселев В И, 2004, Дмитриев Г А,

2006, zur Hausen H et ai, 1996] В настоящее время известно около 200 генотипов вирусов папилломы, инфицирующих эпителий слизистых оболочек (род alpha) и кожи (род beta, gamma, mu и nu) [de Villiers E, 2004] Опасность ВПЧ-инфекции заключается в высокой онкогенности отдельных

разновидностей вируса [Киселев В И, 2004, zur Hausen Н et al, 2001] Так, ВПЧ-16 и ВПЧ-18, относящиеся к роду alpha, признаны основными этиологическими агентами рака шейки матки и других раков аногенитальной области [ВОЗ, 2004] Эпидемиологические и молекулярно-биологические данные позволяют предполагать, что кожные типы ВПЧ рода beta могут обуславливать формирование ряда ЭОК, однако данная взаимосвязь в настоящее время не достаточно изучена [Orth G., 2004, Pfister Н, 2005] Частота выявления ВПЧ рода beta в различных ЭОК существенно варьирует [Shamanm V et al, 1996, Harwood С et al, 2000, Iftner A et al, 2003, Forslund О et al, 2003] Это обусловлено разнообразием используемых с этой целью лабораторных методов менее чувствительные - способны обнаруживать вирус только при его высокой концентрации, более чувствительные - даже единичные копии вируса в пробе [Meyer Т et al, 2000] Кроме того, предполагают, что ассоциация ВПЧ-инфекции с ЭОК может иметь региональные особенности, различаясь у жителей Восточной Европы, Центральной Европы и Америки [zur Hausen Р. et al, 2005] В России подобные исследования не проводились.

В последнее время становится очевидным, что обнаружение ВПЧ в ЭОК не может являться прямым доказательством этиологической роли вируса в развитии данных состояний Присутствие ВПЧ в патологически измененном эпителии кожи может быть следствием как активной вирусной инфекции, так и бессимптомной персистенции, характерной для условно-патогенных инфекционных агентов В связи с этим, помимо выявления ВПЧ, необходимо проводить измерение вирусной нагрузки (количество геномов ВПЧ в эпителиальных клетках) [Smjders Р., 2003; Stoler М, 2006] Определение вирусной нагрузки является сравнительно новым подходом в генодиагностике, уже продемонстрировавшим высокую значимость в мониторинге течения и прогрессирования генитальной (слизистой) ВПЧ -инфекции [Smjders Р et al, 2003, Stoler М, 2006] В настоящее время не вызывает сомнений необходимость проведения количественного анализа

вирусных геномов в коже Это позволит более объективно судить о состоянии ВПЧ в опухолях кожи, а, следовательно, глубже понимать механизмы, связывающие ЭОК и ВПЧ [Smjders Р, 2003, Harwood С et al, 2004, zur Hausen P et al, 2005, Weissenborn S et al, 2005]

Наиболее интересной нозологической формой для изучения связи вирусной нагрузки ВПЧ с динамикой клинического течения опухолевого процесса является кератоакантома Известно, что эта опухоль быстро проходит стадию роста и стабилизации, а затем спонтанно самоизлечивается с формированием выраженного иммунного ответа на антигены опухоли [Беренбейн и др, 1980, Молочков В А и др, 2003; Schwartz et al, 1994] Однако в «атипичных» случаях кератоакантома персистирует и даже подвергается злокачественному перерождению [Молочков В А и др , 2003, Shwartz R et al, 1994] Клинические особенности течения кератоакантомы представляют удобную модель для изучения вирус - индуцированного канцерогенеза в коже.

С учетом вышеизложенного, изучение ассоциации ВПЧ с различными формами ЭОК (доброкачественными, предраковыми и злокачественными) на основе количественного определения ДНК ВПЧ, является актуальной задачей дерматоонкологии, решение которой будет способствовать дальнейшему пониманию взаимосвязей ЭОК и ВПЧ

Цель исследования: изучить ассоциацию эпителиальных опухолей кожи с вирусами папилломы человека Задачи исследования:

1 Разработать методику выявления и количественного определения ДНК ВПЧ в коже

2 Оценить выявляемость ДНК ВПЧ в эпителиальных опухолях кожи

3 Определить вирусную нагрузку ВПЧ в эпителиальных опухолях кожи

4 На примере кератоакантом изучить изменение вирусной нагрузки ВПЧ в зависимости от динамики клинического течения опухолевого процесса

Научная новизна.

Впервые разработана количественная методика обнаружения кожных типов ВПЧ рода beta с использованием полимеразной цепной реакции (ПНР) «в режиме реального времени»

На основе количественного анализа впервые детально изучена ассоциация доброкачественных (себорейный кератоз, кератоакантома), предраковых (актинический кератоз, болезнь Боуэна) и злокачественных (базальноклеточный рак, плоскоклеточный рак) ЭОК с ВПЧ рода beta

На примере кератоакантом продемонстрировано изменение вирусной нагрузки ВПЧ в зависимости от динамики клинического течения опухолевого процесса Положения, выносимые на защиту:

1 Доброкачественные (себорейный кератоз, кератоакантома) предраковые (актинический кератоз, болезнь Боуэна) и злокачественные (базальноклеточный рак, плоскоклеточный рак) ЭОК не менее, чем в 70% случаев ассоциированы с инфекцией ВПЧ рода beta

2. Концентрация ДНК ВПЧ рода beta у больных ВПЧ-ассоциированными ЭОК достоверно превосходит таковую у бессимптомных носителей ВПЧ (контрольная группа)

3 Динамика вирусной нагрузки ВПЧ может описывать клиническое течение ЭОК, что продемонстрировано на примере кератоакантом Внедрение в практику.

Результаты работы используются в лечебном и учебном процессе на кафедре кожных и венерических болезней ФППОВ ММА им И М Сеченова, кафедре дерматовенерологии и дерматоонкологии ФУВ МОНИКИ им М Ф Владимирского, а также на базе Центра молекулярной диагностики ФГУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора, Москва

Апробация работы.

Материалы диссертации доложены и обсуждены на заседании Московского областного общества дерматовенерологов, Москва, 2005г, 2007г, на научно-практической конференции «Пролиферативные заболевания кожи», Москва 25-26 апреля 2006 г, 23rd INTERNATIONAL PAPILLOMAVIRUS CONFERENCE & CLINICAL WORKSHOP 2006 Prague, September 1-7 2006г, на международной научно-практической конференции «Геномные технологии в медицине и медицинское образование на рубеже веков», Алмата 19-20 мая 2006 г, на научно-практической конференции «Социально-значимые заболевания в дерматовенерологии», Москва 29-30 сентября 2006 г, на научно-практической конференции «Современная диагностика и лечение урогенитального хламидиоза», Москва 26-27 апреля 2007 г

Публикации.

По теме диссертации опубликовано 12 печатных работ

Структура диссертации.

Диссертация изложена на 119 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, результатов, выводов и библиографического указателя Указатель литературы включает 29 отечественных и 179 зарубежных работ Работа иллюстрирована 3 фотографиями, 10 рисунками и 16 таблицами

Содержание работы. Материалы и методы.

Общая характеристика исследуемой группы больных.

Группа лиц, вошедших в исследование, была сформирована в соответствии с данными мировой научной литературы, согласно которым ВПЧ рода beta ассоциирован с отдельными вариантами доброкачественных (бородавка, себорейный кератоз, кератоакантома), предраковых (актинический кератоз, болезнь Боуэна) и злокачественных

(плоскоклеточный рак, базальноклеточный рак) ЭОК [8Ьаташп V е1а1 1996, Натоооё С е1а1,2000, Богеме! О й а1,2003, ёе УШюг Е -М. е1 а1,1999]

В настоящее исследование включены 135 больных с доброкачественными, предраковыми и злокачественными новообразованиями кожи, в том числе 10 больных себорейным кератозом (СК), 21 - кератоакантомой (КА), 15 -актиническим кератозом (АК), 5 - болезнью Боуэна (ББ), 74 -базальноклеточным раком (БКР) кожи и 10 - плоскоклеточным раком (ПКР) кожи (табл 1)

Таблица 1.

Распределение больных по нозологиям.

Группа новообразований Нозологическая форма Количество больных Количество исследованных опухолевых очагов

Доброкачественные опухоли кожи Себорейный кератоз 10 16

Кератоакантома 21 21

Предраковые состояния Актинический кератоз 15 15

Болезнь Боуэна 5 5

Злокачественные опухоли кожи Базальноклеточный рак 74 82

Плоскоклеточный рак 10 10

Всего 135 149

Из 135 больных 87 пациентов имели единичные (солитарные) очаги поражения, 49 - множественные Среди них было 69 мужчин и 66 женщин в возрасте от 33 до 79 лет Во всех группах больных преобладали лица пожилого возраста средний возраст при БКР составил 65,2 ± 10,4 года, при ПКР - 69,4 ± 6,9 года, при АК 66,5 ± 12,5 года, при ББ - 60 ± 10,7 года, при КА - 67 ± 10,2 года, при СК - 63,6 ± 11,7 года

В каждом случае диагноз устанавливался впервые и основывался на данных анамнеза, клинической картины, гистологического и/или цитологического исследования Гистологическое подтверждение диагноза было получено у всех пациентов с КА, СК, АК, ББ, ПКР, а также в 63 случаях БКР кожи

Цитологическое исследование проводилось 15 больным БКР кожи при локализации новообразований в местах, труднодоступных для проведения биопсии

Всем пациентам проводили комплексное обследование, включавшее общий анализ крови и мочи, биохимические анализы плазмы крови, ЭКГ, при необходимости - рентгеноскопию органов грудной клетки, УЗИ внутренних органов и др Критерием исключения из исследования были состояния, сопровождающиеся выраженной иммуносупрессией онкологические заболевания внутренних органов и крови, тяжелые системные заболевания, инфекционный гепатит В и С, ВИЧ-инфекция, состояния после трансплантации внутренних органов

Контрольная группа была представлена 49 добровольцами 21 мужчина и 28 женщин в возрасте от 29 до 78 лет (средний возраст 58 ± 14,5 года), у которых кожные заболевания, в том числе ассоциированные с кожными типами ВПЧ, отсутствовали

Взятие и первичная обработка исследуемого материала.

Материалом для молекулярно-биологического исследования служили биоптаты кожи размером 0,2x0,2см, полученные с помощью малоинвазивной модификации взятия биопсии бритвенным способом, или суспензия клеток, полученная методом соскоба Соскоб использовался только для взятия материала из зон новообразований, где имелись нарушения сцепления между клетками, и скарификация обеспечивала получение достаточного количества клеточной массы

Исследуемый материал помещали в отдельные пробирки, содержащие 1 мл транспортной среды (РВБ буфер, ФГУН ЦНИИЭ Роспотребнадзора, Москва) Для максимального сохранения количества клеточной и вирусной ДНК пробирки замораживали сразу после взятия материала и хранили до проведения ПЦР - анализа при -70° С

Генодиагностика ВПЧ-инфекции.

Подготовку исследуемого материала осуществлялась методом обработки ткани протеиназой К с последующим выделением ДНК методом аффинной сорбции на силикагеле с использованием набора для выделения «ДНК-сорб-С» согласно инструкции производителя (ФГУН ЦНИИЭ Роспотребнадзора) Экстракция ДНК проводили в 100 мкл ТЕ-буфера. Образцы, содержащие очищенную ДНК, использовали в реакции амплификации нуклеиновых кислот

Для разработки методики количественного определения ВПЧ рода beta, а так же оценки ее чувствительности и специфичности, использовали рекомбинантные плазмидные положительные контроли, содержащие последовательность полных геномов ВПЧ кожных типов рода alpha, gamma, mu, nu и beta - 1, 3,4, 5, 7, 8,15,20,24,27, 37, 38,49, 50, 65 (M Favre Institut Pasteur,Unite Postulante Genetique, Papillomavirus et Cancer Humain, France, E -M de Villiers, Abteilung tumorviras-Charaktensierung Referenzzenturum for Humanpathogene Papillomviren, Germany), а также контрольные плазмиды фрагмента ß-глобинового гена человека (ФГУН ЦНИИЭ Роспотребнадзора)

Для выявления ДНК ВПЧ рода beta (5 видов) были разработаны четыре системы олигонуклеотидов (группоспецифических праймеров и зондов)

1-я - для выявления вида beta 1 (5, 8,12, 14,21,19,25,47, 36 типы),

2-я - для выявления вида beta 2 (9,15,17,22,23, 38,37, 80 типы),

3-я - для выявления вида beta 3 (49, 75, 76 типы),

4-я - для выявления вида beta 4 (92), beta 5 (96), beta 1 (20,24 и 93 типы)

Последовательности всех олигонуклеотидов ВПЧ рода beta были выбраны

при анализе известных последовательностей ВПЧ, взятых из Интернет ресурса "NCBI GeneBank" (http7/www nebí nlm nih gov) и обработаны при помощи программы AlignX пакета Vector NTI6 (InforMax Inc, 2000)

Во все четыре системы введены олигонуклеотиды для выявления и количественного определения ДНК человека (по ß-глобиновому гену

человека), что позволяло проводить оценку адекватности забора, хранения и обработки образцов (принцип внутреннего контроля)

ПЦР проводили в мультиплексном формате. Каждая пробирка содержала одну из групп олигонуклеотидов для выявления ВПЧ, а также олигонуклеотиды для выявления (3-глобинового гена человека

В состав реакционных смесей для ПЦР входили следующие компоненты праймеры и зонды, нуклеотиды в концентрации 0,2 мМ каждого, ПЦР-буфер (66мМ Тт-НС1, РН 8,8, 17 мМ^НО^О,,, 4 мМ 0,01% Tween 20),

TaqF-ДffiC-пoлимepaзa (2И в реакцию) (ФГУН ЦНИИЭ Роспотребнадзора, Москва), очищенная ДНК, выделенная из клинического материала -10 мкл

В отдельные пробирки (вместо образца ДНК) вносили положительные и отрицательные контрольные образцы (10 мкл) Отрицательный контроль амплификации - представлял обычную реакционную смесь, в которую вместо образца ДНК добавлялся ТЕ-буфер Положительный контроль амплификации - представлял собой фрагмент специфичной ДНК (контрольные плазмиды ВПЧ в концентрации 104 копий ДНК ВПЧ/мл)

Термоциклирование проводили на амплификаторе МхЗОООР (81га1а£епе,США), соединенным с персональным компьютером по следующей программе предварительный этап 95 °С - 15 мин, затем при 95°С - 15 сек , при 60 °С - 30 сек , при 65 °С - 1 мин - 50 циклов

Детекция продуктов амплификации осуществлялась в «реальном времени» путем измерения флуоресцентного сигнала, нарастающего по мере накопления специфического продукта реакции Получаемая зависимость интенсивности флуоресценции от цикла реакции - кривая флуоресценции -имела в случае положительной реакции характерный Б-образный вид В соответствии с этим проводили качественную оценку результатов реакции

Для количественного анализа использовали 10-кратные разведения (6 ^ -1 положительных плазмидных контролей 5, 8, 15, 37, 38, 20, 24,49 типов ВПЧ и ДНК человека (стандарты), по которым осуществляли построение калибровочных прямых и расчет концентрации ВПЧ и ДНК человека

Для построения и математической обработки описанных кривых использовали программу построения, обработки, анализа кривых флуоресценции и ведения документации для метода ПЦР «в реальном времени» - МхЗОООР (Stratagene, США) Расчет нормализованной вирусной нагрузки.

Метод ПЦР в «режиме реального времени», положенный в основу разработки методики количественного выявления ВПЧ рода beta, позволял определять абсолютное количество геномов ВПЧ и ДНК человека в пробе С учетом того, что при взятии клинического материала из очагов ЭОК и нормальной кожи количество эпителиальных клеток (а соответственно и копий вируса), попадающих в образец, существенно варьировало, нами была предложена методика нормирования количества вируса на количество клеток человека Это позволяло получать надежные и достоверные данные о вирусной нагрузке ВПЧ в клетках кожи

Расчет нормализованной вирусной нагрузки (ВН) производился по формуле

ВН = lg ((Кол-во ДНК ВПЧ / Кол-во ДНК чел ) * 103)

Статистическая обработка данных. Достоверность различия частот определяли при помощи критерия «хи-квадрат» Доверительные границы к частотам рассчитывали на основании биномиального распределения Для анализа вирусных нагрузок рассчитывали десятичный логарифм количества вирусов, анализ его связи с другими переменными проводили с использованием метода параметрической статистики достоверность различий средних по группам вычисляли с помощью дисперсионного анализа, а доверительные границы к среднему - на основе распределения Стьюдента

Результаты и обсуждение. Оценка аналитических характеристик разработанной методики выявления и количественного определения ВПЧ рода beta.

Аналитическая специфичность методики оценивалась на высококонцентрированных (108 копий ДНК/мл) образцах контрольной ДНК ВПЧ кожных типов (род beta, gamma, mu, nu: 1, 3, 4, 7, 50, 65, 5, 7, 8, 15, 20, 24, 37, 38, 49 типы), ДНК ВПЧ слизистых типов (род alpha 16,18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 68, 73, 82 типы), ДНК, полученную из культур бактерий, потенциально колонизирующих кожные покровы и слизистые оболочки S aureus, S pyogenus, Ps aeroginosa, E coli, U urealiticum, С trachomatis, G vaginalis, T vaginalis, ДНК человека В результате проведенных исследований перекрестных реакций не обнаружено Положительный сигнал был получен в присутствии ДНК ВПЧ кожных типов рода beta

Аналитическая чувствительность оценивалась с использованием 10-кратных разведений контрольной панели 5, 7, 8, 15, 20, 24, 37, 38, 49 типов ВПЧ рода beta После определения последнего проходящего разведения осуществлялисерию 2-кратных разведений из этой точки Далее определялось последнее стопроцентное проходящее разведение (6 точек из 6), которое расценивали как порог аналитической чувствительности

Аналитическая чувствительность разработанной методики позволяла выявлять генотипы вида beta 1 (смесь А) - 1250 копий ДНК ВПЧ/мл, вида beta 2 (смесь В) - 1 ООО копий ДНК ВПЧ/мл, вида beta 3 (смесь С) - 450 копий ДНК ВПЧ/мл, вида beta 4,5 (смесь D) - 300 копий ДНК ВПЧ/мл

Для разработанных систем олигонуклеотидов выявления ДНК ВПЧ рода beta было проведено исследование линейной зависимости между десятичным логарифмом концентрации исходной ДНК-матрицы в образце (lgC) и циклом начала флуоресценции (пороговым циклом, Ct) Такая зависимость лежит в основе проведения количественных измерений в ПЦР «в реальном времени» (рис 1)

Рисунок 1.

Корреляция логарифма концентрации ДНК ВПЧ и порогового цикла (С^) в разработанных системах олигонуклеотидов.

Смесь А Смесь В

40 35 30 25 20 15 10 $ &--, 40 35 30 25 20 6 & — - " " - -1

^ |

Я2 0,9976 | Й' = 0.9988

I

1гС 1

123466789 12345676

Смесь С Смесь £>

3$ 30 25 го 15 10 5 Г&------ т Г 3$ ■& го 15 10 5 а " — " ~~

к' * О.ЭЙВв й3 = 0,9891

--

"Ч

1§С кс

122456786 1 2 3 4 5 6 7 6

Из рисунка видно, что данные зависимости имели линейный характер в диапазоне для смеси А - от 2,5*103 (3,4 до 109 (9 копий/мл, для смеси В -от 5*102 (2,7 до 2* 107 (7,3 копий/мл , для смеси С - от 7* 102 (2,8до 107 (7 копий/мл , для смеси В - от 5*102 (2,7 до 2*107 (7,3 1§) копий/мл Коэффициент корреляции (К2) во всех случаях составил >0,99

Выявление кожных видов ВПЧ рода beta у больных эпителиальными опухолями кожи.

Выявление и определение вирусной нагрузки кожных видов ВПЧ рода beta у больных ЭОК проводили в два этапа Первоначально все образцы кожи больных ЭОК и контрольной группы были протестированы на присутствие ДНК ВПЧ рода beta (табл 2).

Таблица 2.

Выявляемость ДНК ВПЧ рода beta в эпителиальных опухолях и

образцах нормальной кожи.

Исследуемые образцы Кол-во образцов Образцы ВПЧ- Образцы ВПЧ +

абс. % абс %

Себорейный кератоз 16 4 25,0 12 75,0

Кератоакантома 21 5 23,8 16 76,2

Актинический кератоз 15 1 6,7 14 93,3

Болезнь Боуэна 5 1 20,0 4 80,0

Базальноклеточный рак 82 15 18,3 67 81,7

Плоскоклеточный рак 10 3 30,0 7 70,0

Нормальная кожа 49 26 53,1 23 46,9

Как видно из табл 2, злокачественные (ПКР, БКР), а также предраковые (АК, ББ) и доброкачественные (СК, КА) опухоли кожи в высоком проценте случаев были ассоциированы с ВПЧ последовательности ДНК ВПЧ рода beta выявляли в 75% случаев СК, 76,2% - КА, 93,3% - АК, 80% - ББ, 81,7% - БКР, 70% - ПКР Наряду с этим, ВПЧ beta рода обнаруживали в биоптатах нормальной кожи здоровых доноров в 46,9%

Известно, что потенциальный риск персистенции и прогрессии ВПЧ-инфекции зависит от типа и/или вида ВПЧ, а также от совместной инфицированности клеток эпителия генотипами одного или нескольких видов ВПЧ [Muñoz N et al, 2004] С учетом этого мы проанализировали

данные о частоте обнаружения различных видов ВПЧ рода beta, а также данные о частоте их ассоциаций в образцах ЭОК и нормальной коже

Было установлено, что как в ЭОК, так и нормальной коже выявлялся широкий спектр ВПЧ рода beta, представленный beta 1, beta 2, beta 3, beta 4 и beta 5 видами В образцах доброкачественных ЭОК (СК и КА), а также в нормальной коже различные виды ВПЧ встречались приблизительно с одинаковой частотой В образцах предраковых (АК) и злокачественных ЭОК (БКР и ПКР) beta 1 и beta 2 виды встречались в 1,5-2 раза чаще, чем beta 3, 4, 5 виды (р<0,035) (табл 3)

Таблица 3.

Сравнительная частота обнаружения различных видов ВПЧ рода beta в

эпителиальных опухолях и нормальной коже.

Исследуемые образцы Кол-во ВПЧ+ образцов Виды ВПЧ

beta 1* (%) beta 2* (%) beta 3* (%) beta 4,5* (%)

Себорейный кератоз (п=16) 12 6 (50,0) 7 (58,3) 5(41,6) 6 (50,0)

Кератоакантома (п=21) 16 10 (62,5) 11 (68,7) 8 (50,0) 9 (56,2)

Актинический кератоз (п=15) 14 12 (85,7) 14(100) 7 (50,0) 5 (35,7)

Базальноклеточный рак (п=82) 67 50(74,6) 51 (76,1) 24 (35,8) 11(16,4)

Плоскоклеточный рак (п=10) 7 6(85,7) 5 (71,4) 2 (28,5) 1 (14,2)

Нормальная кожа (п=49) 23 8 (34,8) 11 (47,8) 6(26,1) 11 (47,8)

*в том числе в ассоциация с другими видами

В подавляющем большинстве случаев всех ЭОК (66,6% - 100%) отмечалась ассоциация двух и более видов ВПЧ рода beta Напротив, при изучении образцов здоровой кожи лиц контрольной группы наибольший процент наблюдений (78,3%) составили случаи инфицирования только одним видом ВПЧ рода beta (р<0,01) (табл 4)

Таблица 4.

Встречаемость одного или нескольких видов ВИЧ рода beta в эпителиальных опухолях и нормальной коже.

Исследуемые образцы Кол-во ВПЧ+ образцов Один вид ВПЧ в образце 2 и более видов ВПЧ в образце

абс % абс %

Себорейный кератоз 12 4 33,3 8 66,6

Кератоакантома 16 4 25,0 12 75,0

Болезнь Боуэна 4 - - 4 100

Актинический кератоз 14 - - 14 100

Базальноклеточный рак 67 21 31,4 46 68,6

Плоскоклеточный рак 7 - - 7 100

Нормальная кожа 23 17 78,3 5 21,7

Результаты, полученные при использовании разработанной нами методики по выявлению ДНК ВПЧ рода beta в опухолях и нормальной коже, преобладании в предраковых и злокачественных ЭОК beta 1 и beta 2 видов, а также преимущественном инфицировании ЭОК несколькими видами ВПЧ, не противоречили данным зарубежных исследователей, использовавшим для обнаружения ВПЧ в коже высокочувствительные и высокоспецифичные неколичественные методы ПЦР-анализа [Berchout J et al, 1995, de Villiers E -M et al, 1999, Boxman I et al, 2000, Forslund О et al, 2003] Это позволило использовать полученные данные на следующем этапе исследования при изучении вирусной нагрузки в ВПЧ-ассоциированных ЭОК Определение вирусной нагрузки ВПЧ у больных эпителиальными опухолями кожи.

Широкое распространение ВПЧ как в ЭОК, так и нормальной коже, продемонстрированное в работах зарубежных авторов [Berchout J et al, 1995, de Villiers E 1999, Astori G et al, 1998, Atonsoon A et al, 2000, Boxman I et al, 2000, Forslund О et al, 2003] и подтвержденное нами, не позволяло категорически утверждать о непосредственном участии ВПЧ в

формировании опухолевых заболеваний кожи В связи с этим, на следующем этапе исследования был проведен количественный анализ, включающий определение вирусной нагрузки в ВПЧ - положительных образцах ЭОК и нормальной коже и нормирование количества ДНК ВПЧ на количество геномов человека

В результате проведенного количественного анализа было установлено, что средние показатели вирусной нагрузки ВПЧ рода beta во всех ВПЧ-положительных ЭОК превышали средние показатели вирусной нагрузки ВПЧ в нормальной коже (1,4 ± 0,6 lg/Ю5 клеток человека), причем при СК (3,0 ± 0,7 lg/Ю5 клеток человека), КА (3,2 ± 1,6 lg/Ю5 клеток человека), АК (4,5± 1,2 lg/Ю5 клеток человека) и БКР (2,08 ±1,4 lg/Ю5 клеток человека) различия имели достоверный характер (рис 2)

Рисунок 2.

Вирусная нагрузка (Ig ДНК BIM/105 клеток человека) в эпителиальных опухолях и нормальной коже.

lg ДНК ВПЧ/105 ___клеток

гЬ 1,43

3,21'

3,03'

4,54"

2,09*

2,19

нормальная кожа кератоакантома себорейная

кератома

*- р < 0,05 ** - р < 0,0001

акгиническии кератоз

БКР

ПКР

Таким образом, количественный анализ, примененный нами, продемонстрировал, что вирусная нагрузка в большинстве ЭОК достоверно

превышала этот показатель в нормальной коже. Увеличение вирусной нагрузки в образцах ЭОК по сравнению с нормальной кожей указывает на активацию ВПЧ и может свидетельствовать о важной роли вируса в этиологии и/или патогенезе опухолей кожи

С учетом полученных данных, количественное измерение вирусной ДНК может рассматриваться как предпочтительный метод для изучения связи ВПЧ с развитием, течением или прогрессированием опухолей кожи Анализ вирусной нагрузки ВПЧ с учетом клинического течения опухолевого процесса на примере кератоакантом.

С целью более детального изучения патогенетической роли ВПЧ при ЭОК была проанализирована динамика вирусной нагрузки ВПЧ в образцах КА с учетом цикличности ее течения Было установлено, что в фазу роста КА, т.е в период наиболее интенсивного деления клеток, средняя вирусная нагрузка ВПЧ составила 3,1 ± 1,6 1§./105 клеток человека В фазу стабилизации - 3,9 ± 1,6 ^/105 клеток человека В фазу регресса средняя вирусная нагрузка ВПЧ уменьшилась до 1,6 ± 1,5 ^/105 клеток человека Причем у 5 (71,4%) больных КА, обследованных на стадии регресса опухоли, ДНК ВПЧ вообще не определялась, что могло свидетельствовать о снижении концентрации вируса ниже предела чувствительности метода или же о его полной элиминации (табл 5)

Таблица 5.

Вирусная нагрузка (1^» ДНК ВПЧ/105 клеток человека) в различных

фазах развития кератоакантом.

Фаза развития кератоакантом Кол-во обследованных больных Образцы ВПЧ + Вирусная нагрузка (1^ ДНК ВПЧ/105 клеток)

Рост 6 6(100%) 3,1 ±1,6

Стабилизация 8 8 (100%) 3,9 ± 1,6

Регресс 7 2 (28,6%) 1,6 ± 1,5

Всего 21 16 (76,2%)

Таким образом, концентрации ДНК ВПЧ, измеряемая в различных фазах эволюции КА, менялась в зависимости от стадии опухолевого процесса возрастала в фазу роста и стабилизации и уменьшалась более чем в 20 раз в фазу регресса опухоли Следовательно, динамика вирусной нагрузки ВПЧ отражает этапы клинического течения КА, что, в свою очередь косвенно подтверждает участие ВПЧ в развитии и/или течении КА.

В заключении необходимо подчеркнуть, что, несмотря на многочисленные данные, полученные зарубежными авторами и подтвержденные собственными исследованиями о частом обнаружении ДНК ВПЧ рода beta в различных ЭОК, роль ВПЧ в развитии кожных опухолей остается не ясной В последнее время стало очевидным, что обнаружение ДНК ВПЧ в ЭОК не может являться достаточным доказательством этиологической или патогенетической роли вируса Присутствие ВПЧ в патологически измененном эпителии может быть следствием, как активной вирусной инфекции (при этом количество вирусных частиц должно быть довольно велико и сравнимо с количеством клеток человека), так и бессимптомной персистенции (вирус может определяться в единичных копиях) В связи с этим, необходимо проводить количественный анализ геномов ВПЧ, более точно характеризующий состояние вируса в клетках кожи С учетом современных требований к генодиагностике папилломавирусной инфекции, нами была разработана высокочувствительная и высокоспецифичная методика выявления и количественного определения 5 видов ВПЧ рода beta на основе ПЦР в «режиме реального времени» Было установлено, что доброкачественные (СК, КА), предраковые (АК, ББ) и злокачественные (БКР, ПКР) ЭОК не менее чем в 70% случаев ассоциированы с двумя и более видами ВПЧ рода beta Причем в предраковых (АК) и злокачественных (БКР, ПКР) ЭОК преобладают betal и beta 2 виды ВПЧ рода beta Количественные измерения показали достоверное повышение вирусной нагрузки в ЭОК по сравнению с

нормальной кожей, что позволяет сделать вывод об активации ВПЧ в ЭОК и предполагать важную роль вируса в этиологии и/или патогенезе опухолей кожи. На примере КА продемонстрирована связь вирусной нагрузки с этапами клинического течения опухолевого процесса, что подтверждает патогенетическую роль ВПЧ в развитие ЭОК Дальнейшие исследования в этом направлении, представляющие несомненный интерес для специалистов разных областей медицины, будут способствовать совершенствованию методов лечения и профилактики ЭОК

ВЫВОДЫ

1 Выявление и определение вирусной нагрузки 5 видов ВПЧ рода beta в коже можно проводить с помощью разработанной количественной методики на основе ПНР в «режиме реального времени»

2 С помощью ПЦР в «режиме реального времени» ассоциация ЭОК с ДНК ВПЧ рода beta была выявлена в 75% случаев себорейного кератоза, 76,2% -кератоакантом, 93,3% - актинического кератоза, 80% - болезни Боуэна, 81,7% - базальноклеточного рака кожи и 70% - плоскоклеточного рака кожи В нормальной коже здоровых людей ДНК ВПЧ рода beta обнаруживался в 46,9% случаев

3. В образцах предраковых (актинический кератоз) и злокачественных (базальноклеточный и плоскоклеточный рак кожи) ЭОК папилломавирусы beta 1 и beta 2 видов встречались в 1,5-2 раза чаще, чем представители beta 3,

4, 5 видов В 66,6% ЭОК отмечалась ассоциация 2 и более видов ВПЧ рода beta

4 В ходе количественного анализа было установлено, что вирусная нагрузка ВПЧ во всех ЭОК превышала вирусную нагрузку ВПЧ в нормальной коже (1,4 ± 0,6 lg/ 105 клеток), причем при себорейном кератозе (3,0 ± 0,7 lg/ 105 клеток), кератоакантоме (3,2 ± 1,6 lg/ 105 клеток), актиническом кератозе (4,5± 1,2 lg/ 105 клеток) и базальноклеточном раке кожи (2,08 ± 1,4 lg/ 105 клеток) различия имели достоверный характер

5 На примере кератоакантом продемонстрирована связь вирусной нагрузки ВПЧ с динамикой клинического течения опухолевого процесса в фазу роста кератоакантом вирусная нагрузка составила 3,1 ± 1,6 %/105 клеток, в фазу стабилизации - 3,9 ± 1,6 1^105 клеток, в фазу регресса - 1,6 ± 1,5 1^105 клеток

Список работ, опубликованных по теме диссертации.

1. Кладова А.Ю , Хлебникова А.Н Козлова Е С К проблеме патогенеза и лечения базалиомы кожи// V научно-практическая конференция «Социально значимые заболевания в дерматовенерологии Диагностика, терапия, профилактика» -М, 2005 - С 58-59,

2 Куевда Д А, Кладова А Ю , Шипулина О Ю , Молочков В А Разработка методики количественного определения папилломавирусов рода Бета// VI научно-практическая конференция «Социально значимые заболевания в дерматовенерологии Диагностика, терапия, профилактика» - М - 2006 -С 97-98,

3 Кладова А Ю , Куевда Д.А., Молочков В А., Шипулина О Ю, Козлова Е С , Прокофьев А А Количественное определение вируса папилломы человека (ВПЧ) в эпителиальных образованиях и других пролиферативных заболеваниях кожи// VI научно-практическая конференция «Социально значимые заболевания в дерматовенерологии Диагностика,терапия,профилактика» -М-2006-С 74-75,

4 Кладова А Ю , Куевда Д А , Молочков В А , Шипулина О Ю , Киселев В И, Хлебникова А Н., Козлова Е С Встречаемость кожных типов вируса папиллом человека в патологиях кожи// Альманах клинической медицины - 2006 - Том IX - С 44-50,

5 Молочков В А, Кладова А Ю Базалиома на фоне невуса сальных желез// Российский журнал кожных и венерических болезней - 2006 - № 3 - С 10-12,

6 Кладова А Ю, Куевда Д А., Молочков В А, Шипулина О Ю Количественное определение папилломавирусов рода Бета новые возможности в оценке роли вирусов папилломы в патологиях кожи// Материалы международной научно-практической конференции «Геномные технологии в медицине и медицинское образование на рубеже веков» -Алмата -19-20 мая 2006г - С 129-135,

7 Kladova А, Kuevda D, Molochkov V, Pokrovskn V, Shipulma О, Kozlova E Human papillomavirus -DNA loads m skin pathologies and normal skin// Abstract in 23-d international papillomavirus conference and clinical workshop -Prague,2006 -P 185,

8 Kuevda D , Kladova A, Shipulma О, Molochkov V , Pokrovskn V Novel Real-time PCR based quantitative assay for detection of broad spectrum of Beta - human papillomaviruses// Abstract m 23-d international papillomavirus conference and clinical workshop - Prague, 2006 - P 285,

9 Кладова А Ю , Куевда Д A, Молочков В A, Кунцевич Ж С , Прокофьев А А К ассоциации кератоакантом с вирусом папилломы человека// Альманах клинической медицины - 2007, - Том IX - С 40-44,

10 Хлебникова А Н, Кладова А Ю , Кириченко Н А, Сарханн ВС К проблеме гигантских базалиом// Клиническая дерматология и венерология -2007 - №1 -С 9-12,

11 Козлова Е С Быков А С , Кладова А Ю , Куевда Д А. Изучение некоторых вирусо-бактериальных ассоциаций при псориазе// Альманах клинической медицины -2007 -Том XV - С 191-194;

12 Кладова А Ю , Куевда Д А, Молочков В А, Шипулина О Ю, Козлова Е С , Прокофьев А А Определение вирусов папилломы человека (ВПЧ) рода beta в патологиях и нормальной коже// Материалы IX съезда всероссийского научно-практического общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов - М - 2007 — С 47

Подписано в печать 20 06 2007 г Исполнено 21 Об 2007 Печать трафаретная

Заказ № 566 Тираж 100 экз

Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш, 36 (495)975-78-56 «пгт.аи1огеГега1 ги

Актуальность проблемы

Эпителиальные опухоли кожи (ЭОК) — одна из самых распространенных групп опухолей человека, отличающаяся значительным разнообразием. Отмечаемый в последние годы неуклонный рост заболеваемости ЭОК некоторые авторы называют «бесшумной эпидемией» [Holme S. et al., 2000; Nguen Т. et al. 2002]. Этиология и патогенез ЭОК изучены не достаточно. Вместе с тем, исследования в данном направлении представляют значительный интерес с точки зрения оптимизации лечения и профилактики этих опухолей. [Сергеев Ю.В. и соавт., 1999; Снарская Е.С., 2004; Галил-Оглы Г.А. и соавт., 2005; Молочков В.А. и соавт., 2006; Kaplan В. et al., 2000; Arlette J. et al., 2004].

К факторам, способствующим развитию ЭОК, относят длительную инсоляцию, химические канцерогены, а также ионизирующее излучение [Tolbert P. et al., 1997; Armstrong В. et al., 2001]. Определенную роль отводят наследственным и иммунологическим нарушениям [Молочков В.А., 1993; Снарская Е.С., 2004; Галил-Оглы Г.А. и соавт., 2005; Grossman D. et al., 1997]. В последние годы благодаря достижениям в области молекулярной биологии сложились предпосылки для изучения новых аспектов этиологии и патогенеза ЭОК. В частности, предпринимаются попытки определить роль вируса папилломы человека (ВПЧ) в развитии отдельных вариантов ЭОК — кератоакантомы, себорейного кератоза, актинического кератоза, болезни Боуэна, базальноклеточного и плоскоклеточного рака кожи [Shamanin V. et al., 1996; Berkhout R. et al., 2000; Harwood A. et al., 2000; Weissenborn S. et al., 2005; de Villiers E., 2004].

Число больных, страдающих заболеваниями, ассоциированными с ВПЧ, продолжает непрерывно увеличиваться [Киселев В.И., 2004; Дмитриев Г.А., 2006; zur Hausen Н. et al., 1996]. В настоящее время известно около 200 генотипов вирусов папилломы, инфицирующих эпителий слизистых оболочек (род alpha) и кожи (род beta, gamma, mu и nu) [de Villiers E., 2004]. Опасность ВПЧ-инфекции заключается в высокой онкогенности отдельных разновидностей вируса [Киселев В.И., 2004; zur Hausen Н. et al., 2001]. Так, ВПЧ-16 и ВПЧ-18, относящиеся к роду alpha, признаны основными этиологическими агентами рака шейки матки и других раков аногенитальной области [ВОЗ, 2004]. Эпидемиологические и молекулярно-биологические данные позволяют предполагать, что кожные типы ВПЧ рода beta могут обуславливать формирование ряда ЭОК, однако данная взаимосвязь в настоящее время не достаточно изучена [Orth G., 2004; Pfister Н., 2005]. Частота выявления ВПЧ рода beta в различных ЭОК существенно варьирует [Shamanin V. et al., 1996; Harwood С. et al., 2000; Iftner A. et al., 2003; Forslund O. et al., 2003]. Это обусловлено разнообразием используемых с этой целью лабораторных методов: менее чувствительные - способны обнаруживать вирус только при его высокой концентрации, более чувствительные - даже единичные копии вируса в пробе [Meyer Т. et al., 2000]. Кроме того, предполагают, что ассоциация ВПЧ-инфекции с ЭОК может иметь региональные особенности, различаясь у жителей Восточной Европы, Центральной Европы и Америки [zur Hausen P. et al., 2005]. В России подобные исследования не проводились.

В последнее время становится очевидным, что обнаружение ВПЧ в ЭОК не может являться прямым доказательством этиологической роли вируса в развитии данных состояний. Присутствие ВПЧ в патологически измененном эпителии кожи может быть следствием как активной вирусной инфекции, так и бессимптомной персистенции, характерной для условно-патогенных инфекционных агентов. В связи с этим, помимо выявления ВПЧ, необходимо проводить измерение вирусной нагрузки (количество геномов ВПЧ в эпителиальных клетках) [Snijders Р.; 2003; Stoler М., 2006]. Определение вирусной нагрузки является сравнительно новым подходом в генодиагностике, уже продемонстрировавшим высокую значимость в мониторинге течения и прогрессирования генитальной (слизистой) ВПЧ - инфекции [Snijders P. et al., 2003; Stoler М., 2006]. В настоящее время не вызывает сомнений необходимость проведения количественного анализа вирусных геномов в коже. Это позволит более объективно судить о состоянии ВПЧ в опухолях кожи, а, следовательно, глубже понимать механизмы, связывающие ЭОК и ВПЧ [Snijders Р., 2003; Harwood С. et al., 2004; zur Hausen P. et al., 2005; Weissenborn S. et al., 2005].

Наиболее интересной нозологической формой для изучения связи вирусной нагрузки ВПЧ с динамикой клинического течения опухолевого процесса является кератоакантома. Известно, что эта опухоль быстро проходит стадию роста и стабилизации, а затем спонтанно самоизлечивается с формированием выраженного иммунного ответа на антигены опухоли [Беренбейн и др., 1980; Молочков В.А. и др., 2003; Schwartz et al., 1994]. Однако в «атипичных» случаях кератоакантома персистирует и даже подвергается злокачественному перерождению [Молочков В.А. и др., 2003; Shwartz R. et al., 1994]. Клинические особенности течения кератоакантомы представляют удобную модель для изучения вирус - индуцированного канцерогенеза в коже.

С учетом вышеизложенного, изучение ассоциации ВПЧ с различными формами ЭОК (доброкачественными, предраковыми и злокачественными) на основе количественного определения ДНК ВПЧ, является актуальной задачей дерматоонкологии, решение которой будет способствовать дальнейшему пониманию взаимосвязей ЭОК и ВПЧ.

Цель исследования: изучить ассоциацию эпителиальных опухолей кожи с вирусами папилломы человека.

Задачи исследования:

1. Разработать методику выявления и количественного определения ДНК ВПЧ в коже.

2. Оценить выявляемость ДНК ВПЧ в эпителиальных опухолях кожи.

3. Определить вирусную нагрузку ВПЧ в эпителиальных опухолях кожи.

4. На примере кератоакантом изучить изменение вирусной нагрузки ВПЧ в зависимости от динамики клинического течения опухолевого процесса.

Научная новизна

Впервые разработана количественная методика обнаружения кожных типов ВПЧ рода beta с использованием полимеразной цепной реакции (ПЦР) «в режиме реального времени».

На основе количественного анализа впервые детально изучена ассоциация доброкачественных (себорейный кератоз, кератоакантома), предраковых (актинический кератоз, болезнь Боуэна) и злокачественных (базальноклеточный рак, плоскоклеточный рак) ЭОК с ВПЧ рода beta.

На примере кератоакантом продемонстрировано изменение вирусной нагрузки ВПЧ в зависимости от динамики клинического течения опухолевого процесса.

Положения, выносимые на защиту:

1. Доброкачественные (себорейный кератоз, кератоакантома) предраковые (актинический кератоз, болезнь Боуэна) и злокачественные (базальноклеточный рак, плоскоклеточный рак) ЭОК не менее, чем в 70% случаев ассоциированы с инфекцией ВПЧ рода beta.

2. Концентрация ДНК ВПЧ рода beta у больных ВПЧ-ассоциированными ЭОК достоверно превосходит таковую у бессимптомных носителей ВПЧ (контрольная группа).

3. Динамика вирусной нагрузки ВПЧ может описывать клиническое течение ЭОК, что продемонстрировано на примере кератоакантом.

Внедрение в практику

Результаты работы используются в лечебном и учебном процессе на кафедре кожных и венерических болезней ФППОВ ММА им. И.М. Сеченова, кафедре дерматовенерологии и дерматоонкологии ФУВ МОНИКИ им. М.Ф. Владимирского, а также на базе Центра молекулярной диагностики ФГУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора, Москва.

Апробация работы

Материалы диссертации доложены и обсуждены на заседании Московского областного общества дерматовенерологов, Москва, 2005г.; 2007г.; на научно-практической конференции «Пролиферативные заболевания кожи», Москва 25-26 апреля 2006 г.; 23rd INTERNATIONAL PAPILLOMAVIRUS CONFERENCE & CLINICAL WORKSHOP 2006 Prague, September 1-7 2006г.; на международной научно-практической конференции «Геномные технологии в медицине и медицинское образование на рубеже веков», Алмата 19-20 мая 2006 г.; на научно-практической конференции «Социально-значимые заболевания в дерматовенерологии», Москва 29-30 сентября 2006 г.; на научно-практической конференции «Современная диагностика и лечение урогенитального хламидиоза», Москва 26-27 апреля 2007 г.

Публикации

По теме диссертации опубликовано 12 печатных работ.

Структура диссертации

Диссертация изложена на 119 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, результатов, выводов и библиографического указателя. Указатель литературы включает 29 отечественных и 179 зарубежных работ. Работа иллюстрирована 3 фотографиями, 10 рисунками и 16 таблицами.

выводы

1. Выявление и определение вирусной нагрузки 5 видов ВПЧ рода beta в коже можно проводить с помощью разработанной количественной методики на основе ПЦР в «режиме реального времени».

2. С помощью ПЦР в «режиме реального времени» ассоциация ЭОК с ДНК ВПЧ рода beta была выявлена в 75% случаев себорейного кератоза, 76,2% -кератоакантом, 93,3% - актинического кератоза, 80% - болезни Боуэна, 81,7% -базальноклеточного рака кожи и 70% - плоскоклеточного рака кожи. В нормальной коже здоровых людей ДНК ВПЧ рода beta обнаруживался в 46,9% случаев.

3. В образцах предраковых (актинический кератоз) и злокачественных (базальноклеточный и плоскоклеточный рак) ЭОК beta 1 и beta 2 виды ВПЧ встречались в 1,5-2 раза чаще, чем beta 3, 4, 5 виды. В 66,6% ЭОК отмечалась ассоциация 2 и более видов ВПЧ рода beta.

4. В ходе количественного анализа было установлено, что вирусная нагрузка ВПЧ во всех ЭОК превышала вирусную нагрузку ВПЧ в нормальной коже (1,4 ± 0,6 lg/ 105 клеток), причем при себорейном кератозе (3,0 ± 0,7 lg/ 105 клеток), кератоакантоме (3,2 ± 1,6 lg/ 105 клеток), актиническом кератозе (4,5± 1,2 lg/ 105 клеток) и базальноклеточном раке кожи (2,08 ± 1,4 lg/ 105 клеток) различия имели достоверный характер.

5. На примере кератоакантом продемонстрирована связь вирусной нагрузки ВПЧ с динамикой клинического течения опухолевого процесса: в фазу роста кератоакантом вирусная нагрузка составила 3,1 ± 1,6 lg/Ю5 клеток, в фазу стабилизации - 3,9 ± 1,6 lg/Ю5 клеток, в фазу регресса - 1,6 ± 1,5 lg/Ю5 клеток.

Практические рекомендации

1. Всем больным эпителиальными опухолями кожи (доброкачественными, предраковыми и злокачественными) целесообразно проводить обследование на наличие папилломавирусной инфекции рода beta. Показана необходимость дифференцированного выявления 5 видов вирусов папилломы человека рода beta.

2. Обнаружение вирусов папилломы человека рода beta в эпителиальных опухолях кожи следует проводить с определением вирусной нагрузки, объективно отражающей состояние вирусов (активация или бессимптомная персистенция) в эпителиальных клетках кожи.

3. С целью уточнения клинического течения эпителиальных опухолей кожи обосновано определение динамики вирусной нагрузки.

4. Обнаружение и количественное определение вирусов папилломы человека рода beta в образцах кожи (биоптаты, соскобы) может проводиться с помощью разработанной методики ПЦР в «режиме реального времени».