Автореферат и диссертация по медицине (14.01.17) на тему:Аппликационно-инъекционное применение гидролизата коллагена в комплексном лечении ран мягких тканей

На правах рукописи

005536100

Фролов Роман Николаевич

АППЛИКАЦИОННО-ИНЪЕКЦИОННОЕ ПРИМЕНЕНИЕ ГИДРОЛИЗАТА КОЛЛАГЕНА В КОМПЛЕКСНОМ ЛЕЧЕНИИ РАН МЯГКИХ ТКАНЕЙ (экспериментальное исследование)

14.01.17 — Хирургия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

з і т т

Воронеж 2013

005536100

Работа выполнена в Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Воронежская государственная медицинская академия имени H.H. Бурденко» Министерства здравоохранения Российской Федерации.

Научный руководитель: доктор медицинских наук

Андреев Александр Алексеевич

Официальные оппоненты:

Чередников Евгений Федорович — доктор медицинских наук, профессор, Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Воронежская государственная медицинская академия имени H.H. Бурденко» Министерства здравоохранения Российской Федерации, заведующий кафедрой факультетской хирургии

Ходорковский Марк Анатольевич - доктор медицинских наук, профессор, Бюджетное учреждение здравоохранения Воронежской области «Воронежская областная клиническая больница № 1», заведующий отделением микрохирургии

Ведущая организация: Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Московский государственный медико-стоматологический университет им. А.И. Евдокимова» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Защита состоится «¿2j> ^-¿^¿/¿(^ 2013 года в часов на заседа-

нии диссертационного совета Д 208.009.01 при Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Воронежская государственная медицинская академия имени H.H. Бурденко» Министерства здравоохранения Российской Федерации по адресу: 394036, Россия, г. Воронеж, ул. Студенческая, д. 10.

С диссертацией можно ознакомиться в Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Воронежская государственная медицинская академия имени H.H. Бурденко» Министерства здравоохранения Российской Федерации.

Автореферат разослан « 2013 г.

Ученый секретарь диссертационного совета Глухов Александр Анатольевич

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Аюуальность темы. Несмотря на активную разработку и применение современных методов, лечение ран мягких тканей остается одной из актуальных проблем современной хирургии (М.И. Кузин и соавт., 1990; J1.A. Блатун, 2002; О.В. Галимов и соавт., 2006; В.К. Гостищев, 2007; З.Ш. Абдулаева и соавт., 2009; В .Д. Затолокин и соавт., 2010; Е.М. Мохов и соавт., 2012; Торогсег T. et al., 2009). Данная нозология на протяжении многих лет остается наиболее частой в структуре первичной обращаемости больных в амбулаторно-поликли нические учреждения (О.В. Галимов и соавт., 2006; П.Е. Крайнюков, 2010).

Значение исследования раневого процесса повышается с ростом стихийных, техногенных бедствий, производственного и бытового травматизма, военных действий (В.И. Стручков и соавт., 1988; A.A. Гумеров, 2006; О.Э. Луцевич и соавт., 2006; С.Н. Гисак и соавт., 2007; H.A. Назарьева и соавт., 2008; Pereira A.L. et al., 2005; Jaganjac E. et al., 2007; Ammons C.B., 2010; Friman A. et al., 2010).

Осложнения раневого процесса сопровождаются увеличением стоимости лечения и сроков госпитализации больных, по сравнению с не осложненным течением (И.В. Стручков и соавт., 1975; A.M. Светухин, Ю.А. Амирасланов, 2003; В.Г. Изатулин и соавт., 2008; B.C. Савельев и соавт., 2008; Н.Г. Коротких и соавт., 2009; В.В. Мельников и соавт., 2009; М.А. Губин и соавт., 2010; Ub-bink D.T. et al., 2006; Horch R.E. et al., 2008).

На сегодняшний день используется и разрабатывается множество способов лечения ран мягких тканей: применение биологически активных веществ, сорбентов, наночастиц и ионов металлов, гомеопатических препаратов, озонотера-пии, лазеротерапии и вакуумирования (А.В.Черных и соавт., 1989; Е.Ф. Чередников и соавт., 2005; Ю.А. Пархисенко и соавт., 2008; П.И. Толстых и соавт., 2008; Н.Т.Алексеева и соавт., 2010; В.В. Бесчастнов и соавт., 2012; A.M. Трандофилов и соавт., 2013; Ammons C.B., 2010).

Длительное лечение, увеличение сроков нетрудоспособности пациентов, значительные материальные затраты, косметические дефекты, частые осложнения требуют изыскания новых путей, совершенствования уже имеющихся способов лечения больных с ранами мягких тканей (A.M. Зинатулина и соавт., 2006; З.Н. Хатко, С.Г.Павленко, 2008; A.C. Мошкин, 2008; С.Р. Туйсин, И.В. Богданов, 2010; Haidorfer J. et ai., 2011).

Цель исследования - разработать метод аппликационно-инъекционного введения гидролизата коллагена, предназначенный для комплексного лечения ран мягких тканей.

Задачи исследования.

1. Разработать метод лечения ран, основанный на аппликационно-ннъекционном применении гидролизата коллагена и устройство для его осуществления.

2. Определить показания к аппликационно-инъекционному применению гидролизата коллагена в комплексном лечении ран.

3. Изучить клинические и планиметрические результаты лечения ран мягких тканей при аппликационно-инъекционном применении гидролизата коллагена в эксперименте.

4. Изучить морфологические изменения в тканях при аппликационно-инъекционном применении гидролизата коллагена.

Научная новизна.

Разработаны и апробированы аппликационно-инъекционный метод применения гидролизата коллагена в комплексном лечении экспериментальных ран и устройство для его осуществления.

Определены показания к аппликационно-инъекционному применению гидролизата коллагена в комплексном лечении ран.

Изучена динамика клинических и планиметрических показателей лечения ран мягких тканей с использованием аппликационно-инъекционного применения гидролизата коллагена в эксперименте, которая показала более раннее купирование воспалительных явлений и уменьшение площади ран по сравнению с контрольной группой.

Изучены морфологические изменения мягких тканей на фоне аппликационно-инъекционного применения гидролизата коллагена в эксперименте, которые показали более выраженную положительную динамику заживления ран при аппликационно-инъекционном применении гидролизата коллагена, что проявилось более ранним стягиванием дефекта кожи, ускорением регенеративной пролиферации, более высоким содержанием РНК и БН-групп.

Практическая значимость.

Разработаны аппликационно-инъекционный метод введения гидролизата коллагена и устройство для его осуществления в комплексном лечении ран мягких тканей.

Применение аппликационно-инъекционного метода способствует более быстрой активизации процессов восстановления гистологического строения мягких тканей организма, позволяет в более ранние сроки нормализовать клинические, планиметрические показатели и морфологическую картину по сравнению с традиционными методами лечения ран.

Реализация результатов работы.

Материалы диссертации используются в учебном процессе кафедр общей и госпитальной хирургии Государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Воронежская государственная медицинская академия имени H.H. Бурденко» Министерства здравоохранения Российской Федерации.

Результаты исследования внедрены в работу Научно-исследовательского института экспериментальной биологии и медицины Государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Воронежская государственная медицинская академия имени

H.H. Бурденко» Министерства здравоохранения Российской Федерации.

По теме диссертации опубликованы 7 печатных работ, из них 3 в журналах рекомендованных ВАК. Получен патент Российской Федерации на полезную модель /патент РФ №126601 от 10.04.13 г./.

Материалы диссертационного исследования были доложены на VII Всероссийской Бурденковской научной конференции, посвященной 135-летию со дня рождения H.H. Бурденко (Воронеж, 2011); VII Молодежном инновационном форуме (Воронеж, 2013); IV Всероссийской конференции молодых ученых «Комплексный подход к диагностике, лечению и профилактике в медицине» (Воронеж, 2012); научно-практической конференции «Бурденковские чтения» (Воронеж, 2012); VI Всероссийской конференции молодых ученых-медиков (Казань, 2012).

Результаты работы отмечены золотой медалью 34 Межрегиональной специализированной выставки «3дравоохранение-2013» (Воронеж, 2013).

Диссертационное исследование выполнено при финансовой поддержке Совета по грантам Президента Российской Федерации (МД-1578.2011.7).

Объем и структура диссертации.

Диссертация изложена на 126 страницах машинописного текста, состоит из введения, глав обзора литературы, объектов и методов исследования, результатов собственных исследований, обсуждения полученных результатов, заключения, выводов и библиографического указателя, включающего 227 источников, из них 132 отечественных и 95 зарубежных. Диссертация иллюстрирована 7 таблицами и 37 рисунками.

Основные положения диссертации, представленные на защиту.

I. Разработаны новый аппликационно-инъекционный метод применения гид-ролизата коллагена в комплексном лечении ран мягких тканей и устройство для его осуществления.

2. Определены показания к аппликационно-инъекционному применению гид-ролизата коллагена в комплексном лечении ран.

3. Применение аппликационно-инъекционного метода введения гидролизата коллагена в лечении ран мягких тканей способствует нормализации клинических и планиметрических показателей в более ранние сроки по сравнению с традиционными методами.

4. Применение аппликационно-инъекционного метода введения гидролизата коллагена способствует более быстрому восстановлению морфологического строения мягких тканей.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы исследования.

Объектом исследования явилась разработка метода аппликационно-инъекционного введения гидролизата коллагена, предназначенного для использования в комплексном лечении ран мягких тканей.

Работа выполнена на базе Научно-исследовательского института экспериментальной биологии и медицины Государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Воронежская государственная медицинская академия имени H.H. Бурденко» Министерства здравоохранения Российской Федерации. В качестве лабораторных животных использовались половозрелые самцы белых крыс. Все экспериментальные исследования осуществлялись в строгом соответствии с принципами, изложенными в Конвенции по защите позвоночных животных, используемых в экспериментальных целях (г. Страсбург, Франция, 1986) и согласно приказу лабораторной практики Российской Федерации МЗ РФ №267 от 19.06.2003 г.

Применение метода аппликационно-инъекционного применения гидролизата коллагена осуществляли в два этапа.

На первом этапе проводили аппликацию 16% гидролизатом коллагена (температура вещества - 40±0,1°С), которая осуществлялась непосредственно под перпендикулярным углом по отношению к плоскости поверхности раны. Аппликация проводилась однократно на первые сутки от начала моделиро вания раны. Последующие проведения аппликаций были нецелесообразными, так как они могли нарушить процессы образования грануляций и эпителизации. Расход коллагена составил 1 см3 на 1 см2, что позволило создать пленку на поверхности раны толщиной около 1±0,1 мм. Замер толщины слоя аппликации осуществлялся после высыхания коллагена с помощью ультразвукового толщиномера. Выполнение данной техники позволило осуществить оптимальное нанесение вещества по всей площади раны, без лишней травматизации здоро-

вых тканей.

На втором этапе выполняли инъекции 16% гидролизата коллагена (температура вещества - 40±0,1°С) непосредственно вокруг раны под перпен дикулярным углом по отношению к плоскости поверхности раны, на глубину до 0,5 см из расчета 2 мл препарата на 1 см3. Данная техника позволяла вводить оптимальное количество вещества по всему объему тканей раны, без излишней травматизации здоровых тканей. Инъекции проводили однократно сразу после моделирования раны. Последующие инъекции были нецелесообразны, так как они могли нарушить процессы образования грануляций и эпителизации.

Для проведения метода аппликационно-инъекционного введения гидролизата коллагена использовалось специальное устройство, которое было разработано совместно с сотрудниками инженерного бюро «Химавтоматика» (г. Воронеж) и НИИ хирургической инфекции Государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Воронежская государственная медицинская академия имени Н.Н.Бурденко» Министерства здравоохранения Российской Федерации (рис. 1).

Рис. 1. Внешний вид устройства для аппликационного и инъекционного применения гидролизата коллагена в комплексном лечении ран мягких тканей.

Устройство состоит из корпуса с силовым механизмом, соединенного с емкостью для препарата посредством гибкого шланга. Емкость имеет нагрева тельный элемент, блок управления и индикации температуры. Устройство применяется совместно с двумя сменными насадками. Насадка для инъекции лекарственных веществ состоит из корпуса, инъекционных игл, ограничителя глубины инъекции и регулятора высоты ограничителя. Насадка для аппликации лекарственных веществ имеет конусную форму и состоит из корпуса с

щелевидными отверстиями. Разработанное устройство с набором насадок позволяет осуществлять оптимальное распределение препарата по всей поверхности и объему тканей раны без лишней травматизации и нарушения процессов грануляций и эпителизации.

В лечении применялся гидролизат коллагена, производство которого осуществлялось согласно способу получения функционального коллагенового гидролизата (патент РФ № 2409216 С1 от 12.05.2009 г.), разработанного в Федеральном государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Воронежский государственный университет инженерных технологий» под руководством профессора Л.В. Антиповой. Гидролизат коллагена имел стандартный химический состав. Он состоит в основном из щелочерастворимого белка, с содержанием пептидов и аминокислот. Аминокислотный состав гидролизата коллагена характеризуется высоким содержанием глицина, пролина и глутаминовой кислоты. Высокую степень очистки от балластных белковых фракций также подтверждает отсутствие триптофана и низкое содержание метионина.

Экспериментальные исследования проведены в 4-х группах исследований: в одной контрольной и трех опытных (по 24 животных в группе). Всем животным моделировали стандартные раны по модифицированной методике И.А. Сыченникова (1974). Перед началом эксперимента всех животных вводили в эфирный ингаляционный наркоз, затем фиксировали конечности к выступам специального малого операционного стола для проведения экспериментальных исследований на мелких лабораторных животных. В асептических условиях на выбритом от шерсти участке наружной поверхности средней трети левого бедра, после обработки операционного поля раствором антисептика, одноразовым медицинским скальпелем производили линейный разрез кожи, фасции и мышц длиной 1 см.

В 1 контрольной группе лечение не проводилось.

В 1 опытной группе лечение ран осуществляли путем аппликаций раневой поверхности 16% гидролизатом коллагена, толщина слоя - до 1 мм.

Во 2 опытной группе лечение ран осуществляли путем инъекции раны 16% гидролизатом коллагена (температура вещества - 40±0,1°С).

В 3 опытной группе лечение ран осуществляли путем аппликации и инъекций раны 16% гидролизатом коллагена.

Изучение эффективности разработанного метода оценивали с помощью следующих методов исследования: клинических (общее состояние животных, местные проявления воспаления /отечность, гиперемия, болезненность при пальпации/, температурная реакция, сроки появления грануляций и эпителиза ции); планиметрических (измерение площади ран в динамике и скорость ее

8

уменьшения за сутки); гистологических (окраска гематоксилином и эозином, по Ван-Гизону, импрегнация серебром по Футу для выявления ретикулиновых во локон) и гистохимических (определение содержания БН-групп, РНК и суммар ного белка). Клинические и планиметрические показатели течения раневого процесса оценивали сразу после моделирования раны и, в последующем, еже дневно. Забор тканей экспериментальных ран для морфологических исследова ний осуществляли на 1, 3, 7 и 11-е сутки от начала опыта.

Данные, полученные при проведении исследований, приведены в соответствие с международной математической системой СИ.

Статистическая обработка данных производилась с помощью метода вариационной статистики, критерия Стьюдента (достоверным различие считалось при значении р<0,05), критерия Вилкоксона; сравнение не связанных выборок осуществлялось с применением критерия Манна-Уитни; для оценки связи между признаками проведен анализ Спирмена. При оформлении и проведении расчетов статистических данных использовался пакет прикладных компьютерных программ МЯЕхс! 2007.

РЕЗУЛЬТАТЫ ПРОВЕДЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ Результаты клинических методов исследования.

На 1-е сутки после начала лечения поведение подопытных животных во всех исследуемых группах не отличалось от здоровых. Во всех четырех группах исследования пальпация поврежденной конечности вызывала большее беспокойство животного, по сравнению с пальпацией здоровой конечности. В ранах отмечалось наличие незначительного отека и скудного серозного отделяемого. В опытных группах, где проводилось внесение гидролизата коллагена в рану, наблюдалась тенденция к уменьшению воспалительных явлений: уменьшение отека и гиперемии в области раны. Купирование воспалительных явлений и заживление ран в опытных группах происходило более интенсивно по сравнению с 1 контрольной (табл. 1).

Таблица 1

Клинические признаки течения раневого процесса

В Г| эуппах исследования, сутки

Клинический признак Группа исследования

1 контрольная 1 опытная 2 опытная 3 опытная

Отек 2,17±0,29 1,67±0,38 1,83±0,29 1,50±0,40*

Гиперемия кожи 1,83±0,55 1,33±0,38 1,50±0,40 1,17±0,29*

Уменьшение отделяемого до скудного количества 2,67±0,38 1,67±0,38 1,83±0,29 1,50±0,40*

* - достоверность различий признаков по сравнению с контрольной группой р<0,05.

На 3-й сутки все подопытные животные поведенческими реакциями не отличались от здоровых. Пальпация поврежденной конечности не вызывала большего беспокойства, чем здоровой. Отмечалось незначительное серозное отделяемое только в контрольной группе. Во всех опытных группах наблюдалось купирование признаков воспаления. В 1 опытной группе отек купировался в среднем на 1,67±0,38 сутки, во 2 опытной группе - на 1,83±0,29 сутки, в 3 опытной группе - на 1,50±0,40 сутки. Гиперемия кожи околораневой области сохранялась в 1 опытной группе до 1,33±0,38 суток, во 2 опытной группе - до 1,50±0,40 суток, в 3 опытной группе - до 1,17±0,29 суток. Отсутствие раневого отделяемого наблюдалось в 1 опытной группе в среднем на 1,67±0,38 сутки, во 2 опытной - на 1,83±0,29 сутки, в 3 опытной - на 1,50±0,40 сутки. В 1 контрольной группе животных процессы заживления ран протекали менее интенсивно: отек полностью купировался на 2,17±0,29 сутки, гиперемия - на 1,83±0,55 сутки, уменьшение отделяемого до скудного наблюдалось на 2,67±0,38 суток.

Таким образом, во всех группах животных к концу 3-х суток от момента моделирования раны визуально не отличались друг от друга: признаки отечности и гиперемии не определялись, заживление проходило под полоской струпа.

Результаты планиметрических методов исследования.

Изучена динамика изменения площади ран в процессе заживления (табл.

2).

Таблица 2

Динамика изменение площади ран животных, мм

Группа исследования Сразу после нанесения раны Сроки после моделирования ран,сутки

1 3 7 11

1 контрольная 26,25±0,05 19,50±0,29' 8,75±0,38' 3,21±0,17' Сформировавшийся рубец

1 опытная 25,70±0,50 12,46±0,581Д 6,00±0,291Д 1,71±0,30и

2 опытная 25,92±0,43 13,33±0,471,2 6,18±0,48''2 1,75±0,381,2

3 опытная 25,55±0,56 11,75±0,90''2 5,50±0,50''2 1,42±0,28|Д

- достоверность различий по сравнению с первыми сутками, 2 - достоверность различий по сравнению с контрольной группой.

Средняя площадь ран перед началом лечения составляла 25,85±0,30 мм2. Достоверных различий площади ран между группами выявлено не было. В 1 контрольной группе площадь ран от начала эксперимента на 1-е сутки составила в среднем 19,50±0,29 мм2, на 3-е сутки - 8,75±0,38 мм2, на 7-е сутки -3,21±0,17 мм2. На 1-е сутки после лечения в 1 опытной группе площадь ран уменьшилась в среднем до 12,46±0,58 мм2, во 2 опытной группе - до 13,33±0,47

10

мм2, в 3 опытной группе - до 11,75±0,90 мм2. На 3-е сутки после начатого лечения площадь ран в 1 опытной группе составила 6,0±0,29 мм2, во 2 опытной группе - 6,18±0,48 мм2, а в 3 опытной группе - 5,50±0,50 мм2. Площадь ран на 7-е сутки от начала лечения в 1 опытной группе составила 1,71 ±0,30 мм2, во 2 опытной группе - 1,75±0,38 мм2, в 3 опытной группе - 1,42±0,28 мм2. К 11 суткам во всех группах наблюдался полностью сформировавшийся рубец.

На 1-е сутки уменьшение площади раны в 1 контрольной группе составило в среднем 25,71± 1,73%, в 1 опытной - 51,52±2,43%, во 2 опытной -48,57±2,37% и в 3 опытной группе - 54,01±2,73% (табл. 3).

Таблица 3

Динамика изменение площади ран в процессе лечения, % в сутки

Группы исследования Сроки после моделирования ран, сутки

1-е сутки 1-3-е сутки 3-7-е сутки

1 контрольная 25,71± 1,73 27,56±0,42 15,83±0,33

1 опытная 51,52±2,43* 25,92±0,43* 17,88±0,35*

2 опытная 48,57±2,37* 26,82±0,39 17,92±0,31 *

3 опытная 54,01±2,73* 26,59±0,47 18,55±0,38*

* - достоверность различий по сравнению с контрольной группой.

С 1-е по 3-е сутки уменьшение площади ран за сутки в 1 контрольной группе, в среднем, составило 27,56±0,42% за сутки, в 1 опытной группе -25,92±0,43%, во 2 опытной группе этот показатель был равен 26,82±0,39%, в 3 опытной группе - 26,59±0,47%. С 3-х по 7-е сутки скорость уменьшения площади ран за сутки в 1 контрольной группе в среднем составила 15,83±0,33%, данный показатель в 1 опытной группе достиг 17,88±0,35%, во 2 опытной группе - 17,92±0,31 %, в 3 опытной группе - 18,55±0,38%.

Полученные данные говорят о высокой эффективности применения гидролизата коллагена в комплексном лечении ран мягких тканей.

Результаты гистологических методов исследования.

На 1-е сутки после моделирования раны в области дефекта наблюдается повреждение эпидермиса с кровоизлияниями. Полость раны заполнена некротическим содержимым. По периферии - инфильтрирована значительным количеством нейтрофильных лейкоцитов. Более глубокие слои: соединительная ткань и мышцы отечны - воспалены. Мышечные волокна смещены и раздвинуты вследствие выраженного межмышечного отека, причиной которого явился местный ацидоз, обусловленный распадом тканей, застоем крови и нарушением окислительно-восстановительных процессов. Вследствие повышенной проницаемости сосудистой стенки из кровеносных сосудов в ткани выходят форменные элементы и белковые составляющие крови. Нарушение окислительных

11

процессов и тканевого обмена также приводит к набуханию ткани со сдавленней капилляров и венул, что препятствует оттоку крови. Набухание и отек тканей возрастают в паравуальных тканях.

Полученные данные гистологического исследования на 1-е сутки после моделирования раневого процесса свидетельствуют о развитии гистологической картины травматического воспаления.

На 3-й сутки в контрольной группе наблюдалась морфологическая картина воспалительной инфильтрации и значительно выраженного отека мягких тканей.

В воспалительном инфильтрате в стенке раны присутствовали клеточные компоненты: лейкоциты с распадающимися ядрами, единичные тканевые базо-филы, макрофаги и лимфоциты. В стенке раны по периферии инфильтрата наблюдаются фибробласты. Отмечается выпадение фибрина, который связан со стенками раневого дефекта. По периферии мышечные волокна имеют протяженные участки некроза. В области дна раны появляются единичные очаги грануляционной ткани. В сетчатом слое дермы наблюдается единичное количество коллагеновых волокон, образование которых стимулируется факторами роста, выделяемыми фибробластами и лейкоцитами.

На 3-й сутки после моделирования раневого процесса отмечается умеренная воспалительная реакция окружающих тканей, менее выраженная по сравнению с первыми сутками.

На 7-е сутки воспалительная реакция выражена незначительно. Инфиль трация клетками, отвечающими за воспалительный процесс, сохраняется. Поверхность раны почти полностью заполнена грануляционной тканью. Отмечается небольшое количество микроабсцессов различной локализации. В зоне восстановления тканевого дефекта наблюдаются извитые коллагеновые волокна с преимущественно горизонтальным направлением, вокруг которых наблюдается повышенное количество фибробластов, что соответствует продолжению процесса пролиферации. Отмечается формирование мелких капилляров. Проведенные гистологические исследования показали, что на 7 сутки после моделирования раневого процесса в паравуальной зоне на фоне вялотекущих процессов регенерации сохраняется воспалительная реакция окружающих тканей.

При изучении данных гистологического исследования, полученных в 3-х опытных группах была отмечена следующая морфологическая картина.

На 1-е сутки после моделирования раневого процесса в 1 опытной группе имелся дефект эпидермиса с краями, густо инфильтрироваными полиморфноя-дерными лейкоцитами. В раневом канале имеются лимфоциты, плазмоциты и макрофаги. В мягких тканях выражены полнокровие и отек. В глубоких слоях дермы - отмечается отек и набухание коллагеновых волокон, диффузная ин-

12

фильтрация полиморфноядерными лейкоцитами. Воспалительная инфильтрация, проникает в межмышечные пространства и представлена преимущественно полиморфноядерными лейкоцитами. Мышечные волокна раздвинуты, некоторые с выраженной дистрофией, отдельные мышечные волокна с явлениями миолиза.

В биоптатах мягких тканей, взятых из раны на 3-е сутки: отек слабо вы ражен, на поверхности раны имеется корочка, под которой из тканей с зонами некроза формируется молодая грануляционная ткань, представленная организованным фибрином, большим количеством фибробластов, гистиоцитов, и эн дотелиоцитов, формирующих новую сосудисто-капиллярную сеть. В некото рых зонах видны небольшие скопления полиморфноядерных лейкоцитов.

Таким образом, на 3-й сутки после моделирования раневого процесса наблюдалась умеренная воспалительная реакция в паравуальной зоне, менее выраженная, по сравнению с данными полученными в 1 контрольной группе.

В биоптатах исследованных на 7-й день после проведенного лечения, в воспалительном инфильтрате обнаружено большое количество эозинофилов. Наблюдается формирование молодой грануляционной ткани в краях и дне раны, с полнокровием синусоидов. В некоторых зонах видна пролиферация эпителия волосяных фолликулов, сальных желез, их общее количество увеличилось по сравнению с 3-ми сутками. Отмечено увеличение количества фибробластов, гистиоцитов, тканевых базофилов и коллагеновых волокон. На 7-е сутки поверхность раны покрыта восстановленным эпидермисом, под которым лежит грануляционная ткань, богатая сосудами и капиллярами синусоидного типа, с выраженным полнокровием, с большим количеством фибробластов, коллагеновых волокон, гистиоцитов, в некоторых ранах еще присутствуют лейкоциты. Имеются препараты с неполным восстановлением тканей в области раны. В глубине раны, в межмышечных пространствах также происходит формирование мелких капилляров.

Таким образом, на 7-е сутки после моделирования раневого процесса на фоне выраженных пролиферативных процессов сохраняются незначительные признаки воспалительной реакции и неполное формирование эпидермиса.

К 11-м суткам - на месте раны образовался эпителизированный рубец с небольшой деформацией в области дефекта кожных покровов.

На 1-е сутки после моделирования раневого процесса во 2 опытной группе имелся дефект эпидермиса, умеренный некроз соседних тканей с лейкоцитарной инфильтрацией, умеренно выраженный отек мягких тканей.

На 1-е сутки во 2 опытной группе после применения аппликации 16% гидролизата коллагена также наблюдалась воспалительная реакция, сравнимая с данными полученными в 1 опытной группе, однако отмечается более выра-

13

женный отек мягких тканей с лейкоцитарной инфильтрацией, представленный преимущественно нейтрофильными лейкоцитами.

На 3-е сутки моделирования раны мягких тканей наблюдается уменьшение дефекта эпидермиса, связанного, в том числе, с образованием корочки и контракции раны. В пределах дермы визуализируются коллагеновые волокна с инфильтрацией макрофагами, фибробластами и эозинофильными лейкоцитами. Края раны отечны. Наблюдается расхождение мышечных волокон за счет воспалительной инфильтрации, заполняющей межмышечные пространства. Отмечаются признаки формирования молодых грануляций, по периферии раны наблюдается пролиферативная реакция эпидермиса.

На 7-е сутки у животных 2 опытной группы нарастают проявления репа-ративной регенерации. По сравнению с 1 контрольной группой увеличено содержание сформированных коллагеновых волокон, что свидетельствует о зрелости грануляционной ткани. Клеточный компонент содержит единичные клетки воспалительного ряда. Эпидермис в зоне раны стратифицирован, но имеются препараты с дефектом покровных тканей, а также с утолщенным эпителием в области восстановленной кожи.

На 11-е сутки после инъекционного введения 16% гидролизата коллагена формируется рубец, морфологически определяются протяженные коллагеновые волокна, более тонкие чем в препаратах контрольных животных. Эпидермис в зоне рубца в некоторых препаратах имеет большую толщину по сравнению с предыдущими группами. Кожа в области рубца характеризуется вдавлением, что свидетельствует о незавершенности процесса эпидермизации.

На первые сутки в ранах животных 3 опытной группе также отмечаются дефект эпидермиса, некроз подлежащих тканей с выраженным полнокровием сосудов и капилляров в зоне дефекта, диффузная инфильтрация лейкоцитами и дистрофия мышечных волокон. Отек тканей менее выражен.

На 3-е сутки в 3 опытной группе дефект эпидермиса становится незначительным за счет контракции раны. В пределах дермы визуализируются единичные новообразованные коллагеновые волокна и инфильтрат из макрофагов, фибробластов, с примесью полиморфноядерных и эозинофильных лейкоцитов. Воспалительный инфильтрат раздвигает мышечные волокна и заполняет межмышечные пространства с образованием очаговых кровоизлияний. В дне раны начинается формирование молодой грануляционной ткани. По краям раны наблюдается пролиферация клеток эпидермиса, обеспечивающая восстановление кожных покровов.

На 7-е сутки после аппликационно-инъекционного введения гидролизата коллагена морфологическая картина характеризуется эпидермизацией раны. На уровне дермы сформирована зрелая грануляционная ткань, содержащая колла-

14

геновые волокна с клеточным компонентом преимущественно пролифератив-ного ряда.

На 11-е сутки у животных 3 опытной группы в зоне рубца отмечается преобладание волокнистого компонента, представленного тонкими коллагеновыми волокнами с горизонтальным направлением. Между волокнами располагаются клетки преимущественно пролиферативного ряда.

Анализ структурно-функциональных изменений у животных эксперимен тальных групп показал выраженную положительную динамику заживления ран в 3 опытной группе, что проявилось в уменьшении отечности тканей, повыше нии активности стягивания краев раны. Морфологически отмечается преобладание пластических процессов, направленных на восстановление тканей в зоне дефекта, что проявляется уменьшением содержания лейкоцитов на фоне увеличения количества макрофагов, фибробластов, активацией пролиферации эпидермиса, стимуляцией ангиогенеза, коллагеногенеза в дерме.

Проведенное гистологическое исследование позволяет сделать вывод об оптимальном влиянии аппликационно-инъекционного введения 16% гидролизата коллагена на процессы заживления ран мягких тканей по сравнению с изолированным аппликационным и инъекционным введением.

Результаты гистохимических методов исследования.

Выявление РНК у животных контрольной группы показало наличие продукта гистохимической реакции в виде базофильной субстрации различной степени интенсивности (рис. 2).

Наиболее интенсивная базофилия наблюдается в пределах базального и шиповатого слоев, что косвенно указывает на активные метаболические процессы на данном уровне. Поверхностно расположенные слои дают менее интенсивную гистохимическую реакцию. Визуальная оценка содержания РНК в клетках эпидермиса позволила установить, что продукт реакции откладывается в виде пылевидной базофилии в цитоплазме, встречаются клетки с более крупными гранулами в перинуклеарной зоне или по периферии цитоплазмы. По данным микрофотометрии средняя оптическая плотность РНК в клетках базального и шиповатого слоев составила 0,24±0,01 усл. ед. Определение БН-групп в пределах эпидермиса показало разнообразие гистохимической реакции на уровне различных слоев. Наибольшее количество сульфгидрильных групп отмечается в поверхностных слоях, менее выраженная реакция отмечается в глубжележащих слоях эпидермиса. 8Н-группы распространены в основном диффузно или в виде мелкозернистой массы (рис. 3). Более высокая реакционная способность определяется в поверхностных слоях интактного эпителиального пласта по сравнению с околораневой зоной. Средний уровень оптической

плотности БН-групп в клетках базального и шиповатого слоев составил 0,26±0,01 усл. ед. На 3-й сутки у животных 1 контрольной группы на фоне ре-паративных процессов изменяются гистохимические показатели. Интенсивность окраски эпителиальных клеток при выявлении РНК усиливается, выраженность реакции выше в глубоких слоях эпидермиса, где преобладает равномерное отложение продукта реакции, в отдельных клетках наблюдается локализация базофильного материала в перинуклеарной зоне. Среднее значение оптической плотности РНК составляет 0,26±0,01 усл. ед. Анализ гистохимической реакции выявления сульфгидрильных групп в пределах слоев эпидермиса в области раны позволил установить, что визуально не определяется особенностей в топохимии осадка. Количественная оценка средней оптической плотности БН-групп в клетках базального и шиповатого слоев (0,26±0,01 усл. ед.) констатирует сохранение уровня предыдущего экспериментального срока. На 7-е сутки в пределах раневого дефекта продолжается эпителизация, выражающаяся в увеличении толщины и протяженности пласта новообразованного эпидермиса.

Рис. 2. Значения средней оптической плотности РНК в клетках базального и шиповатого слоев контрольной группы.

Рис. 3. Значения средней оптической плотности вН-групп в клетках базального и шиповатого слоев контрольной группы.

Данные морфологические преобразования сочетаются с повышением обменных процессов, что подтверждается увеличением среднего значения оптической плотности РНК (0,30±0,01 усл. ед.) в пределах базального и шиповатого слоев. Количество сульфгидрильных групп в эпидермисе увеличивается, средняя оптическая плотность в пределах базального и шиповатого слоев составляет 0,28±0,02. На 11-е сутки в препаратах 1 контрольной группы в области новообразованного эпидермиса при выявлении РНК определяется выраженная ба-зофилия на уровне глубоких слоев. Установлено увеличение уровня РНК

16

(0,31±0,02 усл. ед.) на фоне существенного снижения оптической плотности БН-групп (0,27±0,01 усл. ед.), что может свидетельствовать о незавершенности процессов стратификации эпидермиса.

Выбор эффективных методов регионального воздействия на ткани в области раны определяется необходимостью не только стимулировать репаратив-ные процессы в зоне дефекта тканей, но и создавать оптимальные условия для пролиферативных превращений, обеспечивающих качественное восстановление кожи.

На 1-е сутки в 1 опытной группе после аппликации гидролизата коллагена при выявлении РНК выявляется умеренная цитоплазматическая базофилия с более выраженной реакцией в пределах базапьного и щиповатого слоев, где среднее значение оптической плотности составило 0,25±0,01 усл. ед., не имея достоверных отличий от уровня контрольной группы (рис. 4). Выявление БН-групп показало, что по краям раны эпидермис характеризуется невысоким уровнем средней оптической плотности БН-групп 0,26±0,02 усл. ед., не отличающийся от контрольных значений (рис. 5).

Рис. 4. Значения средней оптической плотности РНК в клетках базального и шиповатого слоев 1 опытной группы.

Рис. 5. Значения средней оптической плотности вН-групп в клетках базального и шиповатого слоев 1 опытной группы.

На 3-й сутки после лечения в эпидермисе отмечается стимуляция синтетических процессов, о чем свидетельствует повышение метаболической активности в пределах базального и шиповатого слоев - среднее значение оптической плотности повышено (0,27±0,01 усл. ед.) по сравнению с контролем и с предыдущим экспериментальным сроком. Процессы реэпителизации раны характеризуются незначительным повышением среднего значения оптической плотности сульфгидрильных групп (0,26±0,01 усл. ед.). На 7-е сутки процессы

регенерации усиливаются, что выражается в восстановлении целостности кожного покрова почти у всех животных, что находит подтверждение в гистохимических показателях: среднее значение оптической плотности РНК составляет 0,31±0,02 усл. ед., превышая уровень контрольной группы. Отмечается отложение продуктов реакции при выявлении 8Н-групп преимущественно в поверхностных слоях, что указывает на процессы ороговения. В функционально активных слоях среднее значение сульфгидрильных групп превышает контрольный уровень и составляет 0,29±0,01 усл. ед.

На 11-е сутки в 1 опытной группе толщина слоев увеличена по сравнению с эпидермисом интактной кожи в основном за счет глубжележащих слоев. Сред нее значение оптической плотности РНК в клетках базального и шиповатого слоев составляет 0,32±0,01 усл. ед., что превышает уровень контрольной группы и предыдущего срока, это свидетельствует, что ремоделирование раны продолжается на фоне повышенной синтетической активности эпидермиса. Выявление сульфгидрильных групп показало, что качественных особенностей в распределении продуктов гистохимической реакции не отмечалось, количественный анализ указывает на тенденцию к снижению среднего значения оптической плотности БН-групп (0,28±0,01 усл. ед.) по сравнению с предыдущим сроком, что свидетельствует о стабилизации процессов дифференцировки в пределах эпидермиса.

Во 2 опытной группе после инъекционного введения гидролизата коллагена в область раны на 1-е сутки активизируются синтетические процессы на уровне базального и шиповатого слоев эпидермиса, это отражается повышением уровня РНК и ЯН-групп (рис. 6, 7). Средний уровень оптической плотности РНК составляет 0,25±0,01 усл. ед., а сульфгидрильных групп 0,27±0,02 усл. ед., данные показатели превышают контрольные значения.

На 3-й сутки в результате структурно-метаболических преобразований тканей в зоне восстановления кожных покровов на фоне реэпителизации раны происходит усиление пролиферативных процессов, что сопровождается повышением уровня РНК (0,27±0,01 усл.ед) по сравнению с контрольной группой, по сравнению с 1 опытной группой достоверных отличий не отмечается. Среднее значение оптической плотности РНК в пределах базального и шиповатого слоев 0,27±0,01 усл. ед. Среднее значение оптической плотности БН-групп было равно 0,27±0,02 усл. ед. На 7-е сутки после инъекционного введения гидролизата коллагена на фоне полного восстановления кожного дефекта отмечается усиление метаболических процессов с повышением изучаемых характеристик. Среднее значение оптической плотности РНК в клетках базального и шиповатого слоев достоверно превышает аналогичный показатель у животных контрольной группы и составляет 0,32±0,01 усл. ед. Топохимия осадка при данной

18

гистохимической реакции без особенностей.

0,265

Рис. б. Значения средней оптической Рис. 7. Значения средней оптической плотности РНК в клетках базального плотности вН-групп в клетках баи шиповатого слоев 2 опытной груп- зального и шиповатого слоев 2 опытны. ной группы.

Среднее значение оптической плотности БН-групп также превышает кон трольный уровень, но сохраняется уровень 1 опытной группы, что подчеркивает синхронность процессов дифференцировки эпидермиса в этих экспериментальных группах (0,29±0,01 усл. ед.). На 11-е сутки в восстановленном эпидер мисе отмечается стабилизация синтетических процессов, но толщина слоев отличается от интактной кожи, что свидетельствует о незавершении стратификации в пределах эпидермиса. Среднее значение оптической плотности РНК составляет 0,34±0,004 усл. ед. Для данной экспериментальной группы характерно снижение содержания БН-групп в пределах базального и шиповатого слоев, среднее значение оптической плотности составляет 0,27±0,01 усл. ед.

На 1-е сутки после аппликационно-инъекционного введения гидролизата коллагена качественная характеристика гистохимических реакций не отличается от предыдущих экспериментальных групп. Величина среднего значения оптической плотности РНК в пределах функционально активных слоев составляет 0,26±0,01 усл. ед., незначительно превышая контрольный уровень, что создает условия для интенсификации пролиферативных процессов (рис 8). Среднее значение оптической плотности БН-групп (0,28±0,02 усл. ед.) также превышает контрольный уровень, что потенцирует восстановительные процессы, так как сульфгидрильные группы играют важную роль в жизнедеятельности эпителиальных клеток (рис. 9). На 3-й сутки начинается восстановление целостности кожных покровов, эпидермис перемещается от периферии к центру, что корре-

лирует с гистохимическими показателями - среднее значение оптическои плотности РНК составляет 0,29±0,01 усл. ед., превышая контрольный уровень. Показатели функционально активных групп белков сохраняют значение показателя предыдущего экспериментального срока, среднее значение оптической плотности 8Н-групп 0,28±0,02 усл. ед.

Рис. 8. Значения средней оптической Рис. 9. Значения средней оптичес-плотности РНК в клетках базального кой плотности 8Н-групп в клетках и шиповатого слоев в 3 опытной базального и шиповатого слоев в 3

группе после аппликационно- опытной группе после аппликаци-

инъекционного введения коллагена онно-инъекционного введения

коллагена

На 7-е сутки отмечается заполнение дефекта сформированным эпидермисом. Выраженность процесса стратификации приближается к уровню интакт-ной кожи. Среднее значение оптической плотности РНК в клетках базального и шиповатого слоев составляет 0,33±0,02 усл. ед., что достоверно превышает значение у контрольной группы. Сходная количественная динамика наблюдается при выявлении БН-групп, среднее значение оптической плотности этих групп белков возрастает, достигая максимальных значений в этом эксперименте (0,34±0,02 усл. ед.). На 11-е сутки в 3 опытной группе стабилизация гистохимических реакций сопровождается процессами преобразований в пределах восстановительного эпидермиса. Среднее значение оптической плотности РНК (0,33±0,02 усл. ед.) достоверно отличается от контрольной группы, но не изменяется на протяжении от последнего экспериментального срока. Уровень содержания сульфгидрильных групп превышает контрольные значения и составляет 0,29±0,01 усл. ед., но по сравнению с предыдущим сроком наметилась тенденция к снижению, что указывает на стабилизацию процессов стратификации эпидермиса.

Анализ результатов гистохимических реакций показал, что в 1 и 2 опыт-

ных группах после аппликационного и инъекционного введения гидролизата коллагена сохраняется динамика восстановительных процессов, соответствующая направленности преобразований у животных контрольной группы; накопление РНК в процессе эпидермизации раны; повышение содержания БН-групп по мере дифференцировки эпидермиса с последующим снижением, что соответствует завершению процессов стратификации в области раны, но уровень гистохимических реакций достигает наибольших значений в 3 опытной группе после аппликационно-инъекционного метода введения.

Выводы.

1. Разработан метод комплексного лечения ран мягких тканей, основанный на сочетанном паравуальном инъекционном и аппликационном применении гидролизата коллагена.

2. Для реализации метода апликационно-инъекционного введения гидролизата коллагена разработано специальное устройство, позволяющее осуществлять при определенной температуре оптимальное распределение раствора коллагена по поверхности и объему тканей раны.

3. Применение метода аппликационно-инъекционного введения гидролизата коллагена показано при наличии ран мягких тканей без признаков нагноения.

4. Применение аппликационно-инъекционного введения гидролизата коллагена позволило сократить сроки заживления и эпителизации ран на 1,5-2 суток, увеличить скорость заживления площади раны на 7-8% по сравнению с 1 контрольной группой.

5. Использование метода аппликационно-инъекционного применения гидролизата коллагена способствует более выраженной положительной динамике морфологических и гистохимических изменений, что проявляется уменьшением отечности тканей, повышением активности стягивания раны, ускоренной организацией фибрина и ранним формированием коллагена, более высоким содержанием РНК и БН-групп по сравнению с 1 контрольной группой.

Практические рекомендации.

1. В комплексном лечении ран мягких тканей целесообразно применение метода аппликационно-инъекционного введения гидролизата коллагена.

2. Осуществление метода аппликационно-инъекционного введения гидролизата коллагена выполняется в 2 этапа. На первом этапе под перпендикулярным углом по отношению к плоскости поверхности раны проводится аппликация 16% гидролизатом коллагена, нагретом до 40±0,1°С, из расчета 1 мл/см2. На втором этапе выполняются инъекции 16% гидролизатом коллагена с температурой до 40±0,1°С по периферии раны под перпендикулярным углом по отно-

шению к плоскости поверхности раны

3. При проведении метода целесообразно использовать устройство для аппли-кационно-инъекционного применения гидролизата коллагена в комплексном лечении ран мягких тканей.

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

1. Фролов Р.Н. Метод аппликационно-инъекционного применения гидролизата коллагена в комплексном лечении ран / Р.Н. Фролов, А.А. Глухов, А.А. Андреев // Материалы межрегиональной научно-практической конференции «Актуальные вопросы хирургии». - Воронеж. - 2012. - С. 85-87.

2. Экспериментально-морфологическое обоснование применения коллагена при лечении ран мягких тканей / А.А. Глухов, Р.Н. Фролов, А.А. Андреев, Н.Т. Алексеева // Современные наукоёмкие технологии. - 2013. - №4. - С. 107108.

3. Глухов А.А. Влияние аппликационно-инъекционного введения гидролизата коллагена на клиническое течение раневого процесса / А.А. Глухов, А.А. Андреев, Р.Н. Фролов // Материалы VII научно-практической конференции актуальные вопросы организации, оказания первичной, специализированной медицинской помощи в условиях многопрофильного стационара и на догоспитальном этапе. - 2013. - С. 92-98.

4. The use of collagen in soft tissue wound healing / R.N. Frolov, A.A. Glukhov, A.A. Andreev, A.G. Karpukhin // International congress and exhibition «Eu-romedica». - Hannover. - 2013. - P. 87-88.

5. Гистохимическая характеристика восстановительных процессов при заживлении ран / А.А. Глухов, Р.Н. Фролов, Н.Т. Алексеева, А.А. Андреев // Фундаментальные исследования. - 2013. - №7. - С. 55-60.

6. Андреев А.А. Лечение ран с помощью аппликационно-инъекционного введения гидролизата / А.А. Андреев, Р.Н. Фролов, Д.Ю. Бугримов // Глобальный научный потенциал. - 2013. - №6. - С. 5-8.

7. Применение гидролизата коллагена в лечении ран мягких тканей/ Р.Н. Фролов, А.А. Глухов, А.А. Андреев, А.Г. Карпухин // Системный анализ и управление в биомедицинских системах. — 2013. — Т. 12, №.7. — С. 634 -637.

Патент Российской Федерации: Устройство для аппликационного и инъекционного применения гидролизата коллагена в комплексном лечении ран мягких тканей Пат. 126601, Российская Федерация, МПК А61М5/175; заявитель и патентообладатель ГБОУ ВПО ВГМА им. Н.Н. Бурденко Минздрава России № 2012118733/14, заявл. 04.05.2012 г. Глухов А.А., Андреев А.А., Фролов Р.Н., Карпухин А.Г.

Подписано в печать 24.10.13. Формат 60*84 Усл. псч. л. 1. Тираж 100 экз. Заказ 1068.

Отпечатано с готового оригинал-макета в типографии Издатсльско-полиграфического центра Воронежского государственного университета. 394000, Воронеж, ул. Пушкинская, 3