Автореферат и диссертация по медицине (14.00.39) на тему:Апоптоз лимфоцитов при ревматоидном артрите

На правах рукописи

иизиБ8514

Рябков Вадим Александрович

АПОПТОЗ ЛИМФОЦИТОВ ПРИ РЕВМАТОИДНОМ АРТРИТЕ

14.00.39 — ревматология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Ярославль — 2007

003068514

Работа выполнена в Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Петрозаводский государственный университет» Федерального агентства по образованию.

Научный руководитель

Официаль

ные оппоненты:

Ведущая с

доктор медицинских наук ВЕЗИКОВА Наталья Николаевна

доктор медицинских наук, профессор ХРУСТАЛЕВ Олег Анатольевич доктор медицинских наук САТЫБАЛДЫЕВ Азамат Махмудович

рганизация — Государственное образовательное учреждение

дополнительного профессионального образования «Санкт-Петербургская медицинская академия последипломного образования Федерального агент-

ства по здравоохранению и социальному развитию».

Защита диссертации состоится 15 мая 2007 года в 12 часов на заседании диссертационного совета Д 208.119.01 при Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Ярославская государственная медицинская академия Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию» по адресу: 150000, г. Ярославль, ул. Революционная, 5.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Ярославской государственной медицинской академии.

Авторефер

ат разослан « апреля 2007 г.

Ученый секретарь диссертаци онного совета

Зотов А. А.

Актуальность проблемы

Ревматоидный артрит (РА) является одним из самых распространенных хронических воспалительных заболеваний суставов, которое поражает людей наиболее трудоспособного возраста, приводя к ранней инвали-дизации и снижению продолжительности жизни больных (Е. JI. Насонов, 2002, И. А. Андрианова, В. Н. Амирджанова и соавт., 2006; О. М. Фоло-меева, Ш. Ф. Эрдес, 2006).

Этиология РА достоверно неизвестна, а используемая патогенетическая терапия не оказывает достаточного эффекта у части больных, что определяет необходимость поиска новых подходов к лечению, основанных на данных о патофизиологии процесса (Е. JI. Насонов, 2004, С. M. Weyand, 2000).

В настоящее время большое внимание в патогенезе РА уделяется изучению апоптоза — генетически запрограммированной формы гибели клетки, обеспечивающей в организме клеточный гомеостаз (А. А. Яри-лин, 1998; А. Н. Богданов, Т. А. Камилова и соавт., 2005; M. Schirmer, А. N. Vallejo et al., 1998; R. M. Pope, 2002).

Внимание к апоптозу как возможному механизму развития и поддержания патологического процесса при РА обусловлено современными представлениями о патофизиологии и патоморфологии заболевания. Поражение суставов в виде синовиальной гиперплазии позволяет предполагать нарушения программированной гибели синовиоцитов, приводящие к формированию паннуса, а местная инфильтрация различными клетками воспаления не исключает дефекты апоптоза лимфоцитов, поддерживающих хроническое течение болезни (А. Н. Богданов, Т. А. Камилова и соавт., 2006; К. Eguchi, 2001; H. Perlman, L. J. Pagliari et al., 2001; R. M. Pope, 2002; К. Itoh, H. Hase et al., 2004).

Менее изученным вопросом является процесс программированной гибели циркулирующих лимфоцитов, нарушение которого может вести к потере иммунологической толерантности в результате увеличения продолжительности жизни и накопления функционально активных аутореак-тивных Т-клеток (А. Н. Богданов, Т. А. Камилова и соавт., 2005; F. M. Bryl, A. D. Foey et al., 2002).

Продолжается изучение роли в нарушениях процесса апоптоза главных его участников — аспартат-специфических протеаз (каспаз (К)), среди которых выделяют активаторы провоспалительных цитокинов, активаторы эффекторных К и эффекторные К — непосредственные исполнители апоптоза (Е. Б. Владимирская, 2002; М. Ю. Григорьев, Е. Н. Имяни-тов, К. П. Хансон, 2003; А. А. Фильченков, 2003; J. М. Adams, 2003).

Проводятся исследования особенностей функционирования при РА основных регуляторов программированной клеточной гибели, в том числе наиболее изученного индуктора апоптоза Fas-лиганда (FasL), экспресси-руемого на активированных Т-лимфоцитах, и его растворимой формы (sFasL) (А. N. Vallejo, М. Schirmer et al., 2000; О. Bohana-Kashtan, С. I. Civin, 2004). Фактор некроза опухоли-альфа (ФНО-а), являющийся одним из основных участников патогенеза РА, в настоящее время рассматривается как регулятср апоптоза с разнонаправленными эффектами от апоптоти-ческой гибели до стимуляции клеточной пролиферации и дифференци-ровки (А. А. Ярилин, 1998). Продемонстрировано влияние интерлейкинов (ИЛ) как про воспалительных цитокинов на активность программированной гибели лимфоцитов синовиальной ткани и периферической крови при РА (К. Eguchi, 2001; Н. Perlman, L. J. Pagliari et al., 2001).

На основании имеющихся данных последнее время предпринимаются попытки создания препаратов, влияющих на апоптоз, — блокаторов рецепторов, регулирующих программированную клеточную гибель, блокаторов ингибиторов апоптоза и средств, модифицирующих активность К (М. D. Smith, J. G. Walker, 2004; U. Fisher, K. Schulze-Osthoff, 2005).

В то же время активация апоптоза считается одним из механизмов патогенетич гского действия рекомендованных для лечения РА базисных противовоспалительных препаратов (БПВП) (Е. JI. Насонов, 2005; М. Cutolo, A. Sulli et al., 2001). Не исключается возможность прогнозирования эффективности базисных средств на основании результатов изучения программированной клеточной гибели (S. Herman, N. Zurgil et al., 2003). Более активное исследование влияния БПВП на апоптоз поможет объяснить различную чувствительность пациентов к имеющимся лекарственным средствам.

Несмотря на признанное участие периферических лимфоцитов в патогенезе РА опубликованные сведения, посвященные нарушениям апоптоза как причине накопления клона аутореактивных Т-клеток, весьма малочисленны. Имеющиеся данные отражают главным образом иммунологические характеристики программированной клеточной гибели in vitro без учета активности, течения заболевания и проводимой терапии.

С учетом вышеизложенного в работе необходимо продолжить изучение интенсивности апоптоза периферических лимфоцитов при различной активности РА и влияния проводимого лечения на программированную клеточную гибель.

Цель исследования

Изучить интенсивность апоптоза периферических лимфоцитов и оценить возможность использования показателей активности программированной клеточной гибели для прогнозирования эффективности проводимой терапии при ревматоидном артрите.

Задачи работы

• Определить интенсивность апоптоза периферических лимфоцитов по активности каспаз-4, -6, -8 и количеству разрывов ДНК у больных ревматоидным артритом.

• Сравнить результаты исследования активности апоптоза периферических лимфоцитов у больных ревматоидным артритом с показателями здоровых доноров и пациентов с остеоартрозом.

• Оценить активность апоптоза периферических лимфоцитов у больных с впервые выявленным и ранее установленным ревматоидным артритом.

• Оценить интенсивность программированной гибели периферических лимфоцитов в зависимости от активности ревматоидного артрита.

• Сопоставить показатели активности апоптоза с основными клинико-лабораторными проявлениями ревматоидного артрита.

• Определить влияние ФНО-а, интерлейкина-2, интерлейкина-6, растворимого Рая-лиганда сыворотки крови на интенсивность апоптоза периферических лимфоцитов.

• Изучить динамику апоптоза периферических лимфоцитов на фоне проводимой базисной терапии.

• Оценить возможность использования показателей активности программированной клеточной гибели для прогнозирования эффективности терапии базисными противовоспалительными препаратами.

Научная новизна работы

В ходе исследования изучены особенности программированной гибели периферических лимфоцитов при ревматоидном артрите и остеоартрозе. Выявлены существенные различия в интенсивности апоптоза при этих заболеваниях.

Впервые методом флуоресценции определена активность каспаз и степень реализации программированной клеточной гибели в виде разрывов ДНК при ревматоидном артрите со сравнительной оценкой показателей при различных стадиях, длительности и активности заболевания. Обнаружена закономерная связь нарушений апоптоза периферических лимфоцитов с активностью ревматоидного артрита.

В работе впервые исследована динамика интенсивности программированной п (бели периферических лимфоцитов на фоне проводимого лечения базисньши противовоспалительными препаратами. Выявлено корреги-рующее влияние эффективной базисной терапии в отношении ассоциированного с воспалительной активностью снижения реализации апоптоза.

Впервые оценена возможность использования показателей активности программированной гибели периферических лимфоцитов в качестве прогностических факторов эффективности лечения базисными противовоспалительными препаратами.

Получе тивности ность базис граммирова] вания выяв определяемы сивности ал ми клинике базисными

Практическая ценность работы

нные результаты позволяют оценить характер изменений ак-оптоза при ревматоидном артрите. В работе показана способных противовоспалительных препаратов индуцировать про-иную гибель периферических лимфоцитов. В ходе исследо-лено, что количество разрывов ДНК и активность каспазы-4, ,ю в динамике методом флуоресценции как показатели интен-оптоза, могут быть использованы в комплексе с традиционны--лабораторными данными для оценки эффективности лечения средствами при ревматоидном артрите.

Положения, выносимые на защиту

1. Для больных ревматоидным артритом характерна более высокая активность апэптоза периферических лимфоцитов, которая существенно отличается от таковой у здоровых.

2. Интенсивность программированной гибели периферических лимфоцитов при ревматоидном артрите зависит преимущественно от активности заболевания.

3. Эффективная терапия базисными противовоспалительными препаратами достоверно снижает активность ревматоидного артрита и усиливает апоптоз периферических лимфоцитов.

Апробация работы

Материалы работы изложены в тезисах V Северо-Западной научно-практическ эй конференции по ревматологии (г. Санкт-Петербург, 2005), Всероссийской молодежной медицинской конференции молодых ученых (г. Омск, 2006), VI Северо-Западной научно-практической конференции по ревматологии (г. Петрозаводск, 2006), I Национального конгресса терапевтов (г. Москва, 2006). Результаты исследования были представлены в виде постерного доклада на VI Северо-Западной научно-практической

конференции по ревматологии (г. Петрозаводск, 2006), обсуждены на совместном заседании кафедры госпитальной терапии Петрозаводского государственного университета и сотрудников ГУЗ «Республиканская больница им. В. А. Баранова» (Республика Карелия, г. Петрозаводск).

Реализация результатов работы

Результаты исследования внедрены в практику работы ревматологического отделения ГУЗ «Республиканская больница им. В. А. Баранова» (Республика Карелия, г. Петрозаводск). Полученные материалы используются в учебном процессе для студентов 5-6 курсов медицинского факультета и врачей, проходящих специализацию по программе повышения квалификации на кафедре госпитальной терапии.

Публикации

По материалам исследования опубликовано 9 печатных работ.

Объем и структура диссертации

Диссертация изложена на 155 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, методов исследования, собственных исследований, представленных в 4 главах, обсуждения, выводов, библиографического указателя литературы, включающего 157 научных работ, из них 83 отечественных и 74 иностранных. Диссертация иллюстрирована 61 таблицей и 11 рисунками.

Материалы и методы исследования

Для решения поставленных целей и задач обследовано 110 больных. В исследуемую группу включено 90 пациентов с РА, диагностированным на основании критериев ACR (F. С. Arnett, S. M. Edworthy et al., 1988). Группы сравнения составили 20 здоровых доноров и 20 больных остео-артрозом (ОА) с преимущественным поражением коленных суставов. Обследование при первичном осмотре и в контрольные сроки наблюдения (3, 6, 12 месяцев) осуществлялось в ревматологическом отделении ГУЗ «Республиканская больница им. В. А. Баранова» (Республика Карелия, г. Петрозаводск).

В исследуемую группу включены 63 (70%) женщины и 27 (30%) мужчин в возрасте от 20 до 74 лет (средний возраст 49,34 ± 11,63 года). Длительность заболевания составила в среднем 14,26 ± 13,31 месяцев, причем у 87 (96,67%) пациентов РА диагностирован впервые или в предшествующие исследованию 36 месяцев.

У всех больных проводилась клиническая оценка общего суставного синдрома (суставной индекс Ричи (СИР), число болезненных суставов (ЧБС), число припухших суставов (ЧПС), утренняя скованность (УС), оценка состояния здоровья и боли пациентом по визуальной аналоговой шкале (ВАШ)) и функционального статуса по вопроснику HAQ. Для определения стадии РА всем больным проводилась рентгенография клинически наиболее пораженных суставов. Общая активность РА оценивалась по индексу DAS4.

Пациентам выполнялось исследование гемограммы, определялись уровень общего белка и белковых фракций, фибриногена, С-реактивного белка с помощью высокочувствительного теста (hsCPB), ревматоидного фактора (РФ), циркулирующих иммунных комплексов (ЦИК). Методом имму-ноферментного анализа исследованы на содержание в сыворотке крови ИЛ-2 28 пациентов, ИЛ-6 — 44, ФНО-а — 50, sFasL — 39 больных.

Оценка апоптоза циркулирующих лимфоцитов проводилась по активности К4, Кб и К8 через 30, 60, 120, 150 и 180 минут после начала реакции флуоресценции (ФЦ) с использованием специфических субстратов К (для К4 (активатор цитокинов) — WEHD (Trp=Glu=His=Asp), для К8 (активатор :>ффекторных К) — LETD (Leu=Glu=Thr=Asp), для Кб (эффек-торная К) — VEID (Val=Glu=Ile=Asp)) и по выявлению количества 2-ни-тевых и 1 -I итевых разрывов ДНК методом ФЦ ДНК-тропных красителей — бромистого этидия (EtBr) и 4',6-диамидино-2-фенилиндола (DAPI). Клиническая характеристика больных представлена в таблице 1.

Таблица 1

Клиническая характеристика исследуемой группы

Характе жстика заболевания Число пациентов % больных

Серопозшт вный вариант 59 65,56

Серонегати вный вариант 31 34,44

Системные проявления 57 63,33

Рентгенологическая стадия

Нет измене 1ИЙ 8 8,89

I 5 5,56

II 59 65,55

III 15 16,67

IV 3 3,33

Степень активности

I 23 25,56

II 45 50,00

III 22 24,44

Окончание таблицы 1 Клиническая характеристика исследуемой группы

Характеристика заболевания Число пациентов % больных

Функциональная недостаточность

0 13 14,44

I 42 46,67

II 34 37,78

III 1 1,11

Все больные РА были разделены на 3 группы в зависимости от длительности заболевания и особенностей проводимого лечения. Группу впервые диагностированного РА (ВДРА) составили 25 (27,78%) пациентов, которые были включены в исследование сразу после установления диагноза. Больные этой группы имели начальные клинические проявления заболевания длительностью менее 6 месяцев и никогда ранее не получали БГТВП.

В группу пациентов с ранее диагностированным РА, получающих постоянную базисную терапию (БПБТ) на протяжении 3 и более месяцев перед исследованием, включено 39 (43,33%) больных — в качестве базисного средства использовался главным образом метотрексат в дозе 7,5— 20 мг/нед. (в среднем 11,82 ± 3,47 мг/нед.).

Группу пациентов с установленным ранее РА, не принимающих базисные препараты (БНБП) по разным причинам более 3 месяцев перед первичным осмотром, составили 26 (28,89%) больных. Общая характеристика групп представлена в таблице 2, клиническая характеристика — в таблице 3.

Таблица 2

Общая характеристика групп пациентов

Характеристика группы ВДРА (п = 25) БНБП (п = 26) БПБТ (п = 39)

Возраст, годы 50,96+ 11,51 46,58+ 14,21 50,15 + 9,62

Длительность РА, мес 20,77+ 13,11 19,05 ± 10,73

кол-во % кол-во % кол-во %

Женщины 18 72,00 17 65,38 28 71,79

Мужчины 7 28,00 9 34,62 11 28,21

Таблица 3

Клиническая характеристика групп пациентов

Характерж тика группы ВДРА (п = 25) БНБП (п = 26) БПБТ (п = 39)

о а ■ § а % 0 а 1 % о а • о а %

СеропозитиЕ ный вариант 16 64,00 18 69,23 25 64,10

Серонегати! шый вариант 9 36,00 8 30,77 14 35,90

Рентгенологическая стадия

Нет изменер :ий 7 28,00 0 0,00 1 2,56

I 1 4,00 2 7,69 2 5,13

II 14 56,00 17 65,38 28 71,80

III 3 12,00 6 23,08 6 15,38

IV 0 0,00 1 3,85 2 5,13

Степень активности

I 3 12,00 7 26,92 13 33,33

II 17 68,00 12 46,16 16 41,03

III 5 20,00 7 26,92 10 25,64

Функциональная недостаточность

0 1 4,00 4 15,38 8 20,51

I 14 56,00 14 53,85 14 35,90

II 10 40,00 8 30,77 16 41,03

III 0 0,00 0 0,00 1 2,56

Рекомендованная после первичного обследования базисная терапия включала преимущественно метотрексат в дозе 7,5—20 мг/нед. (в среднем 11,13 + ^ ,24 мг/нед.) — у 75 (83,33%) пациентов, а также сульфасала-зин в дозе 2 г/сут. — у 11 (12,22%) больных. В течение всего времени наблюдения 8 больных по разным причинам не получали БПВП. Нестероидные противовоспалительные препараты на момент первичного осмотра использовались у 62 (68,89%) пациентов. Глюкокортикостероиды (ГКС) получали 11 (12,22%) больных, из них 7 в виде Ьпс^е-терапии, 2 в виде пульс-терапии в связи с высокой некупируемой активностью болезни. Сохраняющаяся высокая активность РА на фоне максимально переносимых доз метотрексата послужила причиной постоянного приема преднизо-лона до 10 мг/сут. еще у 2 пациентов. 42 (46,67%) пациента в течение 12 месяцев перед исследованием получили внутрисуставное введение ГКС.

В качестве группы сравнения обследовано 20 больных OA с преимущественным поражением коленных суставов. Среди пациентов было 17 (85%) женщин и 3 (15%) мужчин. Средний возраст составил 59,70 ± 10,32 года при средней длительности заболевания 5,80 ± 5,59 года.

Показатели активности апоптоза периферических лимфоцитов у больных РА и OA оценивались в сравнении с показателями 20 здоровых доноров в возрасте от 17 до 58 лет.

Результаты исследования обрабатывались с помощью IBM-совместимого компьютера с процессором Pentium с использованием Microsoft Office Excel 2003 и пакета статистических программ Statistica 6.0. Перед проведением статистического анализа количественные признаки проверялись на нормальность распределения с помощью критерия Шапиро-Уилка. Для нормально распределенных признаков определялись средние величины и стандартное отклонение (М ± s, где М — среднее арифметическое, s — стандартное отклонение), для признаков, распределенных отлично от нормального, — медиана и интерквартильный размах (A (L—Н), где А — медиана, L — нижний квартиль, Н — верхний квартиль). Статистический анализ проводился непараметрическими методами — сравнение методами ANOVA Краскела-Уоллиса (для 3 и более независимых групп), Манна-Уитни (для 2 независимых групп), Вилкоксона (для 2 зависимых групп) и анализ корреляции методом Спирмена (О. Ю. Реброва, 2003).

Результаты исследования и их обсуждение

Активность апоптоза, определяемая по количеству 1- и 2-нитевых разрывов ДНК, оказалась достоверно выше при РА по сравнению со здоровыми донорами и пациентами с OA без синовита. Результаты представлены в таблице 4.

Таблица 4

Количество 1- и 2-нитевых разрывов ДНК

Флуоресценция ДНК-тропных красителей

EtBr DAPI

Ревматоидный артрит (п = 90) 6,01 ±0,40*** 31,10 ± 3,00***

Остеоартроз, синовит есть (п = 10) 5,65 + 0,41** 30,20 + 2,69*

Остеоартроз, синовита нет (п = 10) 5,20 ±0,11 28,70 ± 1,19

Здоровые доноры (п = 20) 5,20 ±0,19 28,06 ± 0,98

Достоверность различий при сравнении с показателями здоровых доноров отмечена в таблице * при р < 0,05, ** при р < 0,01 и *** при р < 0,001.

Высок; здоровыми активатора эффектов.

ая активность К4 при РА по сравнению с больными ОА и донорами, отмечаемая на рис. 1, объясняется ролью К4 как цитокинов и участием ее в реализации провоспалительных

0,0881 ± : 0,0140***

0,0536 ± ± 0,0439**

0,0140 ± ±0,0120

0,0096 ± ± 0,0005

РА

ОА с синовитом

ОА без синовита

Здоровые доноры

Рис. 1. Активность К4 в исследуемой группе Достоверность различий при сравнении с показателями здоровых доноров отмечена ** при р < 0,01 и *** при р < 0,001.

Высоки е показатели К8 и Кб, отраженные на рис. 2, предполагают ведущую роль в индукции программированной клеточной гибели мембранных «рецегторов смерти». Значение К8 как активатора эффекторной Кб подтверждается положительной корреляцией показателей (р < 0,001).

Отмечена положительная корреляция уровня К8 с числом припухших суставов (р < 0,01), длительностью УС (р < 0,05), уровнем ЬбСРБ (р < 0,05), что может отражать индукцию К8 при более высокой активности ревматоидного воспаления. Вместе с тем количество разрывов ДНК при более высокой активности К8 и Кб оказалось ниже (для 1-нитевых разрывов ДНК коэффициент корреляции (г) от -0,349 до -0,361, р < 0,001). Таким образом, при РА отмечено ассоциированное с показателями активности болезни повышение: активности К8, тем не менее не реализующееся в полной мере в виде разрывов ДНК.

Не отмечено увеличения интенсивности программированной клеточной гибели при более высоких степенях активности РА, как не выявлено зависимости апоптоза от стадии и длительности заболевания (р > 0,05). Не выявлено достоверных различий показателей активности программированной клеточной гибели при наличии или отсутствии системных проявлений (р > 0,05).

0,015

0,0125 0,01 -0,0075 -0,005

о о о"

-н

о о"

г-м о о о"

-н

о о"

о о о •

-Н-

о о

о о о" -н с* о

о

о"

-о о'

-н ®

р

о о

о о о" ■н

о о

о о О '

о"

-н

оо № О '

о &

о о о о"

о о'

РА

ОА с синовитом

ОА без синовита

Здоровые доноры

□ Каспаза-8

□ Каспаза-6

Рис. 2. Активность К8 и Кб в исследуемой группе Достоверность различий при сравнении с показателями здоровых доноров отмечена ** при р < 0,01 и *** при р < 0,001.

На основании более высокой активности К8 при серопозитивном РА по сравнению с сопоставимой группой пациентов с серонегативным вариантом (р < 0,05) при отсутствии достоверных различий по количеству разрывов ДНК можно предполагать связь обычно более тяжелого течения заболевания у серопозитивных больных с недостаточной реализацией активности К8.

В ходе работы ни один из исследуемых цитокинов (ИЛ-2, ИЛ-6, ФНО-а) не продемонстрировал достоверного влияния на активность апоптоза периферических лимфоцитов. ИЛ-6 показал закономерную положительную корреляцию с ФНО-а (г = 0,472, р < 0,05) и основными острофазовыми показателями (р < 0,01). Учитывая, что согласно методике определения у большинства здоровых лиц уровень ИЛ-6 в сыворотке крови

ниже порога детекции, а в исследуемой группе больных РА концентрация цитокина не определялась только у 3 (6,82%) пациентов, очевидна его роль как маркера воспалительной реакции. Содержание ИЛ-6 в сыворотке крови у пациентов с системными проявлениями болезни (34,42 (8,23—135,29) пг/мл) по сравнению с группой больных без системных проявлений (6,50 (3,59—18,64) пг/мл) было достоверно выше (р < 0,01).

БраэЬ выявлен у 14 (35,9%) из 39 обследованных при отсутствии детектируемых уровней в крови здоровых доноров согласно методике исследования. Не выявлено корреляции показателей активности апоптоза с концентрациями БравЬ или различий в группах больных с определяемым уровнем лиганда и концентрациями его ниже 0,1 нг/мл.

По резул ьтатам сравнительной оценки исходных показателей интенсивности программированной клеточной гибели при сопоставимой активности болезни количество разрывов ДНК у пациентов с впервые диагностированном и ранее установленным РА достоверно не различались.

В исследуемой группе на фоне терапии БПВП в течение года отмечено достоверное снижение индекса ОА84 и улучшение функционального статуса по НАС) при повышении количества разрывов ДНК. Результаты отражены на рис. 3.

3,05 ± 1,18

0,665

0,951

31,01 4 3,13

- . . 2,83 ± 1,24

~ "31,95± 2,55 0,806 ± 0,696*

32,59 ±3,65*

2,51 ± 1,18**

0,703 ± 0,594**

Исходно

6 месяцев

12 месяцев

ПА84

I— ФЦ БАР!

НЛО

Рис. 3. Динамика индекса ОА84, НАС* и количества 1-нитевых разрывов ДНК в исследуемой группе на фоне терапии БПВП в течение 1 года Достоверность различий при сравнении с исходными показателями отмечена

* при р < 0,05, ** при р < 0,01 и *** при р < 0,001.

Указанная закономерность сохранялась в группе ВДРА, в которой кроме этого отмечено увеличение активности К8 и Кб (р < 0,05), за счет чего может повышаться интенсивность апоптоза периферических лимфоцитов. Снижение в течение 12 месяцев уровня К4, показанное на рис. 4, отражает уменьшение выраженности воспалительной реакции.

В группе БНБП в течение года также отмечено снижение активности болезни и улучшение функционального статуса, сопровождающееся увеличением количества разрывов ДНК.

В группе БПБТ не продемонстрировано существенной динамики индекса ПА84, показателей НАС? и реализации апоптоза (р > 0,05). Учитывая, что основную часть обследованных составляли пациенты стационара, можно предположить исходно недостаточный эффект рекомендованных базисных средств или развитие резистентности к ним, послужившие причиной очередной госпитализации.

Проведен анализ динамики активности апоптоза в зависимости от эффективности проводимой терапии, которая оценивалась по критериям АСИ. и ЕиЬА11. Больные с удовлетворительным или хорошим эффектом по критериям ЕЦЪАЯ, а также 20%, 50% и 70% улучшением по критериям

0,095 л 0,09 -0,085 0,08 0,075 -0,07 -0,065

0,0901 ±0,0148

0,0880 ± 0,0204

0,0669 ±0,0249**

Исходно

6 месяцев

12 месяцев

Рис. 4 Активность К4 в группе ВДРА на фоне терапии БПВП в течение 1 года Достоверность различий при сравнении с исходными показателями отмечена * при р < 0,05, ** при р < 0,01 и *** при р < 0,001.

АСЯ состави

«неответчию

ни группу «ответчиков». Пациенты, у которых была констати-

рована неэффективность лечения базисными средствами, вошли в группу

>в».

«Ответчики» продемонстрировали тенденцию к росту количества 1-нитевых разрывов ДНК как за счет увеличения активности К, так и за счет более продуктивной реализации имеющейся активности ферментов. В группе «неответчиков» при незначительном повышении количества

1-нитевых разрывов ДНК отмечено достоверное снижение количества

2-нитевых разрывов (р < 0,05). Динамика интенсивности ФЦ ОАР1 представлена на рис. 5.

33 -|

32,5 -

32 -31,5 31

30,5 -

30

32,87 ± 2,70

31,03 ±3,20' 30,91 ±3,41

31,44 ±2,33

Исходно

6 месяцев

«Ответчики»

«Неответчики»

Ряс. 5. Динамика количества 1-нитевых разрывов ДНК в зависи мости от эффективности терапии БПВП в течение 6 месяцев

Повышение индекса ОАБ4 к 6 месяцам в группе «неответчиков» сопровождалось увеличением активности К4 при обратной динамике у больных с эффективной терапией БПВП — данные отражены на рис. 6.

Для определения прогностической ценности результатов исследования апоптоза было проведено попарное сравнение исходных данных по активности К и количеству разрывов ДНК в группах «неответчиков» и «ответчиков». Результаты анализа не позволяют говорить о прогностической ценности показателей активности программированной клеточной гибели в отношении эффективности проводимой терапии БПВП. Не было выявлено достоверных различий и при сравнении исходных уровней ИЛ-2, ИЛ-6, ФНО-а, вР^Ь (р > 0,05).

0,0625 -

0,06 -

0,0575 -

0,055

0,0609 ±0,0165

ш'

0,0565 ±0,0113

0,0626 ±0,0152* /В

0,0601 ±0,0186

Исходно

6 месяцев

«Ответчики»

I™ «Неответчики»

Рис. 6. Динамика активности К4 в зависимости от эффективности терапии БПВП в течение 6 месяцев Достоверность различий при сравнении с исходными показателями отмечена

* при р < 0,05, ** при р < 0,01 и *** при р < 0,001.

Для оценки влияния метотрексата на активность РА и интенсивность программированной клеточной гибели проведен анализ эффективности лечения у 23 пациентов групп ВДРА и БНБ1Т, начавших терапию препаратом с момента включения в исследование и продолжавших ее в течение всего времени наблюдения без перерывов и смены базисного средства. Динамика основных клинико-лабораторных данных представлена в таблице 5.

На фоне снижения индекса ОАБ4 и улучшения функционального статуса отмечена тенденция к повышению количества 1-нитевых разрывов ДНК в группе «ответчиков» на терапию метотрексатом. Как и в общей группе, уровень К4 повышался у «неответчиков» и снижался у «ответчиков» на фоне соответствующей динамики активности РА к 12 месяцам.

Таблица 5

Динамика клинико-лабораторных показателей на фоне терапии метотрексатом в течение 1 года

Показател и Исходно Время от начала терапии метотрексатом

3 месяца 6 месяцев 12 месяцев

ОА84 3,46 ±0,91 2,69 ±0,82** 2,77 ±1,08 2,32 ±1,10**

НАО 1,266 ±0,686 0,771 ±0,561** 0,862 ±0,659* 0,725 ± 0,693*

ЧБС 6,0(4,0—16,0) 4,0(2,25—9,0) 7,0(1,0—12,0) 4,0(1,0—12,0)

ЧПС 9,0 (3,5—13,0) 6,5 (3,0—9,75) 5,0(2,0—9,0) 2,0 (0,0—5,0)*

СИР 5,0(4,0—11,0) 4,0 (2,25—7,75)* 5,0(1,0—9,5) 4,0(1,0—8,5)

ВАШ боль, мм 50,0 (43,5—55,0) 42,0 (25,75—50,25)* 43,0 (25,0—50,0) 32,0 (8,0—43,0)*

ВАШ активность, м м 45,0 (39,0—50,0) 32,0 (22,75—46,5)* 45,0 (22,5—53,5) 33,0 (8,0—42,5)*

УС, мин 90,0 (42,5—165,0) 25,0 (11,25—60,0) 30,0 (17,5—150,0)* 10,0 (0,0—40,0)**

ЬэСРБ, мг/л 14,50 (3,47—35,35) — 5,96 (3,73—11,20)* 3,83 (1,86—9,37)

фибриноген, и 5,5 (4,4—6,6) — 4,7 (3,7—5,7) 4,3 (3,8—4,6)**

а2-глобулин, г/л 8,35 ± 1,50 — 6,43+0,86** 6,90 ±0,83*

РФ, МЕ/мл 64(16—256) 64 (0—128) 64 (8—256) 96 (32—256)

ЦИК, ед опт ГШ 0,135 ±0,049 — 0,103 + 0,041** 0,128 ±0,057

СОЭ, мм/ч 30,0 (21,0—43,5) 19,0 (16,0—28,0)** 13,0 (10,0—29,0)** 14,0 (9,5—24,0)**

Достоверность различий по сравнению с исходными показателями отмечена в таблице * при р < 0,05, ** при р < 0,01 и *** при р < 0,001.

По результатам анализа исходных показателей интенсивности программированной гибели периферических лимфоцитов в группах «ответчиков» и «неответчиков» не представляется возможным рассматривать активность К и количество разрывов ДНК как прогностические факторы эффективности терапии метотрексатом.

1. У больны апоптоз л вышенно] разрывов

ВЫВОДЫ

х ревматоидным артритом имеет место более интенсивный лмфоцитов периферической крови, определяемый в виде по-количества 1-нитевых (31,10 ± 3,00) и 2-нитевых (6,01 ± 0,40) ДНК по сравнению со здоровыми донорами (28,06 ± 0,98

го

и 5,20 ± 0,19) и больными остеоартрозом без синовита (28,70 ± 1,19 и 5,20 ±0,11).

2. Интенсивный апоптоз циркулирующих лимфоцитов при ревматоидном артрите может быть опосредован более высокой активностью каспазы-8 (0,0127 ± 0,0032) и каспазы-6 (0,0119 ± 0,0027) по сравнению со здоровыми донорами (0,0098 ± 0,0007 и 0,0101 ± 0,0008).

3. Каспаза-4 лимфоцитов периферической крови как активатор цито-кинов имеет более высокую активность при ревматоидном артрите (0,0881 ± 0,0140), чем у здоровых доноров (0,0096 ± 0,0005), больных остеоартрозом без синовита (0,0140 ± 0,0120) и с синовитом (0,0536 ± ± 0,0439).

4. При ревматоидном артрите имеет место ассоциированное с показателями активности болезни (число припухших суставов, длительность утренней скованности, С-реакгивный белок) повышение уровня каспазы-8 периферических лимфоцитов (г от 0,227 до 0,315, р < 0,05), не реализующееся в полной мере увеличением количества разрывов ДНК.

5. Активность апоптоза периферических лимфоцитов, определяемая по количеству разрывов ДНК, не зависит от стадии и длительности ревматоидного артрита.

6. Повышенная продукция ФНО-а, интерлейкина-2, интерлейкина-6, растворимого РаБ-лиганда при ревматоидном артрите не оказывает влияния на активность каспаз и реализацию апоптоза периферических лимфоцитов в виде разрывов ДНК.

7. Исследование активности апоптоза периферических лимфоцитов согласно полученным данным не позволяет прогнозировать эффект назначаемой базисной терапии у больных ревматоидным артритом.

8. Эффективная терапия базисными средствами, достоверно снижая активность ревматоидного артрита (ОА84 с 3,49 ± 1,07 до 2,08 ± 0,85 за 6 месяцев), усиливает программированную гибель периферических лимфоцитов, что проявляется увеличением количества 1-нитевых разрывов ДНК (с 31,03 ± 3,20 до 32,87 ± 2,70) на фоне уменьшения активности каспазы-4.

9. Эффективная терапия ревматоидного артрита метотрексатом (ОА84 с 3,70 ± 1,15 до 1,92 ± 0,90 за 12 месяцев) увеличивает реализацию апоптоза периферических лимфоцитов в виде 1-нитевых разрывов ДНК (с 30,93 ± 1,30 до 32,74 ±4,12) без индукции активности каспаз.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

Определение реализации апоптоза периферических лимфоцитов в виде количества разрывов ДНК в сочетании с исследованием активности каспазы-4 методом флуоресценции может быть использовано для оценки эффективности базисной терапии в дополнение к традиционным клинико-лабораторным данным.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Варга О. Ю., Рябков В. А., Хейфец Л. М. Влияние метотрексата на активность апоптоза лимфоцитов при ревматоидном артрите. V СевероЗападная конференция по ревматологии. Тез. докл. Санкт-Петербург. 2005: 30—¿1.

2. Варга О. Ю., Рябков В. А., Хейфец Л. М. Прогностическая значимость активности апоптоза лимфоцитов при ревматоидном артрите. Мед. акад. ж. 2005; 3 (приложение 7): 16—18.

3. Варга О. Ю., Рябков В. А. Апоптоз: понятие, механизмы реализации, значение. Экология человека 2006; 7: 28—32.

4. Рябков В. А., Варга О. Ю. Влияние активности ревматоидного артрита на качество жизни больных и показатели липидного спектра. III научная конференция с международным участием «Интервенционная радиология». Тез. докл. Петрозаводск. 2006: 113—115.

5. Рябков В. А., Варга О. Ю. Взаимосвязь между активностью заболевания, активностью апоптоза периферических лимфоцитов и нарушениями липидного обмена при ревматоидном артрите. VI Северо-Западная научно-практическая конференция по ревматологии. Тез. докл. Петрозаводск.

2006: 164-4-165.

6. Рябков В. А., Варга О. Ю. Влияние основных цитокинов на активность апоптоза циркулирующих лимфоцитов при ревматоидном артрите. VI Северо-Западная научно-практическая конференция по ревматологии. Тез. докл. Петрозаводск. 2006: 166—167.

7. Рябков В. А. Фактор некроза опухоли-альфа и кардиоваскулярный риск у больных ревматоидным артритом. I Всероссийская молодежная медицинская конференция молодых ученых «Экстремальные и терминальные состояния», Тез. докл. Омск. 2006: 71—72.

8. Варга О. Ю., Игнатьев В. К., Рябков В. А., Волкова Т. О., КручекМ. М. Активность генетически запрограммированной смерти лимфоцитов при ревматоидном артрите. Тер. архив 2006; 6: 14—19.

9. Рябков В. А., Везикова Н. Н., Варга О. Ю. Активность апоптоза циркулирующих лимфоцитов при ревматоидном артрите. I Национальный конгресс терапевтов. Тез. докл. Москва. 2006: 189.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

БНБП — больные, не получающие базисные препараты в течение 3 и более месяцев перед включением в исследование

БПБТ — больные, получающие базисную терапию в течение 3 и более месяцев перед включением в исследование

БПВП — базисный противовоспалительный препарат

ВАШ — визуальная аналоговая шкала

ВДРА — впервые диагностированный ревматоидный артрит

ГКС — глюкокортикостероиды

ИЛ — интерлейкин

К — каспаза

ОА — остеоартроз

РА — ревматоидный артрит

РФ — ревматоидный фактор

СИР — суставной индекс Ричи

УС — утренняя скованность

ФНО-а — фактор некроза опухоли-альфа

ФЦ — флуоресценция

ЦИК — циркулирующие иммунные комплексы

ЧБС — число болезненных суставов

ЧПС — число припухших суставов

АСЯ — Американская Коллегия ревматологов

БАР! — 4',6-диамвдино-2-фенилиндол

DAS —I- индекс активности заболевания

EtBr —- бромистый этидий

EULAR — Европейская противоревматическая Лига

FasL — Fas-лиганд

hsCPB -4 С-реактивный белок, определенный с помощью высокочувствительного теста

sFasL — растворимая форма Fas-лиганда

Подписано в печать 05.04.07. Формат 60x84Бумага офсетная. Уч.-изд. л. 1. Тираж 100 экз. Изд. № 96. Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования ПЕТРОЗАВОДСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ

Отпечатано в Издательстве ПетрГУ 185910, г. Петрозаводск, пр. Ленина, 33