Автореферат и диссертация по медицине (14.00.36) на тему:Апоптоз клеток иммунной системы и его регуляция у женщин в климактерическом периоде

/

На правах рукописи

ВАСИЛЬЕВА Ирина Александровна

АПОПТОЗ КЛЕТОК ИММУННОЙ СИСТЕМЫ И ЕГО РЕГУЛЯЦИЯ У ЖЕНЩИН В КЛИМАКТЕРИЧЕСКОМ ПЕРИОДЕ

14.00.36 - аллергология и иммунология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

г 1 ОКТ 2009

Москва 2009

003478150

Работа выполнена в Федеральном государственном учреждении «Ивановский научно-исследовательский институт материнства и детства имени В.Н. Городкова Федерального агентства по высокотехнологичной медицинской помощи»

Научный руководитель:

доктор медицинских наук,

профессор Сотникова Наталья Юрьевна

Официальные оппоненты:

академик РАЕН, доктор

медицинских наук, профессор Ярилин Александр Александрович доктор медицинских наук,

профессор Козлов Иван Генрихович

Ведущая организация:

Федеральное государственное учреждение «Научный центр акушерства, гинекологии и перинатологии имени академика В.И. Кулакова Федерального агентства по высокотехнологичной медицинской помощи»

Защита состоится «У??» О^ПЛ^/г^ 2009 года в 14.00 часов на заседании диссертационного совета Д 208.072.05 при ГОУ ВПО РГМУ Рос-здрава по адресу: 117997, г. Москва, ул. Островитянова, д. 1.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГОУ ВПО РГМУ Росздрава по адресу: 117997, г. Москва, ул. Островитянова, д. 1

Автореферат разослан« » 2009 года

Ученый секретарь диссертационного Совета,

кандидат медицинских наук, доцент Кузнецова Т. Е.

АКТУАЛЬНОСТЬ НАУЧНОГО ИССЛЕДОВАНИЯ

С возрастом изменяются многие функции организма, в том числе и иммунной системы (Семенков В.Ф., Карандашов В.И., Ковальчук Л.В., 2005). Экспериментальные и клинические исследования в геронтологии показали, что иммунная защита организма является первой системной функцией, которая нарушается при старении (Хавинсон В.Х., Анисимов В.Н., 2003). Симптомы старости появляются уже в конце репродуктивного периода и становятся более интенсивными по мере дальнейшего старения (Хавинсон В.Х., Анисимов В.Н., 2009).

Иммунная и эндокринная системы находятся в тесной взаимосвязи, направленной на поддержание постоянства внутренней среды организма (Ширшев C.B., 2002; Olsen N.J., Kovacs W.J., 1996). Нарушение этого взаимодействия ведет к развитию ряда заболеваний (Olsen N.J., Kovacs W.J., 1996; Elmore S., 2007). На современном этапе доказано, что изменение уровня половых стероидных гормонов отражается на функциональном состоянии иммунной системы (Bebo B.F. et al., 2001; Pfelscifter J. et al., 2002).

Следующим периодом в жизни женщины после фертильного является климактерический период. Падение уровня циркулирующих эстрогенов и прогестерона в пременопаузалыюм периоде и крайне низкий их уровень в постменопаузальном периоде определяет возникновение симптомов эстрогендефицитного состояния (Minici F. et al., 2007) и приводит к нарушению функции иммунной системы (Kamada M. et al., 2000; Kumru S. et al., 2004). Наступление климактерического периода сочетается с возникновением аутоиммунных, опухолевых и инфекционно-воспалительных процессов, что подтверждает нарушение функции иммунной системы (Effros R.B., 2003). Как известно, данные патологические процессы, могут быть связаны с изменением апоптоза клеток иммунной системы (Reed J.S., 2000; Hakim F.T. et al., 2004; Schmitt E. et al., 2007; Elmore S., 2007). Утверждается, что различие между старыми и молодыми многоклеточными организмами состоит, прежде всего, в количестве функционирующих клеток в органе или ткани: с возрастом это количество в большинстве органов уменьшается из-за стимуляции митохондриального пути апоптоза (Северин Ф.Ф., Скулачёв В.П., 2009). Поскольку уровень половых стероидных гормонов изменяется в зависимости от стадии климактерического периода, представляется целесообразным изучение параметров апоптоза как в пременопаузальном, так и в постменопаузальном периодах. Однако особенности апоптоза клеток иммунной системы у женщин как в

пременопаузальном, так и постменопаузальном периодах остаются не изученными.

В настоящее время широко используется заместительная гормональная терапия (ЗГТ) у женщин климактерического периода, однако механизмы действия препаратов ЗГТ остаются недостаточно изученными. Более того, имеются данные, свидетельствующие об онкоген-ном потенциале препаратов ЗГТ (СЫеЬошэк! Я.Т. ег а1., 2003; Рге1еую в.М. а!., 2005), Современные препараты ЗГТ, содержащие в своем составе эстрогены и прогестины, обладают положительным клиническим эффектом, элиминируя симптомы эстрогендефицитного состояния (Сметник В.П., Кулаков В.И., 2001). Известно, что экзогенные половые стероидные гормоны: эстрогены и прогестерон способны модулировать функцию иммунной системы и процессы апоптоза (Riggs В.Ь. й а1., 2002). В связи с этим изучение влияния препаратов ЗГТ на апоптоз клеток иммунной системы и параметры его регуляции становится особенно актуальным. Однако, сведения о влиянии заместительной гормональной терапии на апоптоз клеток иммунной системы малочисленны.

Цель научного исследования

Установить особенности регуляции Раз-зависимого апоптоза клеток иммунной системы периферической крови и эндометрия женщин в пре- и постменопаузальном периоде и оценить влияние препаратов заместительной гормональной терапии на характеристики апоптоза.

Задачи исследования

1. Установить особенности апоптоза клеток иммунной системы на системном и локальном уровне у женщин в пременопаузальном и постменопаузальном периодах по сравнению с параметрами женщин репродуктивного возраста.

2. Выявить особенности сывороточного содержания регулирующих апоптоз факторов у женщин в пре- и постменопаузальном периодах.

3. Оценить экспрессию мРНК регулирующих апоптоз факторов в ткани эндометрия у женщин в пре- и постменопаузальном периодах.

4. Установить характер влияния препаратов заместительной гормональной терапии на апоптоз клеток иммунной системы периферической крови и эндометрия у женщин постменопаузального периода.

Научная новизна исследования

Впервые установлено, что у женщин в климактерическом периоде в отличие от женщин фертилыюго возраста снижается апоптоз лимфоцитов и моноцитов периферической крови преимущественно за счет снижения содержания клеток, находящихся на ранних этапах апоптоза, что сочетается со снижением уровня моноцитов, способных индуцировать апоптоз.

Установлены закономерности апоптоза лимфоцитов и макрофагов эндометрия в пременопаузальном и постменопаузальном периодах, проявляющиеся в пременопаузе снижением уровня лимфоцитов находящихся на ранних этапах апоптоза и повышением количества апоптирующих макрофагов, а в постменопаузальном периоде - снижением уровня апоптирующих лимфоцитов и макрофагов.

Установлены особенности сывороточного содержания факторов, регулирующих апоптоз, в климактерическом периоде, характеризующиеся в пре- и постменопаузе снижением содержания вРавЬ и р53, дополнительно в пременопаузе - снижением уровня БраБ по сравнению с параметрами женщин фертильного возраста.

У женщин в пременопаузальном периоде выявлено снижение экспрессии клетками эндометрия мРНК Х1АР, а в постменопаузе - повышение экспрессии мРНК Х1АР и р53 в ткани эндометрия.

Впервые установлены закономерности изменения содержания РазЬ+ моноцитов, снижение которого ассоциируется с наличием хронического эндометрита у женщин в климактерическом периоде.

Впервые установлено, что препараты заместительной гормональной терапии у женщин в постменопаузальном периоде оказывают влияние на апоптоз клеток иммунной системы периферической крови и эндометрия и регулирующие его факторы, усиливая апоптоз лимфоцитов периферической крови, снижая сывороточное содержание бР^ и р53, а также уровень экспрессии мРНК р53 в ткани эндометрия.

Выявлены различия в действии препаратов заместительной гормональной терапии на параметры апоптоза клеток иммунной системы периферической крови и эндометрия: препарат «Климодиен» в большей степени усиливает апоптоз-индуцирующую способность периферических лимфоцитов и моноцитов, а препарат «Анжелик» усиливает апоптоз лимфоцитов эндометрия.

Практическая значимость исследования

Разработаны нормативы параметров апоптоза периферических и эндометриальных клеток иммунной системы у женщин климактерического периода.

Разработан и предложен способ диагностики хронического эндометрита у женщин в постменопаузальном периоде (приоритетная справка № 2009115014 от 20.04.2009).

Выявлены особенности влияния препаратов заместительной гормональной терапии на параметры Раз-зависимого апоптоза у женщин климактерического периода, что может использоваться в обосновании выбора терапии.

Внедрение результатов исследования

Результаты диссертационной работы внедрены в практическую деятельность центра планирования семьи и репродукции ФГУ «Ив НИИ М и Д им. В.Н. Городкова Росмедтехнологий», консультативно-диагностической поликлиники ФГУ «Ив НИИ М и Д им. В.Н. Городкова Росмедтехнологий» и хирургического отделения НУЗ «Отделенческая больница на станции Иваново ОАО «Российские железные дороги».

Положения, выносимые на защиту

У женщин с наступлением менопаузы в отличие от женщин фер-тильного возраста на системном и локальном уровне нарушается Раз-зависимый апоптоз клеток иммунной системы и его регуляция, что проявляется угнетением апоптоза периферических и эндометриальных лимфоцитов, апоптоз-индуцирующей способности моноцитов, готовности к апоптозу макрофагов эндометрия и снижением сывороточного уровня вРазЬ и р53. Параметры апоптоза клеток иммунной системы зависят от стадии климактерического периода и в большей степени проявляются в постменопаузальном возрасте.

Препараты заместительной гормональной терапии восстанавливают апоптоз лимфоцитов, но снижают содержание факторов, регулирующих апоптоз, как на системном, так и на локальном уровне. В действии препаратов заместительной гормональной терапии на параметры апоптоза существуют различия, которые могут быть обусловлены особенностями содержания синтетических эстрогенов и прогестинов.

Снижение содержания в крови РавЬ-позитивных моноцитов может служить диагностическим критерием хронического эндометрита у женщин постменопаузального периода.

Апробация

Материалы диссертации доложены и обсуждены на научной конференции «Молодая наука - развитию Ивановской области» (Иваново, 2006), на научно-практической конференции студентов и молодых ученых ИвГМА «Неделя науки - 2007» в рамках областного фестиваля «Молодая наука — развитию Ивановской области» (Иваново, 2007), на научно-практической конференции студентов и молодых ученых ИвГМА «Неделя науки - 2008» в рамках областного фестиваля «Молодая наука - развитию Ивановской области» (Иваново, 2008), на научно-практической конференции молодых ученых, посвященной дню памяти основателя института В.Н. Городкова (Иваново, 2009), на научных чтениях, посвященных памяти академика В.И. Кулакова (Москва, 2009), на 13 Всероссийском форуме с международным участием «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге» (Санкт-Петербург, 2009).

Публикации

По теме диссертации опубликовано 17 печатных работ, в том числе 6 - в журналах, рекомендованных ВАК Минобразования и науки РФ.

Объём и структура работы

Диссертация изложена на 130 страницах машинописного текста. Работа состоит из введения, обзора литературы, главы «Материалы и методы исследования», трех глав собственных исследований, главы «Обсуждение полученных результатов», выводов, практических рекомендации и библиографического указателя включающего 221 источник отечественных и зарубежных авторов. Работа иллюстрирована 22 таблицами и 11 рисунками.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследования

Работа выполнена на базе ФГУ «Ивановский научно-исследовательский институт материнства и детства имени В.Н. Городкова Росмедтехнологий» (директор - засл. деятель науки РФ, д.м.н., профессор Посисеева JI.B.). Исследования проводились в лаборатории клинической иммунологии - заведующая лабораторией -засл. врач РФ, д.м.н., профессор Сотникова Н.Ю. и в центре планиро-

вания семьи и репродукции - заведующая центром, д.м.н., профессор Богатова И.К.

Всего было обследовано: 25 здоровых женщин фертильного возраста, 10 женщин в пременопаузальном периоде, 25 женщин в по-стменопаузальном периоде, 10 женщин в постменопаузальном периоде после лечения препаратом «Анжелик» и 10 женщин в постменопаузальном периоде после лечения препаратом «Климодиен». Материалом для непосредственного исследования служили: периферическая венозная кровь и биоптаты эндометрия из полости матки.

Для проведения иммунологических исследований получали популяцию мононуклеарных клеток (МНК) из периферической крови и из ткани эндометрия.

Выделение МНК из периферической крови осуществляли стандартным методом скоростного центрифугирования в градиенте плотности фиколл-урографина (d=l,078). Для выделения обогащенной популяции МНК из эндометриальной ткани использовали стандартный безферментативный механический метод (Chernyshov V.P., 1993). Выделение обогащенной популяции МНК эндометрия осуществляли стандартным методом скоростного центрифугирования в градиенте платности фиколл-урографина (d=l,078) (Чичахов ДА., Пулин А.М., 2008).

Поверхностный фенотип иммунокомпетентных клеток определяли с помощью моноклональных антител (мАТ) методом двухцветной проточной цитофлюориметрии на приборе FACScan (Becton Dickinson, USA). В качестве флюорохромной метки использовали флюоресцеин изотиоционат (FITC) и фикоэритрин (РЕ).

В исследовании использовали следующие мАТ: коньюгирован-ные с РЕ (фикоэритрин) анти CD95 антитела (CALTAG Laboratories, USA), коныогированные с FITC (флюоресцеин изотиоцианат) анти CD95L антитела (CALTAG Laboratories, USA), коньюгированный с FITC recombinant AnnexinV (CALTAG Laboratories, USA) и Propidium Iodid (CALTAG Laboratories, USA).

Процедуру окрашивания и фиксации клеток проводили стандартным способом в соответствии с указаниями фирмы-разработчика. Для определения количества клеток, вступивших в апоптоз, проводили тест с одновременным окрашиванием клеток аннекином V (Annexin V) и пропидиумом иодидом (Pi). Анализ результатов проводили в программе "LYSYS П".

Содержание sFas, sFasL, Bcl-2 и Р-53 в сыворотке крови оценивали методом твердофазного иммуноферментного анализа (ИФА) на микропланшетном ридере Multiscan EX (Labsystems, Финляндия). В

таблице представлена характеристика использовавшихся в работе тест систем для проведения ИФА.

Таблица

Панель моноклональных антител, использованных в исследовании

№ п/п Показатель Фирма-производитель Предел чувствительности системы

1. sFas/APO-1 Bender MedSystems, Австрия >13,2 pg/ml

2. sFasL Bender MedSystems, Австрия > 0,07 ng/ml

3. Bcl-2 Bender MedSystems, Австрия > 0,5 ng/ml

4. р-53 Bender MedSystems,Австрия > 0,33 U/ml

Анализ и интерпретацию результатов проводили в соответствии с рекомендациями фирмы-разработчика.

Для определения уровня экспрессии специфической мРНК клетками эн-домегриальной ткани использовали полуколичественный метод RT-PCR в реальном времени.

Процедуру выделения тотальной РНК из эндометрия проводили стандартным гушщдин-тиоцианат-фенол-хлороформным методом (Van der Vel-den, 2003) с использованием набора реагентов «Онкоскрин» (ООО «Генотехнология», Гематологический научный центр РАМН, лаборатория генной инженерии, Москва, Россия). Далее выделенную мРНК переводили в комплементарную кДНК, используя коммерческий набор реагентов Онкоскрин RT (ООО «Генотехнология», Гематологический научный центр РАМН, лаборатория генной инженерии, Москва, Россия).

Для проведения полуколичественной RT-PCR в реальном времени использовались следующие наборы праймсров, зондов и реагентов для проведения ПЦР в реальном времени производства ООО «Генотехнология», Гематологический научный центр РАМН, лаборатория генной инженерии (Москва, Россия): ОНКОСКРИН 12-Q для определения интенсивности экспрессии гена ß-2-микроглобулина человека (ген домашнего хозяйства), ОНКОСКРИН 13-Q для определения интенсивности экспрессии гена XIAP. Кроме того, в работе использовались коммерческие праймеры и зонды для определения мРНК Вс1-2, р53 производства BIOSOURCE INTERNATIONAL (USA). ПЦР-

амплификацию в режиме реального времени проводили на амплифи-каторе с оптической насадкой iCycler iQ (BIO-RAD, USA) по протоколу, рекомендованному разработчиком праймеров. Для количественно определения уровня экспрессии мРНК Bcl-2, Р-53 и XIAP использовали стандартный сравнительный Ct метод (Van der Velden, 2003).

Общее количество проведенных исследований составило 2217.

Статистическая обработка данных проводилась с расчетом среднего арифметического и ошибки среднего арифметического с использованием программы Microsoft Excel из комплекта Microsoft Office 2000. Достоверность различий сравниваемых показателей определялась по t-критерию Стьюдента.

Автор выражает благодарность и глубокую признательность за научное сотрудничество, помощь в организации и проведении клинических исследований заведующей центром планирования семьи и репродукции д.м.н., профессору И.К. Богатовой И.К. и всему коллективу врачей.

РЕЗУЛЬТАТЫ РАБОТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Проведенные нами исследования выявили ряд отличий параметров апоптоза клеток иммунной системы у женщин в климактерическом периоде от таковых у женщин репродуктивного возраста, причем ряд этих изменений отмечался на всем протяжении климактерического периода, а некоторые особенности иммунного апоптоза зависели от стадии климактерического периода.

В периферической крови у женщин пременопаузального и по-стменопаузального периодов, по сравнению с женщинами фертильно-го возраста, снижалось содержание лимфоцитов с фенотипом Аппех-inV+ (20,00±1,02% у женщин фертильного возраста, 15,21 ±0,83% в пременопаузальном периоде и 15,13±1,02% в постменопаузальном периоде, р<0,001 и р<0,02 соответственно) и Annexin V+Pi-(18,31±0,99% в фертильном периоде, 13,46±0,7% в пременопаузе и 13,54±0,95% в постменопаузе, р<0,001 в обоих случаях). Аналогичные изменения апоптоза были выявлены и в эндометрии, так, у женщин климактерического периода снижалось количество эндометриальных лимфоцитов, имеющих фенотип AnnexinV+ (26,89±1,51 % у женщин фертильного возраста, 21,53±1,75% в пременопаузальном периоде и 18,02±1,51% в постменопаузальном периоде, р<0,05 и р<0,01 соответственно) и Annexin V+Pi- (19,76±1,11% у женщин фертильного возраста, 15,64±0,97% в пременопаузальном периоде и 14,55±1,42% в по-

стменопаузальном периоде, р<0,02 в обоих случаях). Та же самая закономерность прослеживалась нами и в отношении моноцитов периферической крови. У женщин пременопаузального и постменопау-залыюго периодов, по сравнению с женщинами фертильного возраста, снижалось содержание моноцитов с фенотипом AnnexinV+ (44,10±2,63% в фертильном периоде, 31,73±2,43% в пременопаузе и 34,99±2,44% в постменопаузе, р<0,001 и р<0,02 соответственно) и Annexin V+Pi- (37,05±2,42% в фертильном периоде, 25,80±1,76% в пременопаузе и 29,63±2,37% в постменопаузе, р<0,001 и р<0,05, соответственно).

Как известно, иммунный апоптоз развивается в активированных клетках и необходим для завершения иммунного ответа (Ярилин A.A., 1999; Ковальчук Л.В. и соавт., 1998; Ковальчук Л.В., 1999). Снижение апоптоза лимфоцитов и моноцитов у женщин в пре- и постменопаузе может приводить к пролонгации жизни лимфоцитов и накоплению активированных клонов клеток, способствуя развитию аутоиммунных реакций у женщин в данные возрастные периоды их жизни. Это предположение согласуется с литературными данными, указывающими на то, что в климактерическом периоде повышается частота развития аутоиммунных болезней (Nalbandian G., 2005).

При изучении особенностей экспрессии Fas молекул на поверхности периферических и эндометриальных клеток иммунной системы было установлено, что характер экспрессии этой молекулы был различен на системном и локальном уровне у женщин пре- и ностмено-паузального возраста и зависел от типа МНК. В периферической крови у женщин пременопаузального и постменопаузального периодов по сравнению с аналогичными показателями женщин фертильного возраста было значительно повышено содержание лимфоцитов, экспрес-сирующих Fas молекулы (17,33±1,01% у женщин фертильного возраста, 32,07±3,27% в пременопаузальном периоде и 28,85±1,01% в по-стменопаузальном периоде, р<0,02 и р<0,001 соответственно), тогда как в ткани эндометрия снижался уровень Fas-позитивных макрофагов (40,37±2,52% у женщин фертильного возраста, 25,53±2,89% в пременопаузальном периоде и 28,66±2,11% в постменопаузальном периоде, р<0,01 в обоих случаях).

Пусковым фактором для реализации Fas-зависимого апоптоза является связывание Fas-рецептора с Fas-лигандом (Барышников А.Ю. и соавт., 2002). У женщин как в пре-, так и в постменопаузальном периоде по сравнению с показателями женщин фертильного возраста в периферической крови был снижен уровень FasL-позитивных моно-

цитов (36,33±2,38% у женщин фертильного возраста, 30,08±2,53% в пременопаузальном периоде и 26,52±2,16% в постменопаузальном периоде, р<0,05 и р<0,01 соответственно), что позволяет говорить об угнетении апоптоз-индуцирующей способности моноцитов в период климактерия.

Известно, что транслокация РаяЬ на поверхность клетки происходит после воздействия активационного сигнала (Клепег Р.А. е1 а1., 1997). Можно предположить, что в пре- и постменопаузальном периодах нарушается процесс активации моноцитов. С другой стороны, фагоцитам отводится основная роль в индукции апоптоза различных клеток-мишеней, таких как опухолевые, генетически поврежденные, дисфункциональные клетки, и клетки иммунной системы, экспресси-рующие Раз-рецептор (Клепег Р.А. а1., 1997). В связи с этим нарушение в пре- и постменопаузе апоптоз-индуцирующей функции моноцитов может приводить к описанному выше снижению апоптоза периферических лимфоцитов и моноцитов, а также, вероятно, проявляться недостаточной элиминацией дефектных и аутоагрессивных клеток у данного контингента пациенток. Поскольку в период менопаузы увеличивается частота аутоиммунной патологии (Ка1ЬапсПап в. е1 а1., 2005), можно предположить, что выявленное снижение апоптоз-индуцирующей функции фагоцитов является одним из важных механизмов их развития. Это предположение согласуется с имеющимися литературными данными. Показано, что аутоиммунные болезни ассоциируются с нарушением функции фагоцитарных клеток и процесса их активации (Engelich О.в. е1 а1., 2001), а также со снижением РаяЬ-зависимого пути индукции апоптоза аутореактивных клонов лимфоцитов (ЯаШшеИ 1С. <Л а1„ 2002; КШгейег е1 а1., 2003).

Проведенные нами исследования позволили установить, что показатель относительного содержания РазЬ+ моноцитов может быть использован для диагностики хронического эндометрита у женщин в постменопаузальном периоде. При ретроспективном анализе данных нами было установлено, что при значении показателя БазЫ- моноцитов равного 22,0% или менее у женщины диагностируется хронический эндометрит с точностью 82,6%, чувствительностью - 75,00% и специфичностью - 86,67% (приоритетная справка № 2009115014 от 20.04.2009). Учитывая, что популяция моноцитов, экспрессирующих молекулы СЭ95Ь, обладает цитотоксическим действием и способна осуществлять элиминацию инфицированных клеток-мишеней (Филь-ченков А.А., 2002), можно предположить, что уменьшение содержания в периферической крови ЁаБЬ - позитивных моноцитов приводит к

ухудшению реализации цитотоксических реакций, направленных па своевременное удаление инфицированных клеток - мишеней. Все это может определять снижение противоинфекционной защиты.

Таким образом, в обеих обследованных группах женщин климактерического периода отмечалось усиление готовности к вступлению в апоптоз периферических лимфоцитов, и снижалась готовность к вступлению в апоптоз эндометриальных макрофагов. Кроме того, у женщин в пременопаузальном и постменопаузалыюм периодах снижалась апоптоз-индуцирующая способность моноцитов.

Интенсивность процессов апоптоза регулируется целым рядом факторов, которые оказывают либо про-, либо антиапоптотическое действие. Известно, что факторы sFas и Вс1-2 являются блокаторами апоптоза, тогда как sFasL и р53 относятся к факторам стимулирующим апоптоз. По нашим данным у женщин в пременопаузальном и в постменопаузальном периодах в сыворотке крови было достоверно снижено по сравнению с показателями женщин фертильного возраста содержание индукторов апоптоза sFasL (62,00±07,00 пг/мл у женщин фертильного возраста, 41,00±04,00 пг/мл в пременопаузальном периоде и 44,82±03,25 пг/мл в постменопаузальном периоде, р<0,05 в обоих случаях) и р53 (4,86±0,66 U/ml у женщин фертильного возраста, 2,18±0,45 U/ml в пременопаузальном периоде и 2,38±0,20 U/ml в постменопаузальном периоде, р<0,02 и р<0,01 соответственно). Эти данные хорошо согласуются с выявленным нами снижением апоптоза лимфоцитов и моноцитов периферической крови. По-видимому, снижение системной продукции sFasL и р53 лежит в основе механизмов регуляции апоптоза в целом и апоптоза клеток иммунной системы в частности у женщин в климактерическом периоде.

В то же время четкой закономерности в изменении системной продукции блокаторов апоптоза у женщин климактерического периода нами выявлено не было. В пре- и постменопаузальном периоде уровень Вс1-2 в сыворотке крови по нашим данным был ниже пределов чувствительности тест-системы. При этом у женщин фертильного возраста содержание в сыворотке Вс1-2 было в пределах детектируемых значений и составило 1,34+0,68 нг/мл. Однако достоверных различий между группами фертильных женщин и женщин в климактерическом периоде по этому показателю мы не выявили.

Изменения сывороточного содержания sFas у женщин климактерического периода по нашим данным зависят от стадии климактерия и различаются у женщин в пре- и постменопаузе. В группе женщин в пременопаузальном периоде нами было выявлено значительное сни-

жение сывороточного содержания Брав по сравнению с показателями фертильных женщин (269,90±44,80 пг/мл у женщин фертильного возраста и 105,09±38,06 пг/мл в пременопаузальном периоде, р<0,05). То есть в данный период происходит снижение содержания на системном уровне не только факторов, индуцирующих апоптоз, но и его ингибиторов.

Хотелось бы отметить, что у женщин в пременопаузе нами был отмечен ряд особенностей апоптоза клеток иммунной системы, которые не были характерны для женщин в постменопаузальном возрасте. Так, только для женщин в пременопаузальном периоде было характерно усиление апоптоза эндометриальных макрофагов, о чем свидетельствовало повышение по сравнению с аналогичными данными у женщин фертильного периода содержания АппехтУ+ клеток (49,53±2,76% у женщин фертильного возраста и 57,93±2,37% в пременопаузальном периоде, р<0,05). По-видимому, эти изменения могут быть связаны с тем, что в данный период жизни женщины гормональные нарушения носят нестабильный характер (Сметник В.П., Кулаков В.И., 2001). Поэтому, у женщин в пременопаузе угнетение апоптоза как на системном, так и на локальном уровне, проявляется в несколько меньшей степени, чем в постменопаузе. Вероятно, выявленное нами низкое сывороточное содержание ингибитора апоптоза вРав может определять меньшую выраженность угнетения апоптоза у женщин в пременопаузе по сравнению с таковой у женщин в постменопаузе.

У женщин в постменопаузальном периоде нами отмечалось повышенное по сравнению с группой женщин в пременопаузальном периоде сывороточное содержание Браэ (105,09±38,06пг/мл в пременопаузальном периоде и 209,73±25,82 пг/мл в постменопаузальном периоде, р<0,05), которое при этом не отличалось от такового у женщин фертильного возраста (269,90±44,80пг/мл у женщин фертильного возраста и 209,73±25,82 пг/мл в постменопаузальном периоде, р>0,05).

Следует отметить, что только у этих женщин происходило резко выраженное угнетение апоптоза эндометриальных макрофагов, о чем свидетельствовало сниженное содержание эндометриальных макрофагов с фенотипом АппехтУ+ (57,93±2,37% в пременопаузе и 42,86±3,35% в постменопаузе, р<0,05).

В целом в эндометрии женщин в постменопаузе угнетение апоптоза как лимфоцитов, так и макрофагов было выражено больше, чем у женщин в пременопаузе. Складывается впечатление, что максимальная степень угнетения апоптоза клеток иммунной системы у женщин

в постменопаузе может определяться изменением общего баланса регуляции апоптоза, который сдвигается в пользу доминирования анти-апоптотических сигналов за счет резкого подавления выработки индукторов апоптоза в данный возрастной период. Тогда как в-премено-паузе сниженная продукция ингибиторов апоптоза ассоциирована с угнетением и выработки ряда факторов, блокирующих апоптоз, что может определять меньшую степень выраженности угнетения апоптоза клеток иммунной системы в данный возрастной период.

Для уточнения локальных механизмов регуляции апоптоза в ткани эндометрия женщин в климактерическом периоде нами был проведен анализ уровня экспрессии мРНК таких факторов, регулирующих апоптоз, как р53, Вс1-2 и Х1АР.

Экспрессия мРНК р53 (11(2 - 1,12±0,28) и Вс1-2 (И/} - 0,73±0,42) в эндометрии женщин в пременопаузальном периоде практически не отличалась от таковой в эндометриальной ткани здоровых женщин фертильного возраста. Уровень экспрессии мРНК Х1АР в пременопау-зе был снижен относительно его уровня у фертильных женщин (0,56±0,21).

В эндометрии женщин постменопаузального периода уровень экспрессии мРНК р53 более чем в 6 раз превосходил уровень экспрессии мРНК р53 в эндометрии здоровых женщин фертильного возраста (11(2 - 6,54±2,85). Экспрессия мРНК Вс1-2 и Х1АР также была повышена в эндометрии женщин в постменопаузальном периоде относительно таковой у женщин фертильного возраста. ИХ) для Вс1-2 в эндометрии женщин в постменопаузе составил 1,77±0,97, а для Х1АР -1,91±0,27.

У женщин в постменопаузе отмечалась более высокая, чем у женщин пременопаузального возраста, экспрессия мРНК Х1АР (р<0,001). Следует также отметить, что уровень экспрессии мРНК р53 в эндометрии женщин в постменопаузе был значительно выше, чем у женщин в пременопаузальном периоде (р>0,05). У женщин постменопаузального периода в эндометрии отмечалось максимальное снижение активности иммунного апоптоза, вероятно, за счет повышения активности XIАР и Вс1-2. Одновременно у женщин данной группы усиливался и синтез в эндометриальной ткани проапоптотического фактора 53, который может играть роль в морфологической перестройке эндометрия у женщин в постменопаузе (Магивук А. е! а1., 2007). Выявленные изменения в экспрессии мРНК р53, Вс1-2 и Х1АР в эндометрии женщин в различные периоды климактерического периода, по-видимому, непосредственно связаны с особенностями гормо-

нального фона и функционального состояния эндометрия в пре- и постменопаузе.

С целью коррекции симптомов, обусловленных эстроген-дефицитным состоянием, в климактерическом периоде назначается заместительная гормональная терапия (ЗГТ). Ранее в работах с использованием экспериментальных моделей было показано, что эстрогены способны влиять на апоптоз клеток иммунной системы (Kovats S., 2008). Для нашего исследования были выбраны два препарата ЗГТ, наиболее часто используемые в клинической практике у женщин в постменопаузе - «Анжелик» и «Климодиен», различающиеся по составу эстрогенов и прогестинов. Действующими веществами препарата «Анжелик» - являются: 1 мг эстрадиола и 2 мг дроспиренона, в состав «Климодиена» входят 2 мг эстрадиола валерата и 2 мг диеноге-ста.

По нашим данным, у женщин постменопаузального периода после приема как препарата «Анжелик», так и препарата «Климодиен» усиливался по сравнению с исходным уровнем апоптоз лимфоцитов периферической крови до уровня, характерного для женщин фертиль-ного возраста. После приема препарата «Анжелик» повышалось содержание периферических лимфоцитов с фенотипом AnnexinV+ (14,34±1,21% до лечения и 20,19±1,7 % после лечения, р<0,02) и Ап-ncxinV+Pi- (13,05±1,28% до лечения и 18,84±1,15% после лечения, р<0,02) до уровня, характерного для женщин фертильного возраста; после приема препарата «Климодиен» также значительно повышалось содержание периферических AnnexinV+ (14,92±1,51% до лечения и 19,59±0,9% после лечения, р<0,02) и AnnexinV+Pi- лимфоцитов (13,12±1,31% до лечения и 17,45±1,04 % после лечения, р<0,02). Кроме того, оба препарата повышали в эндометрии содержание CD95+ макрофагов («Анжелик» - 28,67±4,14% до лечения и 41,12±2,85 % после лечения, р<0,05; «Климодиен» - 28,66±2,19% до лечения и 41,96±2,96% после лечения, р<0,02). Таким образом, можно говорить о нормализирующем действии препаратов ЗГТ на уровень апоптоза лимфоцитов периферической крови и готовность к апоптозу эндомет-риальных макрофагов.

В то же время в действии изученных препаратов были и различия. После курса приема препарата «Анжелик» повышалось содержание в эндометрии лимфоцитов с фенотипом CD95+ (20,74±2,84% до лечения и 27,44±1,32% после лечения, р<0,05), AnnexinV+ (18,24±2,17% до лечения и 29,44±1,41 % после лечения, р<0,01), Ап-nexinV+Pi- (15,13±2,07% до лечения и 21,47±0,98% после лечения,

р<0,02) и AnnexinV+Pi+ (2,86±0,57% до лечения и 7,98±1,42 % после лечения, р<0,02). Препарат «Климодиен» подобного действия на уровне эндометрия не оказывал. Только у женщин, принимавших «Климодиен», в периферической крови было повышенно содержание CD95L+ лимфоцитов (5,72±0,38% до лечения и 8,86±0,84 % после лечения, р<0,05) и CD95L+ моноцитов (24,55±3,83% до лечения и 33,82±1,64% после лечения, р<0,05).

Следовательно «Анжелик» в большей степени способствовал изменению апоптоза клеток иммунной системы на уровне эндометрия, что проявлялось резко выраженным повышением готовности к вступлению в апоптоз эндометриальных лимфоцитов и усилением их апоптоза, а для «Климодиена» было характерно более выраженное действие на системном уровне, направленное на усиление апоптоз-индуцирующей способности моноцитов.

Оба препарата одинаково влияли на уровень в крови факторов, регулирующих апоптоз. В сыворотке периферической венозной крови снижалось содержание sFas («Анжелик» - 248,82±45,13 пг/мл до лечения и 128,09±28,79 пг/мл после лечения, р<0,05; «Климодиен» -185,58±33,17 пг/мл до лечения и 84,55±24,50 пг/мл после лечения, р<0,05;) и р53 («Анжелик» - 2,81±0,16 U/ml до лечения и 2,10±0,23 U/ml после лечения, р<0,05; «Климодиен» - 2,16±0,27U/mI до лечения и l,45±0,21U/ml после лечения, р<0,05).

Применение обоих препаратов ассоциировалось также со снижением уровня экспрессии мРНК р53 в ткани эндометрия («Анжелик» -RQ - 0,15±0,13; «Климодиен» - RQ - 0,10±0,05).

Таким образом, нами не наблюдалось нормализации сывороточного содержания и локальной продукции факторов, регулирующих апоптоз, под действием обоих изучаемых препаратов ЗГТ.

Дополнительное снижение системной продукции р53, ассоциированное с уменьшением сывороточного содержания sFas, вызванное препаратами ЗГТ, позволяет говорить о том, что заместительная гормональная терапия может оказывать и негативное воздействие на регуляцию апоптоза клеток иммунной системы. Нарушение активности как про-, так и антиапоптотических факторов на системном уровне может проявляться не только в изменении апоптоза клеток иммунной системы, но и отразиться на балансе пролиферации и гибели любых других типов соматических клеток, что усиливает возможность риска развития опухолевых заболеваний.

Таким образом, у женщин в пременопаузальном и в постмено-паузальном периодах в отличие от женщин фертильного возраста как

на системном, так и на локальном уровне нарушается Раз-зависимый апоптоз клеток иммунной системы и его регуляция. Это проявляется угнетением апоптоза периферических и эндометриальных лимфоцитов, снижением апоптоз-индуцирующей способности моноцитов и готовности макрофагов эндометрия к апоптозу. Параллельно у женщин в климактерическом периоде нарушается системная и локальная продукция факторов, регулирующих апоптоз, у них снижается сывороточное содержание БРавЬ и р53. Параметры апоптоза клеток иммунной системы и его регуляции зависят от стадии климактерического периода, и в большей степени проявляются в постменопаузе. Препараты заместительной гормональной терапии восстанавливают апоптоз лимфоцитов, но снижают содержание факторов, регулирующих апоптоз, как на системном, так и на локальном уровне. В действии препаратов заместительной гормональной терапии на параметры апоптоза существуют различия, которые могут быть обусловлены особенностями содержания синтетических эстрогенов и прогестинов. Снижение содержания в крови РаэЬ-позитивных моноцитов может служить диагностическим критерием хронического эндометрита у женщин постменопаузального периода.

ВЫВОДЫ

1. У женщин в пременопаузальном и постменопаузальном периодах нарушается процесс апоптоза лимфоцитов и моноцитов/макрофагов периферической крови и эндометрия, что ассоциируется с угнетением апоптоз- индуцирующей функции моноцитов, и изменением синтеза и продукции факторов, регулирующих апоптоз, на системном и локальном уровне.

2. В периферической крови женщин в пре- и постменопаузальном периоде отмечается снижение по сравнению с показателями женщин фертильного возраста количества лимфоцитов и моноцитов, вступивших в апоптоз, при одновременном повышении содержания С095+ лимфоцитов и снижении уровня СБ95Ь+ моноцитов.

3. В эндометрии женщин в пре- и постменопаузальном периоде снижено количество апоптирующих лимфоцитов и содержание СБ95+ макрофагов. Отличительной чертой эндометрия женщин пременопау-зального возраста является повышенное содержание макрофагов, вступивших в апоптоз, тогда как в эндометрии женщин в постменопаузе количество апоптирующих макрофагов, напротив, снижено.

4. Сывороточный уровень вРаБЬ и р53 в климактерическом периоде снижен по сравнению с аналогичными параметрами у женщин фертильного возраста. В пременопаузальном периоде также снижено сывороточное содержание яРая и экспрессия мРНК Х1АР в ткани эндометрия, а в постменопаузальном периоде отмечается усиление экспрессии мРНК р53 и Х1АР в эндометрии. В постменопаузальном периоде сывороточный уровень вРаэ и экспрессия в эндометрии мРНК Х1АР выше, чем у женщин в пременопаузе.

5. У женщин в постменопаузе курс заместительной гормональной терапии приводит к нормализации апоптоза периферических лимфоцитов и снижению сывороточного содержания вРаБ и р53, повышению содержания Раэ+ макрофагов в эндометрии и угнетению уровня экспрессии мРНК р53 в ткани эндометрия. Отмечаются различия в действии препаратов заместительной гормональной терапии: препарат «Климодиен» повышает апоптоз-индуцирующую способность периферических лимфоцитов и моноцитов, а препарат «Анжелик» нормализует апоптоз эндометриальных лимфоцитов.

6. Низкий уровень РавЬ-позитивных моноцитов в периферической крови женщин постменопаузального периода (< 22%) позволяет с точностью 82,60% диагностировать хронический эндометрит у данного контингента пациенток.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

Рекомендуется женщинам в постменопаузальном периоде определять содержание РаБЫ- моноцитов и при значениях показателя равном или менее 22% диагностировать хронический эндометрит.

Рекомендуется у женщин в постменопаузе в ходе лечения препаратами заместительной гормональной терапии определять параметры апоптоза клеток иммунной системы.

Рекомендуется дифференцированный подход к назначению препаратов заместительной гормональной терапии женщинам в постменопаузальном периоде: препарат «Анжелик» рекомендуется назначать женщинам с выраженными изменениями параметров апоптоза клеток иммунной системы в эндометрии, а препарат «Климодиен» - женщинам с преимущественными изменениями на системном уровне.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Васильева И.А., Богатова И.К., Букина Е.А. Особенности апоптоза иммунокомпетентных клеток периферической крови и эндометрия в менопаузальном периоде // Сборник материалов VII Российского форума «Мать и дитя». - М., 2005. - С.343-344.

2. Васильева И.А., Букина Е.А., Богатова И.К., Сотникова Н.Ю. Особенности апоптоза лимфоцитов эндометрия в постменопаузальном периоде и влияние на него заместительной гормональной терапии // Russian Journal of Immunology. -2006. - Vol. 9, Suppl. 3. - P. 121.

3. Васильева И.А., Сотникова Н.Ю., Богатова И.К., Букина Е.А. влияние заместительной гормональной терапии на апоптоз иммунокомпетентных клеток периферической крови в постменопаузальном периоде // Медицинская иммунология. - 2006. - Т. 8, № 2-3. - С. 307308.

4. Васильева И.А., Сотникова Н.Ю., Богатова И.К., Букина Е.А., Астраух Н.В., Шныркова М.А. Влияние препарата «Климодиен» на апоптоз периферических лимфоцитов в постменопаузе // Материалы 8 Всероссийского научного форума «Мать и дитя». - М., 2006. - С. 343.

5. Васильева И.А., Сотникова Н.Ю., Богатова И.К., Букина Е.А. Влияние препарата «Климодиен» на апоптоз лимфоцитов периферической крови женщин постменопаузального периода // Физиология и патология иммунной системы. - 2006. - № 10 (1). - С. 24-25.

6. Крошкина Н.В., Васильева И.А., Сотникова Н.Ю., Астраух Н.В., Шныркова М.А., Соловьева Т.А. Fas-зависимый апоптоз моно-нуклеарных клеток периферической крови женщин постменопаузального периода и влияние на него препарата Климодиен // Вестник Уральской медицинской академической науки. - 2006. - № 3 - 1 (14). - С.112-115.

7. Васильева И.А. Влияние заместительной гормональной терапии на апоптоз лимфоцитов эндометрия в постменопаузальном периоде // Материалы научно-практической конференции студентов и молодых ученых ИвГМА «Неделя науки - 2006» в рамках областного фестиваля «Молодая наука - развитию Ивановской области». - Иваново, 2006.-С. 105-107.

8. Васильева И.А., Сотникова Н.Ю., Богатова И.К., Букина Е.А., Соловьева Т.А. Влияние препаратов ЗГТ на сывороточный уровень sFas и sFasL у женщин постменопаузального периода // Russian Journal of Immunology. -2007. - Vol. 9, Suppl. 4. - P. 75-76

9. Васильева И.А. Апоптоз клеток иммунной системы в постменопаузе и заместительная гормональная терапия // Материалы научно-практической конференции студентов и молодых ученых ИвГМА «Неделя науки - 2007» в рамках областного фестиваля «Молодая наука - развитию Ивановской области». - Иваново, 2007. — С. 70.

10. Васильева И.А., Сотникова Н.Ю., Букина Е.А., Соловьева Т.А. Влияние препарата «Климодиен» на экспрессию мРНК р-53 и Вс1-2 в эндометрии женщин постменопаузального периода // Российский иммунологический журнал. - 2008. - Т. 2 (11), № 2-3. - С. 285.

11. Васильева И.А., Сотникова Н.Ю. Букина Е.А. Влияние препаратов заместительной гормональной терапии на сывороточное содержание sFas и р53 у женщин менопаузального периода // Проблемы репродукции. - 2008. - Спец. выпуск. - С. 15.

12. Васильева И.А., Сотникова Н.Ю., Астраух Н.В., Шныркова М.А., Букина Е.А. Влияние препарата Климодиен на сывороточное уровень sFas в периферической крови женщин постменопаузального периода // Материалы IV съезда акушеров-гинекологов России. - М., 2008.-С. 322.

13. Васильева И.А. Влияние Климодиена на экспрессию мРНК р-53 и Вс1-2 в эндометрии женщин постменопаузального периода // Материалы научно-практической конференции студентов и молодых ученых ИвГМА «Неделя науки - 2008» в рамках областного фестиваля «Молодая наука — развитию Ивановской области». - Иваново, 2008. -С. 83.

14. Васильева И.А., Сотникова Н.Ю., Букина Е.А., Анциферова Ю.С., Богатова И.К. Параметры апоптоза периферических лимфоцитов и фагоцитов у женщин в менопаузе // Российский иммунологический журнал. - 2009. - Т. 3 (12), № 1.-С. 65-71.

15. Васильева И.А., Сотникова Н.Ю., Букина Е.А. Особенности апоптоза нейтрофилов в постменопаузальном периоде // Бюллетень Военно-Медицинской академии. - 2009. - № 1 (25). - С. 288.

16. Васильева И.А., Сотникова Н.Ю., Букина Е.А. Влияние препаратов «Климодиен» и «Анжелик» на апоптоз МНК периферической крови и эндометрия женщин постменопаузального периода // Медицинская иммунология. - 2009. - Т. 11, № 4-5. - С. 404^05.

17. Васильева И.А., Сотникова Н.Ю., Богатова И.К., Букина Е.А. Особенности сывороточного содержания sFas и р53 у женщин в пре-менопаузальном и постменопаузальном периодах // Аллергология и иммунология. - 2009. - Т. 10, № 2. - С. 253.

ПЕРЕЧЕНЬ УСЛОВНЫХ СОКРАЩЕНИЙ

Вс1-2 - В-клеточной лейкемии/лимфомы подобный протеин

CD - cluster of differentiation (кластер дифференцировки)

ERa - эстрогеновый рецептор a типа

ERp - эстрогеновый рецептор р типа

Fas - синтетаза жирных кислот

FasL — лиганд синтетазы жирных кислот

FITC — флюоресцеин изотиоционат

IL - интерлейкин

р53 - протеин 53

PBS - фосфатный буфер

РЕ - фикоэритрин

PI - пропидиум иодид

RT-PCR - полимеразная цепная реакция в режиме реального времени

sFas - растворимая форма Fas

sFasL - растворимая форма FasL

XIAP - х-сцепленный ингибирующий апоптоз фактор

АГ - антиген

AT - антитела

ЗГТ - заместительная гормональная терапия

ИФА - иммуноферментный анализ

мАТ - моноклональные антитела

МНК - мононуклеарные клетки

мРНК - матричная рибонуклеиновая кислота

ВАСИЛЬЕВА Ирина Александровна

АПОПТОЗ КЛЕТОК ИММУННОЙ СИСТЕМЫ И ЕГО РЕГУЛЯЦИЯ У ЖЕНЩИН В КЛИМАКТЕРИЧЕСКОМ ПЕРИОДЕ

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Формат 60x84 1/16. Печ. л. 1,75. Усл. печ. л. 1,6. Тираж 70 экз.