Автореферат и диссертация по медицине (14.00.36) на тему:Апоптоз иммунокомпетентных клеток при хроническом обструктивном бронхите

I

На правах рукописи

САМОЙЛОВА НАТАЛЬЯ ЕВГЕНЬЕВНА

АПОПТОЗ ИММУНОКОМПЕТЕНТНЫХ КЛЕТОК ПРИ ХРОНИЧЕСКОМ ОБСТРУКТИВНОМ БРОНХИТЕ

14 00 36 - аллерготогия и иммунология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Москва - 2007

003058717

Работа выполнена в Государственно« образовательном учреждении Высшего профессионального образования Московской медицинской академии им И М Сеченова Росздрава

Научный руководитель чпен-корреспондент РАМН

доктор медицинских наук, профессор Александр Викторович Караулов

Официальные оппо ненты доктор медицинских наук, профессор

Александр Александрович Ярилин

доктор медицинских наук, профессор Станислав Степанович Афанасьев

Ведущая организация - ГОУ ВПО Российский государственный медицинский университет Росздрава

Защита состоится___2007г в_часов на заседании

Диссертационного Совета Д 208 040 08 при ГОУ ВПО Московской медицинской академии им ИМ Сеченова Рсздрава по адресу 119991, г Москва, ул Трубец <ая, д 8, стр 2

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГОУ ВПО Московской медицинской академии им ИМ Сеченова Росздрава по адресу 117998, г Москва,Нахимовский проспект, 49

Автореферат разослан___2007г

Ученый секретарь диссертационного совета,

доктор медицинских наук, профессор Андрей Юрьевич Миронов

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы Широкое распространение хронических обструктивных болезней легких (ХОБЛ) и увеличение удельного веса хронического обструктивного бронхита (ХОБ) ставят проблему диагностики и лечения этой патологии в число наиболее актуальных (А Г Чучалин, 1997, А Н Кокосов, 2002)

Одной из причин хронизации ХОБ, частых рецидивов и торпидности к проводимой традиционной терапии являются развивающиеся нарушения в системе иммунитета Так как иммунитет является сложной иерархической многокомпонентной структурой с множеством соподчиненных составных элементов, функционирующих согласно определенным закономерностям, то определенный, даже незначительный дефект работы этой системы может служить причиной несостоятельности ответа организма на повреждение Установление нарушений в системном иммунитете при ХОБ служит целью многих исследований, так как расширение представлений о патогенезе заболевания может способствовать разработке новых лечебных и профилактических мероприятий при ХОБ (АМ Борисова, 1991, А А Ярил и н, 1999, А М У1{*по1а, 1999 и др )

Одной из центральных проблем медицины интенсивно изучаемой во всем мире в настоящее время является регуляция процесса программированной клеточной гибели, или апоптоза, в норме и патологии Основная функция апоптоза заключается в уравновешивании клеточной пролиферации, в элиминации поврежденных, трансформированных и инфицированных клеток В нашей работе мы исследовали закономерности программированной клеточной гибели ключевых клеток иммунной системы - лимфоцитов - и основного звена неспецифической резистентности - нейтрофилов (А Н Маянский, НА Маянский, 1990, МасЫее,1997, М БаеПа, 1999, Потапнев М П ,2002)

В настоящее время многими авторами доказана целесообразность использования иммунотропной терапии в лечении хронического обструктивного бронхита (Е Л Ермина, 1997, А В Караулов, 2000, Д Новак, 2000, Б В Пинегин, 2000) В частности, доказана клиническая эффективность и иммунотропная активность полиоксидония (Р М Хаитов, Б В Пинегин, 2000) Однако вопрос о механизмах биологических эффектов этого иммуномодулятора, в том числе о его влиянии на процесс апоптоза иммунокомпетентных клеток, остается во многих аспектах открытым

Цель исследования анализ клинических и иммунологических изменений при хроническом обструктивном бронхите и патогенетической роли апоптоза с целью оптимизации лечения больных на основе включения в комплексную терапию иммуномодулятора полиоксидония Задачи исследования:

1 Изучить состояние системного иммунитета у пациентов с хроническим обструктивным бронхитом в динамике заболевания

2 Выявить особенности экспрессии С095-антигена на лимфоцитах периферической крови у больных хроническим обструктивным бронхитом в зависимости от характера патологического процесса и применения различных противовоспалительных препаратов

3 Исследовать уровень апоптоза нейтрофилов и лимфоцитов у пациентов с хронические обструктивным бронхитом

4 Оценить клинико-иммунологическую эффективность полиоксидония в комплексном лечении больных с хроническим обструктивным бронхитом, в частности изучить влияние этого иммуномодулятора на апоптоз нейтрофилов и лимфоцитов

Научная новизна

Получены новые данные об изменениях клеточного иммунитета, в зависимости от степени тяжести ХОБ и активности воспалительного процесса

-г-

Отмечена взаимосвязь между изменением иммунологических показателей и степенью обструкции при ХОБ

Выявлены новые закономерности уровня экспрессии Раз(С095, АРО-1)-рецептора на лимфоцитах и состояния апоптоза мононуклеарных и полиморфноядерных лейкоцитов периферической крови в динамике заболевания и использовании различных лечебных программ Определенная степень активности вступления клеток в состояние апоптоза соответствует тяжести течения заболевания и влияет на прогрессирование хронического воспаления при ХОБ

Впервые проводилось комплексное исследование апоптоза при ХОБ Изучено действие комплексной терапии с использованием иммунокорректора полиоксидония на клиническое течение ХОБ и показатели системного иммунитета у пациентов с различной степенью тяжести ХОБ, величину Раз(С095, АРО-1)-рецептора и апоптоз лимфоцитов и гранулоцитов в различные периоды заболевания Практическая ценность работы

Полученные в результате проведенных исследований новые сведения о патогенетических механизмах развития иммунологической недостаточности, лежащих в основе прогрессирования хронического обструктивного бронхита послужили отправной точкой для разработки методов диагностики степени тяжести и периода заболевания, внедрение которых в клиническую практику позволит определить оптимальные схемы терапии, критерии назначения противовоспалительных препаратов

Установлена эффективность применения иммунокоррегирующего препарата полиоксидония в лечении больных ХОБ Результаты динамического иммунологического наблюдения свидетельствуют о том, что препарат преимущественно влияет на число СБ 16+ и С020+-лимфоцитов и нормализует активность нейтрофилов

Основные положения, выносимые на защиту:

1 При хроническом обструктиьном бронхите наблюдаются различные иммунологические нарушения, соответствующие степени тяжести течения заболевания, характеризующиеся нарушением соотношений субпопуляций Т-лимфоцитов, дисиммуноглобулинемией, недостаточной фагоцитарной активностью и избыточной реализацией бактерицидного потенциала нейтрофилами

2. Хронический обструктивный бронхит характеризуется повышенным уровнем экспрессии СВ95-рецептора, не зависящим от периода заболевания Противовоспалительная терапия при ХОБ оказывает влияние на количество С095-положительных лимфоцитов

3 Уровень апоптоза мононуклеарных и полиморфноядерных лейкоцитов периферической крови динамично меняется в различные периоды ХОБ и зависит от степени тяжести заболевания

4 Использование иммуномодулятора полиоксидония в терапии ХОБ повышает эффективность противовоспалительной терапии при обострении заболевания, способствует удлинению периода ремиссии и повышению качества жизни пациентов Развитие клинического эффекта применения полиоксидония сопровождается положительными сдвигами измененных иммунологических показателей при ХОБ

Внедрение в пракшку

Результаты исследования внедрены в практику Поликлиники №1 ЦКДК ФГУ "Национального медико-хирургического центра имени Н И Пирогова" Росздрава, ЗАО "Лечебный центр", Иммунологического центра Клинической больницы №83 Федерального медико-биологического агентства России Апробация работы

Основные положения диссертации доложены на научно- практических конференциях ФУ «Медбиоэкстрем» в 2003 и 2004гг, на третьей конференции молодых ученых России с международным участием «Фундаментальные науки и прогресс клинической медицины», Москва, январь 2004г, на объединенном

иммунологическом форуме в Екатеринбурге, июнь 2004г, результаты диссертации отражены в материалах 2-ой научно-практической конференции «Организация, методология и клиническая практика восстановительной медицины и медицинской реабилитации» в Москве, апрель 2005, IV конференции иммунологов Урала, в Уфе, октябрь 2005г Публикации

Основные материалы диссертации отражены в 9 печатных работах Структура н объем диссертации

Диссертация изложена на 124 страницах машинописного текста, иллюстрирована 16 рисунками и 17 таблицами, состоит их введения, обзора литературы, результатов собственных исследований, обсуждения полученных данных, выводов, практических рекомендаций, указателя литературы, включающего 140 источников

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы исследования Обследовано 80 больных, находившихся на стационарном лечении по поводу обострения хронического обструктивного бронхита и амбулаторном наблюдении в период ремиссии ХОБ Все пациенты были разделены на группы в зависимости от тяжести течения заболевания согласно рекомендациям GOLD 2003 г - 2 и 3 стадии ХОБ Под наблюдением в период обострения находилось 60 пациентов, из которых большая часть - 33 человека (55%) - это больные с ХОБ среднетяжелого течения и 27 (45%) пациентов с тяжелым ХОБ В период ремиссии наблюдалось 20 пациентов

Среди обследуемых пациентов были 38 женщин и 42 мужчины в возрасте от 43 до 72 лет (средний возраст составил 55,3 года) Продолжительность заболевания у обследованных колебалась то 3 до 40 лет, при этом большую часть (65 %) составили пациенты с давностью болезни более 10 лет Все пациенты получали стандартное лечение в соответствии с рекомендациями GOLD 2003г и Федеральной программой "Хронические обструктивные болезни легких" Больные в стадии обострения получали муко- и бронхолитики,

антибактериальную терапию (в соответствии с данными бактериологического исследования мокроты, до получения результатов микробиологического исследования выбор осуществляли эмпирически с назначением антибиотиков широкого спектра действия) Пациентам с тяжелым обострением ХОБ назначались глюкокортикостероиды парентерально коротким курсом (по рекомендация ВОЗ, 2003г) В период ремиссии пациенты использовали ингаляционные селективные р2-агонисты или холинолитики, часть пациентов (преимущественно с тяжелым ХОБ) получали ингаляционные ГКС Всем больньм проводилось обязательное клинико-лабораторное, иммунологическое и функциональное обследование

Иммунологическое обследование включало в себя исследование параметров иммунной системы 1 и 2 уровней Выделение мононуклеарных и полиморфноядерных лейкоцитов из периферической крови проводили одноэтапным методом с использованием двуслойного градиента Фиколл-Верографина Фенот ипирование лимфоцитов (CD3, CD4, CD8, CD16, CD19 и CD 95) проводили на проточном цитометре Epics XL 4 фирмы "Beckman coulter"

Определение сывороточных иммуноглобулинов (IgA,IgM,IgG) происходило методом радиальной иммунодиффузии по Манчини

Исследование показателей фагоцитоза включало фагоцитарный индекс и активность нейтрофилов в спонтанной и индуцированной

хемолюминесценции

Регистрацию апоптоза мононуклеарных и полиморфноядерных лейкоцитов осуществляли с помощью проточной цитофлуометрии после окрашивания ДНК йодистым пропидием в качестве флуорохрома на проточном цитофлуорометре Epics Profile Измеряли процент гиподиплоидных клеток среди свежевыделенных лейкоцитов и через 24 часа после их инкубации в культуральной среде

Для диагностики ХОБ, определения степени бронхиальной обструкции и степени тяжести заболевания, эффективности терапии проводили исследование

функции внешнего дыхания в различные периоды болезни на компьютерном спироанализаторе "Master Screen Body" 2003г, фирмы Jaeger, Германия Часть пациентов получала комплексную терапию с включением иммуномодулятора полиоксидония Разделение больных на группы происходило следующим образом пациенты со стреднетяжелым ХОБ - 1 группа получала патогенетическую терапию, 2 группа - комплексную терапию с полиоксидонием, пациенты с тяжелым ХОБ - 3 группа назначалась патогенетическая терапия, 4 группа - комплексное лечение с полиоксидонием Критериями оценки эффективности лечения явилась динамика клинических, лабораторных, иммунологических, функциональных показателей, качество жизни пациентов, а также длительность ремиссии, сроки нахождения в стационаре, дальнейшая частота использования антибактериальной терапии и системных ГКС

Данные обработаны методом вариационной статистики с помощью персонального компьютера IBMP и пакета прикладных программ "Statistica 6 0"

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ Сравнительный анализ изменений иммунитета в период обострения показал, что у пациентов как со среднетяжелым так и с тяжелым ХОБ отмечалось значимое повышение количества лейкоцитов, при этом у пациентов с тяжелым ХОБ лейкоцитоз был более выраженный Также в обеих группах было повышено абсолютное количество лимфоцитов при повышении их относительного показателя у пациентов со среднетяжелым ХОБ и достоверным его снижением до 19,8 ± 1,9 % у пациентов с тяжелым ХОБ (р<0,05) Отмечено достоверное повышение относительного количества CD3+ и CD4+-лимфоцитов и абсолютного числа СЭЗ+-клеток в группе тяжелого ХОБ (р<0,05), у пациентов со среднетяжелым течением ХОБ выявлено тенденция к повышению данных показателей 42,4% (14) пациентов данной группы имеют повышенный уровень СБЗ+-лимфоцитов и 45,4% (15) - СБ4+-лимфоцитов

В группе с тяжелым ХОБ снижено количество С08+-лимфоцитов у 62,9% (17) пациентов и СБ16+ - , С019+-лимфоцитов у 51,8% (14) пациентов У пациентов со средчетяжелым ХОБ имеется тенденция к снижению данных показателей (р>0,05)

Уровень спонтанной метаболической активности лейкоцитов был сниженным по сравнению с контролем в обеих группах (в случае среднетяжелого ХОБ р>0,05, тяжелого ХОБ - р<0 05) методом хемилюминесценции, в обеих группах показатели индуцированной зимозаном хемилюминесценции не отличались ог таковых у здоровых лиц При этом 36% (12) пациентов со среднетяжелым и 41% (11) - с тяжелым ХОБ имели достоверно сниженные показатели индуцированной ЛЗХЛ По-видимому, отсутствовала необходимая стимуляция со стороны Т-лимфоцитов на нейтрофилы, несмотря на выявленное повышение количества последних в периферической крови Снижение функциональной активности фагоцитов в данный период ХОБ ведет к затяжному, вялотекущему обострению, неполноценной эрадикации возбудителя, недостаточной элиминацией повре еденных клеток из организма

Показатели иммуноглобулинов в обеих группах не отличались от показателей здоровых доноров То есть отсутствовала адекватная стимуляция гуморального иммунитета при обострении воспалительного процесса, несмотря на абсолютный лимфоцитоз и повышение уровня СБЗ+ и СБ4+-клеток

Таким образом, несмотря на, казалось бы, закономерную реакцию клеточного звена иммунитета со стороны СБЗ+- и СБ4+-лимфоцитов в период обострения воспаления, отсутствовало стимулирующее влияние СБ4+ клеток на пролиферацию цитотоксических СВ8+-лимфоцитов, что приводило к повышение ИРИ до 2,0+0,25 СБ8+ участвуют в осуществлении клеточной цитотоксичности, имеющей важное значение в разрешении микробного воспаления, как и антителзависимая цитоксичность с участием СО 16+лимфоцитов, недостаток которых в циркуляции обнаружен нами у пациентов при обострении ХОБ Обнаруженный дисбаланс в регуляторных Т-

клетках приводит к неадекватному ответу со стороны как клеточного, так и гуморального звена иммунитета и, как следствие, предрасполагает к хронизации воспалительного процесса на слизистой легких Нам представлялось интересным изучить динамику одного из основных рецепторов апоптоза - СБ95 и отметить его роль в развитии апоптоза при ХОБ В период обострения ХОБ было отмечено повышение в среднем в два раза количества С095-положительных лимфоцитов в циркуляции, причем их уровень у пациентов с различной степенью тяжести ХОБ не различался Разброс индивидуальных показателей в обеих группах были в диапазоне от 3540% у 36% пациентов и до 55-80% у 64% респондентов (рисунок 1)

а в

Рисунок1 Уровень С095-рецептора методом проточной цитофлуометрин на лимфоцитах периферической крови здорового добровольца (А) и больного с тяжелым ХОБ в период обострения (Б)

Величина показателя С095+ в период ремиссии достоверно превышала нормальные показатели (р<0 05) и была обратно пропорциональна тяжести заболевания Полученные данные свидетельствуют о существовании избыточной или хронической антигенной стимуляции в фазе ремиссии, которая способствует активации лимфоцитов и повышает их готовность к Раз-зависимому апоптозу Причем активация лимфоцитов у пациентов с тяжелым ХОБ была наименьшая (табл 1)

Таблица 1 Количество лимфоцитов периферической крови, экспрессирующих СБ95-рецептор в динамике ХОБ различное степени тяжести

ПЕРИОД ЗАБОЛЕВАНИЯ СБ95, %

ХОБ, легкое течение ХОБ, среднетяжелое течение ХОБ, тяжелое течение

Обострение - 50,2±3,2* 51,0±4,3*

Ремиссия 54,2±1,2* 48,4±1,4* 44,5±7,8*

Контроль 25,1±1,4%

*р<0,05 в сравнении со здоровыми донорами

Оценивая динамику С095-положительных лимфоцитов следует отметить, что у пациентов 1 группы со среднетяжелым ХОБ в период лечения не происходит достоверного изменению уровня СБ95+ Терапия системными ГКС у пациентов 3 группы с тяжелым ХОБ вела к достоверному снижению СБ95+ лимфоцитов до 35,5±6,6%, вероятно за счет лимфоцитолитического действия препаратов, через 3 месяца этот показатель вновь повысился до 41,5±5,1% Это доказывает, что процессы индукции апоптоза глюкокортикостероидами опосредованы специальными рецепторами

В то же вргмя комплексная терапия с полиоксидонием в период обострения у пациентов 2 группы со среднетяжелым ХОБ в начале лечения приводила к снижению величины С095+( р<0,05) до 40,7±2,4%, которая после

- ю-

окончания лечения (44,6*2,8%) и контроле через 3 месяца (43,5±2,8%) повышалась до первоначального уровня. Подобная динамика экспрессии рецептора апоптоза регистрировалась и в случае применения полиоксидония в период ремиссии. У пациентов 4 группы с тяжелым ХОБ значимых изменений уровня Раз-рецептора не отмечалось (р>0,05).

Ркс 1 Дикмпка CD96+ Пйифецктой у пацнектов со срвднетяжелыи ХОБ

» »

Рис 2. Дина ми ra CD№ лимфоцитов у пациенте а с тиилын ХОБ.

гругаа |-*-2-ч груди [

уут ----— Ó.V.

•Vy,

" шаз-я группа

При исследовании уровня ano птоза и мму но компетентных клеток периферической крови больных ХОБ выявлено, что в период обострения у пациентов со среднетяжелым ХОБ уровень ano птоза лимфоцитов непосредственно при выделении 14,5±4,5% и после суточной инкубации 26,3±4,8% достоверно превышал показатели здоровых доноров в несколько раз (р<0,05), у пациентов с тяжелым ХОБ уровень спонтанного апоптоза лимфоцитов превышал контрольные значения в 20 раз и составил 20,1 ±0,34 % (р>0,05), культивирование не приводило в дальнейшем к повышению апоптоза (17,2±2,8%) . Количество апоптотически измененных гранулоцитов при выделении в обеих группах (10,0±1,3% при среднетяжелом ХОБ и Í3,8±ó,l% при тяжелом ХОБ) не отличалось от контроля, при культивировании было повышено почти в два раза по сравнению со здоровыми лицами, что составило

при среднетяжелом ХОБ 40,7±12,1% и при тяжелом ХОБ 35,0±14,9 %(р<0,05) (Таблица 2)

Таблица 2 Уровень апоптоза лимфоцитов и гранулоцитов периферической крови здоровых доноров и больных с различной степенью тяжести ХОБ в период обострения

ГРУППЫ КОЛИЧЕСТВО ГИПОДИПЛОИДНЫХ КЛЕТОК, %

Лимфоциты Гранулоциты

Время инкубации Время инкубации

0 часов 24 часа 0 часов 24 часа

Здоровые 1,2±0,2 3,6±0,7 9,2±1,б 22,0±3,0

Обострение ХОБ, среднетяжелое течение 14,5±4,5* 26,3±4,8* 10,0±1,3 40,7±12Д*

Обострение ХОБ, тяжелое течение 20,1±0,34* 17,2±2,8* 13,8±6,1 35,0±14,9*

*р<0,05 в сравнении со здоровыми донорами

В фазе ремиссии у пациентов с тяжелым течением ХОБ отмечено снижение апоптоза свежевыделенных лимфоцитов до 6,8±1,8%, однако показатель оставался по-прежнему высоким, величина апоптотически измененных гранулоцитов не отличалась от здоровых лиц (8,9±1,8% при выделении и 23,1±6,8% при дальнейшей культивации) У пациентов со среднетяжелым течением ХОБ не выявлено значительной динамики в показателях в сравнении с периодом обострения количество гиподиплоидных мононуклеаров при выделении 9,2±2,5% после 24-часовой инкубации в культуральной среде ш

vitro 28,9±7,0%, число апоптотически измененных гранулоцитов при выделении 7,8±0,9%, при культивации 32,1±9,8%

Таким образом, активация клеток в период обострения и ремиссии ХОБ повышает готовность клеток к апоптозу через Fas-опосредованный механизм Однако, нами не выявлено корреляции между величиной CD95 и апоптозом лимфоцитов у пациентов с ХОБ Можно предположить, что чувствительность клеток к Fas-индуцированному апоптозу определяется не только уровнем экспрессии Fas-антигена, но и его функциональным состоянием, балансом цитокинов и внутриклеточных регуляторов апоптоза Кроме того, вероятно апоптоз лимфоцитов при ХОБ осуществляется так же посредством других рецепторов апоптоза (TNF) и рецепторнезависимым путем В результате сравнительного анализа количества гиподиплоидных нммунокомпетентных клеток периферической крови групп пациентов с ХОБ в зависимости от получаемой противовоспалительной терапии были получены следующие результаты

Показатели апоптоза лимфоцитов у больных со среднетяжелым ХОБ во 2 группе, получающей комплексную терапию с полиоксидонием, после лечения непосредственно после выделения в среднем по группе снизились до уровня здоровых лиц и составили 4,8±3,4%, при культивировании m vitro оставались высокими в сравнении с контролем - 9,9±1,99% Те же показатели у пациентов с традиционным лечением в 1 группе снизились от первоначальных показателей на 45-55%, но оставались повышенными и составили 7,4±3,2% и 17,5±6,4% соответственно (р<0,05) (рис 4 )

Рис.4. Уровень апоптоза лимфоцитов перифериферической крови пациентов со среднетяжепым ХОБ до и после лечения.

Количество свежевыделенных гиполиплоидных гранулоцитов во 2 группе, в результате комплексной терапии с полиоксидонием, умеренно повысилось до 13,4±5,4% (р>0,05), апоптотический иидекс культивированных гранулоцитов достоверно снизился до 27±9,5% (р<0,05) . Соответствующие показатели у пациентов первой группы составили 8,3±1,7% и 36,1*9,9%, то есть традиционная терапия не приводила к достоверному изменению апоптоза гранулоцитов (рис.5).

Рис. 5. Уровень апоптоза гранулоцитов периферической крови пациентов со среднетяжелым ХОБ до и после лечения.

45

время инкубации, часы

В группе пациентов с тяжелым ХОБ, получающих патогенетическую терапию с ГКС регистрировалась активация апоптоза лимфоцитов, что является следствием известного л имфо цитол ити чес ко го действия ГКС. Величина апоптоза свежевыделенных клеток составила 25,2±10,2%, культивированных 22,0±5}3%. Действие ГКС на гранул о циты было противоположным, мы отметили, что доля клеток в спонтанном апоптозе достоверно снизилась до 6,5±5,5% в сравнении с контролем, при культивировании показатель соответствовал физиологической норме - 25,2±5,4%.

У пациентов 4 группы после комплексной терапии с полиоксидонием величина апоптоза лимфоцитов непосредственно при выделении составила 5,5±1,7%, при культивировании 13,3±1,8%, то есть показатели достоверно снизились в сравнении с началом обострения, но не достигали контрольных величин. Количество гиполиплоидных гранулоцитов при выделении составило 14,5±3,6%, что превышало величину контроля (р<0,05), культивирование

приводило к повышению процента апоптотическЯ измененных клеток до 31,8*8,4% (рис.6,7).

Рис.6. Уровень апоптоза лимфоцитов периферической крови пациентов с тяжелым ХОБ до и после лечения.

зо 1------

х

0 24

время инкубации, часы

РиС.7. Уровень апоптоза гранулоцитов периферической крови пациентов с тяжелый ХОБ до и после лечения.

40

х 35 л

время инкубации, часы

Применение при ХОБ в комплексной терапии в качестве иммуномодулятора полиоксидония способствовало более быстрой регрессии клинических проявлений заболевания, нивелирование симптомов интоксикации, уменьшение частоты приступов кашля и их выраженности происходило на 3-4 дня раньше в сравнении с контрольной группой

Применение полиоксидония у больных со среднетяжелым ХОБ позволило сократить длительность пребывания в стационаре на 26,5%, удлинить длительность ремиссии до 1 года у 25% больных и до 6 месяцев у 28%, при этом снизилась частота обострений и потребность в назначении антибактериальной терапии в среднем на 31% В группе пациентов с тяжелым ХОБ иммуномодулирующая терапия способствовала удлинению ремиссии с 3,6±0,22 до 5,0±0,11 месяца, снижению количество обострений в год в 1,25 раза Рис 8,9

Показатель качества жизни пациентов был выше, чем в группе с традиционной терапией Это было связано с улучшением самочувствия, что проявлялось повышением физической выносливости, улучшением социальной адаптации пациентов, где важную роль играет сохранение повседневного "стиля жизни" пациентов с ХОБ

Рис.8 Длительность ремиссииу пациентов с ХОБ.

1-я 2-я 3-я 4-я

группы

1-я 2-я 3-я 4-я

группы

выводы

1 У больных хроническим обструктивным бронхитом повышено абсолютное и относительное количество СБЗ+ и СБ4+ лимфоцитов и снижено число СБ8+, СБ 16+ и СБ 19+ клеток, показатели люминол-зависимой хемилюминесценции нейтрофилов ниже таковых у здоровых доноров Выявленные иммунологические нарушения у пациентов с ХОБ коррелируют с тяжестью течения заболевания и способствуют дальнейшей его прогрессии

2 При обострении ХОБ выявлено достоверное увеличение относительно здоровых лиц количества СВ95-положительных лимфоцитов и усиление апоптоза лимфоцитов и культивированных гранулоцитов Период клинико-лабораторной ремиссии характеризовался нормализацией уровня апоптоза гранулоцитов, количество С095+ и гиподиплоидных лимфоцитов также снижалось, но оставалось выше уровня здоровых доноров

3 Традиционная патогенетическая терапия при ХОБ не приводит к достоверному изменению уровня СБ95+ - лимфоцитов и количества гиподиплоидных мононуклеаров и гранулоцитов.

4 Включение иммуномодулятора полиоксидония в терапию пациентов с ХОБ позволило добиться удлинения периода ремиссии, снижения числа обострений в сравнении с применяемой традиционной терапией

5 Применение полиоксидония приводило к нормализации показателей иммунного статуса, проявляющееся в повышении количества СБ16+ и С019+-лимфоцитов, нормализации активности нейтрофилов в спонтанной хемилюминесценции, повышении устойчивости лимфоцитов и гранулоцитов к апоптозу.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1 Определение уровня апоптоза мононуклеарных и полиморфноядерных лейкоцитов периферической крови является информативным методом оценки тяжести течения, периода заболевания и может служить критерием разработки индивидуачьной схемы лечения Исследование иммунологических параметров в динамике лечения позволяет оценить его эффективность у каждого больного

2 Терапия с применением полиоксидония показано пациентам с ХОБ, у которых наблюдается снижение в периферической крови С01б+, С019+-лимфоцитов, изменение функциональной и фагоцитарной активности нейтрофилов Препарат оказывает положительное воздействие на клиническое течение заболевания, увеличивает длительность ремиссии, снижает частоту обострений

Назначение полиоксидония осуществляется на фоне стандартной базисной тергпии при обострении хронического обструктивного бронхита, в период ремиссии применение препарата возможно в виде монотерапии Полиоксидоний рекомендуется вводить внутримышечно по 0 006 г через день, 10 инъекции на курс, с интервалом 3 месяца

СПИСОК НАУЧНЫХ РАБОТ, ВЫПОЛНЕННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Сокуренко СИ, Самойлова НЕ, Караулов АВ, Федосеев АН, Бондаренко НЛ Иммунопатогенез хронического обструктивного бронхита// Материалы 13-го Национального конгресса по болезням органов дыхания -Санкт-Петербург -2003 г - С 124

2. Самойлова Н Е , Бондаренко Н Л , Ликов В Ф , Сокуренко С И , Караулов А В Апоптоз лимфоцитов при хроническом обструктивном бронхите// Объединенный иммунологический форум Журнал российского общества иммунологов Тезисы докладов - Екатеринбург -2004 г -С 254

3 Бондаренко Н Л, Самойлова Н Е, Дмитриева Е В Исследование апоптоза лимфоцитов при хронических обструктивных заболеваниях легких // III конференция молодых ученых России с международным участием "Фундаментальные науки и прогресс клинической медицины" Сборник тезисов -Москва -2004 г -С 114

4 Самойлова Н Е, Сокуренко С И, Караулов А В , Бондаренко Н Л Иммунореабилитация пациентов с хроническим обструктивным бронхитом // Иммунология Урала Материалы IV конференции иммунологов Урала -Уфа -2005 г - С 152-153

5 Бондаренко Н Л, Сокуренко С И , Караулов А В , Самойлова Н Е изменение маркера активации С095 при стероидозависимой бронхиальной астме и хроническом обструктивном бронхите И Иммунология Урала Материалы IV конференции иммунологов Урала -Уфа - 2005 г - С 165-166

6 Самойлова Н Е , Сокуренко С И , Караулов А В Иммунореабилитация пациентов с хроническим обструктивным бронхитом И Материалы второй научно-практической конференции "Организация, методология и клиническая практика восстановительной медицины и медицинской реабилитации" -Москва - 2005 г.-С 84-85

7 Караулов А В , Сокуренко С И , Самойлова Н Е. СБ95+ лимфоциты, апоптоз лимфоцитов и гранулоцитов периферической крови пациентов с хроническим обструктивным бронхитом // Материалы V симпозиума " Физиология иммунной системы. Перспективные подходы к диагностике и терапии иммунопатологий и аллергических заболеваний" -Москва - 2006 г - С 39-40

8 Самойлова Н Е, Сокуренко С И , Караулов А В Иммунопатология и иммунореабилитация пациентов с хроническим обструктивным бронхитом // XVI Национальный конгресс по болезням органов дыхания Сборник трудов конгресса - Санкт-Петербург -2006 г -С 87

9 Караулов А В , Самойлова Н Е , Кокушков Д В Исследование изменений апоптоза лимфоцитов и гранулоцитов периферической крови у пациентов с

хроническим обструктивным бронхитом на фоне комплексной терапии с включением полиоксидония // Иммунология - 2007 г - Том 28 -№ 2 - С 93-95

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ХОБ - хронического обструктивного бронхита ХОБЛ- хронические обструктивные болезни легких ГКС- глюкокортикостеоиды ЛЗХЛ-люминолзависимая хемилюминесценция ИРИ-иммунорегуляторный индекс

Подписано в печать 19 04 2007 г Исполнено 20 04 2007 г Печать трафаретная

Заказ № 400 Тираж ЮОэкз

Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш , 36 (495) 975-78-56 у. уу'\у аиТогеГгга! ги

Хронический обструктивный бронхит (ХОБ) входит в состав хронических обструктивных заболеваний легких (ХОБЛ) и является самым распространенным из всех форм ХОБЛ. ХОБ рассматривается как неблагоприятный вариант ХОБЛ вследствие нарастающего нарушения легочной вентиляции, газообмена и развития тяжелых осложнений (64).

Исследования последних лет подтвердили основную роль сложной иерархии межклеточных взаимодействий в патогенезе хронического воспаления при ХОБ. Основными эффекторными клетками, играющими ключевую роль в хронизации воспаления, являются нейтрофилы и лимфоциты (13,23, 43, 74, 83,123).

В настоящее время все большее внимание уделяется проблеме апоптоза или программированной гибели клеток. Отмечено, что задержка апоптоза нейтрофилов вследствие гипоксии и повышенной экспрессии антиапоптотических факторов при ХОБ, способствует развитию "нейтрофильного" воспаления и приводит к "оксидативному взрыву", который может быть одной из причин повреждения эпителиального пласта при ХОБ (95,104).

Относительно роли апоптоза Т-лимфоцитов в патогенезе ХОБ в литературе имеются противоречивые данные. Согласно одной теории, пролонгация воспаления при ХОБ может быть связана с повышением выживаемости Т-лимфоцитов и утратой их способности к апоптозу, согласно второй, напротив, с усилением активационного апоптоза Т-лимфоцитов и образованием низкодифференцированных некомпетентных Т-клеток (22, 90).

Среди рецепторов цитоплазматического "домена гибели" клетки антиген из семейства факторов некроза опухолей (ФНО) - Fas (CD95, АРО-1) не имеет иных функций, кроме передачи сигнала к развитию апоптоза (73). Дисфункция системы Fas и его лиганда FasL может вносить свой вклад в нарушение контроля над состоянием и числом эффекторных клеток при ХОБ. Изучение механизма функционирования рецепторных систем клетки и их роли в процессах активации и апоптоза при ХОБ может способствовать расширению представлений о патогенезе заболевания и разработке новых лечебных и профилактических мероприятий для пациентов с ХОБ. Цель исследования: анализ клинических и иммунологических изменений при хроническом обструктивном бронхите и патогенетической роли апоптоза с целью оптимизации лечения больных на основе включения в комплексную терапию иммуномодулятора полиоксидония. Задачи исследования:

1. Изучить состояние системного иммунитета у пациентов с хроническим обструктивным бронхитом в динамике заболевания.

2. Выявить особенности экспрессии С095-антигена на лимфоцитах периферической крови у больных хроническим обструктивным бронхитом в зависимости от характера патологического процесса и применения различных противовоспалительных препаратов.

3. Исследовать уровень апоптоза нейтрофилов и лимфоцитов у пациентов с хроническим обструктивным бронхитом.

4. Оценить клинико-иммунологическую эффективность полиоксидония в комплексном лечении больных с хроническим обструктивным бронхитом, в частности изучить влияние этого иммуномодулятора на апоптоз нейтрофилов и лимфоцитов.

Научная новизна

Получены новые данные об изменениях клеточного иммунитета, в зависимости от степени тяжести ХОБ и активности воспалительного процесса. Отмечена взаимосвязь между изменением иммунологических показателей и степенью обструкции при ХОБ.

Выявлены новые закономерности уровня экспрессии Fas(CD95, АРО-1)-рецептора на лимфоцитах и состояния апоптоза мононуклеарных и полиморфноядерных лейкоцитов периферической крови в динамике заболевания и использовании различных лечебных программ. Определенная степень активности вступления клеток в состояние апоптоза соответствует тяжести течения заболевания и влияет на прогрессирование хронического воспаления при ХОБ.

Впервые проводилось комплексное исследование апоптоза при ХОБ.

Изучено действие комплексной терапии с использованием иммунокорректора полиоксидония на клиническое течение ХОБ и показатели системного иммунитета у пациентов с различной степенью тяжести ХОБ, величину Fas(CD95, АРО-1)-рецептора и апоптоз лимфоцитов и гранулоцитов в различные периоды заболевания.

Теоретическая и практическая ценность работы

Полученные в результате проведенных исследований новые сведения о патогенетических механизмах развития иммунологической недостаточности, лежащих в основе прогрессирования хронического обструктивного бронхита послужили отправной точкой для разработки методов диагностики степени тяжести и периода заболевания, внедрение которых в клиническую практику позволит определить оптимальные схемы терапии, критерии назначения противовоспалительных препаратов.

Установлена эффективность применения иммунокоррегирующего препарата полиоксидония в лечении больных ХОБ. Результаты динамического иммунологического наблюдения свидетельствуют о том, что препарат преимущественно влияет на число CD16+ и С020+-лимфоцитов, нормализует активность нейтрофилов.

Результаты исследования внедрены в практику КДК №1 ФГУ "НМХЦ имени Н.И.Пирогова" Росздрава, ЗАО "Лечебный центр", отделения иммунологии Клинической больницы №83 Федерального медико-биологического агентства России.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. При хроническом обструктивном бронхите наблюдаются различные иммунологические нарушения, соответствующие степени тяжести течения заболевания, характеризующиеся нарушением соотношений субпопуляций Т-лимфоцитов, дисиммуноглобулинемией, недостаточной фагоцитарной активностью и избыточной реализацией бактерицидного потенциала нейтрофилами.

2. Хронический обструктивный бронхит характеризуется повышенным уровнем экспрессии СйЭб-рецептора, не зависящим от периода заболевания. Противовоспалительная терапия при ХОБ оказывает влияние на количество С095-положительных лимфоцитов.

3. Уровень апоптоза мононуклеарных и полиморфноядерных лейкоцитов периферической крови динамично меняется в различные периоды ХОБ и зависит от степени тяжести заболевания.

4. Использование иммуномодулятора полиоксидония в терапии ХОБ повышает эффективность противовоспалительной терапии при обострении заболевания, способствует удлинению периода ремиссии и повышению качества жизни пациентов. Развитие клинического эффекта применения полиоксидония сопровождается положительными сдвигами измененных иммунологических показателей при ХОБ.

выводы.

1. У больных хроническим обструктивным бронхитом повышено абсолютное и относительное количество CD3+ и CD4+ лимфоцитов и снижено число CD8+, CD16+ и CD19+ клеток; показатели люминол-зависимой хемилюминесценции нейтрофилов ниже таковых у здоровых доноров. Выявленные иммунологические нарушения у пациентов с ХОБ коррелируют с тяжестью течения заболевания и способствуют дальнейшей его прогрессии.

2. При обострении ХОБ выявлено достоверное увеличение относительно здоровых лиц количества СР95-положительных лимфоцитов и усиление апоптоза лимфоцитов и культивированных гранулоцитов. Период клинико-лабораторной ремиссии характеризовался нормализацией уровня апоптоза гранулоцитов; количество CD95+ и гиподиплоидных лимфоцитов также снижалось, но оставалось выше уровня здоровых доноров.

3. Традиционная патогенетическая терапия при ХОБ не приводит к достоверному изменению уровня CD95+ - лимфоцитов и количества гиподиплоидных мононуклеаров и гранулоцитов.

4. Включение иммуномодулятора полиоксидония в терапию пациентов с ХОБ позволило добиться удлинения периода ремиссии, снижения числа обострений в сравнении с применяемой традиционной терапией.

5. Применение полиоксидония приводило к нормализации показателей иммунного статуса, проявляющееся в повышении количества CD16+ и С019+-лимфоцитов, нормализации активности нейтрофилов в спонтанной хемилюминесценции, повышении устойчивости лимфоцитов и гранулоцитов к апоптозу.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ.

1. Определение уровня апоптоза мононуклеарных и полиморфноядерных лейкоцитов периферической крови является информативным методом оценки тяжести течения, периода заболевания и может служить критерием разработки индивидуальной схемы лечения.

Исследование иммунологических параметров в динамике лечения позволяет оценить его эффективность у каждого больного.

2. Терапия с применением полиоксидония показано пациентам с ХОБ, у которых наблюдается снижение в периферической крови CD16+, С019+-лимфоцитов, изменение функциональной и фагоцитарной активности нейтрофилов. Препарат оказывает положительное воздействие на клиническое течение заболевания, увеличивает длительность ремиссии, снижает частоту обострений. Назначение полиоксидония осуществляется на фоне стандартной базисной терапии при обострении хронического обструктивного бронхита, в период ремиссии применение препарата возможно в виде монотерапии. Полиоксидоний рекомендуется вводить внутримышечно по 0.006 г через день, 10 инъекций на курс, с интервалом 3 месяца.