Автореферат и диссертация по медицине (14.00.36) на тему:Антитела к антигенам сперматозоидов человека в норме и при нарушениях репродуктивной функции

На правах рукописи

Николаева Марина Аркадьевна

АНТИТЕЛА К АНТИГЕНАМ СПЕРМАТОЗОИДОВ ЧЕЛОВЕКА В НОРМЕ И ПРИ НАРУШЕНИЯХ РЕПРОДУКТИВНОЙ ФУНКЦИИ

14.00 36 - аллергология и иммунология

03.00.25 - гистология, цитология, клеточная биология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Москва - 2007

003066851

Работа выполнена в лаборатории клинической иммунологии Федерального государственного учреждения «Научный центр акушерства, гинекологии и перинатологии Федерального агентства по высокотехнологичной медицинской помощи»

Научный консультант академик РАМН, доктор

медицинских наук, профессор Сухих Геннадий Тихонович

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, профессор

Стенина Марина Александровна ГОУ ВПО РГМУ РОСЗДРАВА

доктор биологических наук, профессор Курило Любовь Федоровна ГУ «Медико-генетический научный центр РАМН»

доктор биологических наук, профессор Захарова Людмила Алексеевна Институт биологии развития им Н К Кольцова РАН

Ведущая организация Государственное предприятие

Государственный Научный Центр «Институт иммунологии Федерального медико-биологического агентства»

Защита состоится « 22~у> октября 2007 г в 14 00 часов на заседании диссертационного совета Д 208 072 05 при ГОУ ВПО «Российский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию» по адресу 117997, г Москва, ул Островитянова, д 1

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке РГМУ по адресу 117997, г Москва, ул Островитянова, д 1

Автореферат разослан « » сентября 2007 г

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат медицинских наук,

доцент Т.Е. Кузнецова

Актуальность работы

Иммунорегуляция процессов гаметогенеза, оплодотворения и беременности играет важную роль при репродукции человека Основной функцией иммунной системы является защита организма путем распознавания «своего» и «не своего» (чужого) Препятствуя развитию инфекций и раковых опухолей и обеспечивая отторжение чужеродных тканей, иммунная система парадоксальным образом «не замечает» уникальных антигенов сперматозоидов, продукция которых начинается в пубертатный период, когда толерантность к «своему» уже давно сформирована, не противодействует проникновению генетически чужеродных сперматозоидов в организм женщины и дальнейшему развитию полуаллогенного плода Многочисленные исследования свидетельствуют о том, что отсутствие иммунного конфликта при нормальном функционировании репродуктивных органов является результатом сбалансированного динамического взаимодействия иммунной и репродуктивной систем (Говалло В И , 1987, Johnson Р et al, 1999, Хаитов РМ и Алексеев ЛП, 2001, Сухих ГТ и Ванько ЛВ, 2003) Однако механизмы, обеспечивающие иммунологическую регуляцию репродуктивной функции человека, до сих пор во многом остаются невыясненными Очевидно, что изучение взаимодействия иммунной и репродуктивной систем имеет большое теоретическое значение для понимания иммунологических закономерностей, а также несомненное клиническое значение для иммунодиагностики и эффективной коррекции различных нарушений репродукции человека

До сих пор не существует единого мнения о роли гуморального иммунитета при репродукции Возможность продукции антител к сперматозоидам - антиспермальных антител (АСАТ) - была показана в конце XIX века в работах К Ландштайнера (Landstemer К, 1899) и И И Мечникова (Metchnikoff Е, 1899) В последующих публикациях,

посвященных выявлению АСАТ, было постулировано существование иммунологического бесплодия, обусловленного наличием антител к антигенам сперматозоидов в сыворотке и секретах репродуктивного тракта мужчин (RumkeР and HelhngerG, 1959) и женщин (FranklinRR and Dukes С D 1964) С тех пор значение АСАТ в генезе бесплодия интенсивно исследуется, но до сих пор остается невыясненным вопрос о том, является ли присутствие АСАТ в сыворотках женщин до наступления беременности, при беременности и после беременности физиологическим или патофизиологическим фактором Отсутствует также единая точка зрения о механизмах формирования АСАТ у мужчин Для выявления АСАТ используется широкий спектр методов, приводящих зачастую к противоположным выводам

С помощью методов спермоагглютинации (Franklin R R and Duckes С D , 1964), спермоиммобилизации (Isojima S et al, 1968), MAR (mixed agglutination reaction) - теста (Jager S et al, 1978), иммуноферментного анализа (Zanchetta R et al, 1982) и IBT (immunobead) - теста (Bronson R A et al, 1984) получены данные об отсутствии или низком уровне АСАТ в сыворотке фертильных женщин, в то же время данные иммунофлуоресценции (TungKS et al, 1976) и иммуноблоттинга (Shetty J et al, 1999, Domagala A and Kurpisz M , 2004) подтверждают присутствие АСАТ в сыворотках фертильных мужчин и женщин В обзоре, посвященном проблеме антиспермального иммунитета (Heimerhorst F М et al, 1999), авторы делают вывод о методическом кризисе, связанном с выявлением АСАТ Там же подчеркивается, что «на данный момент отсутствует стандартный единый метод выявления АСАТ, отсутствуют общепринятые представления о клинической значимости АСАТ, отсутствуют доказательства влияния АСАТ на процессы репродукции, невозможно использовать предлагаемые рутинные методы выявления АСАТ в качестве тестов для диагностики иммунного бесплодия»

Очевидно, что в основе противоречивых представлений о значении антиспермального иммунитета лежит проблема адекватности методов, используемых для выявления АСАТ

Методология изучения влияния антиспермального иммунитета на процессы репродукции включает в себя также сравнение функций АСАТ-негативных и АСАТ-позитивных сперматозоидов

Важнейшей функцией сперматозоидов, играющей ключевую роль в проникновении сперматозоида через оболочку яйцеклетки, является акросомная реакция (АР) - рецептор-опосредованная активация и высвобождение протеолитических ферментов (Yanagimachi R, 1988) Данные о влиянии АСАТ на АР противоречивы в одних исследованиях показано ингибирование АР при наличии АСАТ (BenoffS et al,1993), в работах других авторов выявлена стимуляция преждевременной, спонтанной АР (Lansford В etal,1990, Harrison S etal,1998, BohringC etal,2001)

Противоречивые представления о функциях АСАТ-позитивных сперматозоидов могут быть также обусловлены субъективным характером методов, используемых для оценки этих функций Так для оценки акросомного статуса используется трудоемкий и субъективный метод флуоресцентной микроскопии

Очевидно, что для формирования современных представлений о влиянии антиспермального иммунитета на репродуктивную функцию человека необходима разработка новых адекватных методов выявления АСАТ в различных биологических жидкостях бесплодных и фертильных пациентов, а также создание объективных методов оценки влияния АСАТ на оплодотворяющую способность сперматозоидов

Цель работы

Характеристика иммунных реакций на антигены сперматозоидов в норме и при нарушениях репродуктивной функции у мужчин и женщин с

помощью новых объективных количественных способов выявления антиспермальных антител и оценки функций сперматозоидов

Задачи исследования

1 Разработка объективного количественного способа выявления антител к антигенам сперматозоидов с помощью метода проточной цитофлуорометрии

2 Количественная оценка уровня антител к антигенам сперматозоидов в сыворотках крови и секретах репродуктивного тракта у фертильных и бесплодных мужчин и женщин

3 Разработка объективного способа оценки акросомной реакции сперматозоидов с помощью метода проточной цитофлуорометрии

4 Оценка влияния антиспермальных антител на функции сперматозоидов - скорость движения, генерацию активных форм кислорода, акросомную реакцию

5 Выявление зависимости уровня антиспермальных антител от состояния клеточного звена иммунитета у мужчин и женщин

Научная новизна исследования

Впервые предложен количественный способ выявления антител классов б, А и М на поверхности живых сперматозоидов с помощью проточной цитофлуорометрии Установлено, что связывание АСАТ, присутствующих в секретах репродуктивного тракта мужчин и небеременных женщин, с поверхностными антигенами живых сперматозоидов является маркером нарушения репродуктивной функции

Продемонстрировано существование в сыворотках крови и секретах репродуктивного тракта бесплодных мужчин и женщин АСАТ теплового и холодового типа, выявляющихся на поверхности живых сперматозоидов лишь в определенном температурном диапазоне

Впервые разработан количественный способ оценки акросомного статуса сперматозоидов с помощью одновременного окрашивания гамет лектином Pisum sativum, меченным флуоресцеин-изотиоцианатом, и лектином Arachis hypogaea, меченным тетраметилродамин-изотиоцианатом, и последующего анализа методом ПЦМ

Впервые показано, что преждевременная активация сперматозоидов, происходящая при связывании АСАТ с поверхностью клеток, является одним из механизмов нарушения репродуктивной функции Обнаружено, что активация сперматозоидов, покрытых антителами, сопровождается сбрасыванием поверхностных комплексов антиген-антитело, что определяет низкую чувствительность вьивления АСАТ с помощью метода проточной цитофлуорометрии (ПЦМ) и ограничивает возможность использования живых сперматозоидов для количественной оценки содержания АСАТ в сыворотке крови и секретах репродуктивного тракта

Впервые установлено, что антитела к белкам теплового шока с молекулярным весом 90 кДа (БТШ90), присутствующие в сыворотках крови фертильных мужчин и женщин, взаимодействуют со спермальными антигенами, сорбированными на латексных частицах, и не выявляются на поверхности живых сперматозоидов В сыворотках крови фертильных мужчин и женщин и в семенной жидкости выявлена высокая активность связывания антител к БТШ90 с антигенами сперматозоидов Иммунный фактор бесплодия, обусловленный присутствием антиспермальных антител, диагностировался при низкой антигенсвязывающей активности антител к БТШ90

Впервые выявлена зависимость между активностью связывания антител к БТШ90 с антигенами сперматозоидов и состоянием клеточного звена иммунной системы мужчин и женщин, представленного регуляторными уб Т- лимфоцитами

Практическая значимость работы

Разработаны диагностические критерии для выявления иммунного фактора бесплодия у мужчин и женщин, основанные на количественной оценке связывания антиспермальных антител, присутствующих в секретах репродуктивного тракта, с антигенами живых сперматозоидов

Установлено, что оценка активности связывания антител к БТШ90, присутствующих в сыворотке крови и секретах репродуктивного тракта, с антигенами сперматозоидов, сорбированными на латексных частицах, является прогностическим показателем при выявлении иммунного фактора бесплодия у мужчин и женщин, а также при диагностике угрозы прерывания беременности

Разработан способ выявления бесплодия, обусловленного нарушениями функций сперматозоидов, основанный на количественной оценке спонтанной и индуцированной ионофором А23187 акросомной реакции с помощью ПЦМ

Реализация результатов работы

Результаты диссертационной работы внедрены в программу лекций кафедры лабораторной диагностики ГОУ ДПО «Российская медицинская академия последипломного образования Росздрава» и в практическую работу лаборатории клинической иммунологии ФГУ «Научный центр акушерства, гинекологии и перинатологии Федерального агентства по высокотехнологичной медицинской помощи»

Апробация работы

Материалы диссертации доложены и обсуждены на 4 Всесоюзном симпозиуме «Иммунология репродукции» (Киев, 1990), VII Всемирном конгрессе по иммунологии репродукции человека (Хельсинки, Финляндия, 1990), 7 Всемирном конгрессе по цервикальной патологии и кольпоскопии (Италия, Рим, 1990), Республиканской научной конференции по

иммунологии репродукции (Иваново, 1993), Международном симпозиуме по иммунологии репродукции (1993, Киев), конференции «Иммунологический мониторинг и иммунореабилитация» (Москва, 1995), 11 международном конгрессе по андрологии (Анкара, Турция, 1995), Международном симпозиуме по акросомной реакции сперматозоидов (Коллюр, Франция, 1995), 3 международном форуме по репродуктивной иммунологии (Берлин, Германия, 1996), Международном симпозиуме по иммунологии репродукции (Киев, 1996), Международном симпозиуме по мужскому бесплодию и репродуктивным технологиям (Генк, Бельгия, 1998), 8 Международном симпозиуме по сперматологии (Монреаль, Канада, 1998), европейском симпозиуме по иммунологии репродукции (Рим, Италия, 1999), 1 международной конференции «Хроноструктура и хроноэкология» (Москва, 2000), II Российском форуме «Мать и дитя» (Москва, 2000), Второй международной конференции по экспериментальной и клинической репродуктивной иммунобиологии (Амстердам, Нидерланды, 2000), XII Международной конференции «Репродуктивные технологии сегодня и завтра» (С -Петербург, 2003), Всероссийской конференции «Мужское здоровье» (Москва, 2003), Европейском конгрессе репродуктивной иммунологии (Плзень, Чехия, 2004), Международной научной конференции "Ломоносов-2004" (Москва, 2004), Международной научной конференции "Ломоносов-2005" (Москва, 2005), IX Всероссийском научном Форуме с международным участием «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге» (Санкт-Петербург, 2005), II Российской конференции по иммунотерапии и иммунореабилитологии (Москва, 2005), Республиканской научной конференции «Иммунология репродукции» (Иваново, 2005), Всероссийском научном форуме «Мать и дитя» (Казань, 2007), 2-й Республиканской конференции «Иммунология репродукции» (Сочи, 2007)

Структура и объем диссертации

Материалы диссертации изложены на 298 страницах машинописного текста Работа состоит из введения, обзора литературы по теме диссертации, описания материалов и методов, 4 глав собственных исследований и их обсуждения, заключения, выводов и указателя литературы, включающего 432 источника Работа иллюстрирована рисунками и таблицами

Основные положения, выносимые на защиту

1 Присутствие антиспермальных антител в сыворотке крови и секретах репродуктивного тракта у мужчин и у женщин вне беременности, взаимодействующих с антигенами живых сперматозоидов, является маркером нарушения репродуктивной функции Антиспермальные антитела гетерогенны по изотипу, температурному оптимуму связывания с антигенами и механизмам влияния на функции сперматозоидов

2 Преждевременная активация сперматозоидов при образовании поверхностных комплексов антиспермальных антител с антигенами является одним из механизмов нарушения репродуктивной функции При активации сперматозоидов меняется траектория движения сперматозоидов, усиливается генерация свободных радикалов кислорода, увеличивается вероятность преждевременной акросомной реакции и снижается вероятность оплодотворения

3 В сыворотке крови и секретах репродуктивного тракта фертильных мужчин и женщин присутствуют антитела к белкам теплового шока с молекулярным весом 90 кДа (БТШ90), взаимодействующие с антигенами сперматозоидов, сорбированными на латексных частицах Антигенсвязывающая активность антител к БТШ90 отражает состояние антиспермального иммунитета и регуляторного клеточного звена иммунной системы мужчин и женщин, являясь прогностическим показателем при выявлении нарушений репродуктивной функции Иммунный фактор бесплодия, обусловленный присутствием антиспермальных антител, диагностируется при низкой антигенсвязывающей активности антител к БТШ90

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы исследования

Исследования проводились в лаборатории клинической иммунологии ФГУ «Научный центр акушерства, гинекологии и перинатологии Федерального агентства по высокотехнологичной медицинской помощи» (руководитель лаборатории академик РАМН, д м н, профессор Сухих Г Т) Комплексное клинико-лабораторное обследование пациентов, состоящих в бесплодном браке, проводилось совместно с отделением восстановления и сохранения репродуктивной функции НЦ АГиП (руководитель д м н, профессор Назаренко ТА)

В группу с иммунным фактором бесплодия включали мужчин (п=395) или женщин (п=182), в сыворотке крови и секретах репродуктивного тракта которых были обнаружены антиспермальные антитела Выявление антиспермальных антител проводили с помощью MAR-теста (Ferti Pro N V , Бельгия) стандартным способом в соответствии с указаниями фирмы-разработчика Позитивными значениями MAR-теста считали значения MAR%250% (Руководство ВОЗ, 1999)

В группу с бесплодием неясного генеза были включены мужчины (п=123) с нормозооспермией и отсутствием в анамнезе сексуально-передаваемых инфекций, хирургических вмешательств, травм половых органов, орхитов и варикоцеле Бесплодие неясного генеза у женщин (п=123) было подтверждено с помощью клинико-лабораторного исследования, включавшего тесты функциональной диагностики, проведение

лапароскопии, гистероскопии, исследования уровня гормонов, посткоитального теста, ультразвукового исследования

Контрольную группу составили 30 супружеских пар, имеющих детей, обратившихся для подбора метода контрацепции Женщины, включенные в контрольную группу, в течение последних 12 месяцев с момента обращения имели беременность Клинико-лабораторное обследование пациенток с привычным невынашиванием беременности (п=25) проводилось совместно с

лабораторией клинической иммунологии ФГУ «Ивановский научно-исследовательский институт материнства и детства им В Н Городкова Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию» (зав лабораторией - заслуженный врач РФ, д м н, профессор Сотникова Н Ю )

Материалом для непосредственного исследования служили гепаринизированная кровь и сыворотка крови из кубитальной вены, цервикальная слизь, эякулят

Классификация спермограмм выполнялась согласно стандартному протоколу ВОЗ (Руководство ВОЗ, 1999)

Выявление АСАТ на поверхности сперматозоидов или латексных частиц, покрытых антигенами сперматозоидов, проводили на проточных цитофлуориметрах FACScan и FACSCalibur (Becton Dickinson, США), Bryte (Bio-Rad, США), анализируя в каждой пробе по 5000 клеток или латексных частиц, покрытых антигенами сперматозоидов

Для выявления локализации АСАТ на поверхности сперматозоидов применялся метод флуоресцентной микроскопии Образцы анализировались с помощью микроскопа фирмы Leitz Laborlux S ( Leica, Germany) при увеличении х 400

Для оценки влияния АСАТ, присутствующих в сыворотке крови, на подвижность сперматозоидов в присутствии комплемента использовали тест спермоиммобилизации (IsojimaS et al, 1968) Индекс спермо-иммобилизации (ИСИ) вычисляли, как отношение процента подвижных сперматозоидов в образце, не содержащем комплемент, к этому показателю в образце с комплементом

Компьютерный анализ спермы (Computer Assisted Semen Analysis, CASA) проводился совместно с отделением вспомогательных технологий в лечении бесплодия (руководитель заслуженный врач РФ, дмн, профессор Кузьмичев Л Н) С помощью анализатора Hamilton Thorn (США) оценивали подвижность сперматозоидов (процент быстро-, средне-, медленно-подвижных и неподвижных сперматозоидов) и скорости движения

сперматозоидов по различным траекториям VCL (curvilinear velocity) -трековая скорость (мкм/сек), VAP (average path velocity) - путевая скорость (мкм/сек), VSL (straight-line velocity) - прямолинейная скорость (мкм/сек) Оценивали также ALH (amplitude of lateral head displacement) - амплитуду бокового смещения головки (мкм), LIN (lmiarity) линейность- отношение прогрессивной скорости к трековой скорости (%) и STR (stnghtness) среднюю «прямизну» движения - отношение прогрессивной скорости к путевой скорости (%)

Измерение уровня генерации свободных радикалов кислорода (СРК) в эякуляте проводили методом хемилюминесценции, используя люминометр LKB-Wallac 1256 (Финляндия) К суспензии клеток добавляли люминол (5-амино-2,3-дигидро-1,4-фталазиндион) Оценивали максимальное значение люминисценции, которое наблюдалось через 2-10 минут после добавления люминола Уровень генерации СРК выражали в мВ/сек

Лимфоциты периферической крови получали с использованием среды для выделения лимфоцитов Lymphosep (ICN, USA) Поверхностный фенотип иммунокомпетентных клеток определяли с помощью моноклональных антител (Becton Dickinson, США), меченных флуоресцеин-изотиоцианатом (ФИТЦ) или фикоэритрином Процедуру окрашивания клеток и последующий анализ методом ПЦМ проводили стандартным способом в соответствии с указаниями фирмы-разработчика

Для получения однонаправленной смешанной культуры лимфоцитов половых партнеров лимфоциты мужчин предварительно обрабатывали митомицином С (Sigma, США) Клетки культивировали в течение 5 суток и оценивали интенсивность пролиферации колориметрическим методом с использованием бромистого метилтиазолилтетразолия (Кравченко И H с соавт, 1992) Оптическую плотность измеряли при 550 нм на планшетном фотометре (Bio-Rad, США) Пролиферативную реакцию лимфоцитов женщины оценивали как отношение оптической плотности в смешанной

культуре к показателям оптической плотности монокультур лимфоцитов половых партнеров

Статистическая обработка результатов проводилась с использованием пакета прикладных программ «Microsoft» и «MedCalc» Для определения достоверности различий значений в двух группах использовались параметрический парный критерий Стьюдента (при нормальном распределении) и непараметрические критерии - Манна-Уитни или Вилкоксона При определении зависимостей между показателями был использован коэффициент корреляции Пирсона или Спирмена В качестве критерия достоверности различий принимали уровень значимости р<0,05 Чувствительность и специфичность методов оценивали с помощью построения характеристической кривой (Receiving Operated Curve) с помощью статистической программы «MedCalc» (Zweig M H and Campbell G, 1993)

Результаты работы и их обсуждение

Методом, рекомендованным ВОЗ для выявления антиспермальных антител (АСАТ), является MAR (mixed agglutination reaction) - тест (Руководство ВОЗ, 1999) В основе теста лежит связывание Fc-фрагментов иммуноглобулинов (Ig) класса G (IgG), сорбированных на поверхности латексных частиц, и Fc-фрагментов IgG на поверхности сперматозоидов антисывороткой к Fc-фрагменту IgG человека Мы предположили, что тот же принцип может быть использован для выявления АСАТ методом проточной цитометрии (ПЦМ), который, в отличие от MAR-теста, позволит не только выявлять различные классы АСАТ, но и оценивать количество антител на поверхности сперматозоидов

Для выявления АСАТ на поверхности сперматозоидов с помощью ПЦМ клетки инкубировали с мышиными антителами к IgG, IgA и IgM человека (Sigma, США), а затем с ФИТЦ-мечеными антителами к Fc-фрагменту мышиных иммуноглобулинов С помощью «окна

дискриминации» на двух параметр и ческой цитограмме распределения клеток по прямому и угловому светорассеянию из анализа исключали разрушенные клетки и агглютинаты. Мертвые сперматозоиды исключали из анализа, используя окрашивание иодидом про пи дня - флуоресцентным красителем, проникающим только в клетки с поврежденной мембраной (Вуепяоп О.Р. е1 а1,, 1982), и анализировали только живые клетки (рис. I Б, субпопуляции а,б). Активность связывания АСАТ с поверхностными антигенами характеризовали, оценивая ПЦМ% - процент живых сперматозоидов, покрытых АСАТ (рис, I Б, субпопуляция б), и количество АСАТ, связанных с поверхностью сперматозоидов.

Рис.1. Результаты выявления АСАТ, представленных 1 цС, на поверхности (А) МАЯ-негативных (МАЙ%=0%) и (Б) МЛ К-позитивных (МАЯ%=100%) сперматозоидов методом проточной цитофлуорометрии. (а) - субпопуляцпя живых АСА'Г-негативных сперматозоидов; (б) - субпопуляцпя живых АСАТ-иозитивных сперматозоидов; (в) - суб по пул и ни я Мертвых сперматозоидов

Для характеристики количества АСАТ использовали среднюю интенсивность зеленой флуоресценции АСАТ-позитивных сперматозоидов, выраженную в условных единицах флуоресценции (УЕФ).

При сравнении результатов выявления АСАТ, представленных (АСАТ !§0), на поверхности живых сперматозоидов бесплодных пациентов с помощью МАК-теста и ПЦМ была выявлена положительная корреляция

(рис 2А) Чувствительность и специфичность выявления АСАТ с помощью ПЦМ (ПЦМ-теста) по сравнению с МАЯ-тестом составляла 89% и 86%, соответственно, при очень низком пороговом значении ПЦМ% (>3%)

100 80 £ 60 40 20 0

МАК.%

Рис 2 Зависимость между результатами выявления АСАТ на поверхности живых сперматозоидов бесплодных пациентов с помощью МАИ-теста и ПЦМ-теста (А) МАЯ% варьировал от 0% до 100%, (Б) МАЯ%=100%

При анализе МАЯ-позитивных образцов спермы, где все сперматозоиды были покрыты АСАТ (МА11%=100%, п=53), с помощью ПЦМ выявлялось лишь 37±28% сперматозоидов, покрытых АСАТ (рис 2Б)

Хотя при выявлении АСАТ ^О в сыворотке крови мужчин (п=20) чувствительность и специфичность ПЦМ-теста по сравнению с МАЯ-тестом составили 100% при пороговом значении ПЦМ%>15%, процент АСАТ-позитивных сперматозоидов, выявляемых с помощью ПЦМ в образцах, где все сперматозоиды были покрыты АСАТ (МАЯ%=100%), варьировал от 45% до 93% При выявлении АСАТ ^О в сыворотке крови женщин (п=24) также была выявлена сниженная чувствительность (64%) и

высокая специфичность^ 100%) ПЦМ-теста при пороговом значении ПЦМ% >49%.

Была проведена оценка диагностической значимости выявления АСАТ, представленных различными классами иммуноглобулинов, в секретах репродуктивного тракта мужчин и женщин.

Для оценки чувствительности и специфичности ПЦМ-теста для выявления иммунного фактора бесплодия у мужчин сравнивали результаты выявления АСАТ в эякуляте пациентов с иммунным фактором бесплодия (МА[*%>50%, п =81} и у фертильных пациентов 11=13) (рис.3).

Рис. 3. Выявление АСЛТ 1§А, и ^М на поверхности сперматозоидов фертильных 100мужчин (I) и пациентов с

иммунным фактором бесплодия 80(2)

.о р

Ж60

40

20 0

Чувствительность и специфичность выявления иммунного фактора бесплодия с помощью МЦМ составила при выявлении АСАТ [«С (ПЦМ%> 13%) 64% и 92%, при выявлении АСАТ 1§Л (ПЦМ%>3%) 96% и 100%, и при выявлении АСАТ (ПЦМ%>8) 42% и 92%, соответственно. Наблюдалась слабая зависимость между присутствием АСАТ и I(г=0.44, р = 0,0001), АСЛТ 1&А и (1=0,38, р = 0,0001) и АСАТ 1аА и ^М (г=0.29, р = 0,007). У пациентов с иммунным фактором бесплодия чаще всего на поверхности сперматозоидов выявлялись АСАТ 1§А (96%), причем в 33% присутствовали АСАТ 1§А, ¡цС и 1|М , в 30% случаев выявлялись АСАТ

1гА т^с; тем

^А и в 7% - АСАТ 1§А и ^М, а в 26% образцов выявлялись только АСАТ ^А Была выявлена положительная корреляция между результатами выявления АСАТ ^О в эякуляте и сыворотке крови с помощью ПЦМ-теста 0=0,62, р=0,007, п=20) и МАЛ-теста (г=0,89, р=0,001, п=20)

При использовании полученных критериев был выявлен иммунный фактор бесплодия у 17% (13/76) мужчин с бесплодием неясного генеза

Особое диагностическое значение могло иметь использование ПЦМ-теста для выявления АСАТ в цервикальной слизи, так как в этом случае МАЯ-тест не может быть использован из-за высокой вязкости цервикальной слизи, а с помощью метода спермоиммобилизации не могут быть выявлены АСАТ класса А, так как ^А не фиксируют комплемент

На рисунке 4 представлены результаты выявления АСАТ в цервикальной слизи пациенток с бесплодием неясного генеза (п=36) и фертильных женщин (п=10), полученные при использовании МАК-негативных сперматозоидов половых партнеров Чувствительность и специфичность выявления иммунного фактора бесплодия у женщин с бесплодием неясного генеза составила при выявлении АСАТ (диагностически значимый уровень ПЦМ%>14%) 22% и 100%, при вьивлении АСАТ ^Д (ПЦМ%>11%) 33% и 90%, и при выявлении АСАТ ¡¿М (ПЦМ%>3%) 13% и 80%, соответственно У 14 из 36 (39%) пациенток с бесплодием неясного генеза уровень хотя бы одного из трех классов АСАТ превышал диагностически значимый и, таким образом, диагностировался иммунный фактор бесплодия Таким образом, выявление АСАТ в цервикальной слизи обладает большой диагностической значимостью

Чаще всего в цервикальной слизи пациенток с иммунным фактором бесплодия выявлялись АСАТ 1§А (86%), причем в 14 % присутствовали ^А, ГёС, и ^М АСАТ, в 43 % случаев выявлялись и АСАТ, а в 29% образцов выявлялись только 1§А АСАТ Были обнаружены также образцы, в которых выявлялись только АСАТ 1§М (14%)

Не было выявлено зависимости между содержанием АСАТ и АСАТ lgA как в цервнкалькой слизи, так н в сыворотке женщин.

р

5С

40

С

*

Рис. 4. Выявление АСАТ ^А, (дй и 1цМ в первикальной слизи фертильных женщин {п=!0, светлые столбики) и женщин с бесплодием неясного генеза (п=36), темные столбики)

*

1 s

Ж.

IgA IgG IgM

Очевидные преимущества ПЦМ-теста по сравнению с MAR-тестом -объективность, возможность анализа большого числа образцов при использовании даже слабо подвижных или неподвижных сперматозоидов, выявление АСАТ классов A, G и М - позволяют использовать предложенный способ для диагностики иммунного фактора бесплодия,

В то же время была обнаружена низкая чувствительность выявления АСАТ IgG с помощью ПЦМ-теста по сравнению с MAR-тестом. Поэтому следующим этапом исследования явился анализ возможных причин получения ложно-негативных результатов ПЦМ-теста.

Было установлено, что в процессе выявления АСАТ при использовании поливалентных антител может происходить агрегация и сбрасывание -шеддинг (англ. shedding- сбрасывание) комплексов антиген-антитело в окружающую среду, и, таким образом, количество связавшихся с поверхностью АСАТ и количество АСАТ, оставшихся на поверхности сперматозоидов, выявляемое методом ПЦМ, могут различаться в десятки раз (Nikolaeva М.А. et ai., 2ООО), Интенсивность шеддинга зависела от множества факторов: особенностей метаболизма сперматозоидов, условий проведения анализа, концентрации АСАТ и вторых антител, i |ри

определенных условиях наблюдалось полное удаление комплексов антиген-антитело с поверхности клеток

Шедцинг иммунных комплексов наблюдался и при использовании моноклональных антител (мАТ) 4ЕЗ и 1Е10 к поверхностному антигену сперматозоидов - тестикулярной изоформе ангиотензин-превращающего фермента (тАПФ) (№ко1аеуа М А ег а1, 2006)

Высокая вероятность агрегации и шеддинга поверхностных комплексов антиген-антитело ограничивает возможность использования ПЦМ для количественного выявления АСАТ Очевидно, что большое значение приобретает поиск способов ингибирования этих процессов Стандартные способы блокирования агрегации, обычно применяемые для других типов клеток, такие, как низкая температура, использование азида натрия и цитохалазина В, не приводили к ингибированию агрегации и шеддинга комплексов антиген-антитело с поверхности сперматозоидов в МАЯ-позитивных образцах Более того, выявление АСАТ при низкой температуре (4°С) более чем в 5 раз снижало количество АСАТ на поверхности клеток (р<0,0005) по сравнению с количеством АСАТ, выявляемым при 23°С Однако неожиданно при 4°С были выявлены АСАТ на поверхности живых сперматозоидов в МАЯ-негативных образцах спермы пациентов с бесплодием неясного генеза (рис 5) Бесплодие, обусловленное присутствием АСАТ, выявляемых при 4°С, диагностировалось среди пациентов с бесплодием неясного генеза с чувствительностью 20% и специфичностью 100% при ПЦМ%>15% Таким образом, было впервые продемонстрировано существование АСАТ теплового и холодового типа, выявляющихся лишь в определенном температурном диапазоне

В целом, частота выявления иммунного фактора бесплодия в группе пациентов с бесплодием неясного генеза составила 37% - у 17% пациентов на поверхности сперматозоидов выявлялись тепловые АСАТ, а в 20% случаев - холодовые АСАТ

100 80 I 60

40 20 0

- Р* 0 01 1 1

Р< 0 01 г ■ 1

т 8

4 Т А,

Рис 5 Выявление АСАТ на поверхности сперматозоидов фертильных доноров (п=13), пациентов с иммунным фактором бесплодия

(МА11=100%, п=10) и с бесплодием неясного генеза (МАЯ%=0%, п= 79) с помощью ПЦМ при 4°С

Ш'4 П»/ь

Ферпшъные

10П»/о 0°-о

Бесплодные

Было установлено, что выявление тепловых АСАТ на поверхности клеток возможно лишь в том случае, если оба РаЬ-фрагмента связываются с антигенами Маркером «сшивки» антигенов бивалентными антителами является агрегация поверхностных иммунных комплексов -двухмерный аналог процесса преципитации Как МАЯ-тест, так и ПЦМ-тест могут эффективно выявлять тепловые АСАТ лишь при условии эквивалентности концентраций антигенов и антител Холодовые АСАТ выявлялись при 4°С и проявляли так называемую функциональную моновалентность, когда лишь один РаЬ-фрагмент был связан с поверхностным антигеном При этом агрегация поверхностных комплексов отсутствовала — на поверхности головки сперматозоидов МАЯ-негативных образцов спермы, содержащих холодовые АСАТ, с помощью флуоресцентной микроскопии выявлялось гомогенное распределение флуоресценции

Следующим этапом исследования явилось выяснение механизмов клеточных реакций на образование поверхностных иммунных комплексов и поиск способов их блокирования Очевидно, что изучение механизмов влияния АСАТ на функциональную активность сперматозоидов необходимо как для оптимизации выявления АСАТ, так и для понимания

патогенетической роли АСАТ при бесплодии и выбора адекватных методов коррекции бесплодия, обусловленного иммунными факторами

Оценивали влияние АСАТ на функции сперматозоидов - скорость движения, спермоиммобилизирующую активность антител в присутствии комплемента, акросомную реакцию, генерацию активных форм кислорода Не было выявлено зависимости между присутствием тепловых и холодовых АСАТ на поверхности сперматозоидов нативной спермы и процентом активно-подвижных сперматозоидов в эякуляте Спермоиммобилизирующая активность семенной плазмы мужчин с бесплодием неясного генеза, содержащих тепловые АСАТ (MAR=100%, п=10) и холодовые АСАТ (ПЦМ%>25%, п=5) существенно отличалась - индекс

спермоиммобилизации (ИСИ) составил 1,1±0,1 и 12,3±3,2, соответственно (р<0,0001) Спермоиммобилизирующая активность сывороток крови женщин с бесплодием неясного генеза, содержащих тепловые АСАТ (MAR%=100%, п=9) была также существенно ниже, чем активность сывороток, содержащих холодовые АСАТ (ПЦМ%>25%, п=6) - ИСИ составил 1,4±0,5 и 8,1±6,1, соответственно (р<0,005) Спермоиммобилизирующая активность как сыворотки, так и семенной плазмы в отсутствии АСАТ практически не обнаруживалась

Важнейшей функцией сперматозоидов, играющей ключевую роль в проникновении сперматозоида в яйцеклетку, является акросомная реакция (АР) - рецепторно-опосредованный экзоцитоз ферментов, разрушающих прозрачную оболочку яйцеклетки (zona pellucida) (Yanagimachi R , 1988) В норме АР происходит при связывании сперматозоида с оболочкой яйцеклетки Существуют два основных типа нарушений, препятствующих оплодотворению и приводящих к бесплодию, - спонтанная АР, которая происходит еще до взаимодействия сперматозоида и яйцеклетки, и отсутствие индукции АР при связывании сперматозоида с zona pellucida Показана возможность диагностики бесплодия с помощью определения процента сперматозоидов с завершенной АР после индукции АР ионофором

А23187 (Tesarik J., 1996). Так как метод флуоресцентной микроскопии, используемый для определения акросомного статуса, трудоемок и субъективен, нами был предложен новый способ оценки АР с помощью ПЦМ.

Для оценки АР сперматозоидов было использовано одновременное окрашивание сперматозоидов ФИТЦ-меченым лектином Pisum Sativum, который связывается с маннозными остатками акрозина, являющегося основным компонентом акросомального матрнкса, и ТРИТЦ-меченьвд лектином Arachis hypogaeа, взаимодействующим с р-D-галактозильными остатками, локализованными на наружной акросомальной мембране (Aitken R.J. and Rrindle J.P., 1993). Анализируя в каждой пробе по 5000 клеток, определяли процент сперматозоидов с завершенной АР, представленных субпопуляцией клеток со сниженной зеленой и красной флуоресценцией (рис, 6Б, субпопуляция 2).

е

ш

«

3 а

Си

О

4

А Б

Сперматозоиды с завершенной ДР

локализованы в области 2

АР% = 41,4%

& j 1

щ)

Интенсивность пеленой флуоресценции (УЯФ)

Рис. 6, Оценка акросомного статуса сперматозоидов фертильного пациента с помощью ПЦМ, Определение процента сперматозоидов с завершенной АР (АР%) (А) в контрольном образце без ионофора и (Б) в образце, содержащем ионофор А23187. Данные представлены в виде двухпараметрической цито граммы распределения клеток по интенсивности зеленой и красной флуоресценции.

Уровень спонтанной АР выявляли в контрольной пробе, не содержащий нонофор (рис. ЙА), индуцированную АР определяли в пробе, содержащей ионофор А23187 (рис. 6Б), индуцируем ость АР вычисляли как разность между процентом сперматозоидов с завершенной АР в образце, содержащем ионофор, и в контрольном образце.

С помощью предложенного способа было проведено сравнение акросомного статуса активно-подвижных сперматозоидов, полученных из эякулятов бесплодных пациентов, у которых были выявлены тепловые АСАТ (МАГ*%=100%, п = 13) или ¿солодовые АСАТ (ПЦМ%>-25%. п~5) на поверхности клеток (рис.7).

12 3 12 3 12 3

Спонтанная АР Индуоировавнйя Ин ду ц и руг моста. АР момофорои А2318? АР

Рис. 7. Уровень спонтанной и индуцированной ионофором А23187 акросомноЙ реакции и индуцируемости АР в образцах, содержащих (I) АСАТ-негативные сперматозоиды фертильных доноров, (2) сперматозоиды, покрытые Холодовыми антителами, и (3) сперматозоиды, покрытые тепловыми антителами

В качестве контрольной группы были использованы сперматозоиды фертильных доноров, на поверхности которых ни тепловые, ни холодовые антитела не выявлялись (п= 10) Процент сперматозоидов со спонтанной АР в образцах, содержащих как тепловые, так и холодовые АСАТ, был существенно выше по сравнению с образцами сперматозоидов фертильных доноров Не было выявлено достоверных различий между уровнем спонтанной АР в образцах с тепловыми и Холодовыми АСАТ Процент сперматозоидов с индуцированной АР был значительно ниже в MAR-позитивных образцах (р<0,05) по сравнению с образцами фертильных доноров Также выявлено существенное снижение индуцируемости АР в обеих группах бесплодных пациентов по сравнению с фертильньтми донорами Был обнаружен парадоксальный ингибирующий эффект ионофора А23187 на спонтанную АР у 54% (7/13) бесплодных пациентов с тепловыми и у 80% (4/5) пациентов с Холодовыми антителами

Проведенное исследование продемонстрировало, что АСАТ к поверхностным антигенам сперматозоидов могут стимулировать АР Известно, что процессы агрегации поверхностных антигенов сперматозоидов играют ключевую роль в физиологическом протекании АР (TesarikJ and Mendoza С , 1993, Lassale В and Testart G , 1996) Возможно, спонтанная АР сперматозоидов, покрытых антителами, также может быть связана с агрегацией иммунных комплексов, происходящей при связывании антител с поверхностными антигенами Как было показано ранее, агрегация иммунных комплексов является одним из свойств, характерных для MAR-позитивных клеток Известно, что ионофор А23187 является ингибитором агрегации (Young-KarlanВR and AshmanRF, 1981), и нельзя исключить, что его добавление к сперматозоидам, покрытым антителами, также вызывает ингибирование агрегации иммунных комплексов и блокирует спонтанную АР

Одним из механизмов индукции АР в присутствии АСАТ может быть усиление продукции свободных радикалов кислорода (СРК) Регулируемый

процесс свободнорадикального окисления является важнейшей составляющей метаболизма сперматозоидов, необходимой для капацитации и акросомной реакции, деконденсации хроматина и процессов фертилизации (Aitken R J et al, 1998, De Lamirande E et al, 1998)

С помощью метода хемилюминесценции нами было показано, что уровень генерации СРК в образцах, содержащих холодовые АСАТ (MAR%=0%, ПЦМ%>25%, п=5), значительно выше, чем в MAR-позитивных образцах (MAR%=100%, п=10) - интенсивность люминесценции составляла 7,6 и 1,2 Мв/106 клеток, соответственно (р<0,03) Генерации СРК в образцах, полученных от фертильных доноров (п=20), не наблюдалось

Мы предположили, что ингибирование генерации СРК может привести к уменьшению воздействия антител на клеточный метаболизм В качестве ингибитора перекисного окисления нами был использован N-ацетилцистеин, внутриклеточное деацетилирование которого приводит к образованию тиолового антиоксиданта глутатиона (Mayer M and Noble M, 1994) Однако ингибирование спонтанной АР в присутствии N-ацетилцистеина наблюдалось лишь в 4 из 10 (40%) MAR-позитивных образцов, содержащих тепловые АСАТ, и в 6 из 12 (50%) MAR-негативных образцов, содержащих холодовые антитела В остальных случаях присутствие антиоксиданта стимулировало спонтанную АР

Интенсивность генерации СРК может определять результат воздействия СРК на клетку - приводить либо к активации клетки и АР, либо к повреждению клеточных мембран Нельзя исключить, что стимуляция АР происходит лишь в узком «коридоре» между активирующим и повреждающим уровнем СРК, так как избыток СРК блокирует индукцию АР (Ichikawa Т et al, 1999) Поэтому снижение генерации СРК может приводить не только к блокированию АР, но и к ее индукции, что согласуется с нашими данными

Важным фактором, защищающим сперматозоиды от повреждений, является высокая концентрация антиоксидантных ферментов и скэвенджеров

СРК в семенной плазме (Lewis SE, et al, 1997), поэтому нельзя было исключить, что отмывка сперматозоидов от семенной жидкости стимулирует генерацию СРК сперматозоидами, покрытыми антителами, активацию сперматозоидов и акросомную реакцию in vitro

Были проведены эксперименты, подтвердившие наличие активированных сперматозоидов, покрытых антителами, в нативной сперме, которая не подвергалась экспериментальным манипуляциям Одним из главных признаков, свидетельствующих об активации сперматозоидов, наблюдаемых при физиологической капацитации, является изменение траектории движения клеток Поэтому были охарактеризованы особенности движения сперматозоидов, покрытых антителами, с помощью компьютерного анализатора спермы Анализировали фракцию активно-подвижных сперматозоидов, полученных с помощью флотации В таблице 1 приведены данные о характере движения MAR-негативных сперматозоидов фертильных доноров (MAR%=0%, п=5), а также покрытых тепловыми (MAR%=100%, п=11) и Холодовыми (ПЦМ%>25%, n=5) AC AT сперматозоидов пациентов с иммунным фактором бесплодия и нормальными показателями спермограммы

Таблица 1

Анализ подвижности сперматозоидов фертильных доноров и покрытых тепловыми или Холодовыми АСАТ сперматозоидов бесплодных пациентов (M±SD)

Параметр Фертильные (MAR%=0%) (п = 5) Бесплодные (MAR%=100%) (п=11) Бесплодные (MAR%=0%, ПЦМ > 25%) (п = 5) Уровень значимости различий (Р)

VSL (мкм/сек) 26,4 ± 6,6а 28,3 ± 8,7 30,2 ± 3,6° ' < 0,04

VCL (мкм/сек) 50,6 ±11,16 61,4±21,1 68,6 ±11,б6 6< 0,03

VAP (мкм/сек) 34,0 ± 6,7В 43,0 ±13,6 42,6 ± 5,4" в < 0,05

LIN (%) 55,6 ± 6,3 гл 45,9 ± 8,9г 42,6 ± 9,3 д г < 0,05, д<0,03

STR (%) 78,3 ± 7,1 69,9 ±12,3 72,7 ± 6,4

ALH (мкм) 3,5 ± 0,7ж 4,7 ± 1,3 е 4,8 ± 0,5 ж е = 0,07, ж< 0,01

Присутствие АСАТ на поверхности сперматозоидов рассматривается в ряде работ как причина снижения подвижности клеток (Mathur S et al, 1984), однако различий между группами по содержанию активно-подвижных сперматозоидов нами выявлено не было

В то же время было продемонстрировано увеличение прогрессивной (VSL), трековой (VCL) и путевой (VAP) скорости сперматозоидов, покрытых Холодовыми антителами При этом наблюдалось снижение линейности движения (LIN) и увеличение амплитуды бокового смещения головки (ALH) Особенностью MAR-позитивных сперматозоидов также являлось снижение линейности движения и тенденция к увеличению амплитуды бокового смещения головки Изменение этих параметров движения клеток, покрытых антителами, свидетельствуют о гиперактивации сперматозоидов Движения гиперактивированных сперматозоидов не являются прямолинейными характерно более глубокое сгибание хвоста, поэтому траектория движения такого сперматозоида напоминает цифру "8" или звездочку Гиперактивация характеризуется снижением LIN и увеличением ALH (Robertson L et al, 1988, Mortimer ST and Mortimer D, 1990) и рассматривается как одно из проявлений капацитации - серии функциональных, биохимических и биофизических изменений сперматозоида, необходимых для АР и оплодотворения (Yanagimachi R, 1969)

В целом, полученные данные свидетельствуют о том, что одним из механизмов нарушения репродуктивной функции при наличии как холодовых, так и тепловых АСАТ является функциональная и метаболическая активация сперматозоидов, приводящая к стимуляции преждевременной АР и снижению вероятности оплодотворения Тестирование эффектов как тепловых, так и холодовых АСАТ на функции клеток оценивали при температуре 23° или 37°С, что свидетельствует о том, что холодовые АСАТ могут связываться с поверхностью клеток и влиять на их функции в широком температурном диапазоне, выявляясь при этом только при 4° С

Активация сперматозоидов может сопровождаться изменениями антигенного состава поверхности сперматозоида - шедцингом одних антигенов и демаскировкой или экспрессией других (Benoff S etal, 1993), а также разрушением плазматической мембраны в ходе АР, что затрудняет использование живых сперматозоидов для количественного выявления АСАТ с помощью ПЦМ

Мы предположили, что наиболее перспективным способом количественной оценки уровня антител, независимым от клеточных реакций, может быть выявление АСАТ с помощью латексных частиц, покрытых антигенами сперматозоидов Метод ПЦМ был адаптирован для выявления АСАТ на поверхности латексных частиц, покрытых антигенами, полученными после обработки сперматозоидов детергентом (BioServ Diagnostics, Германия) Частицы инкубировали с сывороткой крови или семенной жидкостью, а затем с ФИТЦ-мечеными козьими антителами к IgG, IgA или IgM человека и анализировали с помощью ПЦМ Высокая активность связывания антител с латексными частицами (ПЦМ% была выявлена в сыворотке крови фертильных мужчин и женщин, а также в семенной жидкости фертильных пациентов

Согласно общепринятой точке зрения, АСАТ, присутствующие в сыворотке и секретах фертильных пациентов, являются низкоаффинными и не оказывают влияния на процессы оплодотворения Считается, что выработка АСАТ к внутриклеточным антигенам сперматозоидов является физиологическим механизмом, обеспечивающим элиминацию поврежденных или мертвых сперматозоидов Так как антигены, связанные с латексными частицами, могут являться измененными, денатурированными антигенами, возможно, что выявляемые нами антитела распознают только денатурированные антигены и не взаимодействуют с нативными

В последнее время большое внимание уделяется также изучению естественных антител, - низкоаффинных, полиреактивных антител,

распознающих ограниченное количество аутоантигенов и выявляющихся в норме в кровотоке доноров (Bayry J et al, 2004)

Мы предположили, что выявленные нами антитела могут специфично реагировать с белками теплового шока (БТШ) - консервативными иммунодоминантными антигенами, экспрессируемыми большинством клеток конститутивно или в ответ на различные стрессорные воздействия (LindquistS and CraigEA, 1988) Для выявления специфичности АСАТ, присутствующих в сыворотках фертильных мужчин и женщин, оценивали ингибирование связывания АСАТ с латексными частицами, покрытыми антигенами сперматозоидов, в присутствии мАТ к БТШ с молекулярным весом 25 кДа (БТШ25), 60 кДа (БТШ60), 70 кДа (БТШ70) и 90 кДа (БТШ90) (Sigma, США) Максимальное ингибирование связывания АСАТ (84%) наблюдалось в присутствии МАТ к БТШ90 Таким образом, большая часть антител, выявляемых на поверхности латексных частиц, представлена антителами к БТШ90

Известно, что БТШ90 является конститутивным белком, выявляемым в большинстве типов клеток (Picard D, 2002) и экспрессируемом сперматозоидами (Neuer А et al, 2000) Ранее было установлено, что естественные антитела, выявляющиеся в норме в кровотоке доноров, могут взаимодействовать с БТШ90 (Pashov А , et al, 2002) Эти данные, а также выявление антител к БТШ90 у девушек (рис 9) позволяют предположить, что обнаруженные нами антитела могут являться естественными аутореактивными антителами, и/или продуцироваться при антигенной стимуляции белками теплового шока, экспрессируемыми сперматозоидами и/или аутологичными клетками репродуктивного тракта мужчин и женщин Присутствие в сыворотках фертильных мужчин и женщин антител, взаимодействующих с денатурированными антигенами сперматозоидов продемонстрировано в многочисленных исследованиях (Mathur S et al, 1988, Paradisi R et al, 1995, Domagala A and Kurpisz M , 2004), однако до сих пор

количественная характеристика и выяснение специфичности этих антител не проводилось • '

Учитывая, что продукция АСАТ предполагает стимуляцию антигенами сперматозоидов, а механизмы продукции антител к БТШ90 остаются невыясненными, в дальнейшем мы использовали термин «антиспермальные антитела» только для обозначения антител, выявляемых на поверхности живых сперматозоидов Антитела, выявляемые на поверхности латексных частиц называли «антитела к БТШ90»

Было обнаружено, что антитела к БТШ90 являются маркером, отражающим состояние антиспермального иммунитета у мужчин и женщин При тестировании сывороток мужчин с бесплодием неясного генеза была выявлена отрицательная зависимость между результатами выявления АСАТ и антител к БТШ90 (г= - 0,67, р<0,02, п=13) Активность антител к БТШ90 в семенной жидкости MAR-позитивных образцов была значительно ниже (4,0 УЕФ), чем в MAR- негативных образцах (8,5 УЕФ, р<0,001) и образцах фертильных доноров (17,7 УЕФ, р<0,01)

Обнаружена также негативная корреляция между результатами выявления АСАТ и антител к БТШ90 в сыворотке женщин с бесплодием неясного генеза (рис 8) Активность связывания антител к БТШ90 с антигенами сперматозоидов, выявляемая в сыворотке крови женщин с иммунным фактором бесплодия (MAR%>40%), была существенно ниже, чем у фертильных женщин (рис 9)

100

ЕЮ

г = -О 92? Р < 0 002

Рис 8 Зависимость между

результатами выявления АСАТ (МАЯ%) и антител к БТШ90 (ПЦМ%) в сыворотках крови женщин с бесплодием неясного генеза (п=12)

о

.ер

О 20 40 ВО ВО 100

MAR%

Оценка антигенсвязывающей активности антител к БТШ90 может быть использована для диагностики иммунного бесплодия у мужчин (чувствительность 100% и специфичность 93% при активности антител к БТШ90 в семенной жидкости, превышающей 5,8 УЕФ) У женщин при тестировании сывороток крови иммунный фактор бесплодия может быть диагностирован с чувствительностью 100% и специфичностью -100% при ПЦМ%<30,8% Предлагаемый способ имеет целый ряд преимуществ выявление антител к БТШ90, в отличие от MAR-теста, является объективным и не требует трудоемкого микроскопического анализа, при выявлении антител к БТШ90 не требуется наличия активно-подвижных сперматозоидов, а используется стандартный набор реагентов с длительным сроком хранения, что позволяет оптимизировать и стандартизировать тестирование, а также существенно упростить организацию проведения анализа, исключив необходимость процедуры получения спермы у половых партнеров обследуемых женщин в день проведения анализа

Таким образом, формирование антител к БТШ90 с высокой антигенсвязывающей активностью наблюдается в отсутствии АСАТ, а наличие иммунного фактора бесплодия у мужчин и женщин диагностируется при слабой иммунной реакции на БТШ90 Полученные результаты согласуются с данными о том, что частота выявления антител к некоторым антигенам сперматозоидов, лимфоцитов и эритроцитов у здоровых фертильных мужчин существенно выше по сравнению с пациентами с иммунной формой бесплодия (Domagala A and Kurpisz М, 2004)

Была исследована активность антител к БТШ90 в сыворотке крови в процессе изменения репродуктивного статуса здоровых женщин и женщин с нарушениями репродуктивной функции (рис 9)

Было выявлено возрастание активности антител к БТШ90, связанное с началом половой жизни - активность антител у женщин с длительностью половой жизни не менее полугода была выше по сравнению с этим показателем у девушек (рис 9)

Р «0002

О О)

ш * 100

I

£ 80 Е

| 60 О

X 40 й

| 20 0

Р <00001 ГР<001 1

Р < О 0003 1 р<0 01 1

Р«001

Р<002

Р«001 1-1

о

1

Р«0 001' Р<0001

41-II---1

/ // / // Ж

^ «6е V <с>

Рис 9 Активность связывания антител к БТШ90 с антигенами сеперматозоидов, выявляемая в сыворотках крови девушек (п=7), здоровых женщин, не имевших беременности (п=6), фертильных беременных женщин (п=18), фертильных женщин вне беременности (п=9) женщин с иммунным фактором бесплодия (п=7) и пациенток с угрозой прерывания беременности (п=8)

В ранние сроки нормально развивающейся беременности (первый триместр) активность антител к БТШ90 резко снижалась, а при высокой активности антител к БТШ90 диагностировалась угроза прерывания беременности После нормально протекающей беременности и родов наблюдалось восстановление высокой активности антител (рис 9)

Снижение активности антител к БТШ90 при беременности также является маркером снижения толерантности иммунной системы матери к отцовским антигенам, так как уровень АСАТ, выявляемых в крови женщин при физиологической беременности (МАЫ%=55%, п=10) был существенно выше (р<0,0001), чем у фертильных женщин вне беременности (МАЯ%=4%,

п=10) Известно, что высокий уровень антиотцовских антител при беременности способствует выживанию полуаллогенного плода (Ог§аё 8 et а1, 1999), и, таким образом, снижение толерантности к отцовским антигенам может рассматриваться как необходимый этап иммунорегуляции беременности

У небеременных пациенток с диагнозом «привычное невынашивание беременности» активность антител к БТШ90 была существенно ниже (р<0,02), чем у фертильных женщин (18,1 УЕФ, п=15 и 37,1 УЕФ, п = 8, соответственно)

Нами было также установлено, что высокая антигенсвязывающая активность антител к БТШ90, выявляемая в сыворотке крови, является маркером толерантности к аллоантигенам полового партнера у женщин Анализировали зависимость пролиферативной реакции лимфоцитов женщины (группа небеременных женщин с привычным невынашиванием беременности) на лимфоциты полового партнера от уровня активности антител к БТШ90

Рис 10 Зависимость пролиферативной реакции лимфоцитов женщины на лимфоциты мужа в однонаправленной смешанной культуре лимфоцитов от антигенсвязывающей активности антител к БТШ90 (ПЦМ%), выявляемой в сыворотке крови женщины

При использовании однонаправленной смешанной культуры лимфоцитов было показано, что при высокой активности антител к БТШ90 пролиферативная реакция лимфоцитов жены на лимфоциты мужа отсутствовала (рис 10) При снижении активности антител к БТШ90 наблюдалось увеличение пролиферативной реакции Уровень активности

лродифераотвтая гишюшнлъ

антител к БТШ90 не влиял на пролиферативную реакцию лимфоцитов женщины на лимфоциты донора Таким образом; высокая активность антител к БТШ90 является маркером толерантности иммунной системы женщин к аллоантигенам полового партнера, при которой отсутствуют как гуморальные, так и клеточные иммунные реакции на аллоантигены

Суммируя полученные данные, можно утверждать, что активность антител к БТШ90 может рассматриваться как маркер иммунной регуляции процессов репродукции и являться прогностическим показателем при выявлении нарушений иммунорегуляции различных этапов репродукции

Активность антител к БТШ90 может определяется взаимодействием белков теплового шока, экспрессируемых сперматозоидами и/или клетками репродуктивного тракта, и иммунокомпетентных клеток

Был проведен анализ активности антител к БТШ90 в сыворотке крови и фенотипа лимфоцитов периферической крови пациентов с бесплодием неясного генеза Как у мужчин, так и у женщин было выявлено снижение активности антител к БТШ90 при увеличении относительного содержания ар Т-клеток (г= - 0,66, р=0,02, п=13 и г=-0,48, р=0,01, п=26, соответственно) и СБ4+ клеток (г=-0,79, р=0,01, п=12 и г=-0,44, р=0,03, п=24, соответственно) У женщин наблюдалась также отрицательная корреляция между активностью антител к БТШ90 и как относительным, так и абсолютным содержанием СБ8+ лимфоцитов (г=-0,49, р=0,02, п=22 и г=-0 47, р=0,05, п=19, соответственно) Была обнаружена отрицательная зависимость между абсолютным содержанием >}КТ клеток

(С03+/С056/16+) в крови женщин и активностью антител к БТШ90 (г= - 0,45, р=0,04, п=21) Не было выявлено зависимости между активностью антител к БТШ90 и как абсолютным, так и относительным содержанием 75 Т-клеток, СБ16+, С03-С056/16+ (ЫК-клеток), С025+, С04+/СБ25+, СБ 19+ (В-клеток), СЭ19+/С05+ (В1 клеток), СЭ95+ клеток в периферической крови мужчин и женщин

Продемонстрирована отрицательная корреляция между количеством у5 Т-клеточных рецепторов на поверхности у8Т-клеток и активностью антител к БТШ90 в сыворотке крови мужчин и женщин (рис 11)

Так как снижение числа уб Т-клеточных рецепторов отражает созревание у5 Т-клеток (МтсНеуа-ШБвоп Ь , 2003), можно утверждать, что активность антител к БТШ90 увеличивается при возрастании зрелости у5 Т-клеток, присутствующих в периферической крови

Возможно, незрелые уб Т-клетки, продуцирующие преимущественно ФНОа и ИФу (Агск Р е1 а1, 1999), блокируют синтез антител, в то же время зрелые клетки уб Т-клетки, продуцирующие, преимущественно ТФР02 и ИЛ10 (МтсЬеуа-Ыйввоп Ь , 2003), стимулируют синтез антител к БТШ90

МУЖЧИНЫ

женщины

160 1 = - 0 51

140 р = 0 04

120 п 11 =16

100 о □ ° °

80 о □

60

40

Антитела к БТШ90 (уел ед )

Рис 11 Зависимость активности антител к БТШ90 от экспрессии Т-клеточных рецепторов (ТКРуб ) на уб Т- лимфоцитах периферической крови мужчин и женщин вне беременности

Известно, что предшественниками у5 Т-клеток являются незрелые клетки костного мозга, экспрессирующие молекулы адгезии нейрональных клеток СБ56, причем незрелые уб Т-клетки характеризуются фенотипом С056+/ТСЯу5+, а зрелые у5 Т-клетки - фенотипом С056-/ТСЯу5+ (МшсЬеуа-МПбоп Ь eíal, 1997)

Был проведан анализ гетерогенности у5 Т-лимфоцитов (рис. 12) и выявлена зависимость активности антител к БТШ90 от содержания зрелых уб Т-клеток в периферическом крови мужчин (г=0,65, р<0,05, п-10) и женщин (г=0,89, р<0,0006, п= 10). В то же время содержание незрелых уб Т-клеток практически не зависело от активности антител.

ш а-

i' а

и

о -i "tí

■ ч! . с;- CD5&WCR/M '.я! ■- ' Ш ■ Ял

я!

Рис, 12. Выявление зрелых (ТСКуб+/С056-) и незрелых (ТСКу5+/С05б+) у5 Т-клеток а периферической крови

пациентки с бесплодием неясного генеза

10'

1<Г

103

I ti-

re R/o-FITC

А нтигенсвя бывающая активность антител к БТШ90 может являться показателем, отражающим взаимодействие белков теплового шока с регуляторными клетками. Особый интерес представляют у5 Т-клетки, присутствующие как в периферической крови, так и в слизистых оболочках репродуктивного тракта мужчин (Muñoz M.G. and Witkin S.S. 1995) и женщин (Minclieva-Nillson L., 2003). Установлено, что y5 Т-клстки играют важную роль в имйунорегуляции беременности (Arck Р. et al., 1999). Известно, что белки теплового шока могут стимулировать у8 Т-клстки, связываясь с ними посредством CD91 рецепторов и Toll-подобных рецепторов 2 и 4 типов, пли взаимодействовать с Т-клсточпыми рецепторами yS Т-клеток как суперантигены (Binder R..I. et al,, 2004), Избыточная презентация БТШ90 стимулирует пролиферацию и созревание уб Т-клеток (Kunzmann V. et al., 2004). Обнаружено участие уб Т-клеток в формировании антител к белкам теплового шока (Pao W. et al., 1996; Lindroth К. et al., 2002).

Большое внимание в последнее время уделяется обсуждению роли БТШ и регуляториых клеток в формировании периферической толерантности

к ауто- и аллоантигенам Распространенность аутоиммунных заболеваний в странах с высоким уровнем жизни связывают с низкой вероятностью контактирования жителей этих стран с микобактериями, бактериальные БТШ которых обеспечивают функциональную активность регуляторных клеток (King С et al, 2004, Qin Н Y et al, 2006) В то же время не вызывает сомнения патогенетическая роль белков теплового шока при некоторых аутоиммунных заболеваниях - рассеянном склерозе (Birnbaum G and KotilinekL, 1999), сахарном диабете (Weitgasser R et al, 2003), и ревматоидном артрите (van Eden W , 1991)

Эти данные, а также результаты собственных исследований позволяют предположить, что формирование толерантности к алло- и аутоантигенам сперматозоидов обеспечивается сбалансированным взаимодействием белков теплового шока, экспрессируемых сперматозоидами и/или аутологичными клетками репродуктивного тракта, регуляторных Т-клеток, антиген-презентирующих клеток и клеток-эффекторов Количество экспрессируемых белков теплового шока, количественный баланс и функциональные характеристики иммунокомпетентных клеток,

участвующих в этих взаимодействиях могут определять направленность иммунной реакции - формирование толерантности к антигенам сперматозоидов или продукцию антиспермальных антител

Антигенсвязывающая активность антител к БТШ90 может являться маркером, отражающим как состояние регуляторного клеточного звена иммунной системы, так и уровень антиспермальных антител в сыворотке крови и секретах репродуктивного тракта мужчин и женщин, и использоваться в качестве диагностического критерия при выявлении нарушений иммунорегуляции репродуктивной функции при бесплодии и невынашивании беременности

ВЫВОДЫ

1 Разработан способ " выявления антител ~ на поверхности живых сперматозоидов с помощью проточной цитофлуорометрии Связывание антиспермальных антител, присутствующих в секретах репродуктивного тракта мужчин и небеременных женщин, с поверхностными антигенами живых сперматозоидов является маркером нарушения репродуктивной функции Установлено, что антиспермальные антитела гетерогенны по изотипу, температурному оптимуму связывания с антигенами, механизмам влияния на функции сперматозоидов

2 Разработан объективный количественный способ определения основных параметров акросомного статуса сперматозоидов человека с помощью проточной цитофлуорометрии Способ позволяет оценивать процент спонтанной и индуцированной ионофором А23187 акросомной реакции и диагностировать бесплодие, обусловленное нарушениями функций сперматозоидов, при нормальных показателях спермограммы

3 Преждевременная функциональная и метаболическая активация сперматозоидов, покрытых антиспермальными антителами, является одним из патогенетических механизмов влияния антиспермальных антител на репродуктивную функцию При активации меняется траектория движения сперматозоидов, усиливается генерация свободных радикалов кислорода, увеличивается вероятность преждевременной акросомной реакции и снижается вероятность оплодотворения

4 Активация сперматозоидов, покрытых антителами, сопровождается сбрасыванием поверхностных комплексов антиген-антитело, что определяет низкую чувствительность выявления антиспермальных антител с помощью метода проточной цитофлуорометрии и ограничивает возможность использования живых сперматозоидов для количественной оценки содержания антиспермальных антител в сыворотке крови и секретах репродуктивного тракта

5 В сыворотке крови и секретах репродуктивного тракта фертильных мужчин и женщин присутствуют антитела к белкам теплового шока с молекулярным весом 90 кДа (БТШ90), взаимодействующие с антигенами сперматозоидов, сорбированными на латексных частицах Метод проточной цитофлуорометрии является объективным количественным методом, позволяющим оценивать активность связывания антител к БТШ90 с антигенами сперматозоидов

6 Изменение репродуктивного статуса фертильных женщин сопровождается изменением активности связывания антител к БТШ90 с антигенами сперматозоидов, выявляемой в сыворотке крови Антигенсвязывающая активность антител к БТШ90 увеличивается при начале половой жизни, снижается на ранних сроках беременности и достигает исходного высокого уровня после родов

7 Высокая антигенсвязывающая активность антител к БТШ90, выявляемая в сыворотке крови и/или секретах репродуктивного тракта, является маркером толерантности к аллоантигенам полового партнера у женщин и к аутоантигенам сперматозоидов у мужчин Иммунный фактор бесплодия, обусловленный присутствием антиспермальных антител, диагностируется при низкой антигенсвязывающей активности антител к БТШ90

8 Увеличение уровня антиспермальных антител в сыворотке крови на ранних сроках физиологической беременности наблюдается на фоне сниженной антигенсвязывающей активности антител к БТШ90 Высокая активность антител к БТШ90, выявляемая в сыворотке крови в ранние сроки беременности, является прогностическим показателем при диагностике угрозы прерывания беременности

9 Продукция антиспермальных антител, выявляемых в сыворотке крови, зависит от состояния регуляторного клеточного звена иммунной системы Снижение относительного содержания зрелых уб Т- лимфоцитов с фенотипом ТСЯу8+/С056- в периферической крови мужчин и женщин сопровождается снижением активности антител к БТШ90 и, соответственно, увеличением вероятности выявления антиспермальных антител

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

При обследовании пациентов, состоящих в бесплодном браке, рекомендуется использовать выявление антиспермальных антител в секретах репродуктивного тракта с помощью ПЦМ Проведение одновременного комплексного обследования обоих супругов с применением предложенных тестов позволяет эффективно диагностировать иммунный фактор бесплодия у мужчин и женщин и является основой для выбора оптимальных способов коррекции бесплодия

Количественная оценка спонтанной и индуцированной ионофором А23187 акросомной реакции сперматозоидов с помощью ПЦМ может быть рекомендована при обследовании мужчин, состоящих в бесплодном браке и имеющих нормальные показателями спермограммы Предложенное исследование позволяет эффективно диагностировать бесплодие, обусловленное нарушениями акросомной реакции, у бесплодных пациентов с нормозооспермией и выбирать оптимальный способ коррекции репродуктивной функции

Количественный способ оценки активности связывания антител к БТШ90, присутствующих в сыворотке и секретах репродуктивного тракта, с антигенами сперматозоидов может быть использован при выявлении иммунного фактора бесплодия, при диагностике угрозы прерывания беременности а также для проведения дальнейших исследований механизмов иммунорегуляции репродуктивной функции человека

Список основных работ, опубликованных по теме диссертации

1. Nikolaeva М.А., Ter-Avanesov G.V., Terekhina L.N., Pshemchnikova T.Ja., Sukhikh G.T. Antisperm antibody detection on the surface of the living spermatozoa // J. of Reprod. Imunol. -1989 - Suppl.l. - P.61.

2 Николаева M A, Терехина JIH, Волков Н И, Федорова Т А, Пшеничникова Т Я , Сухих Г Т Выявление антиспермальных антител у супружеских пар с бесплодием неясного генеза и эндометриозом // Тез 4 Всес симп "Иммунология репродукции" - Киев -1990 - С 53

3. Николаева М.А., Тер-Аванесов Г.В., Терехина JI.H., Пшеничникова Т.Я., Сухих Г.Т. Выявление антиспермальных антител на поверхности живых сперматозоидов методом проточной цитофлуорометрии // Ж. «Бюллетень экспериментальной биологии и медицины». -1990. - Т.109, №4.- С.379-382.

4 Nikolaeva MA, Sukhikh GT, Ter-Avanesov GV, Terekhma LN, Pshenichnikova T Ja Detection of antisperm antibodies on the surface of living spermatozoa using flow cytometry // Abstr of VI1 World Congress of human reproduction - Helsinki, Finland -1990 - Abstr 384

5 Nikolaeva M A , Terekhma L N, Sukhikh G T Detection of antisperm antibodies in cervical mucus by flow cytometry // Abstr of 7 World Congress of Cervical Pathology and Colposcopy -Rome, Italy -1990 -P66

6. Николаева M.A., Вербицкий М.Ш., Сухих Г.Т. Использование проточной цитофлуорометрии для определения антиспермальных антител методами спермоиммобилизации и спермотоксичности //Ж. «Бюллетень экспериментальной биологии и медицины». -1992. -Т114, №10. - С. 398-399.

7 Николаева М А, Филиппова Р Д, Голубева Е JI, Сухих Г Т Антиспермальные антитела и состояние клеточного иммунитета у бесплодных женщин с эндометриозом // Тез республиканской конференции по иммунологии репродукции -Иваново -1993 - С 53

8 Nikolaeva М А , Golubeva Е L , Philippova R D , Volkov NI, Sukhikh G T Antisperm antibodies and cell immunity of infertile women with endometriosis // Abstr of Int Symp Immunology of Reproduction - Kiev -1993 -P 113

9. Nikolaeva M.A., Kulakov V.I., Ter-Avanesov G.V., Terekhina L.N., Pshenichnikova T.Ja., Sukhikh G.T. Detection of antisperm antibodies on the surface of living spermatozoa using flow cytometry: preliminary study H Fertility and Sterility. -1993. - Vol.59, №3. - P.639-644

10 Николаева MA, Терехина ЛН, Филиппова РД, Пшеничникова T Я, Сухих Г Т Антиспермальные антитела при бесплодии у женщин // Сб научных трудов "Иммунологические аспекты репродуктивного здоровья" - М -1995 - С 205-212

11 Nikolaeva М А , Goukasian I А , Philippova R D , Sukhikh G Т Using flow cytometry for acrosome status evaluation m human sperm // Abstr of Int Symp on Human Sperm Acrosome Reaction - France -1995 - P 458-459

12 Nikolaeva M A , Goukasian IA, Philippova R D , Sukhikh G T Evaluation of stimulus-induced acrosome reaction by flow cytometry // Abstr of 11 Int Congress on Andrology - Turkey - 1995 - Abstr A12

13. Филиппова Р.Д., Николаева M.A., Гукасян И.А., Волков Н.И., Пшеничникова Т.Я., Сухих Г.Т. Антиспермальные антитела и состояние клеточного иммунитета у женщин с эндометриозом // Ж. «Акушерство и гинекология». -1996. - №1. - С.34-36.

14 Nikolaeva М А , Goukasian IА , Philippova R D , Korotkova I V, Sukhikh G T Flow Cytometry study on the effect of serum and peritoneal fluid of

women on sperm-binding activity of IgG antisperm antibodies // Abstr of 3 International Forum of Reproductive Immunology - Germany -1996 -P9

15 Nikolaeva MA, Kuyavskaja DV, Matveeva NK, Goukasian I A, Philippova R D, Korotkova IV, Sukhikh G T, Adamyan L V Characterization of lymphocyte subpopulations and antisperm antibodies detection m the blood and peritoneal fluid of women with endometriosis // Abstr of 3 International Forum of Reproductive Immunology - Germany -1996 -P 18

16 Nikolaeva M A , Kuyavskaja D V, Goukasian IA , Philippova R D , Korotkova I V , Sukhikh G T Effect of spermatozoa's individual properties on results of antispermal antibodies detection in women's serum // Abstr of Int Symp Immunology of Reproduction -Ukraine, Kiev - 1996 -P72

17 Nikolaeva M A , Goukasian I A , Philippova R D , Korotkova I V , Sukhikh GT Adaptation of flow cytometry method for detection of antisperm antibodies m women blood serum and peritoneal fluid // Abstr of Int Symp Immunology of Reproduction - Ukraine, Kiev - 1996 -P 73

18. Николаева M.A., Гукасян И.А., Филиппова Р.Д., Короткова И.В., Куявская Д.В., Сухих Г.Т. Выявление антиспермальных антител в сыворотке крови женщин при использовании сперматозоидов различных доноров // Ж. «Бюллетень экспериментальной биологии и медицины». -1997. - Т124, №7. - С. 89-91.

19. Николаева М.А., Гукасян И.А., Филиппова Р.Д., Короткова И.В., Куявская Д.В., Сухих Г.Т. Адаптация метода проточной цитофлуорометрии для выявления антиспермальных антител в сыворотке крови и перитонеальной жидкости женщин // Ж. «Бюллетень экспериментальной биологии и медицины». -1997. — Т124, №9. - С. 339-341.

20. Nikolaeva М.А., Goukasian I.A., Filippova R.D., Korotkova I.V., Sukhikh G.T. Flow Cytometry study on the effect of serum and peritoneal fluid of women on the sperm-binding activity of IgG antisperm antibodies // Fertility and Sterility. -1997. - Vol.67, №4. - P.680-686.

21 Nikolaeva M A , Korotkova I V , Golubeva E L , Bozedomov V A , Sukhikh G T Interaction of the live antisperm antibodies-positive spermatozoa with antibodies to immunoglobulin G results in appearance of spermatozoa subpopulation without antisperm antibodies on their surface // Abstr of Int Symp on Human Reproduction and Male Subfertility - 1998 - Genk, Belgium - P 60

22 Nikolaeva M A , Sukhikh G T, Golubeva E L, Korotkova IV , Kulakov V I Induction of acrosome reaction in antisperm antibodies-positive spermatozoa after their mteration with the antibodies // Abstr of 8 Int Symp on Spermatology -1998 - Montreal, Canada - Abstr PI-44

23. Nikolaeva MA, Golubeva E.L., Kulakov V.I., Sukhikh G.T. Evaluation of stimulus-induced acrosome reaction by two-colour flow cytometric analysis//Molecular Human Reproduction.-1998.-Vol.4- №3 - P.243-250.

24 Nikolaeva M A, Golubeva E L , Korotkova Г V, Sukhikh О T Shedding of immune complexes from the sperm surface during detection of antisperm antibodies // Abstr of European Meeting of Immunology and Reproduction -1999 -Rome, Italy -P64

25 Голубева E JI, Короткова И В , Николаева М А, Сухих Г Т Нарушения акросомальной реакции в диагностике репродуктивной функции // Сб матер 1 межд конф "Хроноструктура и хроноэкология" - 2000 - М С55

26 Божедомов В А, Сухих Г Т, Николаева М А Способ фармакологического лечения аутоиммунного мужского бесплодия // Патент на изобретение № 2149021 от 20 05 2000 Российская Федерация

27 Божедомов В А , Лоран О Б , Николаева М А , Сухих Г Т Влияние антиспермальных антител на мужскую репродуктивную функцию // Ж «Андрология и генитальная хирургия». — 2000 - N2 - С 25-33

28 Nikolaeva М А , Golubeva Е L , Korotkova IV , Repin V S , Krutskikh A U, Sukhikh G T The effect of antisperm antibodies on the acrosome status of human spermatozoa // Abstr of Second Int Conf on Experimental and Clinical Reprod Immunobiology - 2000 - Amsterdam, Netherlands - P 85

29. Nikolaeva M.A., Kulakov V.I., Korotkova I.V., Golubeva E.L., Koujavskaja D.V., Sukhikh G.T. Antisperm antibodies detection by flow cytometry is affected by aggregation of antigen-antibody complexes on the surface of spermatozoa // Human Reproduction. - 2000. - Vol.15, №12. -P.2545-2553.

30 Божедомов В И , Лоран А Б , Николаева М А , Сухих Г Т Влияние антиспермальных антител на мужскую репродуктивную функцию // Ж «Андрология и генитальная хирургия» - 2000 - № 2 - С 25-33

31. Короткова И.В., Николаева М.А., Божедомов В.А., Голубева ЕЛ., Крутских А.Ю., Тер-Аванесов Г.В., Сухих Г.Т. Уровень генерации свободных радикалов в образцах эякулята бесплодных пациентов. // Ж. «Бюллетень экспериментальной биологии и медицины». - 2001. -Т131, №9. - С. 555-557.

32. Николаева М.А., Крутских А.Ю., Короткова И.В., Голубева ЕЛ., Кулаков В.И., Сухих Г.Т. Антиспермальные антитела и бесплодие -неразрешимая проблема или перспективное направление исследований? // Ж. «Бюллетень экспериментальной биологии и медицины». -2001. - Т131, №1. - С. 33-38.

33. Nikolaeva М.А., Golubeva E.L., Korotkova I.V., Koujavskaja D.V., Sukhikh G.T. Production of free radicals in semen samples of autoimmune infertile men // Am.J.Reprod.Immunol. - 2001. - Vol.46, N1. - P51.

34 Божедомов В А Николаева M A , Голубева E Л Короткова И В Сухих Г Т Теодорович О В Мужское бесплодие при нормозоозооспермии // Тезисы Всеросс конф «Мужское здоровье» -2003 - М -С 15

35 Божедомов В А, Николаева М А, Логинова Н С, Матвеева Н К, Верясов В Н, Сухих Г Т, Теодорович О В Особенности клеточного, гуморального иммунитета и системы интерферонов у мужчин с

аутоиммунными реакциями против сперматозоидов // Тезисы Всероссконф «Мужское здоровье» -2003 - М -С 19-20

36 Божедомов В А, Николаева М А, Теодорович О В Нормализация акросомальной реакции в результате комплексной терапии карнитином, фруктозой и лимонной кислотой // Ж «Проблемы репродукции» - 2003 -№6 Р 49-52

37. Nikolaeva М.А., Korotkova I.V., Golubeva E.L., Sukhikh G.T. Detection of semen antisperm antibodies using indirect flow cytometry test // J. of Reprod. Imunol. - 2003. - Vol.58, N2. - P.136.

38. Nikolaeva M.A., Alexinskaja M.A., Ehstratova O.S., Sukhikh G.T. The kinetic of spermatozoa interaction with antisperm antibodies in sera of fertile women // Am.J.Reprod.Immunol. - 2004. - Vol.51, N6. - P.486.

39 Николаева M А Ауто- и изо-антитела к антигенам сперматозоидов человека в норме и при нарушениях репродуктивной функции // Russian Journal of Immunology -2005 - Vol 9, Suppl 2 - P 56-60

40 Николаева M A , Голубева E JI, Короткова И В , Сухих Г Т , Назаренко Е Г Влияние лимфоцитотерапии на динамику уровня антиспермальных антител в цервикальной слизи женщин при бесплодии //Тез II Росс конф по иммунотерапии и иммунореабилитологии -2005 -М - С 189

41. Алексинская М.А., Николаева М.А., Данилов С.М., Елистратова О.С., Сухих Г.Т. Количественная оценка тестикулярной изоформы ангиотензин-превращающего фермента на поверхности сперматозоидов человека // Ж. «Бюллетень экспериментальной биологии и медицины». — 2006. - Т.141, №1. - С. 41-44.

42. Алексинская М.А., Николаева М.А., Данилов С.М., Кузьмичев JI.H., Левчук Т.Н., Елистратова О.С., Сухих Г.Т. Зависимость скорости движения сперматозоидов от экспрессии тестикулярной изоформы ангиотензин-превращающего фермента на их поверхности // Ж. «Бюллетень экспериментальной биологии и медицины». — 2006. — T.141,N.2.-С. 198-201.

43. Nikolaeva М.А., Balyasnikova I.V., Alexinskaya М.А., Metzger R., Franke F.E., Albrecht R.F.II, Kulakov V.I., Sukhikh G.T., Damlov S.M. Testicular isoform of angiotensin I-converting enzyme (ACE, CD143) on the surface of human spermatozoa: revelation and quantification using monoclonal antibodies // Am.J.Reprod.Immunol. - 2006. - Vol.55, №1-P54-68.

Список использованных сокращений

АГ антиген

АПФ ангиотензин-превращающий фермент

АР акросомная реакция

АСАТ антиспермальные антитела

AT антитело

БТШ белки теплового шока

ИФ интенсивность флуоресценции

ИСИ индекс спермоиммобилизации

ИЦТ иммуноцитотерапия

мАТ моноклональные антитела

ОИФ относительная интенсивность флуоресценции

ПЦМ проточная цитофлуорометрия

ПЦМ% процент клеток или латексных частиц, покрытых

антителами,

выявляемый с помощью ПЦМ СРК свободные радикалы кислорода

тАПФ тестикулярная изоформа ангиотензин-превращающего

фермента

ТРИТЦ тетраметилродамин- изотиоцианат

УЕФ условные единицы флуоресценции

ФБД фосфатный буфер Дульбекко

ФИТЦ флуоресцеин-изотиоцианат

ALH amplitude of lateral head «placement (амплитуда бокового

смещения головки) CASA Computer Assisted Semen Analysis (компьютерный анализ

спермы)

CD cluster of differentiation (кластер дифференцировки)

IBT immuno-beads test (тест с полиамидными бусами)

IgG, IgA, IgM иммуноглобулины класса G, A, M LIN liniarity (линейность движения, LIN=VSL/VCL)

MAR mixed agglutination reaction (реакция смешанной

агглютинации)

ROC Receiver Operating Characteristics (характеристическая

кривая)

STR stnghtness (средняя прямизна движения, STR=VSL/VAP)

ТРИТЦ тетраметилродамин- изотиоцианат

VAP average path velocity (путевая скорость движения

сперматозоидов)

VCL curvilinear velocity (трековая скорость движения

сперматозоидов)

VSL straight -line velocity (прямолинейная скорость движения

сперматозоидов)

Актуальность работы

Иммунорегуляция процессов гаметогенеза, оплодотворения и беременности играет важную роль при репродукции человека. Основной функцией иммунной системы является защита организма путем распознавания «своего» и «не своего» (чужого). Препятствуя развитию инфекций и раковых опухолей и обеспечивая отторжение чужеродных тканей, иммунная система парадоксальным образом «не замечает» уникальных антигенов сперматозоидов, продукция которых начинается в пубертатный период, когда толерантность к «своему» уже давно сформирована, не противодействует проникновению генетически чужеродных сперматозоидов в организм женщины и дальнейшему развитию полуаллогенного плода.

Многочисленные исследования свидетельствуют о том, что отсутствие иммунного конфликта при нормальном функционировании репродуктивных органов является результатом сбалансированного динамического взаимодействия иммунной и репродуктивной систем [8, 19, 17, 239]. Однако механизмы, обеспечивающие иммунологическую регуляцию репродуктивной функции человека, до сих пор во многом остаются невыясненными. Очевидно, что изучение взаимодействия иммунной и репродуктивной систем имеет большое теоретическое значение для понимания иммунологических закономерностей, а также несомненное клиническое значение для иммунодиагностики и эффективной коррекции различных нарушений репродукции человека.

До сих пор не существует единого мнения о роли гуморального иммунитета при репродукции. Возможность продукции антител к сперматозоидам - антиспермальных антител (АСАТ) - была показана в конце XIX века в работах К. Ландштайнера [257] и И.И. Мечникова [280]. В последующих публикациях, посвященных выявлению АСАТ, было постулировано существование иммунологического бесплодия, обусловленного наличием антител к антигенам сперматозоидов в сыворотке и секретах репродуктивного тракта мужчин [354] и женщин [168]. С тех пор значение АСАТ в генезе бесплодия интенсивно исследуется, но до сих пор остается невыясненным вопрос о том, является ли присутствие АСАТ в сыворотках женщин до наступления беременности, при беременности и после беременности физиологическим или патофизиологическим фактором. Отсутствует также единая точка зрения о механизмах формирования АСАТ у мужчин.

Для выявления АСАТ используется широкий спектр методов, приводящих зачастую к противоположным выводам.С помощью методов спермоагглютинации [168], спермоиммобилизации [232], MAR (mixed agglutination reaction) - теста [235], иммуноферментного анализа [430] и IBT (immunobead) - теста [91] получены данные об отсутствии или низком уровне АСАТ в сыворотке фертильных женщин; в то же время данные иммунофлуоресценции [210] и иммуноблоттинга [211, 133] подтверждают присутствие АСАТ в сыворотках фертильных мужчин и женщин.

В обзоре, посвященном проблеме антиспермального иммунитета, авторы делают вывод о методическом кризисе, связанном с выявлением АСАТ [194]. Там же подчеркивается, что «на данный момент отсутствует стандартный единый метод выявления АСАТ, отсутствуют общепринятые представления о клинической значимости АСАТ, отсутствуют доказательства влияния АСАТ на процессы репродукции, невозможно использовать предлагаемые рутинные методы выявления АСАТ в качестве тестов для диагностики иммунного бесплодия»

Очевидно, что в основе противоречивых представлений о значении антиспермального иммунитета лежит проблема адекватности методов, используемых для выявления АСАТ.

Методология изучения влияния антиспермального иммунитета на процессы репродукции включает в себя также сравнение функций АСАТ-негативных и АСАТ-позитивных сперматозоидов.

Важнейшей функцией сперматозоидов, играющей ключевую роль в проникновении сперматозоида через оболочку яйцеклетки, является акросомная реакция (АР) - рецептор-опосредованная активация и высвобождение протеолитических ферментов [428]. Данные о влиянии АСАТ на АР противоречивы: в одних исследованиях показано ингибирование АР при наличии АСАТ [54], в работах других авторов выявлена стимуляция преждевременной, спонтанной АР [141,187,84].

Противоречивые представления о функциях АСАТ-позитивных сперматозоидов могут быть также обусловлены субъективным характером методов, используемых для оценки этих функций. Так для оценки акросомного статуса используется трудоемкий и субъективный метод флуоресцентной микроскопии.

Очевидно, что для формирования современных представлений о влиянии антиспермального иммунитета на репродуктивную функцию человека необходима разработка новых адекватных методов выявления АСАТ в различных биологических жидкостях бесплодных и фертильных пациентов, а также создание объективных методов оценки влияния АСАТ на оплодотворяющую способность сперматозоидов.

Цель работы

Характеристика иммунных реакций на антигены сперматозоидов в норме и при нарушениях репродуктивной функции у мужчин и женщин с помощью новых объективных количественных способов выявления антиспермальных антител и оценки функций сперматозоидов.

Задачи исследования

1. Разработка объективного количественного способа выявления антител к антигенам сперматозоидов с помощью метода проточной цитофлуорометрии.

2. Количественная оценка уровня антител к антигенам сперматозоидов в сыворотках крови и секретах репродуктивного тракта у фертильных и бесплодных мужчин и женщин.

3. Разработка объективного способа оценки акросомной реакции сперматозоидов с помощью метода проточной цитофлуорометрии.

4. Оценка влияния антиспермальных антител на функции сперматозоидов - скорость движения, генерацию активных форм кислорода, акросомную реакцию.

5. Выявление зависимости уровня антиспермальных антител от состояния клеточного звена иммунитета у мужчин и женщин.

Научная новизна исследования

Впервые предложен количественный способ выявления антител классов G, А и М на поверхности живых сперматозоидов с помощью проточной цитофлуорометрии (ПЦМ). Установлено, что связывание AC AT, присутствующих в секретах репродуктивного тракта мужчин и небеременных женщин, с поверхностными антигенами живых сперматозоидов является маркером нарушения репродуктивной функции.

Продемонстрировано существование в сыворотках крови и секретах репродуктивного тракта бесплодных мужчин и женщин АСАТ теплового и холодового типа, выявляющихся на поверхности живых сперматозоидов лишь в определенном температурном диапазоне.

Впервые разработан количественный способ оценки акросомного статуса сперматозоидов с помощью одновременного окрашивания гамет лектином Pisum sativum, меченным флуоресцеин-изотиоцианатом, и лектином Arachis hypogaea, меченным тетраметилродамин-изотиоцианатом, и последующего анализа методом ПЦМ.

Впервые показано, что преждевременная активация сперматозоидов, происходящая при связывании АСАТ с поверхностью клеток, является одним из механизмов нарушения репродуктивной функции. Обнаружено, что активация сперматозоидов, покрытых антителами, сопровождается сбрасыванием поверхностных комплексов антиген-антитело, что определяет низкую чувствительность выявления АСАТ с помощью метода ПЦМ и ограничивает возможность использования живых сперматозоидов для количественной оценки содержания АСАТ в сыворотке крови и секретах репродуктивного тракта.

Впервые установлено, что антитела к белкам теплового шока с молекулярным весом 90 кДа (БТШ90), присутствующие в сыворотках крови фертильных мужчин и женщин, взаимодействуют со спермальными антигенами, сорбированными на латексных частицах, и не выявляются на поверхности живых сперматозоидов. В сыворотках крови фертильных мужчин и женщин и в семенной жидкости выявлена высокая активность связывания антител к БТШ90 с антигенами сперматозоидов. Иммунный фактор бесплодия, обусловленный присутствием антиспермальных антител, диагностировался при низкой антигенсвязывающей активности антител к БТШ90.

Впервые выявлена зависимость между активностью связывания антител к БТШ90 с антигенами сперматозоидов и состоянием клеточного звена иммунной системы мужчин и женщин, представленного регуляторными уб Т- лимфоцитами.

Практическая значимость работы

Разработаны диагностические критерии для выявления иммунного фактора бесплодия у мужчин и женщин, основанные на количественной оценке связывания антиспермальных антител, присутствующих в секретах репродуктивного тракта, с антигенами живых сперматозоидов.

Установлено, что оценка активности связывания антител к БТШ90, присутствующих в сыворотке крови и секретах репродуктивного тракта, с антигенами сперматозоидов, сорбированными на латексных частицах, является прогностическим показателем при выявлении иммунного фактора бесплодия у мужчин и женщин, а также при диагностике угрозы прерывания беременности.

Разработан способ выявления бесплодия, обусловленного нарушениями функций сперматозоидов, основанный на количественной оценке спонтанной и индуцированной ионофором А23187 акросомной реакции с помощью ПЦМ.

Реализация результатов работы

Результаты диссертационной работы внедрены в программу лекций кафедры лабораторной диагностики ГОУ ДПО «Российская медицинская академия последипломного образования Росздрава» и в практическую работу лаборатории клинической иммунологии ФГУ «Научный центр акушерства, гинекологии и перинатологии Федерального агентства по высокотехнологичной медицинской помощи».

Апробация работы

Материалы диссертации доложены и обсуждены на 4 Всесоюзном симпозиуме «Иммунология репродукции» (Киев, 1990), VII Всемирном конгрессе по иммунологии репродукции человека (Хельсинки, Финляндия, 1990), 7 Всемирном конгрессе по цервикальной патологии и кольпоскопии (Италия, Рим, 1990), Республиканской научной конференции по иммунологии репродукции (Иваново, 1993), Международном симпозиуме по иммунологии репродукции (1993, Киев), конференции «Иммунологический мониторинг и иммунореабилитация» (Москва, 1995), 11 международном конгрессе по андрологии (Анкара, Турция, 1995), Международном симпозиуме по акросомной реакции сперматозоидов (Коллюр, Франция,

1995), 3 международном форуме по репродуктивной иммунологии (Берлин, Германия, 1996), Международном симпозиуме по иммунологии репродукции (Киев, 1996), Международном симпозиуме по мужскому бесплодию и репродуктивным технологиям (Генк, Бельгия, 1998), 8 Международном симпозиуме по сперматологии (Монреаль, Канада, 1998), европейском симпозиуме по иммунологии репродукции (Рим, Италия, 1999), 1 международной конференции «Хроноструктура и хроноэкология» (Москва, 2000), II Российском форуме «Мать и дитя» (Москва, 2000), Второй международной конференции по экспериментальной и клинической репродуктивной иммунобиологии (Амстердам, Нидерланды, 2000), XII Международной конференции «Репродуктивные технологии сегодня и завтра» (С.-Петербург, 2003), Всероссийской конференции «Мужское здоровье» (Москва, 2003), Европейском конгрессе репродуктивной иммунологии (Плзень, Чехия, 2004), Международной научной конференции "Ломоносов-2004" (Москва, 2004), Международной научной конференции "Ломоносов-2005" (Москва, 2005), IX Всероссийском научном Форуме с международным участием «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге» (Санкт-Петербург, 2005), II Российской конференции по иммунотерапии и иммунореабилитологии (Москва, 2005), Республиканской научной конференции «Иммунология репродукции» (Иваново, 2005), Всероссийском научном форуме «Мать и дитя» (Казань, 2007), 2-й Республиканской конференции «Иммунология репродукции» (Сочи, 2007).

Структура и объем диссертации

Материалы диссертации изложены на 278 страницах машинописного текста. Работа состоит из введения, обзора литературы по теме диссертации, описания материалов и методов, 4 глав собственных исследований и их обсуждения, заключения, выводов и указателя литературы, включающего 433 источника. Работа иллюстрирована 69 рисунками и 9 таблицами.

231 ВЫВОДЫ

1. Разработан способ выявления антител на поверхности живых сперматозоидов с помощью проточной цитофлуорометрии. Связывание антиспермальных антител, присутствующих в секретах репродуктивного тракта мужчин и небеременных женщин, с поверхностными антигенами живых сперматозоидов является маркером нарушения репродуктивной функции. Установлено, что антиспермальные антитела гетерогенны по изотипу, температурному оптимуму связывания с антигенами, механизмам влияния на функции сперматозоидов.

2. Разработан объективный количественный способ определения основных параметров акросомного статуса сперматозоидов человека с помощью проточной цитофлуорометрии. Способ позволяет оценивать процент спонтанной и индуцированной ионофором А23187 акросомной реакции и диагностировать бесплодие, обусловленное нарушениями функций сперматозоидов, при нормальных показателях спермограммы.

3. Преждевременная функциональная и метаболическая активация сперматозоидов, покрытых антиспермальными антителами, является одним из патогенетических механизмов влияния антиспермальных антител на репродуктивную функцию. При активации меняется траектория движения сперматозоидов, усиливается генерация свободных радикалов кислорода, увеличивается вероятность преждевременной акросомной реакции и снижается вероятность оплодотворения.

4. Активация сперматозоидов, покрытых антителами, сопровождается сбрасыванием поверхностных комплексов антиген-антитело, что определяет низкую чувствительность выявления антиспермальных антител с помощью метода проточной цитофлуорометрии и ограничивает возможность использования живых сперматозоидов для количественной оценки содержания антиспермальных антител в сыворотке крови и секретах репродуктивного тракта.

5. В сыворотке крови и секретах репродуктивного тракта фертильных мужчин и женщин присутствуют антитела к белкам теплового шока с молекулярным весом 90 кДа (БТШ90), взаимодействующие с антигенами сперматозоидов, сорбированными на латексных частицах. Метод проточной цитофлуорометрии является объективным количественным методом, позволяющим оценивать активность связывания антител к БТШ90 с антигенами сперматозоидов.

6. Изменение репродуктивного статуса фертильных женщин сопровождается изменением активности связывания антител к БТШ90 с антигенами сперматозоидов, выявляемой в сыворотке крови. Антигенсвязывающая активность антител к БТШ90 увеличивается при начале половой жизни, снижается на ранних сроках беременности и достигает исходного высокого уровня после родов.

7. Высокая антигенсвязывающая активность антител к БТШ90, выявляемая в сыворотке крови и/или секретах репродуктивного тракта, является маркером толерантности к аллоантигенам полового партнера у женщин и к аутоантигенам сперматозоидов у мужчин. Иммунный фактор бесплодия, обусловленный присутствием антиспермальных антител, диагностируется при низкой антигенсвязывающей активности антител к БТШ90.

8. Увеличение уровня антиспермальных антител в сыворотке крови на ранних сроках физиологической беременности наблюдается на фоне сниженной антигенсвязывающей активности антител к БТШ90. Высокая активность антител к БТШ90, выявляемая в сыворотке крови в ранние сроки беременности, является прогностическим показателем при диагностике угрозы прерывания беременности.

9. Продукция антиспермальных антител, выявляемых в сыворотке крови, зависит от состояния регуляторного клеточного звена иммунной системы. Снижение относительного содержания зрелых уб Т- лимфоцитов с фенотипом ТСКу5+/СБ56- в периферической крови мужчин и женщин сопровождается снижением активности антител к БТШ90 и, соответственно, увеличением вероятности выявления антиспермальных антител.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

При обследовании пациентов, состоящих в бесплодном браке, рекомендуется использовать выявление антиспермальных антител в секретах репродуктивного тракта с помощью ПЦМ. Проведение одновременного комплексного обследования обоих супругов с применением предложенных тестов позволяет эффективно диагностировать иммунный фактор бесплодия у мужчин и женщин и является основой для выбора оптимальных способов коррекции бесплодия.

Количественная оценка спонтанной и индуцированной ионофором А23187 акросомной реакции сперматозоидов с помощью ПЦМ может быть рекомендована при обследовании мужчин, состоящих в бесплодном браке и имеющих нормальные показателями спермограммы. Предложенное исследование позволяет эффективно диагностировать бесплодие, обусловленное нарушениями акросомной реакции, у бесплодных пациентов с нормозооспермией и выбирать оптимальный способ коррекции репродуктивной функции.

Количественный способ оценки активности связывания антител к БТШ90, присутствующих в сыворотке и секретах репродуктивного тракта, с антигенами сперматозоидов может быть использован при выявлении иммунного фактора бесплодия, при диагностике угрозы прерывания беременности а также для проведения дальнейших исследований механизмов иммунорегуляции репродуктивной функции человека.

234