Автореферат и диссертация по медицине (14.00.25) на тему:Антиоксидантные средства: стратегия отбора, перспективы применения

На правах рукописи

КОСОЛАПОВ ВАДИМ АНАТОЛЬЕВИЧ

АНТИОКСИДАНТНЫЕ СРЕДСТВА: СТРАТЕГИЯ ОТБОРА, ПЕРСПЕКТИВЫ ПРИМЕНЕНИЯ

14 00 25 • Фармакология, клиническая фармакология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук

ВОЛГОГРАД 2005

Работа выполнена в НИИ фармакологии и на кафедре фармакологии ГОУ ВПО Волгоградский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию

Научный консультант:

Заслуженный деятель науки РФ, член-корреспондент РАМН, доктор медицинских наук,

профессор А А Спасов

Официальные оппоненты:

Член-корреспондент РАМН, доктор медицинских наук, профессор

Доктор медицинских наук, профессор

Доктор медицинских наук, профессор

П А Галенко-Ярошевский К М Резников И Н Тюренков

Ведущее учреждение:

НИИ фармакологии РАМН

Защита состоится "2?." 2005 г в". К "час на заседании диссерта-

ционного совета Д208.008 02 при Волгоградском государственном медицинском университете (400131 г Волгоград, площадь Павших Борцов, 1)

С диссертацией можно ознакомиться в фундаментальной библиотеке Волгоградского государственного медицинского университета

Автореферат разослан " " 2005 г

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор медицинских наук,

профессор А Р Бабаева

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы В организме человека постоянно образуююя различные интермедиаты кислорода, оказывающие при избыточном образовании токсическое действие (Владимиров Ю.А, Арчаков А И , 1972; Halliwell В , 2000, Шанин Ю.Н. и др, 2003; McCord J M , Edcas M A , 2005) В i енсзе многих патологических состояний ключевая роль отводится активации перекисям о окисления липидов, белков и ДНК (Бурлакова Е Б и др , 1992, Биленко MB и др , 1998; Анисимов В.Н и др , 1999; Тихазе А К , 19996, Ланкин В 3 и др., 2000, Клебанов Г И. и др , 2001 ; Golden T.R. et al., 2002, Mathews С E. et al, 2004). Вышесказанное делает актуальным поиск и фармакологическое изучение антиоксидангных средств для лечения ряда патологических состояний, сопровождающихся избыточной активацией процессов пероксидации и нарушениями кислородного обмена, в частности, при гипоксиях-ишемиях мола, нарушениях мозгового кровообращения (Ginsberg MD, 1993, Погорелый BE., Гае-вый M Д., 1999, Поварова О В и др , 2003), ишемических и реперфузионных повреждениях миокарда (Биленко M В. и др , 1998, Venardos К et al, 2004), печени (Fukai M. et al., 2005), атеросклерозе (Тихазе A.K , 1999a,б; Ланкин В.З. и др., 2000; Tardif J С , 2005), сахарном диабете (Балаболкин, M И., 1994, Кубатиев А А и др , 1996, Seven А. et al., 2004), нарушениях гемореологии и микрогемодинамики (Плотников M Б. и др., 2000; PlotnikovMB et al, 2004) и др

Наиболее часто для ограничения пероксидации при свободно-радикальных патологиях использутоюя естественные - такие как а-токоферол, аскорбиновая кислота (Pryor W.A. et al, 1988; Абрамченко В В., 2001, Шанин ЮН и др , 2003) и синтетические антиоксидантные вещества - дибунол, пробукол, мексидол (Биленко М.В., 1989; Тихазе А К и др , 1999а, Дюмаев К M и др., 1995, Bisby R.H , Morgan С G , 1999). Однако широкое внедрение этих и аналогичных средств в нашей стране в повседневную клиническую практику пока офаннчено В частности, использование их при i и-поксиях-ишемиях moi за значительно лимитируется особенностями структурно-функциональной организации мозга, своеобразием физиологической антиоксидант-ной системы мозга (Зозуля Ю А. и др, 2000), а также рядом недостатков жиро- и водорастворимых препаратов (Бурлакова Е Б , 1975; Burlakova ЕВ et al, 1998)

Это делает целесообразным поиск новых ингибиторов ПОЛ К сожалению, проблема поиска и создания новых высокоэффективных антиоксидантов остается до конца не решенной К числу потенциально активных антиоксидантов могут быть отнесены производные бензимидазола (Анисимова В А и др., 1973), особенно учитывая тот факт, что структура, в частности, имидазо-бензимидазолов, является тг-элехтроно-избыточной (Пожарский АФ, 1985), что позволяет предполагать у них антиокси-дантную активность. При этом у производных имидазо-бензимидазола выявлен широкий спектр фармакологической активности (Панченко Т И , 1990; Спасов А А и др , 1995, 1999, 2002; Островский О В , 1996; Дудченко Г П , 2001)

В целях разработки лекарственных средств на основе антиоксидантных веществ представлялось необходимым оптимизировать подходы к отбору соединений, которые позволяли бы на основе строения и физико-химических свойств веществ предполагать у них наличие атиоксидантной активности, детально изучить ее спектр и механизмы действия Гакже было предпринято изучение их фармакологических эффектов на моделях, в генезе коюрых важное значение имеет активация свободно-радикальных процессов, таких как различные формы остмй.гидакси&И.РбВИРАРеоксиге-

нации, хроническая гипоксия плода, ишемии головного мозга и реперфузионный период, сахарный диабет, ДВС-синдром Для детализации механизмов действия новых веществ представлялось важным изучить их влияние на активацию ПОЛ, состояние анггиоксидантной системы, а также влияние на реологию крови и процессы микроциркуляции при патологиях. Целесообразным представлялось для подбора эффективных доз препарата и создания оптимальной схемы лечения провести изучение фармакоки-нетических свойств нового соединения с оценкой биодоступности его лекарственной формы, а также исследовать его токсикологические свойства.

Диссертационная работа выполнена в рамках Федеральной целевой научно-технической программы «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития науки и техники гражданского назначения» (№ госрегистрации 01200116045), является составной частью научно-исследовательской программы «Поиск, разработка и фармакологическое изучение веществ, проявляющих антиоксидант-ные свойства» (№ госрегистрации 01200111180), включенной в план НИР Волгоградского государственного медицинского университета.

Целью исследования явилось создание системы поиска и прогноза, разработка подходов к изучению антиоксидантной активности лекарственных средств на примере конденсированных производных бензимидазола, а также экспериментальное обоснование их применения при свободно-радикальных патологиях.

В задачи исследования входит:

1. Проведение поиска высокоэффективных антиоксидантных средств среди конденсированных производных бензимидазола,

2. Разработка системы прогноза антиоксидантной активности соединений на основе использования зависимостей химической структуры, физико-химических свойств и биологической активности с использованием методов (ЗвАЯ.

3. Создание методологии изучения новых химических соединений по их влиянию на свободно-радикальные процессы с использованием современных непрямых и прямых хемилюминесцентных методов определения антиоксидантной активности.

4. Исследование антиоксидантных и антирадикальных свойств наиболее активных соединений с использованием методов изучения различных уровней свободно-радикальных реакций.

5. Изучение фармакодинамических свойств наиболее активных антиоксидантных соединений при свободно-радикальных патологиях.

6. Изучение гемобилогических свойств антиоксидантного вещества с высокой биологической активностью.

7. Изучение фармакокинетических свойств субстанции и лекарственной формы нового антиоксидантного соединения.

8. Исследование общей и специфической токсичности субстанции и лекарственной формы нового антиоксидантного соединения.

Научная новизна.

Впервые с использованием компьютерных систем прогноза и расчета закономерностей пр'оведен анализ взаимосвязи между структурой и антиоксидантной активностью в ряду имидазо-бензимидазола. С использованием системы «Микрокосм» выявлены основные структурные дескрипторы антиоксидантной активности производных имидазо-бензимидазолов, а также установлена связь между активностью и соле-образуюшим остатком. Определены физико-химические свойства, определяющие ан-тиоксидантную активность в данном химическом ряду и доказано, что антиоксидант-

ная активность имидазо-бензимидазолов определяется как суммарным зарядом молекулы, так и зарядом радикала в положении С2, а также липофильностыо этого радикала В результате сравнительного изучения антиоксидантных свойств известных препаратов и нового соединения эноксифол на различных моделях свободно-радикальных реакций, показано их действие на различные уровни свободно-радикального процесса и детализирован спектр антиоксидантной активности каждого из указанных веществ

Установлено действие соединения эноксифол при различных свободно-радикальных патологиях с оценкой влияния на интенсивность ПОЛ" в частности при острой гипоксии-ишемии и ишемии с реперфузией, при хронической внутриутробной гипоксии плода, при сахарном диабете и ДВС-синдроме Установлен спектр влияния соединения эноксифол на свертывающую систему и реологические параметры крови в норме и при свободно-радикальных патологиях, что позволило доказать наличие в основе механизмов действия соединения эноксифол его антиоксидантных и гемобио-логические свойств Показано, что при названных состояниях, соединение эноксифол, обладает значительной протективной активностью, повышая выживаемость животных, улучшая их функциональное состояние и ускоряя процессы реституции, что свидетельствует о перспективности разработки терапевтических методов, направленных на коррекцию свободно-радикальных патологий.

Впервые проведено всестороннее доклиническое изучение фармакокинетических И токсикологических свойств соединения эноксифол и его лекарственной формы. Научно-практическая значимость.

В ходе исследования опгимизированы схемы многоэтапного 01б0ра и изучения антиоксидантных веществ, что позволяет определить направленность дальнейшего скрининга антиоксидантных свойств новых веществ. В результате выявленных закономерностей между структурой и антиоксидантной активностью производных имида-зо(1,2-а)бензимидазола разработаны рекомендации для целенаправленного синтеза антиоксидантных веществ

Отработана методология детализации механизмов действия антиоксидантных веществ с выяснением их общей антиоксидантной активности и уточнением спектра антирадикальной активности современными непрямыми и прямыми методами исследования. Выявлено наиболее активное вещество и проведены расширенные доклинические исследования, а также разработана лекарственная форма.

При изучении фармакодинамических свойств соединения эноксифол на моделях свободно-радикальных патологий, показано, что в основе его действия лежит ан-тиоксидантная активность.

Установлено, что соединение эноксифол обладает также выраженными гемо-биологическими свойствами, и показана его активность на моделях с нарушением ге-мореологии и активацией перекисного окисления Детализированы механизмы гемо-биологического действия нового соединения

Проведены фармакокинетические и токсикологические исследования субстанции, а также созданной лекарственной формы эноксифола Реализация результатов исследования.

Выявленные закономерности между антиоксидантной активностью, химической структурой и физико-химическими свойствами конденсированных производных (1,2-а)бензимидазола используются при синтезе новых веществ в НИИ физической и органической химии Ростовского университета и ПИИ фармакологии ВолГМУ В работу НИИ фармакологии ВолГМУ внедрен новый комплексный подход к оценке ан-

тиоксидантной активности вещее ib Результаты работы используются и лекционных курсах на кафедрах фармацевтической химии, теоретической и клинической биохимии, фармакологии и биофарчации ФУ В ВолГМУ, на кафедрах фармакологии Ростовского медицинского университета и Кубанской медицинской академии Положения, выносимые на защиту.

1. Антиоксидангная активность в ряду производных N9 имида1о(1,2-а)бензимидазола может опредепяться наличием в их структуре высокодостоверных структурных дескрипторов, в час!ности гидрокси или дигидроксифенилышх заместителей, а также прямо коррелирует с зарядом и обратно коррелирует с линофильностыо радикала в положении С2

2. Соединение эноксифол с выраженной антиоксидантной активностью, обладает значительной протективной активностью, повышая выживаемость животных, улучшая их функциональное состояние, ускоряя процессы реституции и нормализуя I10JI при гипоксии и ишемии мозга, в постгипоксическом и реперфузионном периоде, при тотальной, при хронической внутриутробной гипоксии плода, ДВС-синдроме и снижая процессы ПОЛ при сахарном диабете

3 Соединение эноксифол проявляет гемобиологическую активность, проявляющуюся в снижении агрегации тромоцитов, влиянии на коагуляционное звено гемостаза и способности снижать вязкость крови как в норме, так и при свободно-радикальных патологиях, и в основе которой лежат его антиоксидантные свойства

4. Механизм защитных эффектов соединения эноксифол обусловлен ограничением патологической активации свободно-радикальных реакций, его гемобиологиче-скими и микрогемодинамическими свойствами

5. Соединение эноксифол являйся потенциальным текарственным средством для коррекции патологической активации свободнорадикальных процессов при таких состояниях, как острые и хронические церебральные гипоксические и ишемиче-ские повреждения, синдром повышенной вязкости крови

Апробация работы.

Материалы диссертации докладывались на конференциях молодых ученых, Волгоград, 1993 1998, на 49й, 50-й научных сессиях Волгоградской медицинской академии, 1994, 1995 на Всероссийской конференции "Научная работа на кафедре -как основа творческою роста преподавателя" Волгоград, 1993 на Росийской конференции "Антигипоксанты и акгопрогекторы итоги и перспективы" Санкт-Петербург, 1994, на И, III, IV, VII международных конгрессах "Человек и лекарство", Москва, 1993, 1996, 1997, 2000, на 1 и П съсздс Российского научного общества фармакологов, Волгоград, 1995, Москва, 2003; на I, II и III Всероссийских конференциях «Гипоксия механизмы, адаптация, коррекция», Москва, 1997, 1999, 2002, научно-практической конференции «Свободные радикалы и болезни человека», Смоленск, 1999, конференции «Биологические основы индивидуальной чувствительности к психотропным средствам», Суздаль, 2001, конференции «Free radicals and antioxidants in the development and functions of the central nervous system- from fetus to aging», Санкт-Пе-гербург, 2001, VI международной конференции «Биоантиоксидант», Москва, 2002 , Научно-практическом семинаре «Методы оценки антиоксидантной активности биоло! ически активных веществ чечебпого и профилактического на!начения», Москва, 2004, 8м региональном съезде Европейского научного общества нейропсихофарчакологов, Москва, 2005

Публикации.

По теме диссертации опубликовано 55 работ

Объем и структура работы.

Диссертация изложена на 266 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, четырех разделов, содержащих экспериментальные данные и их обсуждение, заключения, выводов и приложения. Работа иллюстрирована 87 таблицами и 31 рисунком Указатель литературы включает 356 источников, из них 202 отечественных и 154 зарубежных

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Эксперименты выполнены на 675 белых неинбредных мышах обоего пола массой 18-22г, 1691 белых неинбредных крысах обоего пола массой 160-300г и 440 плодах крыс, 130 морских свинках, 12 кроликах и 24 собаках

В работе изучались конденсированные производные бензимидазола (всего 285 соединений), синтезированные в НИИ ФОХ Ростовского государственного университета1. Первичный прогноз факта наличия/отсутствия антиоксидантной активности проводился для структурных формул оснований с использованием программы PASS версии 1,511 (Poroikov V , Filimonov D , 2001). Выявление структурных дескрипторов у соединений с антиоксидантной активностью проводилось с использованием компьютерною программного комплекса «Микрокосм» 3.0а, основанного на исследовании зависимостей «структура - свойство» методами теории распознавания образов (Васильев П.М. и др., 2004) Тестирование выборок в системе «Микрокосм» проводилось для структурных формул солей, а также с учетом изомерии.

Скрининг антиоксидантных свойств производных бензимидазола проводили на модели аскорбат-индуцируемого ПОЛ гомогенатов печени (Ланкин В 3 и др , 1975) Углубленное изучение антиоксидантной активности веществ проводилось на моделях аскорбат- и НАДФН-зависимого ПОЛ микросомальной фракции печени крыс (Куба-тиев А А , Андреев С В , 1981), супероксидцисмутазо-подобную активность на модели окисления кверцетина (Костюк В А и др , 1990), взаимодействие со свободным радикалом 2,2-дифенил-1-пикрилгидразил (ДФНГ*) по методу (Glevtnd G , 1963). Влияние веществ на процессы хемшноминесценции изучали на хемилюминометре «Хемилю-миномср-03» (Уфа, Россия) Антиоксидантную активность исследовали на модели Ре2+-индуцированной ХЛ липидов (Фархутдинов Р Р , 1995), взаимодействие с активными формами кислорода на модели люминол-занисичой ХЛ (Семешко С Г , Фархутдинов Р Р.. 2002), способность инактивировать супсроксидный анион-радикал оценивали по методу ксан гин-ксантиноксидаза индуцированной люцигенин-зависимой ХЛ (Gunaydin В , Demiiyurek А Т , 2001), способность веществ к перехвату и инактивации пероксильного радикала (RO2*) оценивалась по методу ЛБАН-индуцированной ХЛ (Клебанов Г И и др , 2001) Антиоксидантную активность оценивали по величине ин-гибирующей концентрации ИК50

В качестве препаратов сравнения изучались мексидол - производства Эллара (Россия), фенозан был иобезно предоставлен институтом химической физики АН РФ, бемитил и этомерзол - любезно предоставлены Санкт-Петербургской Военно-медицинской академией, пробукол был любезно предоставлен фирмой Servier (Франция); дибунол - производства ICN Biomedicals, а-юкоферол - производства фирмы Serva

1 Выражаем глубокую признательность к х н , в н с ВА Анисимовой за предоставленные соедине

11ИЯ

(Германия), тролокс - Fluka (Швейцария) аскорбиновая кислота - Chemapol (Чехия) N-ацетилцисгеин и дефсроксамин - Sigma (США)

Фармаколинамические свойства перспективного производного бензимидазола соединения эноксифол изучали на моделях свободно-радикальных патологий острой и хронической гипоксии, ишемии мозга, сахарном диабете, ДВС синдроме

Противо! ипоксическое деиствис веществ изучалось на моделях ос!рой шиобари-ческой, гемическои и 1исююксической гипоксии у мышей, а так же на крысах с разной фенотипической устойчивостью к гипоксии в соответствии с методическими рекомендациями под редакцией Л Д. Лукьяновой (1990) Кроме того, было изучено влияние веществ на восстановление крыс после гипобарической гипоксии, для чего был подобран оптимачьный высотный и скоростной режим, сопровождавшийся выраженными реоксигенационными повреждениями (Косолапов В А , 1996) Через 30 мин. после спуска у крыс измеряли динамометрию передних лап, локомоторную активность в актометрс Ugo Basile (Италия), поведение в открытом поле и УРПИ (Бу-реш и др , 1991) Состояние антиоксидантной системы и продукты IIOJ1 оценивали по уровню малонового диальдегида (МДА) в тесте с тиобарбитуровой кислотой (Гаври-лов В Б и др . 1987), шиффовых оснований (ШО) и диеновых конькмагов (ДК) - по В Е. Кагану (1986), содержанию [лутатиона - по G L. Ellman (1959), активности глута-тион-пероксидазы (ГП) - по В M Моину (1986), глузагион-редукгазы (ГР) - по В II Верболовичу и Л M Подгорной (1987), каталазы - по M А Королюк и др (1988) и су-пероксиддисмутазы (СОД) - по В А. Костюк и др (1990)

Внутриутробная гипоксия моделировалась у крыс в проточной барокамере при температуре 20-22°С с 12 по ?! день беременности (Трегубова И А и др, 2000) Беременные крысы поднимались на «высоту» 6 000 м, и экспозиция на «высоте» составляла 2 часа Скорость «подъема» и «спуска» равнялась 50 м/с На 20-й день беременности животных подвергали эвтаназии Для выявления повреждающего действия на плод производили вскрьп ие брюшной стенки, подсчитывали количество желтых тел беременности месг имплантации, количество живых и мертвых эмбрионов Рашпою и позднюю резорбцию, общую эмбриональную смертность подсчитывали по формулам, предложенным A M Малашенко (1967) Па основании полученных данных рассчитывались показатели смертности после имплантации и выживаемости При анализе эмбрионального материала также учитывали вес и длину плодов Органо-метрическое исследование плаценты проводили по методу (Милованов АП , Бруси-ловский А И , 1986) Для оценки состояния антиоксидантной системы в пренатальный период определяли уровень МДА. активность ферментов' каталазы, СОД и Г"П

Противоишемическое действие оценивали на модезях билатеральной окклюзии сонных артерий (Мирзоян PC и др , 2000) где критерием церебропротекторного эффекта являлся процент выживаемости животных по сравнению с контропем, и тотальной ишемии головного моз! а, моделируемой с помощью гермокоагуляции вертсбро-базилярных артерий и наложения окклюзоров на каротидные артерии с их пережатием на 30 мин с последующей релерфузией (Bromont С , Bwlct С , 1979), с оценкой в течение первых 7 суток восстановления крыс (Дрозд В В и др , 2001) по данным динамометрии передних лап, неврологическою статуса животных, их активност в акто-метре, поведению в оiкрытом поле, данным УРПИ (Буреш и др , 1991) Для оценки состояния антиоксидантной системы в реперфузионный период определяли уровень МДА, активность ферментов катлазы, СОД и ГП

Диабет моделировали у крыс свежеприготовленным на 0,01 М ацетатном буфере раствором аллоксана (165 мг/кг) (Sigma, США) Цитотоксин вводили внутрибрюшин-но крысам находящимся на стандартном пищевом рационе, и предварительно i оло-давшим перед введением аллоксана в течение 16 часов (Колесник Ю М , 1992) В тканях мозга, печени и поджелудочной железы определяли уровень МДД, активность ферментов СОД и Г11 Уровень глюкозы определяли с помощью набора «Глюкохром Д» (Россия)

Эндотоксемию, которая сопровождается диссеминированным внутрисосуди-стым свёртыванием (ДВС) крови, вызывали внутрибрюшинным введением LPS-эндотоксина Salmonela typhosa (Sigma, США) в дозе 5 мг/кг (LD50) Забор крови проводили из нижней полой вены наркотизированных животных Через 1 и 4 часа после интоксикации оценивался неврологический статус, динамометрия, локомоторная активность, функциональная активность тромбоцитов, коагуляционное звено системы гемостаза, процессы перекисного окисления липидов в крови и opi анах Агрегацион-ную активность тромбоцитов исследовали по методу Born G (1962) в модификации (Габбасов ЗА и др , 1989) на двухканальном лазерном анализаторе агрегации тромбоцитов 220 I-A (НПФ Биола, Россия) в богатой тромбоцитами плазме, индукцию агрегации проводили 5 мкМ АДФ (Reanal, Венгрия). Влияние LPS-токсина на свертываемость крови изучали методом тромбо-эластографии (Якунин Г А, 1973) с помощью 4-х канального тромбоэластографа-гемокоагулографа ГКГМ-4-02 (Россия)

Для фармакочогического анализа применяли активатор ПОЛ адриабластин (Нурмухомбетов АН и др . 1988) В качестве препаратов сравнения применяли субстанции этомерзола, мексидола, бемит ила, пробукола, дибунола, кавинтона

Для выяснения гемобиологических свойств эноксифола изучали влияние на агрегацию тромбоцитов и вязкость крови в норме, а также на животных с экспериментальными патологиями, сопровождающимися активацией окислительных процессов и синдромом гипервязкости - глобальной ишемии-рсперфузии головною мозга (Мир-зоян Р.С и др , 2000) и сгрептозотоцинового сахарного диабета (Баранов В Г , 1983).

Антиагрегантную активность веществ исследовали, как описано выше Исследования "in vitro" проводили на богатой тромбоцитами плазме (Люсов В А , Белоусов ЮБ, 1971) Антиагрегантную активность соединений изучали в диапазоне концентраций от 1х10"4 до 1x106 М Уровень агрегации оценивали по величине максимальной амплитуды агрегатоараммы Для сравнения антиагрегантпой активности веществ рассчитывали концентрацию ЭК50. снижающую агрегацию на 50%

Механизм антиагрегантно1 о действия эноксифола изучали "in vitro" с помощью различных индуюоров агрегации 5x106, 1хЮ"6 и 5x10'7 М АДФ (Reanal, Венгрия), SxlO"6 М адреналин (Sigma, США), 5х10-5 М арахидоновая кислота (Sigma, США), 1 х IО"7 М фактор активации тромбоцитов (ФАТ) (Sigma, США), 4 мкг/мл коллаген (Sigma, США) и 7,4х10"4 М перекись водорода (Россия) в пробе Серии экспериментов выполнялись на тромбоцитах кролика и человека для учета видовой специфичности тромбоцитов.

Вязкость крови измеряли на реологическом анализаторе крови АКР-2 (Россия) (Добровольский НА и др , 1996) при семи скоростях сдвига Все образцы приводились к единому гемаюкригу 45 ус, измеряемому на микрогемоцентрифуге МГЦ-8 Кислотный гемолиз эритроцитов оценивали по методу Терского И А и Гительзона ИИ (1967) на лазерном анализаторе агрегации «Биола», также оценивалась осмотическая резистентность эритроцитов

Механизмы гемобиологических свойств эноксифола исследовали по влиянию на деформабельность эритроцитов (Johnson RM , Ravmdranath Y , 1996) с помощью лазерного 1ифрактометричсского метода, заряд мембраны эритроцитов с использованием зонда ДСМ* (Добрецов ГК, 1989) на спектрофлуориметре HITACHI MPF - 400 (Япония), оксидативный гемолиз эритроцитов (Tsuchiva М et al, 7002), который вызывался 50мМ водо-рас творимым соединением АБАП (Fluka, Швейцария), который при t37°C разлагается, образуя пероксильные радикалы

Влияние эноксифота на микрогемодинамику изучалось с использованием одно-канального лазерного доплсровского флоуметра ALF-21 фирмы «Transonic System Inc» (США) с одновременной регистрацией уровня артериального давления в бедренной артерии электроманометром BPR-01 фирмы «Электрометрия» (Венгрия) Регистрацию локального мозгового кровотока (ЛМК) и артериального давления (АД) проводила синхронно на самописце OAF (Австрия; Также исследовалось влияние эноксифола на жизнеспособность тканей в условиях редуцированного кровообращения в изолированном кожном лоскуте (Любимов Б И и др , 1986)

Изучение фармакокинетики субстанции и лекарственной формы эноксифола проведено в соответствии с указаниями по проведению доклинических исследований фармакокинетики фармакологических веществ и лекарственных средств (Жердев В П и др, 2000)

Изучение безвредности субстанции и лекарственной формы эноксифола проведено в соответствии с требованиями Фармакологического Комитета МЗСР РФ (Фисенко B.II, 2000) и включало изучение общетоксикологических свойств препарата изучение острой токсичности, кумулятивных свойств и хронической токсичности (Арзамасцев Е В, 2000), а также исследование специфической токсичности перепарата- аллергизирующих свойств (Любимов Б И, 2000), репродуктивной токсичности (Любимов Б И., 2000), иммунотоксичности (Хаитов Р М и др., 2000).

Статистическую обработку данных проводили с использованием пакета программ Statistica 5 1 (StatSoft, США) и Excel 2000 (MS Office 2000, США) Проводился расчет базовых статистических показателей Поведенческие реакции анализировались с использованием дисперсионного анализа множественных сравнений и критерия Шеффе (р<0,05) Выживаемость оценивалась с применением двухстороннего точного метода Фишера Результаты биохимических исследований оценивали с использованием двуххвостового критерия Стьюдента с поправкой Бонферони (р<0,05) для сравнения 3-х и более экспериментальных групп, при распределении вариант, отличном от нормального - критерия Манна-Уитни

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Поиск антиоксидантных средств

Из 285 протестированных веществ (Таблица 1) наибольшее количество активных антиоксидантных соединений находилось в ряду N9 производных имидазо( 1,2-а)бензимидазола (36,1%), а также неконденсированных производных бензимидазота (28,5%), тогда как среди соединений N1 производных дшидро-ИМБИ антиоксидантных соединений не оказалось.

Прогноз активности соединений в ряду N9 производных имидазо(1,2-а)бенз-имидазола, проведенный в программе PASS, показал, что с большой долей вероятности вещества могут обладать антиоксидантной и антирадикальной активностью Ана-

лиз их структур позволил выявить, чго наибольшая достоверность прогноза этих видов активности отмечается у соединений, содержащих в структуре гидроксифениль-ный либо дигидроксифенильный радикалы Наряду с этим, при проведении прогноза был выявлен еще один вид активности, который достоверно прогнозируется более чем у 80% веществ - противоишсмическая ак тивность Данный вид активности у веществ с антиоксидантными

Таблица 1

Структурные формулы производных бензимидазола_

Группы веществ Общая структура Всего изучено Количество активных, %

Неконденсированные производные бензимидазола яз Г Г R1 28 28,5

К1 производные имидазо(1,2-а) бензимидазола R3 Г 1 "nx 62 4,8

N производные имидазо( 1,2-а) бензимидазола R3 N1 ! 1 -ЛХ R 1 122 36,1

М1 производные ди-гидро-имидазо( 1,2-а)бензимидазола R3 V 1 l| 'ИХ 7 0,00

Производные 2,3-дигидроимидазо (1,2 а) бензимидазола R3 ' Г I ^ / '"X \ R1 34 14,7

Производные тетра-гидропиримидо (1 2-а)бензимидазола R3 R1 32 18,7

свойствами вполне объясним, учитывая накопленные данные об активации СРО при ишемических процессах в тканях (Болдырев А.А , 1995, Дюмаев КМ м др., 1995, Love S , 1999), а 1акже использовании антиоксидантаых среде ib, в особенности водорастворимых при ишемиях (Hall Е D et al, 1998, Gulyas В et al, 1999).

При дальнейшем анализе «структура-антиоксидантная активность» с использованием программы «Микрокосм» 3 0а удалось выделить структурные дескрипторы, наличие которых в молекуле веществ с высокой долей достоверности может служить предиктором антиоксидангной активности К тким дескрипторам можно отнести наличие в молекуле трех центров дезактивации свободной радикальной плотности (1), метальные радикалы, соединенные между собой цепочками произвольной длины, чаще всего длинной 10 и более (2), -ОН группы, соединенные с ароматическим углеро дом цепочкой произвольной длины, где может присутствовать либо отсутствовать сопряжение (3), -ОН группа соседствующая с ароматической системой при наличии

сопряжения (4), -И3 в сочетании с ароматическим углеродным атомом, разделенный цепочкой произвольной длины (5) и две -ОН группы, разделенные цепочкой произвольной длины при наличии или 01сутствии в системе сопряжения (6)

Наиболее значимые дескрипторы антиоксидантной активности производных бензимидазола представлены (Таблица 2) Можно отметить, что дескрипторы 1-12

(апМ*.)

(апЬ-Н.)

'(апЬ-Р.)

Н3С-( -Оп-СНз где п>10

он— ( —)-

3

Л

I

:с

он^ис;

/г

Ч

С

-<с

он-

ч

-он

или ОН-(::::) —ОН

4 5 6

являются оригинальными, характерными для имидазо-бензимидазола и отсутствующими у известных антиоксидантных препаратов, тогда как дескрипторы 13-24 встречаются как среди бензимидазолов, так и среди известных препараюв Также среди оригинальных удалось выявить дескрипторы 6 и 8, относящиеся к солевому остатку

Таблица 2

Высокодостоверные признаки антиоксидантной активности конденсированных производных имидазобензимидазола (результаты по 38 активным «а» антиоксидантным

№ Структурный ¡Дескриптор дли-дескриптор 1 |ны цепи в связях Структурный дескриптор 2 Дескриптор связи в» ! рэ ' р„ 1 1 _ 1 .

1. >N11 1 3 -С(Аг)< 1 А 1 9 1 0 0,93 0,07

2. >Ь1Н | 1 -С(АгК а 1 6 0 0,91 0,09

3. >1МН 2 -С(Аг)< А 1 6 0 0,91 0,09

4. -Ы< 7 -ОН А 1 12 2 0,88 0,12

5 6 -ОН .АЛ 10 2 0,86 0,14

6 -№1к 1 -Вг' пО 13 4 0,83 0,17

7. 1 -ОН пО 6 , 1 0,84 0,16

8 -N11+= 1 -Вг' ,п1 15 4 0,85 0,15

9 -Ш+= 6 -011 .А 1 12 1 0,91 0,09

10. 5 -ОН АЛ 10 0 0,94 [0.06 ^

И 1 -он п1 6 0 0,91 Го,09

12 -ЫН+= 4 -он А 1 5 0 0,89 0,11

13. -ОН 2 -С(Аг)< а 1 54 6 0,93 0,07

14 -ОН 3 -С(Аг)< А 1 54 6 0,93 0,07

15. -ОН 4 -С(Аг)< А 1 42 4 0,94 0,0_6_,

16. -ОН ! 1 -С(Аг)< 1 27 3 0,92, 0 08

17 -ОН ! 1 СусАгОб 1 27 3 , 0,92 0,08

№ Структурный дескриптор 1 Дескриптор длины цепи в связях Структурный дескриптор 2 Дескриптор связи S. s„ Ра Р„

18. -ОН 5 -С(Аг)< А 1 22 3 0,91 0,09

19 -ОН 5 СусАг05 .АЛ 12 2 0,88 0,12

20. -ОН 6 -С(Аг)< .А 1 12 2 0,88 0,12

21. -ОН 4 СусАг05 А 1 10 1 0,90 ОДО

22 -ОН 3 -ОН а 1 7 0 0,92 0,08

23 -ОН 3 -С(Аг)< al 5 0 0,89 0,11

24 -ОН 3 СусАг05 а 1 5 0 0,89 0,11

в - число дескрипторов в классе активных и неактивных,

Р - Баесовская вероятность встречаемости дескриптора в классе активных и неактивных

Наряду со структурными группировками активность веществ определяют их физико-химические свойства Ишсстно, что конденсированные и некондексирован-ные производные бензимидазола являются полиядерными ароматическими соединениями (Анисимова В А., 1973; Пожарский А Ф., 1985), имеющими довольно сложную л--электронную систему, содержащую неспаренные электроны 1ак например, структура имидазо(1,2-а) бензимидазола имеет 14 я--электронную систему и две пары не-спаренных электронов на орбиталях, перпендикулярных 7г-сис1еме. Тто делас1 конденсированную систему "элекгроноизбыточной" и ле1ко атакуемой электрофильными частицами (Грандберг И И ,1980) Учитывая то, что заряд па атоме определяется наличием на этом атоме и ближайшем его окружении р и л--электронов для характеристики неравномерности распределения тс-электронной плотности на молекуле имида-зобензимидазола рассчитывалась сумма абсолютных величин зарядов

При проведении сопоставления антиоксидантной активносш с суммарным зарядом нам удалось выявить среди N9 производных имидазо(1,2-а)бензимидазола положительную корреляцию между суммарным зарядом всей молекулы, а также зарядом на радикале в положении С2, и их антиоксидантной активностью В частности, наиболее заряженным был диоксифенильный ра шкал у соединения РУ-185. которое демонстрировало высокую антиоксидантную активность То есть, производные имида-зо(1,2-а)бензимидазола обладают определенной я'-избыточностью что подтверждает полученные ранее данные о том, что они могут быть донорами эчекгронных пар, не являющихся частью ароматической л--системы (Анисимова В.А, 1973, Авдюнина НИ, 1979), а следовательно ингибировать свободно радикальные процессы

Еще одним свойством, для которого была выявлена корреляционная зависимость, стала типофильность замести!еля у второго атома углерода Было установлено, что вещества с наименее липофильным заместителем в положении С2 обладали более высокой антиоксидантной активность по сравнению с веществами с высоким показателем липофильности радикала

Таким образом, высокая антиоксидантная активность конденсированных производных бензимидазола может определяться сочетанием у этих веществ лг-избыгоч-ности в гетероциклическом ядре в фенольном или полифенольном радикале, а также низкой липофильностью 'лих радикалов

Все ото позволяет тать рекомендации для целенаправленною синтеза новых перспективных антиоксидантных веществ По ре!ультатам скрининга и анализа структур с использованием современных компьютерных технологий наиболее перспективными структурами для синтеза соединений, обладающих антиоксидантными свойствами, следует считать ^-производные имидазо(1,2-а)бензимидазота Вновь синтезируемые соединения должны характеризоваться высоким зарядом и небочыпой липофильностью замести!еля в положении С2 Включение в структуры вышеперечисленных дескрипторов также может привести к появлению антиоксидантной активности новых химических соединений После предварительною изучения антиоксидантной активности соединений данно! о ряда с различными заместителями в положениях С2 и N9 стало ясно, что наиболее целесообразно наличие в качестве боковых заместителей фенольных, а именно оксифенильных, диоксифенильных либо тиснильных заместителей у 2i о атома углерода, а наличие галогензачещенных фенольных радикалов наоборот приводит к снижению антиоксидангных свойств Прису1ствие диэтила миноэтильного заместителя у девятого атома азота также приводит к увеличению антиоксидантной актинвосги По солеобразующему остатку предпочтите и,нее, по всей видимости, бромис товодородные соединения

Антиоксидантные свойства наиболее активных веществ производных

бензимидазола и известных препаратов Поскольку сочетание вышенашанных свойств имеюсь у N9 производного имидазо(1,2-а)бензимидазола вещества РУ-185 (эноксифол) (№ юс регистрации 2431779), который может рассматриваться как водо-растворимый фенольный антиок-сидант, а также учитывая его низкую юксичность и высокий условный терапевтический индекс оно бы то выбрано для дальнейших исследований механизмов действия

Известно, чю фенолы являю 1ся активными ингибиторами СРО и позиционируются как вещества, обрывающие цепи (Прайор У . 1979, Bisby RH et al, 1996) В нашем случае речь идет о фенолах, у которых наличие дш идроксифенильного радикала, вероятно, приводит к тому, что энергия связи ОН снижается, и образующийся феноксильный радикал стабилизируется (Островский О В , 1996) В мировой практике наиболее изученными фенол ьными антиоксидантами являются токоферол, дибунол, пробукол Существует ряд их аналогов, например водо-растворимый аналог токоферола тролокс Спектр активности токоферола на сегодняшний момент достаточно полно изучен Известно, что он является основным перехватчиком ор1анических пе-роксильных (LOO*) радикалов, реагирует с гидроксильным (ОН"), алкоксильным (R0*), супероксидным (*02"), синглетным кислородом (J02), пергидроксильным (Н02) радикалами (Fukuzawa et al. 1988, 1992, Síes H , 1992) Тролокс, у которого боковая цепь заменена карбоксильной кислотой, аналогичен по спектру, но более активен, чем токоферол (Suarna С et al, 1992). Спектр действия дибунола также аналогичен токоферолу (Kahl R , 1992, Lambert et al , 1996) При этом дибунол несколько уступает токоферолу по антирадикальной акгивности (Kahl R, 1992), но превосходит ею по антиокислительной (Kahl R , 1992 Абрамченко В В , 2001) Для пробукота установлено, что он проявляет активность, сходную с токоферо юм и диб\'нолом, однако при этом есть данные, что он не взаимодействует с гидроксильным и супероксидным радикалами Clhomas В at al, 1992, Bisby RH et al, 1996)

В наших опытах мы получили сходные данные (Рис 1) а- [окоферот был высоко активен на модели с генерацией супероксидного радикала и при взаимодействии со свободным радикалом ДФПГ Дибунол уступал токофероту по способности пере-

хватывать данные свободные радикалы Кроме того, а-токоферол выражено hhi иби-ровал реакции аскорбат-зависимого, НАДФН-зависимого ПОЛ и подавлял ХЛ липи-дов, что согласуется с данными литературы (Abbey, 1993, Mambro VM et al, 2003). Дибунол был сравним с токоферолом по антиоксидантной активности, несколько уступая в тесте аскорбат-зависимою ПОЛ, но превосходя по влиянию на ХЛ липидов При этом он не влиял на НАДФН-зависимое ПОЛ Другой липофильный антиокси-дантпробукол проявил степень подавления реакций, сравнимую с дибунолом, однако, в отличие от дибунола ингибировр реакцию НАДФН-зависимого ПОЛ, что, возможно, объясняется наличием в молекуле по сравнению с дибунолом сразу двух экранированных фенольных радикалов.

Аскорбат-ПОЛ

7-г

LOO*

НАДФН-ПОЛ

дфпг' ~ * Супероксид

Токоферол

надфн-пол

ДФПГ 'Супероксид

Дибунол

Аскорбат-ПОЛ

Лй

LOO*

НАДФИ-ПОЛ

J-— ' \ > ДФПГ---Супероксид

Аскорбат-ПОЛ

ОН" + люмимол-PW

НАДФН ПО

Иробукол Тролокс

Рис. 1

Спектр антиоксидантной активности фенольных соединений По осям отложены величины -1^ИК50 (М)

Высокую активность проявил тролокс Он усгупал по антиоксидантной активности токоферолу и дибунолу в тесте аскорбат-зависимою ПОЛ, превосходя пробу-кол, тогда как ХЛ липидов тролокс подавлял сильнее токоферола, уступая лишь дибунолу По способности инактивировать ДФПГ тролокс уступал токоферолу Необходимо отметить, что тролокс проявил высокую антирадикальную активность на хемилю-минесцентных моделях, ингибируя образование АФК и пероксильных радикалов Водорастворимый аналог дибунола фенозан проявил активность только в отношении супероксидного радикала, при этом слабо инактивируя ДФПГ и не проявляя антиоксидантной активности

Результаты экспериментов свидетельствуют о высокой антиоксидантной активности нового соединения эноксифол (Рис 2) Эноксифол, лишь незначительно усту-

пая токоферолу по антиоксидантной активности на моделях аскорбат- и НАДФН-зависимого ПОЛ, превосходил его по влиянию на хемилюминесценцию липидов, а также был более активен по сравнению с другими фенольными антиоксидангами, имея более широкий спектр антиоксидантной активности По антирадикальной активности соединение эноксифол несколько ус гупало токоферолу, превосходя дибунол и тролокс по способности инактивировать супероксидные, ДФПГ и пероксильные радикалы Кроме того, для него была убедительно доказана активность в отношении супероксидного анион-радикала методом ксантин-ксантиноксидаза-индуцированной ХЛ в присутствии люцигенина. а также способность инактивировать другие активные формы кислорода В частности одним из таких радикалов явтяется гидроксильный радикал, который, как было показано (Оипау<1т В , Оетнуигек А Т , 2001), образуется в реакции железо-индуцированной ХЛ Было установлено, что активность эноксифола вряд ли обусловлена его хелагирующими свойствами, т.к дефероксамин. изучавшийся на моделях, где индуктором является железо, продемонстрировал низкую активность в достаточно высоких концентрациях Антиоксидантная активность соединения эноксифот может бьпь связана с тем чю в в положении у в юрою атома у1лерода имеется дигидроксифенилышй радикал Последний заместитель, очевидно, является более мощным ингибитором СРО, так как теоретически может терять оба протона из ОН групп с образованием пирокатехинового радикала (Барабой В А ,1984)

Аскарбат-ПОЛ 7»

ОН' + люминол-рад

надфн пол

^ Супероксид

ДФПГ

Эноксифол

Аскорбат ПОП

НАДФН ПОЛ

ОН* + люминол par

НАДФН-ПОЛ

loo-

Аскорбиновая кислота

Рис 2

Спектр антиоксидантной активности водорастворимых антиоксидан гов и нового соединения эноксифол По осям отложены величины -Lg ИК50 (М)

Мексидол, который относится к разряду водорастворимых антиоксидантов (Дюмаев КМ и др , 1995, Лукьянова Л Д, 1999), показал неодинаковый спектр активности. Так он демонстрировал высок\ю антирадикальную активность в реакции со

свободным радикалом дифенил-пикрилгидразилом, мало уступая а-токоферолу и превосходя дибунол При зтом мексидол проявлял слабую активность в отношении АФК, был мало активен в реакции с образованием супероксид-анион-радикала в ходе реакции окисления кверцетинва, что было подтверждено на модели ксантин-ксантиноксидаза-индуцированной XJI, и не инактивировал образование пероксильных радикалов, действуя лишь на вторичные радикалы люминола при АБАП-инду-цированной ХЛ На ход реакций аскорбат- и НАДФН-зависимою ПОЛ мексидол влияния пс оказал и очень слабо ингибировал хемилюминесценцию липидов

Актопротектор производное бензимидазола бсмитил по своей антиоксидантной активности был сравним с мсксидолом Он уступал по способности инактивировать супероксиданион-радикал дибунолу Кроме того, у бсмитила показано слабое антирадикальное действие, что согласуется с литературными данными (Середенин СБ, Дурнев АД, 1992) и отсутствие активности в отношении аскорбат и НАДН-инду-цируемого ПОЛ Производные бензичидазотов дибазол, этомерют и амтизол проявили слабую антирадикальную активность, не влияя на течение остальных реакций

Таким образом, все изученные вещества оказывают неодинаковую анти-оксидантную и антирадикальную активность на моделях с различным генезом свободно-радикальных реакций В основе этого феномена лежат различия в молекулярных механизмах действия веществ, а именно различный спектр в отношении свободно-радикальных реакций Для новых соединений производных имидазобензимидазола таким механизмом действия может быть непосредственное взаимодействие с радикалами по схеме.

ROO' ROOH

+ IH -> +1 ,

R RH

где ROO' - псрекисный радикал. R' - свободный радикал, ROOH -гидроперекись, RH - жирная кислота, III - ишибигор, Г - малоактивный радикал ишибитора, что характерно также и для других фенольных соединений

Предложенный набор методов скрининга, прогноза и выявления основных структруных дескрипторов с последующим изучением механизмов действия новых веществ явтяется достаточно информативным Последовательное использование непрямых и прямых методов исследования свободно-радикальных процессов позволяв изучить ангиоксидантную активность и механизмы действия веществ путем исследования их взаимодействия с супероксидными гидроксильными и различными органическими пероксильными радикалами

Так установлено, что эноксифол может peai ировать с пероксильными радикалами липидов (LOO-) на стадии обрыва цепи, о чем косвенно свиде1ельствует его высокая ингибиторная активность при аскорбат-, НАДФН-индуцируемом ПОЛ и хеми-люминесценции липидов, а так же прямо инактивировать супероксидные ('Од'), гид-роксильные (ОН*) и пероксильные (ROO") радикалы, которые инициируют окисление, что продемонстрировано в реакциях со свободным радикалом дифенил-пикрилгидразилом окисления кверцетина, железо-индуцируемой хемилюминесценции в присутствии люмино ia, ксантин-ксантиноксидаза-индуцируемой люцигенин-зависимой ХЛ, а также при термическом разложении водо-растворимо! о соединения 2,2'-азобис(2-метилпропионамидин)дигидрохлорида с высвобождением пероксильных радикалов Инактивируя свободные радикалы, эноксифол, тем самым, снижает общую

скорость окисления за счет уменьшения суммарной скорости инициирования Проведенные исследования стали основой для дальнейшего изучения фармакодинамиче-ских свойств соединения «эноксифол»

Фармакодинамические свойства соединения эноксифол Фармакодинамические свойства эноксифола были изучены при различных свободно-радикальных патологиях на моделях острой и хронической гипоксии-ишемии у крыс с экспериментальным диабетом, а также при эпдотоксикозе, моделирующем ДВС синдром Важным представлялось изучить влияние эноксифола на показатели ПОЛ и антиоксидантной системы у крыс с экспериментальными патологиями Сравнение эффектов эноксифола с известными антигипоксантами, противоишемическими средствами и антиоксидантами позволило установи 1ь его практические ценные свойства, отличающие его от препаратов сравнения

Противогипоксические эффекты эноксифола и препаратов сравнения Полученные результаты свидетельствуют о высокой противогипоксической активности эноксифола на различных моделях острой гинобарической, гемической и гистатоксической гипоксии в дозах 1-10 мг/кг, тогда как препараты сравнения проявили активность в больших концентрациях При этом немаловажным отличием эноксифола является его высокая активность на модели тканевой гипоксии Важной особенностью спектра противогипоксического действия эноксифола является защитное действие у животных с разной фенотипической устойчивостью к шпоксии, который превосходил по влиянию как на низко, так и на высокорезистентных крыс большинство препаратов сравнения Было установлено (Рис. 3), что эталонный препарат гути-мин (50 мг/кг) проявил высокую противогипоксическую активность у НУ крыс с коэффициентом защиты (Кз) 4,08 (р-"0.05). однако у ВУ крыс защитный эффект гутими-на оказался относитетьно умеренным (Кз=1,57 (р<0,05) Эноксифол по защитному действию, несколько уступал гутимину в группе НУ крыс (Кз 2,31, р<0,05), но значительно превосходило его в группе ВУ животных (Кз 4,41, р0,05). Жирорастворимые антиоксиданты дибунол (50 мг/кг) и пробукол (20 мг/кг) уступали препарату сравнения гутимину по действию на НУ животных, в то время как в группе ВУ крыс их эффекты были сравнимы с эффектом гутимина (Кз=1,41 и 1,21, соответственно)

Рис. 3

Влияние веществ при острой гинобарической [ипоксии у животных с разной фенотипической устойчивостью к гипоксии

Таким образом, полученные результаты свидетельствуют о выраженном проти-вогипоксическом действии соединения эноксифол Его отличительными от препаратов сравнения особенностями являются высокая эффективность на модели i кансвой гипоксии, реализация эффектов в гораздо меньших чем у препаратов сравнения дозах, а также защитное действие у животых с разной фенотипической устойчивостью к гипоксии При этом существующие данные свидетельствуют о том, что защитное действие, как правило, вообще отсутствует у высокорезистентных к гипоксии животных и может достигать значительных величин у неустойчивых особей (Лукьянова Л.Д ,1989) Это подтвердилось в наших опытах с |утимином, который был самым активным препаратом в группе НУ животных и слабо действовал на ВУ крыс

Наряду с поиском средств фармакологической коррекции гипоксических состояний актуальным является создание и применение средств, которые moi ли бы устранять не только фактор гипоксии, но и нарушения в ходе последующей реоксигена-ции Целесообразность применения антиоксидантов в комплексном лечении реокси-генационных повреждений не вызывает сомнений, учитывая активацию ПОЛ при ре-оксигенации, рассматриваемую как крайне неблагоприятное явление (McCord J M, 1993) Так в постгипоксическом периоде отмечено достоверное изменение всех исследуемых показателей В среднем мышечная сила снижалась на 28%, локомоторная активность - на 70%, изменялась поведенческая активность в гесте ОП: латентный период выхода из центра увеличивался на 126%, горизонтальная активность снижалась на 66%, поисковая активность - на 58,3%, а вертикальная - на 77% Мнестические функции ухудшались в среднем на 50% по отношению к норме Всс перечисленные факты, несомненно, свидетельствуют о значительных нарушениях в рефлекторной, когнитивной и других функциях высшей нервной деятельности в постгипоксическом периоде.

Эноксифол (5 мг/кг в/бр) нормализовал мышечную силу передних лап крыс после гипоксии, увеличивал в 3,5 раза (p¿0,05) двигательную активность по отношению к контрольной группе после гипоксии, снижал латентное время выхода из центра в ОП в 9,6 раза (р<0,05) Он имел тенденцию улучшать память крыс после гипоксии по сравнению с контролем Этомерзол (50 мг/кг) увеличивал локомоторную активность крыс в 2 раза по отношению к контролю, нормализовал мышечную силу передних лап, увеличивал количество пересеченных квадратов в 2,3 раза. Имелась тенденция к снижению латентного времени в тесте ОП под действием препарата, незначительно улучшались данные УРПИ В ю же время имелась тенденция к снижению заглядыва-ний в отверстия а вертикальная активность по отношению к контролю не изменялась Мексидол (40 мг/кг) оказывал менее выраженное действие, чем два предыдущих препарата Он нормализовал латентное время в тесте УРПИ, незначительно увеличивая двигательную активность в аклометре, и снижал латентное время в ОП. Дибунол (50 мг/кг) и пробукол (20 мг/кг) при трехкратном профилактическом введении статистически значимо повышали в 1,8 раза мышечную силу животных, а также увеличивали латентное время в тесте УРПИ в 5,2 раза по отношению к группе ''i ипоксия"

Разработанная нами для сравнительной оценки гипоксических повреждений и эффективности лекарственных вещеов система баллов позволяла оценивали выраженность гипоксических повреждений По разности в суммарной оценке повреждений между группами "гипоксия" и "препарат" опредетяли величину защитного эффекта Таким образом, по силе защитного действия в постгипоксическом периоде, всс

исследованные препараты можно представить в следующей последовательности по убыванию (Рис 4) этомерзол > эноксифол > пробукол > мексидол > дибунол

Для выяснения механизмов защитного действия эноксифола и этомерзола, было проведено изучение их влияния на процессы перекисного окисления липидов в рсок-сигенационном периоде Было показано, что в постгипоксическом периоде достоверно увеличивается в мозге, где так же имеется тенденция к увеличению шиффовых оснований, и это, несомненно, отражает активацию свободно-радикального окисления в целом В многочисленных исследованиях было показано, что активация ПОЛ обычно протекает на фоне снижения активности антиоксидантной системы мозга (McCord J.M., 1985, Меньшикова ЕБ и др , 1997) В наших опытах происходило снижение уровня восстановленною глутатиона вследствие имеющего место подавления глута-тионредуктазной реакции (Jamieson D , 1989), хотя достоверного снижения

Защитное действие % □ Эноксифол, 5 мг/кг

во 50 40 30 20 10 о

Рис.4

Действие веществ на восстановление в период рсоксигенации после острой i ипобари-ческой гипоксии (% к контролю)

активности глутатионпероксидазы зафиксировано не было Активность антиокси-дантных ферментов каталазы и супероксиддисмутазы в постгипоксическом периоде снижалась Антиоксидант эноксифол достоверно уменьшал накопление МДА в крови у животных после [ипоксии, подавлял аскорбат-зависимое ПОЛ, что видимо, является следствием активации веществом суммарной антиоксидантной активности организма Это подтверждалось при дальнейшем изучении, где было отмечено нормализующее действие эноксифола на метаболизм глутатиона, который возрастал в мозге на 32% по сравнению группой «гипоксия» и увеличение под его влиянием активности ферментов ГП и СОД В отличие от эноксифола, противогипоксическое действие этомерзола практически не сопровождалось изменениями в уровне продуктов ПОЛ и активности антиоксидантной системы

Дополнительный фармакологический анализ с использованием прооксиданта адриабластина (10 мг/ki в/бр) (Нурмухомбетов АН и др , 1978) позволил подтвердить наличие антиоксидантного компонента в механизме нротивогипоксическою действия эноксифола, который снижал отрицательный эффект адриабластина на локомоторную активность и поведенческие реакции и улучшал когнитивные функции высшей нервной деятельности животных на фоне адриабластина в постгипоксическом периоде

С практической точки зрения важным помимо из>чения аспектов острой гипоксии является изучение процессов, сопровождающих хроническую гипоксию, которая встречается не менее часто, чем острая. Одной из распространенных форм хрониче-

0 Этомерзол 50мг/кг 0 Мексидол 40мг/кг ВДибунол 50мг/кг И Пробукол 20мг/кг

ской гипоксии является гипоксия плола Согласно современным представлениям любое неблагополучное течение беременности у матери для плода трансформируется, прежде всего, в гипоксию (Шабалов Н II, 1997) Нами была разработана модель хронической внутриутробной гипоксии, где оценка степени эффективности изучаемых препаратов базируется на основной клинической картине гипоксических повреждений, а также включает изучение показателей ПОЛ, как одного из важных патогенетических моментов каскада 1 ипоксических нарушений Проведенные на этой модели исследования показали, что на фоне пренатальной гипоксии на 12,69% увеличивалась общая эмбриональная гибель (за счет увеличения на 49,62% гибели после имплантации), и, соответственно, снижалась выживаемость плодов Причем среднее количество плодов на один помет было уменьшенным на 5,74% в группе гипоксии При регистрации соматических показателей установчено, что гипоксия приводила к снижению массы плодов и кранио-каудального размера, что согласуется с данными (Уткина Л И , Тимошин С С , 1990), указывающими, что у эмбрионов, подвергавшихся кислородному голоданию, наблюдается замедление развития При изучении действия пренатальной гипоксии на плацентарные показатели установлено, что происходило достоверное снижение показателей массы, объема и площади плаценты на 20,00%, 21,74% и 13,98%, соответственно, что сопоставимо с литературными данными, свидетельствующими, что снижение массы плаценты зависит от длительности патологического процесса, а уменьшение площади от степени тяжести Таким образом, в условиях экспериментальной внутриутробной гипоксии наблюдалось снижение выживаемости, задержка внутриутробного роста и изменение плацентарных показателей, свиде тельствующих о развитии плацентарной недостаточности, что, по дачным литературы, характерно для хронической внутриутробной гипоксии средней и тяжелой степени тяжести. Было показано, что пренатальная гипоксия сопровождалась интенсификацией свободно-радикатьных процессов по сравнению с контрольной группой Так конечный продукт ПОЛ - МДА достоверно увеличивался в мозговой ткани, в печени и в легких матери и плода Это сопровождалось изменениями активности ферментов антиоксидантной защиты, что выражалось в снижении активности ГП в исследуемых органах матери и плода Активность кагадазы снижалась в печени матери и в органах плода. Так в мозговой ткани плода активность кагалазы оказалась сниженной на 12,76%, в печени плола на 36,82%, в печени магери фермент достоверно снижался на 15,13% Активность СОД в органах повышалась, что, видимо, носило компенсаторный характер

При изучении влияния антиоксидантньгх веществ на пренатальные показатели при моделировании хронической внутриу гробной гипоксии плода было установлено, что наиболее выраженным корригирующим эффектом обладало соединения энокси-фол (10 мг/кг) (Рис 5), пробукол (50 мг/кг) уступал по степени выраженности эффекта по основным регистрируемым показателям (прибавка массы за беременность, общая эмбриональная гибель и гибель после имплантации, антропометрические ггоказатели плода), тогда как мексидол (50 м|/кг) не проявил существенного втаяния па изменения этих показателей под действием гипоксии, за исключением вчияния на постим-плантационую г ибсль

ОПробукол 0 Эноксифол ИМексидол 22 2"

Масса Объем nn^ilifp^

плаценты пгаценты плаценты

р<0,05 к контролю

Рис. 5

Действие веществ на пренагальное развитие плодов крыс с хронической внутриутробной гипоксией (% к гипоксии)

Эноксифол при хронической внутриутробной гипоксии вызывал снижение уровня МДА, причем наиболее выраженным этот процесс оказался в мозге плода и печени матери Активность каталазы при этом увеличивалась Необходимо отметить, что при курсовом введении эноксифола существенно активировались антиттерскисные ферменты каталаза и IП в мозговой ткани по сравнению с группой контроля (гипоксии). Пробукол вызывал снижение уровня МДА в тканях плаценты и органах плода, причем в печени и легких плода это было статистически достоверно, увеличивал активность СОД и каталазы так же в основном в органах плода, чго по всей видимости связанно с его высокой липофильностью и скоростью прохождения через плацентарный барьер Применение мексидола в условиях гипобарической гипоксии привело к снижению МДА лишь в мозговой ткани матери и плода, что соответствует данным литературы (Дюмаев К M и соавт , 1995) При анализе ферментативных изменений на фоне мексидола, у крыс подвергавшихся гипоксии следует отметить, что активность СОД не изменялась, чго согласуется с данными Зорькина А В и др (1998), а антипе-рекисные ферменты по большинству показателей снижались

Изучение >ффективности эноксифою при иеребральных ишемиях Еще одним важным с практической точки зрения аспектом применения антиги-поксантов-антиоксидантов является возможность их использования при нарушениях мозгового кровообращения как в осгрой фазе ишемии, так и в период реперфузии В наших опытах острая ишемия мозга, вызванная двухсторонней окклюзией сонных артерий приводила к гибели 70-80% животных в течение 72 часов после ишемии Эноксифол оказывал выраженное защитное действие в осгрую фазу ишемии как при внутрибрюшинном, так и при пероральном введении, превосходя по эффекту известный противоишемический препарат кавингон (Рис 6)

С целью более детального изучения противоишемических свойств эноксифола была проведена оценка его влияния на восстановтение неврологического статуса, когнитивных и мнестических функций животных в период реперфузии тканей после тотальной ишемии мозга с оценкой состояния ПОЛ

В реперфузионном периоде у каждого четвертого животного наблюдалось значительное повышение локомоторной активности в актометре в 1-е сутки в 3,1 раза, во 2-е сутки в 2,2 раза, и к 3-м суткам все такие крысы погибали У большинства животных отмечалось выраженное угнетение двигательной активности на 87 и 82 % в 1 -е и 2-е сутки соответственно В этой группе летальность составляла 37,5%

<50 S •200

□ Эноксифол/2мг/кг В Эмоксифол/5мг/кг ЯКавинтон/1 6мг/кг 'В Кавинтон/3 2МГ/КГ

р<0,05 к ишемииЗ*

m

48

72

часы

Рис.6

Действие веществ на выживаемость крыс после билатеральной окклюзии сонных артерий (%)

Период ренерфузии сопровождался выраженными нарушениями поведенческих реакций в «открытом поле» во всех сериях исследований, выражавшимися в значительном увеличении на 3-й сутки наблюдений латентного времени выхода из центра ринга примерно в 14 раз по сравнению с ложнооперированными крысами, уменьшении в среднем в 9 раз горизонтальной, поисковой и вертикальной активности У животных, перенесших ишемию-реперфузию, отмечено появление значительного неврологического дефицита и снижение мышечной силы лап Наиболее выраженные изменения наблюдались на 3-е сутки. В дальнейшем следовало некоторое улучшение, обусловленное восстановлением некоторых неврологических рефлексов, таких как рефлекс отдергивания задней лапы, хвоста, хватания передними лапами Однако, даже к 7му дню наблюдений у крыс с реперфузией не происходило полного восстановления неврологического статуса Они хуже запоминали обучающее задание в тесте УРПИ либо быстрее забывали его, чем ложнооперированные животные, что проявлялось сокращением в 11 раз (р<0,05) латентного времени захода в темную камеру.

Под влиянием эноксифола (5 мг/кг в/бр за 10 мин до пережатия окклюзоров) значительно ускорялось восстановление реперфузионных нарушений. При этом многие показатели ВИД крыс, в частности неврологический статус (Рис 7), практически нормализовались Более toi о, увеличивалась выживаемость животных, что согласуется с данными Л M Гаевой (1990) о перспективности создания на основе этого вещества церебропротективного препарата Необходимо также отметить, что изучаемое средство, не уступая по эффективности этомерзолу (50 мг/кг) при оценке двигательной активности и влиянию на функции памяти, значительно превосходило его по восстановлению неврологического дефицита и мышечной силы крыс, перенесших ишемию-реперфузию, а также превосходило анзиоксидант дибунол (50 мг/кг трехкратно в течении 3 дней до ишемии) по всем показателям

Для подтверждения данных об антиоксидантных механизмах действия эноксифола при ишемии в о ¡дельной серии исследований изучались процессы ПОЛ у крыс в реперфузионном периоде Было показано, что в раннем реперфузионном периоде происходила дестабилизация АОС и нарастание продуктов ПОЛ Эноксифол оказывал стабилизирующее действие на процессы СРО, нормализуя уровень МДА и активность антиоксидантных ферментов (Рис. 8)

- • - Ишемия

-70 00

С/тки после ишемии

Рис 7

Влияние соединений на неврологический дефици г > крыс после тотальной ишемии мозга с реперфузией (%)

МДА ГП СОД Каталаэа

0*0 05 * - к контролю " - к ишемии

Рис. 8

Влияние эноксифола на перекиснос окис ¡ение типидов и антиоксиданшуто сисгем> мозга крыс после гогалыюй ишемии мозга с реперфузией (%)

Действие эноксифола на ПОЛ при жепериментальном сахарном диабете

Было установлено, что сформировавшийся к третьему дню эксперимента тяжелый диабет с уровнем глюкозы 16,4 мМ сопровождался активацией перекисною окисления, о чем свидетельствовало увеличение МДА во всех изученных органах Наиболее выраженные изменения отмечались в печени, где количество продукта возрастало на 37,8% по отношению к контрольным показателям Параллельно происходило снижение АОС, что выражалось в уменьшении активности основных антиокси-дантных ферментов - глутатионпероксидазы и супероксилдисмутазы Так происходило достоверное снижение ГП на 46,3% в мозге диабетических крыс, а в печени и поджелудочной наблюдалась тенденция к уменьшению активности ГП на 21,5 и 48,5%, соответственно Активность СОД достоверно снижалась в печени на 14,9% и в поджелудочной железе на 47,2% Введение эноксифола (5 мг/кг) профилактическим курсом (в течение грех суток ло введения аллоксана) привело к нормализации показателей. Эноксифол снижал уровень МДА в органах крыс с диабетом, восстанавливая показатель до нормальных величин Стабилизирующее действие эноксифола выражалось также в восстановлении активности антиоксидантных ферментов Уровень глюкозы под влиянием эноксифола уменьшался на 35,9%, но данные не носити достоверный характер

20 10 ■

8 5

О Диабет □ Эноксифол

-20 3

-41 3'

-27 5

-48 6'

* - р<0,05 к контролк?*

ГП

СОД

Рис 9

Влияние эноксифола на ПОЛ поджелудочной железы крыс с экспериментальным сахарным диабетом (%)

Эффективность эноксифола при экспериментальном ДВС-синдроме

Было установлено, что эндотоксемия сопровождалась изменением неврологических реакций животных свидете гьствующих о токсическом действии ЬРБ-токсина Через 4 часа возникало достоверное снижение на 26.8% мышечной силы, усугублялся неврологический дефицит в результате снижения рефлексов отдйргивания задней лапы, переворачивания, хватания и вздрагивания на звуковой раздражитель

В ежпеме гемостаза возникати характерные для ДВС-синдрома изменения Через 1 час после введения ЬРБ-токсина появлялась тенденция к увеличению степени агрегации, на 11% увеличивалось число активированных тромбоцитов и на 34% возрастал уровень фибрино!ена Через 4 часа наблюдалось резкое снижение функциональной активности тромбоцитов агрегация тромбоцитов достоверно снизилась на 89,6%, отмечалась выраженная тромбоцитопения. сопровождавшаяся уменьшением числа активированных форм на 50%. Уровень фибриногена также снижался на 45,7% Изучение параметров тромбоэластограммы выявило тенденцию к их сдвигу в сторону гиперкоагуляции к 1-му часу эндотоксемии Достоверно изменялись показатели, указывающие на активацию плазменных факторов свертывания крови Время коагуляции укорачивалось на 25,4%, индекс тромбодипамического потенциала увеличивался в 1,85 раз, а тромбоэласгографический индекс уменьшался в 2,7 раз К 4-му часу эндо-юксемии максимальная амплитуда уменьшатась на 53.4%, время реакции и время коагуляции удлинялись на 81 7% и 100,7% соответственно, ветичина индекса громбо динамического потенциала снижалась в 9,2 раза а тромбоэтастографического индекса увеличивалась в 8,4 раза Появлялась тенденция к нормализации показателей, характеризующих фибринолитическую активность крови, что на фоне изменения остальных параметров тромбоэластограммы, указывающих на выраженную гипокоагуля-цию, может свидетельствовав о начинающейся депрессии фибринолиза

При этом ЬР5-интоксикация сопровождалась активацией ПОЛ Изменение продуктов ПОЛ в печени и крови происходило неоднозначно В печени через уровень МДА нарастал к 4му часу после введения 1_Р8-токсина, и прирост составлял 24,2%. тогда как в крови его уровень достигал максимума уже через 1 час, а чере! 4 часа после введения ЬР8-токсина количество малонового диачьдегида нормализовалось Отмечались изменения активности антиоксидантной системы в печени крыс Активность ГГ1 достоверно возрастала к 1 часу, при этом активность фермента превышала ее у интактных животных в 1,5 раза, а через 4 часа активность ГП нормализовалась Ак-

тивность каталазы повышалась через 1 час и оставалась повышенной через 4 часа после интоксикации Наиболее отчетливо пол влиянием LPS-токсина изменялась активность СОД, которая достоверно уменьшалась через 1 час на 28,7% и к 4 часу эндоток-семии активность СОД оставалась сниженной на 56,8% (р<0,05)

Эноксифол вызывал восстановление неврологического дефицита, в основном за счет нормализации рефлекса переворачивания, и мышечной силы крыс Дибунол действовал на данные показатели аналогично При этом эноксифол ослаблял повреждающее действие эндотоксина на громбопиты Это выражалось в отсутствии гиперактивности тромбоцитов через 1 час после введения LPS- токсина, напротив имело место снижение их способности к агрегации на 70,8% Уровень фибриногена несколько снижался, а число активированных тромбоцитов увеличилось. Через 4 часа после введения LPS-токсина стабилизирующее действие эноксифола на тромбоцит арный гемостаз сохранялось При предварительном введении эноксифола LPS-токсин не вызывал характерных для ДВС-синдрома изменений коагуляционного потенциала Так через 1 час после введения LPS-токсина параметры тромбоэластограммы незначительно изменялись в сторону гипокоагуляции (время реакции и время коагуляции удлинялись на 26,3% и 32,2%) соответственно, максимальная амплитуда уменьшалась на 17% (р<0,05), индекс тромбодинамического потенциала уменьшался в 1,7 раз, а тромбо-эластографический индекс возрастал в 1,9 (р<0,05) К 4-му часу эндотоксемии указанные показатели полностью нормализовались Дибунол изменял параметры сосуди-сто-тромбопитарного звена гемостаза в том же направлении, что и эноксифол, но несколько в меньшей стеггени, а его влияние на коагуляционннй гемостаз животных было сравнимо с влиянием эноксифола

Эноксифол нормализовал систему ПОЛ. активированную эндотоксином и оказывал стабилизирующее действие на антиоксидантную систему печени. Так уровень МДА достоверно снижался под его влиянием как в печени, так и в крови соответственно на 29,8% и 21% относительно 4 часа эндотоксемии Изучаемое вещество достоверно нормализовало активность СОД, сниженной под влиянием LPS-токсина. Аналогично действовал и дибунол

Таким образом, фармакодинамические эффекты эноксифола были детально изучены при ряде свободно-радикальных патологий, таких как гипоксии-ишемии мозга и реоксигенациоиный-рсперфузионный период, хроническая гипоксия плода, сахарный диабет, а также ДВС-синдром При этом сравнение эноксифола на данных моделях с эталонными препаратами позволило установить практические достоинства эноксифола, отличающие его от известных средств Механизм действия соединения достаточно полно объясняется его антиоксидантньгми и антирадикальными эффектами Наряду с этим, анализируя полученные данные, можно заметить, что в патогенезе всех вышеперечисленных состояний помимо активации ПОЛ важное место занимают нарушения реологических свойств крови, как правило, влекущие нарушения микрогемодинамики

Гемобиологические свойства соединения эноксифол

Учитывая полученные данные о влиянии эноксифола на агрегацию тромбоцитов и коагуляционное звено гемостаза при ДВС-синдроме, а также имеющиеся данные об антиагрегантных свойствах производных имидазо-бензимидазоча (Турчаева АФ, 1995), целесообразным было более детальное изучение гемобилогической активности соединения эноксифол как в норме, так и при свободно-радикальных патологиях Комплексную оценку гемобиологической активности эноксифола проводили

на моделях с синдромом повышенной вязкоеiи крови (СПВК), когда имеет место резкое нарушение реологических свойств крови с последующим значительным ухудшением перфузии микрососудов органов При этом в механизме нарушений при СПВК лежит усиление агрегации не только тромбоцитов, но и эритроцитов на ряду со снижением их пластических свойств, уменьшением электроотрицательное!и мембран эритроцитов и усилением процессов перекисного окисления.

Изучение влияния эноксифола на гемореологию крови in vitro

При изучении влияния эноксифола на агрегацию тромбоцитов in vitro, индуцированную 5 мкМ АДФ, было установлено, что эноксифол, ЭК50 которою составила 3,3х ] 04 М, превосходил препараты сравнения ацетилсалициловую кислоту, дибунол и мексидол по активности Детализация механизмов антиагрегантного действия эноксифола показала (Рис 10), что эноксифол дозозависимо ингибировал агрегацию, индуцированную АДФ в различных концентарциях как в плазме кролика, так и в плазме человека, причем более выраженным бы то ингибирующее влияние на тромбоциты человека Вясокую антиагреган гную активность эноксифол продемонстрировал при действии на агрегацию тромбоцитов, индуцированную коллагеном и ФАТ

120 % " *онтролю □ Эноксифол ЮОмкМ ■ Эноксифол ЮмкМ 0 Эноксифол 1мкМ

5мкМ АДФ 1мкМАДФ 0 5мкМ Адреналин ФАТ Коллаген Перекись АДФ водорода

* р<0 05 к контролю

Рис 10

Влияние эноксифола на агрегацию тромбоцитов т vitro, вызванную различными индукторами (М±т)

Универсальное атиагрегантное действие при применении различных индукторов агрегации тромбоцитов может свидетельствовать о том, что эноксифол не является блокатором определенного вида рецепторов, а, по-видимому, изменяет чувствительность всех мембранных рецепторных систем в результате непосредственного влияния на мембрану тромбоцитов, что вероятно, обусловлено ei о высокой антиокси-дантной активностью и подтверждается эффективным ингибированием агрегации тромбоцитов, вызванной перекисью водорода, механизм проагрегашною действия которой связан с образованием АФК

Изучение реологических свойств эноксифола в постишемическом периоде у крыс. Учитывая большое количество микроциркуляторных расстройств, вызванных ишемическими повреждениями было проведено изучение влияния эноксифола на реологические параметры при экспериментальном воспроизведении ишемически-реперфузионного поражения головного мозга у крыс У ишемизированных крыс произошло достоверное изменение основных реологических параметров - деформабель-ности и агрегации эритроцитов, что выражалось в увеличении вязкости крови нри вы-

соких и низких скоростях (Рис 11 Л) и свидетельствует о развитии экспериментального СПВК Было выявлено достоверное увеличение агрегации тромбоцитов в ишеми-зированной группе на 64.22% уменьшение осмотической и кислотной резистентности эритроцитов на 53,19 и 9,34%, соответственно (Рис 11Б) Было показано, что при практически равном влиянии эноксифола (5 мг/кг в/в) и пентоксифиттина (4 мг/кг в'в) на деформабельность эритроцитов при высоких скоростях сдвига, эноксифо I превосходил пентоксифиллин по влиянию на процессы агрегации эритроцитов при низких скоростях сдвига Все эю сопровождалось у эноксифола выраженными мембранопро-текторными эффектами Эноксифот превосходил препарат сравнения по уменьшению выраженности нарушений осмотической и кислотной резистентности эритроцитов при ишемии Наряду с этим эноксифо 1 был сравним с пснтоксифил таном по коррек тируюшему влиянию на состояние гиперагрегации тромбоцитов после ишемии-реперфузии головного мозга

Изучение реологических свойств эноксифола у крыс с экспериментальным сахарным диабетом. Другой использованной нами моделью стала модель экспериментально! о диабета, т к ведущей причиной инвалидности и смертности, ботьных диабетом является прогрессирование диабетических микроапгиопатий,

дел 60»/

50

40

30

20

10

о А

Рис. 11

Влияние эноксифола и нентоксифиллина на вязкость крови (А), агрегацию эритроцитов и тромбоцитов и гемолиз зригроцитов (Б) у крыс после ишемии-реперфузии головного мозга (%),* - р<0,05 по отношению к контролю

связанное с гемореологичекими нарушениями (Балабо 1кин МИ, 1998) Исследования, проведенные при моделировании тяжелой формы сгрегггозотоцинового сахарного диабета (содержание гтюкозы в крови более 17 ммоль/л) позвотили выявить статистически значимое увеличение показателей вязкости крови в группе крыс с сахарным диабетом по отношению к здоровым животным во всем диапазоне скоростей сдвига (Рис. 12А), что свидетельствует об изменениях в деформабельнос ти и процессах агрегации эритроцитов Достоверно уветичивалась АДФ-индуцированная агрегация (Рис 12Б), а также достоверно снижались показатели механических свойств эритроцитов о чем свидетельствовало снижение кислотной резистентности на 22,7%, а процент осмотического гемолиза уветичился на 79% (р<0,05)

Иишемия □ эноксифол Ипемтоксифиллин

Кислотный гемолиз

Осмотический гемолиз

скорость сдеига 1/с

□ Контроль НДиабет

80 ,

НДиабет

ОЭноксифол

аПентоксифилрии

14

60

Я

а 40

20

0 я™ "И»

Индекс 20 агрегации эритроцитов

О т-

200 100 20 5 скорость сдвига, с 1

Б

Рис. 12

Влияние эноксифоча и пентоксифиллина на вязкость крови (А), агрегацию эритроцитов и тромбоцитов и гемолиз эритроцитов СБ) у крыс с диабетом (%), * - р-^0,05 по отношению к конгролю, ** - р<0.05 по отношению к диабету

При этом эноксифол снижал вязкость на 17% при высоких скоростях сдвша, и на 23% при низкосдвиговых значениях Устойчивость эритроцитов к действию соляной кислоты у эноксифола на 9% превышала диабетический контроль, практически нормализуя их Осмотическая резистентность эритроцитов у животных, под действием эноксифола, снижалась па 63%, что свидетельствует о значительном повышении процента устойчивости эрифоцитов к гемолизу Препарат сравнения был лишь на 16% эффективнее диабетического контроля Снижение степени гемолиза, под влиянием соединений, свидетельствует об увеличении степени торроидальности, т е уменьшения соотношения площади и объема клетки, с образованием кренированных и кап-форм эритроцитов.

Механизмы гемобиологической активности эноксифола

Для детализации механизмов Iемобиологических свойств эноксифола исследовали его влияние на деформабе (ьность и заряд мембраны эритроцитов, влияние соединения на оксидативный гемолиз эритроцитов

Как известно, одним из механизмов нарушения деформируемости форменных элементов является повышение микровязкости их мембран при активации ПОЛ (Веауеп б Н , Раешас 1, 1990) Современные методы исследования позволяют с высокой достоверностью изучать мембранные свойава форменных элементов крови В частности, использованный в наших исследования лазерный дифрактомегрический метод является наиболее адекватным для оценки способности клеточных элементов крови к деформации в условиях кровотока в сосудистой сети2 С помощью метода эк-тацитометрии возможно измерение не только интегральной деформируемости эритроцитов, но и различных клеточных факторов, участвующих в формировании их деформационных свойств (степени терроидатьности, о > ношение площади мембраны к объему клетки, жесткое I и мембраны и внутренней вязкости) (Сторожок С А , 199!) В

2 Исследования выполнены совместно с к б н , с и с лаборатории сравнительной биохимии ферментов Института эволюционной физиологии и бихимии им И М Сеченова РАН (Санкт-Петербург) Л Н Катюхиным Выражаем ему искреннюю благодарность за помощь в проведении исстедований

наших исследованиях было выявлено увеличение индекса деформируемости эритроцитов в крови здоровых доноров под влиянием соединений эноксифол и пентокси-филлин, отмечаемое в гиперосмолярной области осмоскана, что свидетельствует о снижении под их влиянием осмотической хрупкости эритроцита, уменьшении жесткости мембраны эритроцитов и линейного смешения степени торроидальности (Ка-тюхин Л Н., 2000) Кроме того, было установлено, что деформабельность эритроцитов здоровых доноров существенным образом отличалась от таковой у больных, перенесших в анамнезе острое расстройство мозгового кровообращения Изученные показатели, при осмолярности среды 273, 319, 449 мОсм/л, показали снижение значений индекса на 31; 40; 36 %, соответственно При этом активность эноксифола превышала активность пентоксифиллина, как при гиперосмолярности среды, так и при значениях близких к нормальной осмолярности крови

Большое значение в процессе агрегации форменных элементов крови имеет величина заряда мембраны (Сторожок С А и др , 1999) Одним из способов ее изучения, является применение флуоресцентных зондов (Добрецов ГЕ, 1989), которые позволяют оценить функциональные свойства интактных мембран, изменения, происходящие в биомембранах при развитии патологического процесса на ранних стадиях заболеваний. Проведение измерения поверхностного поля исследуемых мембран с помощью положительно заряженного зонда ДСМ+ продемонстрировали высокую степень влияния соединений эноксифол и пентоксифиллин на флуоресценцию зонда ДСМ+. Применение флуоресцентных зондов выявило увеличение поверхностного заряда эритроцитов под действием как эноксифола, так и пентоксифиллина Полученные данные могут свидетельствовать об увеличении электроотрицательное ги мембран эритроцитов, что в совокупности способствует увеличению силы «электростатического распора» и снижению процесса агрегации клеток в процессе гемоциркуляции (РА$1ег М е( а!, 2001)

Наличие у эноксифола мембранопротекторных свойств было подтверждено протективным действием при гемолизе эритроцитов, вызванном действием активных радикалов в ходе термического разложения гидрофильного радикального инициатора АБАП. В присутствии инициатора можно было наблюдать существенный гемолиз по сравнению с контролем уже через ЗОмин инкубации, а ко 2му часу гемолиз составил 81% (р<0,05) по сравнению с 29% в контроле с буфером (Рис. 13)

□ +АЕАП

П Эноксифол, 100 ЙЭноксифап, 10 ■Эноксифол, 1

■ Меиадэп, 100 НМексцдал, 10

■ Мэюдап 1

Время, мин

Рис. 13

Влияние эноксифола и мексидола на АБАП-индуцированный окислительный гемолиз эритроцитов кролика (%), * - р<0,05 по отношению к контролю с АБАП (); концентрация веществ указана в мкМ

Эноксифол при введении в суспензию эритроцитов приводил к дозозависимому достоверному снижению гемотиза Так 1емолиз ко 2му часу исследования при введении эноксифола в максимальной дозе 100 мкМ составлял 39,3% (р^0,05) Мексидол также проявил способность защищать мембраны эритроцитов от разрушения под влиянием пероксидации но оказался менее эффективен, чем эноксифол в соответствующих концентрациях Таким образом, полученные данные позволяют считать, чго именно антиоксидантныс свойства обоих соединений лежат в основе их способности уменьшать гемолиз эритроцитов

В другой серии опытов также была продемонстрирована связь между гемобио-логической и антиоксидантной активностью эноксифола В условиях экспериментальною «синдрома повышенной вязкости», вызванною герм оста гированим эритроцитов, происходило отчеишвое изменение показателей их вязкости при всех скоростях сдвига, что согласуется с исследованиями других экспериментаторов (Плотников МБ и др , 1996) Этому сопутствовали сдвиги в антиоксидаптнои системе эритроцитов, проявлявшиеся снижением активности супероксиддисмутазы Наибольший эффект соединения проявили на низких скорое 1ях сдвига, при этом влияние эноксифола превосходило гаковое пентоксифиллина При этом эноксифол не только улучшал, но и практически нормализовал вязкостные характеристики крови кроликов Способность эноксифола нормализовывать сниженную при СПВ активность супероксиддисмутазы может также лежать в основе его гемореологических свойств, т к снижение ферментов АОС, и прежде всего СОД, может вызывать нарушения экзоскелета эритроцитов и являться причиной изменения их деформабельности

Влияние эноксифола на процессы микрогемодинамики

Были проведены исследования влияния эноксифола непосредственно на уровень микроциркуляции в коре головного мозга крыс с помощью доплерографии3 Проведенные опыта показали, что эноксифол в дозе 5 мг/ki сразу же после внутривенного введения вызывал повышение уровня локального мозговою кровотока в среднем на 28,6% Изучение действия эносифола при пероральном введении позволило установить, наибольший эффект эноксифола отмечался в дозе 30 мпкг Через 20 минут после введения соединения отмечалось увеличение локального мозгового кровотока на 14,16% В дальнейшем уровень мозгового кровотока продолжает возрастать и на 30-60 минутах увеличение кровотока составляет 23,8, что сопровождалось некоторым понижением уровня артериального давления Через 20 минут посте его введения артериальное давление понижалось в среднем на 13 4 от исходного уровня Необходимо ошешть, что в течение 180 минут наблюдения локальный мозговой кровоток оставался выше исходного уровня.

В отдельной серии опытов было показано положительное влияние эноксифола в условиях редуцированного кровообращения в тканях, когда одним из ведущих патогенетических факторов также являюгея микроциркуляторньте и реолог ичсские нарушения Эноксифол в дозе 5 мг/кг и 10 mi/кг значимо увеличивал длину кожного лоскута на 18,2 и 39,4, соответственно (р<0,05) При эгом в дозе 10 мг/кг эноксифол мало уступал по эффективности ненгоксифиллину, который повышал в дозе 10 мг/кг вы-

3 Исследования выыыисны и вмьегно с профессором дмн PC Мирзолноч и с н с дбн В В Атексанлриным в таборатории фармакотогии цереброраск\тярныч расстройсгв НИИ фармако кн ии РАМН, за что выражаем им г тубокую признательность

живаемость КЛ на питающей ножке по сравнению с показателями контрольной фуп-пы животных на 51,5%

Таким образом, у эноксифола был выявлен широкий спектр гемобиологической активности, как в норме, так и при экспериментальных свободно-радикальных патологиях, показано улучшение микроциркуляторных процессов, а также доказана связь между его гемобиологической и антиоксидантной активностью Учитывая многокомпонентный характер патогенеза свободно-радикальных патологий, использование препарата, влияющего на основные патогенетические звенья, позволяет ожидать наиболее эффективной коррекции.

Изучение Фармакокинетики4 Было установлено, что абсолютная биодоступность неизмененного эноксифола составила 30%, а для общего количества эноксифола и его метаболита в крови - 99% (Таблица 3).

Таблица 3

Фармакокинетические параметры эноксифола у крыс при внутривенном и перораль-

ном введении

ПАРАМЕТР Внутривенное введение Пероральное введение

Эноксифол Эноксифол и метаболит

Площадь под кривой концентрации AUC, Hg/mi/час 39,70 12,03 39,23

Константа элиминации Kel, час ' 0,89 0,49 0,184

Среднее время удерживания MRT, час 1,21 2,18 4,75

Общий клиренс С1, л/чае/кг 0,25 0,83 0,25

Кажущийся объем распределения Vd, л/кг 0,78 1,71 1,38

Период полувыведения 11/2, час 0,78 1.43 3,76

Максимальная концентрация Cmax, ng/ml 35,30 6,33 8,47

Время достижения максимальной концентрации Tmax, мин До 15 60 60

Абсолютная биодоступность Габс 0,30 0,99

Лекарственная форма эноксифола с фогозащигным покрытием биоэквивалентна его субстанции Значения периода полувыведения и среднего времени удерживания в организме одной молекулы вешесгва свидетельствуют о его способности достаточно быстро подвергаться процессам метабо шзма и элиминации Величина объема распределения доказывает способность соединения интенсивно проникать в ор(аны и ткани животных Анализ распределения эноксифола, позволяет сделать вывод, что ею концентрация в тканях аналогична его содержанию в плазме крови, но ниже таковой при пероральном введении Также имеются отличия при распределении эноксифола при разных путях введения Отмечается четкая зависимость между содержанием соединения и уровнем органного кровотока- наибольшие количества при внутривенном введении определяются в органах с сильной васкуляризацией - легких и селезенке, а при пероральном - легких и сердце При этом доказана проницаемость гемагоэнце-фалического барьера для эноксифота, что особенно важно, учитывая перспективы его дальнейшего применения при церебральных нарушениях Также высокие концентра-

4 Исследования выполнены совместно с зав лабораторией клинической фармакокинетики НИИ фармакологии ВолГМУ д б н Л А Смирновой, за что выражаем ей глубокую признательность

ции при внутривенном введении отмечаются в печени и почках, что свидетельствует об интенсивных процессах элиминации вещества.

Выведение эноксифола происходит неодинаково при различных путях введения При внутривенном введение экскреция эноксифола. в основном, происходит через почки, тогда как при пероралыюм введении - основной путь выведения через кишечник. Следует отметить, что в экскрементах определяется только часть от введенной дозы эноксифола, что позволяет сделать вывод о присутствии метаболитов

При совместном назначении эноксифола с лекарственными препаратами влияющими на монооксигеназную систему печени, необходимо учитывать выраженный «эффект перво! о прохождения через печень» для эноксифола Период полувыведения для эноксифола и его основного метаболита при пероральном введении составляет около 4 часов и, таким образом, можно рекомендовать 3-4-х кратное дозирование препарата в сутки.

Исследование лекарственной безопасности

По результатам исследования острой токсичности соединения эноксифол можно отнести к малотоксичным веществам (Таблица 4) При исследовании его способности к кумуляции нарастания токсических эффектов обнаружено не было

Таблица 4

Острая токсичность эноксифола при пероральном и внутривенном введении у крыс

Пол животных Пути введения

Пероральный 1^50, мг/кг Внутривенный 1ДЭ5о, мг/кг

Самцы /792,56 (1783,49-1801,68) 109,20 (99,24±120,15)

Самки 2260,28 (2294,69±2226,39) 126,04 (112,37±141,38)

При длительном (в течение 6 месяцев) введении эноксифола в терапевтических дозах 5 и 25 мг/кг крысам не было отмечено каких-либо очевидных тенденций в изменении функций ЦНС В токсической дозе 200 мг/кг эноксифол приводил к угнетению поведенческой активности и понижению эмоциональности и опрятности животных Также не отмечено существенных изменений и в биохимических исследованиях при его применении в терапевтических дозах. Гистологические исследования показали отсутствие изменений цитоархитектоники мозговой ткани.

Токсическое действие эноксифола в терапевтических дозах на печень доказано не было Применение его в токсических дозах проявлялось в некотором ухудшении дезинтоксикационной функции печени (замедление скорости выведения бромсульфа-леина и удлинение гексеналово!о сна на Зй месяц исследований, нормализовавшееся к бму месяцу исследований), при I истологическом исследовании структура печеночных балок сохранялась у крыс на всей протяженности исследований Учитывая полученные данные, необходимо учитывать возможность наступления изменений в печени, связанных с нарушением выделительной функции, при использовании эноксифола в больших дозах, что делает рископанным его применение тюдям, страдающим заболеваниями печени

Со стороны почек токсическою влияния эноксифола обнаружено не было, о чем свидетельствовало сохранение концентраций креатинина в течение всего эксперимента в пределах физиологических норм, отсутствие изменений уровня мочевины, и это подтверждалось отсутствием патолоТ^^Щ" сдвигов при проведении гистологических исследований В результате ма! ро- и ^^«^^^ЙЙ^жследований внут-

О* Петербург I

О» Ш ш J

ренних органов было показано, что в токсической дозе 200 мг/кг эноксифол способствует некоторым эффектам восстанавливающимся после отмены его применения, а в терапевтических дозах практически не вчияет на эти показатели

При исследовании специфической токсичности эноксифота не было получено никаких доказательств, что препарат в терапевтических дозах и изучаемых концентрациях может оказывать эмбриотоксическое. гонадотропное, аллергенное, иммуно-супрессивное и мутагенное действие Тем не менее, оценивая влияние эноксифола на репродуктивную функцию организма, следует отметить, что хотя эноксифол в терапевтических дозах не влияет на функциональную активность половых желез, не вызывает у беременных крыс появление уродливого потомства и отклонений его развития, тем не менее в больших дозах препарат способен несколько замедлять процессы оссификации скелета и влиять на сперматогенез

По результатам проведенных исследований эноксифол можно считать безопасным препаратом для лечения патологий, сопровождающихся реологическими нарушениями и активацией перекисных процессов, при условии соблюдения противопоказаний его назначения

Обобщая полученный материал, можно заключить, что выраженные антиокси-дантные свойства и защитное действие при свободно-радикальных патологиях, изученные фармакокинетические свойства, выполненные биофармацевтические исследования, полный спектр изучения общей и специфической токсичности и наличие разработанной таблетированной лекарственной формы позволяют пакет документов для представления в МЗ РФ Предполагаемыми областями его применения являются острая и хроническая недостаточность мозгового кровообращения (транзиторная ишемия, ишемический церебральный инсульт, состояния после инсульта), нарушения кровоснабжения мозга вследствие атеросклероза, нарушения периферического кровообращения, в частности диабетические ангиопатии, и другие состояния, связанные с активацией перекисного окисления липидов

ВЫВОДЫ

1 Для поиска новых высокоактивных антиоксидантных средств рационален комплексный подход с проведением предварительного прогноза ан гиоксидантной активности, компьютерным анализом структур, расчетом физико-химических параметров заместителей и изучением антиоксидантной активности в модельных опытах с выяснением спектра антирадикальной активности непрямыми и прямыми методами исследования

2 К дескрипторам антиоксидантной активности имидазо-бензимидазолов можно ог-нести наличие в молекуле трех центров дезактивации свободной радикальной плотности, метильные радикалы, соединенные между собой цепочками произвольной длины, в сочетании с ароматическим углеродным агомом, разделенный цепочкой произвопьной длины, а также гидроксильные группы, соединенные с ароматическим углеродом при наличии или отсутствии в системе сопряжения При этом высокая антиоксидантная активность производных И9 имидазо-бензимидазола может определяться суммарным зарядом гетероциклического ядра, а также фенольного или полифенольного радикала и низкой липофильностью этих радикалов

3 Оксифенильные производные па модели аскорбат-индуцируемого ПОЛ проявляли ингибирующую активность в диапазоне концентраций 0,6-2x10"6 М Самым актив-

ным было соединение эноксифол, которое по эффективности превосходило анти-оксидантщ дибунот и тролокс Оно реагировало с липопероксильными радикалами (I.OO") на стадии обрыва цепи, о чем свидетельствует его шпибиторная активность при хечилюминесценции липидов, инактивировало супероксидные ("02"), гадроксильные (ОН*) и пероксильные (ROO*) радикалы в реакциях со свободным радикалом дифенил-пикрилгидразилом, окисления кверцетина, железо-индуциру-емой хемилюминесценции в присутствии люминола, ксантин-ксантиноксидаза-индуцируемой люцигенин-зависимой XJT, а также при термическом разложении водо-растворимого соединения 2,2'-азобис(2-метилпропионамидин)дигидрохло-рида

4 Соединение эноксифол обладает широким спектром противогипоксического действия в условиях острой гипобарической, гемической и гистотоксической гипоксии, действует на животных с различной фенотипической устойчивостью к гипоксии в отличие от эталонных антигипоксантов этомерзола и гутимина Соединение эноксифол (5мг/кт в/бр) не только значительно ускоряло восстановление крыс в период реоксигенации мозга после гипобарической гипоксии, но и стабилизировало антиоксидантную систему организма, уменьшая образование продуктов перок-сидации, нормализуя систему глутатиона и увеличивая активность каталазы в тканях крыс в постгипоксическом периоде, а также препятствовало прооксидации ад-риабластином в период реоксигенации

5. Эноксифол (10 мг/кг перорально) проявил защитный эффект у животных, подвергавшихся гипоксии в пренатальный период, что выразилось в снижении эмбриональной гибели, нормализации антропометрических показателей плодов и стабилизации состояния антиоксидантной системы, характеризующейся снижением малонового диальдегида и повышением активности супероксиддисмутазы и каталазы.

6. Эноксифол (5 мг/кг перорально и в/бр) оказывал противоишемическое действие, увеличивая выживаемость крыс при острой шемии мозга, вызванной билатеральной окклюзией сонных артерий, нормализовал процессы восстановления крыс в период реперфузии после тотальной ишемии мозга, восстанавливая показатели высшей нервной деятельности, а также уменьшая количество продуктов ПОЛ и повышая активность антиоксидантных ферментов

7 Соединение эноксифол (5 мг/кг в/бр) при профилактическом введении ограничивало повышенное перекисное окисление липидов при аллоксан-индуцированном диабете у крыс, снижая уровень малонового диальдегида и восстанавливая активность антиоксидантных ферментов супероксиддисмутазы и глутатионпероксидазы.

8. Соединение эноксифол (ЗОмг/кг внутрижелудочно) при профилактическом введении улучшало функциональное состояние животных при эндотоксемии, нормализуя показатели неврологического статуса через 1 и 4 часа после введения LPS-токсина, ингибировало агрегацию тромбоцитов и предотвращало развигие гиперкоагуляции через 1 час, способствовало восстановлению функциональной активности тромбоцитов и процессов коагуляции через 4 часа после введения LPS-токсина, а также уменьшало свободно-радикальное окисление в крови, печени и моз! е и стабилизировало состояние антиоксидантной системы в органах при эндотоксемии. Препарат сравнения дибунол уступал по активности эноксифолу

9 В основе фармакодинамических свойств эноксифола, помимо антиоксидантного действия, лежит его гемобиологическая активность Так эноксифол ингибировал

агрегащпо тромбоцитов, вызванную различными индукторами (АДФ, адреналином, фактором активации тромбоцитов, коллагеном, арахидоновой кислотой и перекисью водорода), снижал вязкость крови преимущественно доноров с ишемиче-ской болезнью.

Ю.Гемобиологическая активность эноксифола проявлялась при свободно-радикальных патологиях с синдромом повышенной вязкости крови При этом соединение эноксифол (5 мг/кг) снижало вязкость крови, уменьшало агрегацию тромбоцитов и эритроцитов, повышало кислотную и осмотическую резистентноть мембран эритроцитов у крыс на моделях тотальной ишемии-реперфузии головного мозга и стрептозотоцинового сахарного диабета Препарат сравнения пентокси-филлин (4 мг/кг) уступал соединению эноксифол по активности. При этом у энок сифола обнаружены выраженные мембранотропные свойства, о чем свидетельствовало повышение деформабельности и увеличение электроотрицательности мембран клеточных элементов крови, а также повышение резистентности мембран эритроцитов к окислительиому стрессу

11 Соединение эноксифол (5 мг/кг внутривенно и 30 мг/кг перорально) повышало микроциркуляцию в коре головного мозга крыс, изученную с помощью допплеро-графии, что подтверждалось эффективностью эноксифола (5 и 10 мг/кг внутри-брюшинно) в условиях редуцированного кровообращения в тканях, где эффект эноксифола был сравним с таковым пентоксифиллина (10 мг/кг)

12 Эноксифол обладает высокой абсолютной биодоступностью при пероральном введении, периодом полувыведения около 3.5 часов, проникает через гематоэнцефа-лический барьер Разработанная для эноксифола лекарственная форма в виде таб леток с пленочным фотозащитным покрытием является биоэквивалентной по отношению к субстанции и не препятствует высвобождению и всасыванию лекарственных веществ в желудочно-кишечном тракте

13.По результатам изучения токсичности субстанции и таблетированной лекарственной формы соединение эноксифол относится к малотоксичным веществам При изучении специфической токсичности у эноксифола в терапевтических дозах и изучаемых концентрациях отсутствовало эмбриотоксическое, гонадотропнос, аллергенное, иммуносупрессивное и мутагенное действие Доклиническое изучение его безопасное!и не выявило проявлений, препятствующих проведению клинических испытаний

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Обзоры, статьи

1 Косолапов, В А Поиск и изучение фармакочогических свойств новых антиоксидангных веществ / А А Спасов, О В Островский, В А Косолапов, В А Анисимова // Вестн Вол-гарад мед акад -1995.-№1 -С 36-39

2 Косолапов, В А Защитное действие этомерзола в условиях острой гипобарической гипоксии и в период восстановления после нее / В А Косолапов, О В Островский, А А Спасов // Эксперим и клин фармакол -1996 -№6 -С 51-53

3 Островский, ОВ, Изучение антиоксиданткой активности некоторых оксифенильных соединений / О В Островский, В А Косолапов, А А Спасов, В А Анисимова//Вестн Волгоград мед акад. -1997 -№3 -С 36-39

4 Косолапов, В А Антиоксидантная защита и перекисное окисление липидов в тканях крыс после гипобарической гипоксии / В А Косолапов, О В Островский, Л А Спасов И Бюллетень эксперим биологии и медицины -1998 -№11 -С 519-521

5 Косолапой, В А Хемилюминесцентные методы в опенке свободно-радикальных реакций /В А Косолапов, О В Островский, А А Спасов//Клинич лаб диагн -1999 -№9 -С 41

6 Спасов, А А Влияние соединений с антиоксидантными свойствами на функциональную активность тромбоцитов / А А Спасов, О В Островский, И В Ивахненко, В А Косолапов // Эксперим и клин фармакол -1999 -Т62, №1 -С 38-40

7 Дрозд, В В Динамика восстановительного периода у крыс, перенесших тотальную ишемию головного мозга / В В Дрозд, В А Косолапов, О В Островский, А А Спасов // Бюллетень эксперим биологии и медицины -2000 -Т 130, №10 -С 475-477

8 Синтез и фармакологическая активность 2-гетарилимидазо[1,2-а]бензимидазолов / В А Анисимова, А А Спасов, В А Косолапов и др //Хим-фарм журнал -2002 -Т 36, №10 -С 12-17

9 Синтез и фармакологическая активнос1ь 3-(ароил)-3-(гетароил)имидазо[1,2-а]бенз-имидазолов / В А Анисимова, А А Спасов, В А Косолапов и др // Хим -фарм журнал -2002 -Т 36, №11 -С 3-8

10 Фармакокинетические свойства деребропротекторного и антиоксидантого препарата эноксифол ' Л А Смирнова, В А Косолапов, А С Лекомнев и др // Вестн Волгоград гос. мед ун-та -2002 -№8 -С 32-35

) 1 Ткаченко, Л В Значение антиоксидантов в лечении синдрома предменструального напряжения / Л В Ткаченко, А А Спасов, Л Б. Иванова, В А Косолапов И Вестн Волгоград. roc мед ун-та -2002 -№8 -С 64-66

12 Спасов, А А Противоишемические свойства нового антиоксидантного средства энокси-фола / А А Спасов, В А Косолапов, О В Островский и др // Эксперим и клин фармакол -2003. -Т66, №4. -С 17-20

13 Спасов, А.А Влияние соединения эноксифол на вязкость крови и агрегацию эритроцитов m vitro / А А Спасов, А В Степанов, M Г1 Самохина, В А Косолапов // Вестн Волгоград roc мед ун-та -2003 -Х°9 -С 43-46

14 Косолапов, В А Критерии использования лючинола и ноцигенина в хемилтоминесцен-ции для изучения механизмов действия ангиоксидантных вешеств / В А Косолапов /' Вестн Волгоград гос мед ун-та -2003 -№9 -С 54-57

15 Васильев, ПМ Прогноз и экспериментальная проверка антмоксидантной активности производных имидазобензимидазола с использованием компьютерной информационной технологии / ПМ Васильев, А А Спасов, В А Косолапов, В А Анисимова // Вестн Волгоград, гос. мед. ун-та -2005. -№2(14) -С.29-31.

16 Косолапов, В А Изучение антирадикальной активности новых соединений методами хе-милюминесценции / В А Косолапов, А А Спасов, В А Анисимова // Биомедицинская химия -2005 -Т 51, №3. -С 26-29

Публикации

17 Косолапов, В А Сравнительное изучение противогипоксических и церебропротективных свойств антиоксидантов / В А Косолапов, В В Дрозд, О В Островский, А А Спасов II Проблемы медицины катастроф сб трудов -Пермь, 1995 С 308-311

18 Создание противогипоксических средств на основе соединений, проявляющих антиокси-дантные свойства / О В Островский, В А Косолапов В В Дрозд и др // Фундаменталь ные исследования как основа создания лекарственных средств Тез докл 1-ого съезда Российского общества фармакологов, Волгоград, 9-13 окт 1995г -М ВИНИТИ, 1995 -С313

19 Kosolapov, V A Influence of butilated hidroxitoluene, a-tocopherol and probucol on free radical reaction /VA Kosolapov, О V Ostrovskij // 1 European congress of pharmacology, Milan -1995 -P 220

20. Косолапов, В А Перспективы создания препаратов для профилактики и лечения экстремальных состояний на основе антиоксидантных веществ /ОВ Островский, А А Спасов,

В.А Косолапои, В А Анисимова // Человек и лекарство Тез докл III Рос нац конгр -М, 1996 -С 224

21 Ostrovsky, О V Investigation of antiaggregative effects of benzimidazolc derivatives with antioxidant activity / О V Ostrovsky, V A Kosolapov, I Ivakhnenko // XlVth international symposium on medical chemistry, Maastricht -1996 -P.7 15

22 Островский OB Фармакологические свойства антиоксидантных всществ фенолсодер жащих конденсированных производных бензимидазола / О В Островский В А Косота-пов, А А Спасов, В А Анисимова // Человек и лекарство Тез локл IV Рос над конгр -М, 1997 -С 282

23 Спасов, А А Влияние антиоксидантных веществ на агрегационную активность тромбоцитов / А А Спасов, О В Островский, И В Ивахненко, В А Косолапое // Человек и лекарство Тез докл IV Рос нац конгр -М , 1997 -С 295

24 Ивахненко И В Влияние антиоксидаптного соединения РУ-185 на функциональную активность тромбоцитов и свертывающую систему крови при ДВС синдроме / И В Ивахненко, В А Косолапов // Диагностика, консервативное и хирургическое лечение атеросклероза, коронарной болезни сердца, артериальных гипертензии Тез докл Всерос научно-практической конф -Саратов, 1997 -С 25

25 Трегубова, И А Изменение макроструктуры плаценты при гипобарической гипоксии / И А Трегубова, В А Косолапов, О В Островский, А А Спасов // Гипоксия- механизмы, адаптация, коррекция Тез докл Всерос конф -Москва, 1997 -С 119-120

26 Косолапов, В А 11ротиво1 ипоксические свойства антиоксидантных препаратов / В А Косолапов, О В Островский, А А Спасов // Лекарства-человеку сб науч. грудов VI науч -прак! конф Харьков, 199В -Г II -С 109-114

27 Ивахненко, И В Влияние антиоксидаптного соединения на агрегацию фомбоцитов кролика и человека / И В Ивахненко, А Ф Кучерявенко, В А Косолапов // Тез. докл Итог науч конф студ и молодых vmehmx ВМА -Вол! трал, 1998 -С 230-231.

28 Островский, О В Влияние антиоксидантных соединений на функциональную активность тромбоцитов / О В Островский, И В Ивахненко, А А Спасов, В А Косолапов // Гипоксия механизмы, адаптация, коррекция Тез Всерос конф -Москва, 1999 -С 55 56

29 Спасов, А А Защитные свойства пробукола при внутриутробной гипоксии / А А Спасов, О В Островский, И А Трегубова, В А Косолапов // Гипоксия механизмы, адаптация, коррекция Тез Всерос конф -Москва, 1999 - С 71-72.

30 Трегубова, И А Некоюрые аспекты влияния внутриутробной 1ипоксии на эмбриональные и биохимические показании / И А 1регубова, В А Косолапов, О В Островский, А.А Спасов // Гипоксия механизмы, адаптация, коррекция Тет Всерос конф -Москва, 1999 -С 76

31 Разработка критериев отбора антиоксидантных средств / О В Островский, В И Закрев-ский, В А Косолапов и др // Свободные радикалы и болезни человека Тез докл науч практ конф -Смоленск, 1999 -С 74-75

32 Спасов, А А Влияние ионола на функциональную активность тромбоцитов и сисгему антиоксилангной защиты при эндотоксемии / А А Спасов, О В Островский, И В Ивахненко, В А Косолапов И Свободные радикалы и болезни человека Тез докл науч практ конф -Смоленск, 1999 -С 80-81.

33 Применение антиоксидантных средств для коррекции гипоксических и ишемических расстройств центральной нервной системы / А А Спасов, О В Островский, В А Косолапов и др // Свободные радикалы и болезни человека Тез докл науч практ конф -Смоленск, 1999 -С 82-83

34 Третубова, И А. Влияние ан гиоксидантного вещества на состояние системы антирадикальной защиты беременных крыс при гипоксии / И А 1регубова, В А Косолапов, В А Анисимова. О В Островский // Актуальные проблемы экспериментальной и клинической фармакологии Тез докл Всерос науч конф -Санкт-Петербург, 1999 -С 210 211

35 Ivakhnenko, I Blood intravascular Coagulation Syndrome Modelmg at the LPS-loxme Administration /1 Ivakhnenko V Kosolapov 0 Ostrowsky, A Spasov // New Methods m Drug Research, Limasso! -Cyprus, 1999 -P 49

36 Косолапое, В A Влияние пробукола при внутриутробной гипоксии у крыс / В А Косолапое, И А Трегубова, О В Островский, А А Спасов // Лекаре гва-человеку Междунар сб науч трудов IX научно-практ. конф -Харьков. 1999 -Том XI, №3 -С 127-131

37 Косолапое, В А Коррекция нарушений, вызванных пренатальной гипоксией с помощью антиоксидантных средств / В А Косолапое, И А Гругубова, О В Островский, А А Спасов // VII Российский национальный конгресс "Человек и лекарство" Тез докл -М,

2000 -С 507

38 Косолапов В А Влияние мексидола на развитие плода и перекиснос окисление липидов при внутриутробной гипоксии у крыс / В А Косолапов, И А Трегубова, О В Островский, А А Спасов // Лекарства - человеку 1 XII №1 Харьков 2000 С 82-85

39 Спасов, А А Действие противогипоксических веществ в зависимости от устойчивости организма к гипоксии / А А Спасов О В Островский, В А Косолапов И Биологические основы индивидуальной чувствительности к психотропным средствам Мат Зй междунар конф. -Суздаль, 2001, С 138

40 Spasov, A A Antioxidative drugs and correction of felal mjury during prénatal hypoxia / A A Spasov, О V Ostrovskij, V A Kosolapov, I A Tregubova H Нее radicals and antioxrdants in the development and fonctions of the central nervous System from fétus to agmg Мат конф / Успехи геронтологии -2001 -Выи 6 С 32

41 Трегубова, И А Коррекция мексидолом внутриутробных гипоксичсских повреждений у крысят / И А. Трегубова, В А Косолапов, О В Островский, А А Спасов // Архив клинич эксперим медицины -2001 -№2 -С 225

42 Косолапов, В А Влияние антиоксидантных средств на процессы хечилюминесценции / В А Косолапов, О В Островский, А А Спасов // Свободные радикалы, антиоксиданты и болезни человека Сб трудов нац научно-пракг конф Смоленск, 2001 -С 40 41

43 Спасов, А А Разработка церебропротекторных средств на основе антиоксидантных веществ / А А Спасов, О В Островский, В А Косолапов, В К Bepemai ин И Свободные радикалы, антиоксиданты и болезни человека Сб трудов нац научно-практ конф -Смоленск, 2001 -С 201-204

44 Трегубова, И А Коррекция последствий перинатальной гипоксии с помощью антиокси-дантов / И А Трегубова, В А Косолапов, О В Островский, А А Спасов // Мат 56й региональной конференции по фармации, фармакологии и подготовке кадров, Пятигорск -

2001 -С 230-231

45 Косолапов, В А Активация ггроцессов пероксидации в постишемическом периоде и их коррекция с помощью нового антиоксидантного средства эноксифол / В А Косолапов, А.А. Спасов, В А Анисимова // Биоантиоксидант Тез докл VI междунар конф -Москва, 2002 -С 302-303

46 Спасов. А А Обоснованность выбора гест-систем для изучения антирадикальной активности новых химических соетичений ' А А Спасов, В А Косотапов // Биоантиоксидаш Тез докл VI междунар конф -Москва, 2002 -С 549-550

47 Изучение влияния эноксифола на реотогию крови и перекиснос окисление липидов у крыс после церебральной ишемии / А А Спасов, В А Косолапов, И А 1регубова и др // Гипоксия механизмы, алаптация, коррекция Тез докл Зй Всерос конф Москва, 2002 -С 114-115

48 Косолапов, В А Антиоксилантьг современное состояние проблемы Создание на их основе церебропротекторных средств / В А Косолапов, А В Степанов, А А Спасов // Фун даментальные проблемы фармакологии Сб тез 2го съезда Российского научного общества фармакологов -Москва, 2003 -Ч 1 С 263

49 Смирнова, Л А Экспериментальная фармакокинетика и метаболизм антиоксидантного средства эноксифол /Л.А. Смирнова, В А. Косолапое, А А Спасов // Фундаментальные проблемы фармакологии Сб (ез 2го съезда Российского научного общества фармакологов -Москва, 2003 -4.2 -С 175

50 Spasov A A Hemorhcological Effects of Enoxifol in Cerebral Ischemia Followed by Reperfusion / A A Spasov, A V Stepanov, M P Samokhina, V A Kosolapov // 12 European conference on clinical hemorheology -Sofia, Bulgaria, 2003 -P 27-28.

51. Kosolapov, V.A Antioxidative properties' study of enoxifol by chemiluminescence / Kosolapov V.A., Spasov A A. // Reactive oxygen and nitrogen species, antioxidants and human health: Work collect, of intonation conf. -Smolensk, Russia, 2003 -P 15

52 Смирнова, JI.A Возможные пути метаболизма церебропротекторного средства энокси-фоя / Л.А. Смирнова, В А Косолапов // Актуальные проблемы фармакологии Гез дохл науч. конф. посвяш 50-летию Алтайского гос мед университета -Барнаул, 2003.-С 52

53 Косолапое, В А Использование методов хемишоминесценции в изучении механизмов действия антиоксидантных веществ / В А. Косолапов, А А Спасов // Актуальные проблемы фармакологии Тез докл науч конф посвящ 50-летию Алтайского гос. мед. университета -Барнаул, 2003 -С 21.

54 Применение информационной технологии «Микрокосм» для прогноза фармакологической активности новых гетероциклических соединений / П.М Васильев, А А Спасов, В.А Косолапов и др // Информационные технологии в образовании, технике и медицине- Материалы междунар конф / Международная конференция, Волгоград, 18-22 октября 2004 Волгоград, 2004 -С 180-186

55. Использование информационной технологии «Микрокосм» для прогноза фармакологической активности солей органических соединений /ИМ Васильев, А А Спасов, В А. Косолапов и др //Молекулярное моделирование. Тез. докл 4~й Всероссийск конф (М , 1215 апр 2005 г) -М , 2005. -С. 51.

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ СОКРАЩЕНИЙ

АБАП - 2,2'-азобис(2-метилпропионамидш1) дигидрохлорид

АОС -антиоксидантная система

АФК - активные формы кислорода

ГП -глутатион-пероксидаза

ГР -1лутатион-редуктаза

две - диссеменированное внутрисосудисгое свершвание

ДК - диеновые коньюгаты

ДФПГ - 2,2-дифенил-1-пикрилгидразил

ИМБИ - имидазобензимидазол

МДА - малоновый диальдегид

НАДФ - никотинамидадениндинухлеотидфосфат

ПОЛ - перекисное окисление липидов

РУ- - лабораторный шифр соединений

СОД - супероксид-дисмутаза

СПВК - синдром повышенной вязкости крови

СРО - свободно-радикальное окисление

УРПИ - условная реакция пассивного избегания

ФАТ - фактор активации тромбоцитов

хл - хемилюминесценция

ШО - шиффовы основания

Косолапой Вадим Анатольевич

АНТИОКСИДАНТНЫЕ СРЕДСТВА: СТРАТЕГИЯ ОТБОРА, ПЕРСПЕКТИВЫ ПРИМЕНЕНИЯ

Автореферат

Подписано в печать 12 05 2005

Тираж 100 экз Ьума1аофс Уч-изд л 2,5

Отпечатано в типографии И иательства ВолГМУ 400063 Волгоград ул Рокоссовско! о. \г

««s 10 6 10

РНБ Русский фонд

2006^4 7665