Автореферат и диссертация по медицине (14.00.03) на тему:Антиоксидантные и антигликозилирующие системы сыворотки крови у больных сахарным диабетом I типа

На правах рукописи

Лебедева Елена Алексеевна

УДК 616.379-088.64: 577. 11

АНТИОКСИДАНТНЫЕ И АНТИГЛИКОЗИЛИРУЮЩИЕ СИСТЕМЫ СЫВОРОТКИ КРОВИ

У БОЛЬНЫХ САХАРНЫМ ДИАБЕТОМ I ТИПА

Специальность 14.00.03 - эндокринология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук

Санкт-Петербург, 1997

Работа выполнена в Самарском государственном медицинском университете

Научный консультант - доктор медицинских наук профессор Н.И.Вербовая

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук профессор П.А.Сильннцкин доктор медицинских наук профессор М.Н.Солун доктор медицинских наук Ю.А.Ярошевский

Ведущее учреждение - Военно-медицинская академия, г.Санкт-Петербург

Защита диссертации состоится "3 октября" 1997г. в 13 час. на заседании диссертационного совета Д 074.16.04 при Санкт-Петербургской медицинской академии последипломного образования (193015, Санкт-Петербург, ул. Салтыкова-Щедрина, 41).

С диссертацией можно ознакомиться в фундаментальной библиотеке академии.

Автореферат разослан "_"_1997г.

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат медицинских наук

А.В.Соболев

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

¡13СД - иисулинозависимый сахарный диабет

пол - перекисное окисление липидов

МАП - диабетические микроангиопатии

ФА - фруктозамнн

Бе - селен

МДА - малоновый диальдегид

ДК - диеновые конъюгаты

ГП - глутатионпероксидаза

сод - супероксиддисмутаза

ДО А - общая антиоксидантная активность плазмы крови

САМ - сывороточный альбумин человека

ЛТП III - липопротеины низкой плотности

лгюкп - липопротеины очень низкой плотности

ЛП8Н - липопротеины высокой плотности

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследования

Широкая распространенность, высокая смертность больных сахарным диабетом, ранняя инвалидизация лиц трудоспособного возраста ставят сахарный диабет в ранг важнейших медико-социальных проблем. Прогноз сахарного диабета во многом определяется временем появления и тяжестью поздних сосудистых осложнений. Несмотря на большое количество исследований во всем мире, патогенез диабетических микроангиопатий (МАП) до конца не выяснен (Ефимов А.С., 1986, Балаболкин М.И., 1994, Сильницкий П.А. и др., 1996). По современным представлениям в основе развития МАП лежат метаболические нарушения, пусковым фактором для которых является гипергликемия. Установлено, что глюкоза обладает не только токсическим действием на эндотелий сосудов, но и сама является источником активных форм кислорода, приводящим к оксидантному стрессу (Wolf P., Dean Т. et al., 1987). Об усилении перекисного окисления липидов (ПОЛ! при инсулинозависимом сахарном диабете (ИЗСД) свидетельствуют результаты многочисленных исследований (Ляйфер А.И., Солун М.Н., 1993). Однако интенсивность ПОЛ зависит не только от уровня свободных радикалов, но и от состояния противоперекисной защиты.

В большинстве работ изучалась активность внутриклеточных, чаще всего эригроцитарных ферментов - глутатионпероксидазы, супероксидцисмутазы, каталазы. Данные различных авторов по этому вопросу весьма противоречивы. Одни из них находят снижение активности ферментов (Дедов И.И. и соавт., 1995, Hagglof В. et al., 1983), другие ее повышение (Боднар Г.П., Пристипюк А.И., 1984, Godin N. et al., 1988). Ряд авторов (Балашова Т.С. и соавт., 1993, Bono F. et al., 1987, Jos J. et al., 1993) не обнаружили достоверных изменений в активности ферментов. В нашем исследовании мы предприняли попытку проанализировать компоненты внеклеточной противоперекисной защиты сыворотки на различных стадиях развития МАП. Мы изучали как ферментативные факторы (экстрацеллюлярная супероксиддисмутаза, каталаза), так и неферментативные факторы ( мочевая кислота, селен сыворотки в комплексе с активностью селенсодержащего фермента эритроцитов глутатионпероксидазы).

Гипергликемия при диабете приводит к резкому ускорению процессов гликозилирования белков (Галенок В.А. и др., 1989, Гаспарян Э.Г. и др., 1994). Это неферментативное присоединения глюкозы к аминогруппам белка. Гликозилированию подвергаются различные белки сыворотки крови, а также базальных мембран, что значительно изменяет их свойства. Этот процесс проходит несколько этапов. Вначале образуются обратимые продукты гликозилирования (кетоамины, в том числе фруктозамин). Под термином фруктозамин понимают сумму гикозилированных белков сыворотки, которые на 60% состоят из гликозилированного альбумина. Эти соединения с течением времени претерпевают различные структурные перестройки с формированием стабильных АСЕв-продуктов. Они обладают способностью "сшивать" белки базальных мембран, приводя к их утолщению, нарушениям инфраструктуры и зарядоселективности (Денисенко Т.В., 1990, Ухвата Н., 1990). Известно, что продукты гликозилирования (фруктозамин, АОЕв-пептиды) являются источником свободных радикалов и усугубляют оксидантный стресс при диабете (ОШегу Р. й а1., 1988). Поэтому возможность затормозить процесс гликозилирования на ранних стадиях приобретает особое значение в профилактике МАП. В литературе имеются сообщения об ингибировании его аминогуанидином, который реагирует с кетоаминами с образованием неактивных соединений (Вго\Уп1ее М.е1 а1., 1986, СМеШ Р.Я. е( а!., 1989). Однако медикаментозное влияние на ранние стадии гликозилиования изучено недостаточно, В литературе имеются немногочисленные сообщения о способности вит.С и вит.Е уменьшать образование ФА (БюШа Р. ег а!., 1988, ОпеПо А.« а1., 1988, 1991). Учитывая тот факт, что гликозилирование белков является пусковым моментом в патогенезе диабетических МАП, медикаментозная блокада его, особенно на ранних стадиях, представляется нам важной в плане предотвращения сосудистых поражений при диабете.

Цель исследования

Изучить активность ферментативной и неферментативной антиокислительной системы сыворотки у больных ИЗСД как в дебюте заболевания, так и при длительно существующем диабете, осложненном МАП.

.Изучить экзогенные и эндогенные факторы, блокирующие [ти;-;о-5К.лирова!ше сывороточного альбумина человека, с целью найти хим.<';-:ские соединения, которые в будущем могли бы применяться для предотвращения развития сосудистых осложнений диабета.

Задачи исследования

1. Изучить активность экстрацеллюлярных ферментов супероксиддисмутазы, катзлазы у больных ИЗСД с различными проявлениями МЛП.

2. Изучить общую антиоксидантную активность сыворотки крови, а также компоненты неферментативной защиты - концентрацию селена сыворотки в комплексе с активностью эритроштгарной глутатионпероксидазы, концентрацию мочевой кислоты.

Выделить вещества, содержащиеся в сыворотке крови и обладающие гип'/к'ччкп шлнрующим эффектом.

4. Нтучять ингибирукицее влияние сыворотки крови на процесс

гяиуо«шкроаания сывороточного альбумина человека, липопротеинов «какай плотности в опытах in vitro

Изучить r опытах in vitro способность лекарственных препаратов, применяющихся в лечении диабета и его осложнений и имеющих свободную амидогруппу, уменьшать образование фруктозамина.

6. Изучить влияние букарбана и адебита на гнпергликемию и уровень ФА в опытах in vivo на крысах с аллоксановым сахарным диабетом.

7. Случить влияние букарбана на уровень фруктозамина у больных ИЗСД после 25 дней терапии .

Научная новизна

1. Впервые показано наличие в сыворотке крови соединений, способных значительно затормозить процесс гликозилирования сывороточного :ш.бумннэ человека. Они составляют часть антигликозилирующей системы сыворотки. Этот термин введен нами впервые.

2. К антигликозилирующей системе сыворотки крови относятся термостабильные низкомолекулярные соединения мочевая кислота, аргкнин и в меньшей степени креатинин. Наше исследование не исключает и

наличие других, содержащих аминогруппу соединений, угнетающих процесс гликозилирования.

3. Выдвинута гипотеза, согласно которой вещества, имеющие в своем составе аминогруппу, способны конкурировать с глюкозой за связывание с аминогруппами белка и таким образом ингибировать гликозилирование.

4. Обнаружено новое свойство у применяемых ранее сульфаниламидных препаратов (букарбан, бетаназ) и бигуанидов (адебит). Это способность угнетать образование фруктозамина при неизменном уровне глюкозы в опытах in vitro и in vivo.

5. Впервые показано, что назначение букарбана в дозе 0,5 г 2 раза в сутки в течение 25 дней способно уменьшать уровень фруктозамина у больных ИЗСД на фоне неизменной гипергликемии.

Практическая значимость

Найдены новые пути блокирования гликозилирования белков у больных с ИЗСД. Этим свойством обладают как низкомолекулярные эндогенные соединения ( мочевая кислота, аргинин, креатинин), так и лекарственные препараты, имеющие в своем составе аминогруппы (букарбан, бетаназ, адебит). Показаны пути создания новых лекаственных препаратов, угнетающих гликозилирование.

Внедрение результатов исследования

Результаты исследования внедрены в практику работы эндокринологических отделений МСЧ N9 и областной клинической больницы им. М.И.Калинина г.Самары, а также используются в учебном процессе на кафедре эндокринологии и терапии факультета последипломного образования Самарского государственного медицинского университета.

Основные положения, выносимые на защиту 1. При декомпенсированном ИЗСД, несмотря на усиление ПОЛ, активность антиокислительных ферментов сыворотки и глутатионпероксидазы эритроцитов остается без изменений. При впервые выявленном диабете отмечается увеличение общей антиоксидантной активности плазмы, которая

шлпращается к норме при формировании МАП. Показано снижение концентрации мочевой кислоты - одного из низкомолекулярных анхисксидантов сыворотки у больных с МАП.

2. Сыворотка здорового человека и больного ИЗСД уменьшает гликозилирование сывороточного альбумина при инкубации его с глюкозой m vitro.

3. Выдвинуто положение о наличии в организме антигликозилирующей системы, уменьшающей образование фруктозамина. К эндогенным компонентам этой системы относятся аргинин, мочевая кислота, отчасти креатинин, имеющие в своем составе аминогруппу.

4. Букарбан, бетаназ, адебит способны уменьшать образование фруктозамина в опытах in vitro, а также у крыс с аллоксановым диабетом при неизменном урозне гипергликемии.

5. Букарбан, назначаемый в дозе 0,5 г 2 раза в сутки в течение 25 дней,

уменьшает уровень фруктозамина у больных ИЗСД, не влияя на средний

уровень гипергликемии.

Апробация работы и публикации

Основные материалы диссертации доложены и обсуждены на П Всероссийском съезде эндокринологов (Челябинск, 1991), на 1 и 2 Всероссийской научно-практической конференции "Экология и здоровье челоБска" (Самара, 1994, 1995), на Ш Российском национальном конгрессе "Человек и лекарство" (Москва, 1996), на Ш Всероссийском съезде эндокринологов (Москва, ¡996), на научно-практической конференции, посвященной 25-летию фармацевтического факультета Самарского государственого медицинского университета (Самара, 1996), на заседании Самарской эндокринологической ассоциации (1997).

По материалам диссертации опубликовано 25 печатные работы, из них П-в центральной печати. Одна работа опубликована в виде тезисов в сборнике работ 1 Всемирного Конгресса по предотвращению диабета и его осложнений (Копенгаген, 1996).

Обьем и структура диссертации

Диссертация изложена на 185 страницах машинописного текста и включает следующие главы: введение, обзор литературы, клиническая

характеристика больных и методы исследования, результаты собственных исследований, обсуждение результатов, выводы и практические рекомендации. Диссертация иллюстрирована 24 рисунками и 25 таблицами. Библиографический указатель включает 100 отечественных и 167 зарубежных источников.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

По своему характеру работа является клинико-экспериментальным исследованием.

Клиническая характеристика больных Нами обследован 171 больной ИЗСД, находящийся на стационарном лечении в эндокринологическом отделении МСЧ N9 г.Самары в период с 1990 по 1997 г. Среди обследованных были 88 мужчин и 83 женщины в возрасте от 13 до 60 лет. Впервые диабет был выявлен у 18 человек, у остальных пациентов длительность заболевания составляла от 1 до 30 лет. Все больные находились в состоянии декомпенсации. Контрольную группу составили 76 практически здоровых добровольцев в возрасте от 22 до 34 лет.

Состояние ПОЛ и антиоксидантной защиты сыворотки крови было изучено нами у 159 больных диабетом. В зависимости от выраженности МАП все пациенты были разделены на 4 подгруппы. В первую подгруппу вошли больные с впервые выявленным диабетом без признаков МАП (18 челоовек). Вторую подгруппу составили пациенты с начальными проявлениями МАП (75 человек), имеющие диабетическую ангиопатию сетчатки, начальные проявления ангионейропатии канечностей. В третью подгруппу вошли 44 больных с выраженными проявлениями МАП. Это пациенты с диабетической простой ретинопатией, диабетической нефропатией 1 и П стадии, периферической ангионейропатией. Четвертую подгруппу составили 22 человека с тяжелыми проявлениями МАП, сопровождающимися нарушением функции органов. Это больные с ХПН вследствие диабетической нефропатии Ш стадии, пациенты с пролиферирующей ретинопатией и периферической ангионейропатией в язвенно-некротической стадии.

Наше исследование было проведено в 3 этапа. На первом этапе изучалась концентрация антиоксиданта селена (Бе) в сыворотке крови и его

взаимосвязь с липидным спектром у 45 больных ИЗСД в возрасте от 13 до 60 лег с длительностью заболевания от 0 до 26 лет. В зависимости от тяжести МАП все больные были разделены следующим образом: впервые выявленный диабет без МАП - у 5 пациентов, начальные проявления МАП -у 25 человек, выраженные проявления МАП - у 11, МАП с нарушением функции органа - у 4 человек.

На втором этапе изучалось состояние ПОЛ по уровню малонового диальдегида (МДА) и диеновых конъюгатов (ДК) в комплексе с общей антиоксидантной активностью сыворотки (АОА), которая является интегральным показателем неферментативной противоокислительной системы. Одним из ее компонентов является Бе, концентрацию которого мы определяли в сочетании с активностью селенсодержащего фермента глутатионпероксидазы эритроцитов (ГП). Обследовано 69 больных ИЗСД в вочрасте от 13 до 56 лет и с длительностью заболевания от 0 до 30 лет. В зависимости от наличия и выраженности ангиопатий все пациенты были разделены следующим образом: больные с впервые выявленным диабетом без МЛН - 13 человек, с начальными проявлениями МАП - 28 человек, с выраженными МАП - 17 человек и с ангиопатиями, сопровождающимися нарушением функции органа - 11 пациентов.

На тре гьем этапе работы определялась активность антиокислительных ферментов - еупероксиддисмутазы (СОД), каталазы сыворотки, ГП эритроцитов в зависимости от выраженности МАП. Об интенсивности гликозилирования сыворотчных белков судили по уровню ФА. Обследовано 45 больных ИЗСД, осложненном МАП различной тяжести в возрасте от 15 до 60 лет с длительностью заболевания от 2 до 29 лет. У 24 человек была определена концентрация одного из антиоксидантов сыворотки мочевой кислоты.Все больные были разделены на подгруппы в зависимости от выраженности сосудистых осложнений. В первую подгруппу вошли 22 человека с начальными проявлениями МАП, во вторую - 16 человек с выраженными проявлениями МАП, в третью - 7 человек с тяжелыми проявлениями МАП, сопровождающимися нарушением функции органа. Концентрация мочевой кислоты исследована у 12 пациентов из первой подгруппы, у 7 больных из второй подгруппы и у 5 человек из, третьей подгруппы ( больные с ХПН в исследование включены не были).

В заключительной части работы изучалась взаимосвязь между средним уровнем гликемии и концентрацией ФА у 12 больных ИЗСД. У 8 из них проведена апробация назначения букарбана совместно с инсулинотерапией с целью уменьшить образования ФА. В исследование включены 8 мужчин и 7 женщин в возрасте от 17 до 60 лет с длительностью заболевания от 1 до 21 года.

На протяжении всего срока госпитализации {20-30 дней) у больных определялась гликемия натощак, перед ночным сном, обедом и ужином. Была проведена статистическая обработка результатов и получены величины средней гликемии (М) и ошибки средней (ш). Перед выпиской из стационара определялся уровень ФА. Затем больные получали совместно с инсулинотерапией букарбан в дозе 0,5 г 2 раза в сутки в течение 25 дней. В домашних условиях пациенты измеряли уровень гликемии самостоятельно 13 раза в день с помощью тестов самоконтроля. Затем повторно определялся уровень ФА и рассчитывался показатель средней гликемии.

Методы исследования

Содержание МДА в сыворотке определялось по реакции с тиобарбитуровой кислотой спектрофотометрическим методом, модифицированным О.Н.Коробейниковым (1989). Уровень ДК определялся по методике В.Б.Гаврилова и М.И.Мишкорудной (1983) путем экстракции раствором гептана с последующей спектрофотометрией.

Для определения 8е сыворотки крови нами был использован метод, описанный ЯЛ.ВауйеИ е1 Ь.Р.КошаНБ (1985). Он основан на разрушении биологического материала смесью НМОЗ и НС104 с последующим добавлением 2,3-диаминонафталина и флюориметрией образовавшегося пиазоселенолового комплекса. Этот метод был адаптирован к имеющимся условиям путем замены экстрактирующего вещества и введением внутреннего стандарта.

Определение активности ГП эритроцитов проводилось по методике А.Р.Гаврилова и Н.Ф.Хмара (1986). По убыли в среде восстановленного глугатиона определяли активность ГП при использовании насыщающих концентраций гидроперекиси третбутила.

Активность СОД сыворотки определяли по методу N.Nishikimi et al.(1972), основанном на способности СОД ингибировать реакции восстановления нитросинего тетразолия. Для изучения активности каталазы ü сыворотке мы воспользовались спектрофотометрическим методом iví.A-Королюка и соавт.(1988), основанным на способности перекиси водорода образовывать с солями молибдена стойкий окрашенный комплекс.

АОА плазмы крови оценивалась нами по методике Г.А.Клебанова и И.В.Бабенксвой (1988). Плазма крови обладает способностью тормозить перекисное окисление липопротеидов куриного желтка, подвергшихся окислению сернокислым железом.

Концентрация мочевой кислоты в сыворотке определялась спектрофотометрическим методом L.Morimont et M.London (1964), описанным в монографии С.И.Рябова и соавт.(1979).

У ряда пациентов совместно с определением концентрации Se в сыворотке мы изучали липидный спектр, используя электрофоретический метод разделения липопротеинов в тонком слое сефадекса Г-200 (Боринский Ю.Б., Тумаков С.А., 1976).

Содержание фруктозамина (ФА) в сыворотке больных диабетом и инкубационной среде in vitro определялось по методу О.И.Свистуновой и В.Н. Титова (¡992), который основан на восстановлении тетразолия нитросинего.

Экспериментальная часть

Процесс гликозилирования сывороточных белков изучался нами в опытах in vitro и in vivo. Так как гликозилирование это неферментативный процесс, то он может успешно протекать не только в организме, но и в пробирке. Согласно методике J.Moldrem et al.(1993), мы приготавливали in vitro искусственную среду, содержащую 1 мл 5% сывороточного альбумина человека (САЧ) фирмы "Reanai" и глюкозу в конечной концентрации в среде 11, 22, 44 и 88 мМ/л. Смесь была приготовлена на фосфатном буфере и инкубирована в холодильнике при температуре + 1-+2 °С. На 6,11,16,22 и 28 день от начала инкубации определяли степень гликозилирования САЧ по уровню ФА. На рис.1 показано, что интенсивность гликозилирования САЧ

зависит от двух факторов - концентрации глюкозы в среде и времени экспозиции.

В качестве эталона для дальнейших исследований была выбрана концентрация глюкозы 44 мМ/л, при инкубации с которой 5% раствора САЧ в течение 14 дней наблюдается интенсивное образование ФА до 273 ± 6,61 мкМ/л полностью гликозилированного альбумина. В эту эталонную среду добавляли сыворотку крови здорового донора или больного ИЗСД в объеме 50% от общего количества или растворы эндогенных или экзогенных соединений в различных концентрациях и изучали их влияние на гликозилирование САЧ по уровню ФА.

Нами был изучен процесс гликозилирования ЛПНП, которые выделялись из плазмы крови при помощи седиментации их средой, содержащей гепарин и хлорид кальция. Взвесь ЛПНП подвергалась центрифугированию, промывалась 0,05М фосфатным буфером, а затем помещалась в пробирки, куда был добавлен раствор глюкозы в конечной концентрации 44 мМ/л. Смесь инкубировалась как было описано выше, а затем анализировалась на содержание ФА и МДА.

В качестве экспериментальной модели in vivo для изучения влияния ряда лекарственных препаратов на процессы образования ФА были использованы 18 беспородных крыс обоего пола весом 200-2 Юг, у которых развивался аллоксановый сахарный диабет после введения под кожу аллоксана в дозе 200 мг/кг. Животные выдерживались на стандартной диете в течение 2-х месяцев для полного и стабильного развития диабета и образования ФА. После этого у крыс бралась кровь из подъязычной вены и определялась гликемия и уровень ФА. Затем первой группе крыс (п=9) в течение одного месяца ежедневно через желудочный зонд вводился букарбан в водно-крахмальной взвеси в дозе 0,075 г/кг, второй группе крыс (п=9)- адебит в дозе 0,005 г/кг. Эти дозы были аналогичны высшим суточным дозам у человека, после чего измеряли уровень гликемии и ФА под влиянием этих препаратов.

врема инкубации, сутки

?ис. 1. Гликозилирование 5 % САЧ различными концентрациями • люкозы в инкубационной среде в течение 28 дней.

Концентрация глюкозы:

1 ПмМУл

2 22мМ/л

3 44 мМ/ л

4 88 мМ/ л

Полученные результаты обрабатывались на персональном компьютере IBM PC AT/286-EGA с использованием общепринятых методов вариационной статистики с помощью интегрированного пакета WORCS фирмы Microsoft. Результаты представлены в виде М ±т, где М - средняя величина изучаемого параметра, ш - ее средняя ошибка. Оценка достоверности различий средних величин для независимых переменных осуществлялась по t-критерию Стьюдента. Различия считались достоверными при р<0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Клиническая часть

При декомпенсированном ИЗСД отмечается активация процессов ПОЛ, что проявляется в высокодостоверном увеличении концентрациии МДА и несколько меньшем росте ДК (таблица 1) как в группе с впервые выявленным диабетом, так и при формировании МАП. Достоверных различий между группами отмечено не было. По-видимому, ускорение процессов ПОЛ является постоянно действующим фактором в патогенезе сосудистых осложнений. Выявлена положительная корреляция между уровнем МДА и ДК (г=0,54, п=51, р<0,001), что свидетельствует о взаимосвязи первичных и вторичных продуктов ПОЛ.

Результаты исследования ферментативной антиокислительной системы сыворотки представлены в таблице 2. У лиц с начальными и выраженными проявлениями МАП активность СОД не отличалась от нормы. В группе с тяжелыми МАП, осложненными нарушением функции органов, отмечается рост активности СОД сыворотки, что может быть связано с разрушением клеток и выходом фермента в межклеточное пространство. Активность каталазы сыворотки и ГП эритроцитов не отличались от нормы на всех стадиях формирования сосудистых осложнений. Не было обнаружено достоверных корреляций между активностью ферментов и уровнем МДА и ДК, по-видимому, усиление ПОЛ не сопровождается адекватным ростом их активности. Это свидетельствует о неэффективности ферментативной защиты при ИЗСД. Вероятно, на первый план в защите от избыточной . продукции кислородных радикалов выступают неферментативные низкомолекулярные соединения.

ЛОА - это интегральный показатель, отражающий потенциал шпкомолекулярной антиокислительной защиты. При впервые выявленном ди;.бете отмечается увеличение этого показателя, при формировании МАП происходит его снижение до нормы (таблица 1). Обнаружена отрицательная корреляция между АОА плазмы и уровнем МДА (г=-0,362, п=37, р<0,05). По-видимому, рост продуктов ПОЛ сопровождается угнетением иизкоыолекулярной защиты. На фоне отсутствия повышения активности ферментов это может способствовать формированию МАП.

Нами предпринята попытка изучить концентрацию двух важных сывороточных антиоксидантов - Бе и мочевой кислоты, роль которых в патогенезе МАП недостаточно ясна. Концентрация Бе в сыворотке крови больных ИЗСД колебалась в широких пределах от 57 до 130 нг/мл, в среднем 93,1 ± 3,4 мкг/л, что достоверно не отличается от концентрации Бе в контрольной группе - 95,4 ± 3,9 мкг/л (р>0,05). Мы не обнаружили существенных различий в концентрации Бе у мужчин - 93,5 ± 5,3 мкг/л и у женщин 93,8 ± 4,1 мкг/л (р>0,05). Содержание Бе в крови больных с длительностью заболевания не более 3 лет в среднем составило 96,0 ± 7,2 мкг/л, с длительностью заболевания от 4 до 10 лет - 96,3 ±5,3 мкг/л, более 10 лег отмечено некоторое снижение уровня Бе в среднем до 87,0 ± 5,8 мкг/л, которое однако оказалось статистически недостоверным (р>0,05).

Нами не найдена корреляция Бе сыворотки с активностью ГТ1 эритроцитов, что может быть связано с достаточным насыщением организма этим микроэлементом и отсутствием селенодефицита как у здоровых лиц, так и у больных диабетом.

При изучении липидного спектра крови у больных ИЗСД в стадии декомпенсации обнаружено существенное повышение уровня ЛПНП, ЛПОНП , а также высокодостоверное увеличение концентрации триглицеридов у больных диабетом, которое достигало 5,01 ± 0,14 мМ/л против 3,1 ±0,09 мМ/л в контроле (р<0,001).

В контрольной группе нами обнаружена положительная корреляция между уровнем Бе в сыворотке и ЛПНП (г=0,507, р<0,01), общим холестерином (г=0,494, р<0,05) и триглицеридами (г=0,604, р<0,01) и отрицательная связь с ЛПВП (г=-0,413, р<0,05). По-видимому, у здоровых лиц при увеличении атерогенных факторов (ЛПНП, холестерина,

триглииеридов) и уменьшении антиатерогенного фактора (ЛПВП) отмечается повышение уровня Se.

У больных ИЗСД сохраняется корреляция между концентрацией Se и холестерином (г=0,581, р<0,001), однако полностью утрачивается корреляция между Se и триглицеридами (г=0,175, р>0,05), а также с ЛПНП и ЛПВП. Появляется отрицательная корреляция между Se и ЛПОНП (г=-0,429, р<0,05).

Таким образом, на фоне усиления ПОЛ и гиперлипидемни, наблюдаемой при ИЗСД, отмечается нарушение корреляции Se сыворотки с липидными фракциями, что может способствовать развитию сосудистых осложнений.

Концентрация другого важного антиоксиданта сыворотки-мочевой кислоты-представлена в таблице 2. Обнаружено существенное снижение уровня мочевой кислоты во всех группах больных по сравнению с контролем. По-видимому, этот факт может привести к несостоятельности противоперекисной защиты.

Экспериментальная часть

Процесс гликозилирования белков и ПОЛ тесно связаны друг с другом. В опытах in vitro нами показано, что под влиянием инкубации с глюкозой происходит не только интенсивное гликозилирование ЛПНП, но и рост содержания в них МДА с 1,10±0,16 нМ/мл до 2,25 ± 0,21 иМ/мл (р<0,001). Таким образом, гликозилирование ЛПНП повышает содержание в них продуктов ПОЛ в 2 раза, что может способствовать окислению ЛПНП и развитию атеросклеротического процесса. Наше дальнейшее исследование было посвящено гликозилированию САЧ.

Инкубация 5% САЧ с раствором глюкозы 44 мМ/л сопровождается интенсивным его гликозилированием и образованием ФА в концентрации 273,3±6,6 мкМ/л. После добавления в инкубационную среду сыворотки здорового человека или больного ИЗСД в количестве 50% от общего объема, наблюдалось высокодостоверное торможение образования ФА до 19,0 ± 1,3 мкМ/л (р<0,001) в первом случае и до 22,6 ± 0,6 мкМ/л (р<0,001) во втором случае. По-видимому, в сыворотке крови содержатся вещества, препятствующие интенсивному гликозилированию САЧ. Нами были

Таблица 1.

Показатели ПОЛ и антиоксидантной системы сыворотки у больных ИЗСД в зависимости от выраженности МАП

Группа МДА ДК $е Активность ГП АОА _нмоль/ мл_усл. ед. _мкг/ л____ед. на 106 клеток усл.ед.

1, без МАП 4,20 + 0,19*** 8,07 + 0,61* 91,47 + 6,50 51,47 + 6,50 62,22 + 2,81**

п= 13 п= 13 п = 13 п = 12 п = 8

2, начальные 4,23+0,16*** 7,37 + 0,24 98,70 + 4,18 51,57 + 3,60 51,15 ± 2,61

проявления МАП п = 27 п = 27 п = 27 п = 26 п = 21

3, выраженные 4,01 +0,19** 7,75 + 0,32* 96,94 + 2,81 54,55 + 4,53 47,56 + 3,70

проявления МАП п= 16 п= 16 п= 17 п= 17 п= 12

4, тяжелые 4,38 + 0,29*** 7,65 + 0,39* 91,70 + 3,83 53,83 + 5,37 51,17 + 5,21

проявления МАП п = 11 п= 11 п = 10 п= 10 п = 7

с нарушением

функции органов

Контрольная 3,30 + 0,06 6,07 + 0,24 96,30 + 2,60 58,35 + 2,57 47,90 + 2,56

группа п = 31 п = 31 п = 30 п = 30 п = 15

*р < 0,05 , **р < 0,01, ***р < 0,001 по сравнению с контрольной группой

Таблица 2.

Концентрация фруктозамина, мочевой кислоты, активность антиокислнтельных ферментов у больных ИЗСД с различными проявлениями МАП

Группа Фруктозамин Каталаза ГП эритроцитов СОД сыворотки Мочевая кислота

мкМ/л сыворотки ед.на 10 клет ед.на 1 мг белка мкМ/л __ед/сек_____

1, начальные 10,59 ± 0,65 *** 1,06 ±0,28 73,65 ±4,31 9,26 ±1,01 176,66 ± 14,22**

проявления МАП п = 22 п=10 п=19 п = 22 п=12

2, выраженные проявления МАП

9,65 ±0,73*** 0,70 ±0,09

п= 16

п = 5

67,73 ± 5,58 п= 16

12,07 ± 1,53 п= 15

172,0 ±38,13* п = 7

3, тяжелые проявления МАП с нарушением функции органов

Контрольная группа

8,71 ±1,18** п = 7

5,58 ±0,30 п ~ 16

1,11 ±0,24 п = 3

1,21 ±0,25 п= 15

77,08 ±9,04 п = 7

74,32 ±4,93 п= 15

19,81+5,14* п = 7

10,35+1,27 п — 16

150,0 ±45,8* п = 5

282,72 + 27,50 п= П

*р < 0,05 **р<0,01

*р < 0,00!

Ч!,:явлеи(.г достоверные различия между уровнем ФА в пробирках, содержащих сыворотку здорового человека и больного ИЗСД (р<0,01), что спи'кггслмягвует, по-видимому, о более низкой антигликозилирующей способ I if сти смвортки больного диабетом.

Термическая обработка сыворотки путем нагревания в кипящей го «хной бчне до 100° С в течение 2 минут не приводила к потере ее антиглихозплирующих свойств. Мы предположили, что вещества, подавляющие гликозилирование, не относятся к термолабильным соединениям. По-видимому, это низкомолекулярные соединения, обладающие конкурентным эффектом на реакцию гликозилирования. В скрининговых опытах in vitro мы добавляли в инкубационную среду аминокислоты (аргинин, глутаминовую кислоту, лейцин, лизин, гистидин), мочевую кислоту, мочевину, креатииин в концентрации 10"3М.

результатам этого ориентировочного исследования реальным й'.гяглчкозллирующим эффектом обладают мочевая кислота, креатинин и япг'кин. иыча проведена серия экспериментов с достаточным количеством наблюдений (п=9 для каждого вещества) для получения статистически ,t I'JCi С Ё .'рНЫ х результатов. 'Гак инкубация САЧ с глюкозой 44 мМ/л приводила к образованию ФА в среде в концентрации 151,2 ± 18,6 мкМ/л. При добаялении в среду мочевой кислоты отмечено высокодостоверное уменьшение гликозилирования до 1,7 ± 0,7 мкМ/л ФА (р<0,001), аргинина -до 3' ,3 -t 7,9 мкМ/л ФА (р<0,001). Креатинин в концентрации 10"3М также уменьшал содержание ФА, однако это снижение было недостоверным - 135,3 ± 14,8 мкМ/л (р>0,05).

Мы изучали гликозилирование САЧ в среде под воздействием очень высокой концентрации глюкозы - 44 мМ/л, которая практически не встречается даже при тяжелом декомпенсированном диабете. Мы повторили предыдущую серию опытов и использовали более низкую концентрацию глюкозы 17 мМ/л, которая часто регистрируется у больных ИЗСД. На 14 день инкубации САЧ с глюкозой отмечено образование ФА в концентрации 45,0 ±5,8 мкМ/л. В пробирках, куда была добавлена мочевая кислота в концентрации 10~3М отмечалось высокодостоверное торможение гликозилирования до 8,2 ± 6,0 мкМ/л ФА (р<0,001). Аргинин полностью подавлял этот процесс и ФА практически не образовывался. Уменьшение

уровня ФА под влиянием креатинина до 33,6 ± 5,7 мкМ/л (р>0,05) оказалось статистически недостоверным. Таким образом, при высоких концентрациях глюкозы защита альбумина от гликозилирования осуществляется, по-видимому, за счет мочевой кислоты, а при более низких - за счет аргинина.

И, наконец, в инкубационную среду, содержащую САЧ и глюкозу в концентрации 17 мМ/л, мы добавляли все три исследуемые вещества в физиологических концентрациях - мочевая кислота 600 мкМ/л, аргинин 170 мкМ/л, креатинин 150 мкМ/л. Отмечено достоверное снижение уровня ФА до 12,8 ± 5,2 мкМ/л по сравнению с контролем, где концентрация ФА достигала 38,8 ± 5,8 мкМ/л (р<0,01).

Таким образом, мы можем говорить о наличии в сыворотке крови комплекса эндогенных соединений, значительно уменьшающих гликозилирование альбумина. Нами впервые введен термин "антигликозилирующая система сыворотки крови", в которую входят мочевая кислота, аргинин и в меньшей степени креатинин. Мы не исключаем и наличия других низкомолекулярных соединений, тормозящих образование ФА. Мочевая кислота, которая упоминалась нами ранее как антиоксидант сыворотки, является также частью антигликозилирующей системы. По-видимому, уменьшение ее концентрации, обнаруженное нами у лиц с ИЗСД, является причиной снижения как антиокислительных, так и антигликозилирующих свойств сыворотки при диабете.

Была выдвинута гипотеза, согласно которой вещества, имеющие в своем составе аминогруппу, способны конкурировать с глюкозой за связь с аминогруппами белка и, таким образом, ингибировать гликозилирование.

В скрининговых опытах in vitro были изучены лекарственные препараты, широко применяющиеся для лечения диабета и его осложнений и имеющие в своем составе аминогруппы (никотиновая кислота, никотинамид, пирацетам, панангин, букарбан, бетаназ и адебит). В этот ряд была включена и аскорбиновая кислота, которая хотя и не имеет в своем составе аминогруппу, но по свидетельству P.Stolba et al.(1988) способна уменьшать гликозилирование в опытах in vitro и in vivo. Лекарственные препараты добавлялись в инкубационную среду, содержащую 5% САЧ и глюкозу 44мМ/л, в конечной концентрации 10'3М. Результаты скрининговых опытов представлены на рис.2, и 3.

"■к:..*.. Результаты скрининговых опытов по изучению влияния ряда лекарственных вешеств на уровень фруктозамина в среде, Ьодержащей САЧ и глюкоз) в концентрации 44 мМ/ л. График 1 -никотиновая кислота, 2 - ннкотинамид, 3 - панангин, 4 - пирацетам, 5 - аскорбиновая кислота. К - контроль.

время инкубация, сутки

Рис.3. Результаты скрининговых опытов по изучению влияния сахароснижающих лекарственных препаратов на уровень фруктозамина в среде, содержащей САЧ и глюкозу в концентрации 44 мМ/ л. График 1 - букарбан, 2 - бетаназ, 3 - адебит. К - контроль.

Только бук?.рба». бетаназ и адебит обладают реальной способностью блокировать гликозилирование САЧ. Производные сульфонилмочевины и /<цг\,шш:!ы по своему действию существенно отличаются от других препаратов, имеющих аминогруппу. Возможно, причиной этого является присоединение аминогруппы к ароматическому ядру или включение ее в с>-0>кгур;у бкгуанида. Результаты скрининговых опытов нашли подтверждение после проведения эксперимента с достаточным количеством наблюдений для получения статистически достоверных результатов. В инкубационную среду был добавлен адебит в концентрации ICf'M и 10'3М, наблюдалось высокодостоверное уменьшение уровня ФА с 273,3 ± 6,6 мкМ/л в контроле до 118,2 ± 3,7 мкМ/л (р<0,001) и 92,4 ± 6,2 мкМ/л (р<0,001) соответственно.

В опытах in vivo, когда крысы с аллоксановым диабетом получали чькшне суточные дозы адебита и букарбана в течение месяца, наблюдалось

- ."ижеь'че уровня ФА, хотя гипергликемия оставалась неизменной (таблица 3). Таким обрзлом, сульфаниламиды и бигуаниды не влияют на гликемию у крыс, i*o способны достоверно затормозить процесс гликозилирования.

3 заключительной части исследования мы апробировали назначение букарбана в дозе 0,5г 2 раза в сутки в течение 25 дней совместно с инсулинотерапией у 8 больных ИЗСД с целью снижения уровня ФА. Результаты представлены в таблице 4. После назначения букарбана практически у всех больных отмечено уменьшение уровня ФА, тогда как средний уровень гликемии оставался без изменений.

Наилучший результат получен у трех больных (N 1, 2, 3), у которых наблюдались высокие исходные цифры гипергликемии и ФА. Если в кг.чест-ве нормального уровня ФА взять 5,5 мкМ/л (эта цифра определена у !í¡ добровольцев), то назначение букарбана позволило снизить увеличенную концентрацию ФА у первого больного на 47%, у второго на 42%, у третьего н;; 32% Уровень гликемии оставался у этих больных по-прежнему высоким. Менее выраженный эффект отмечен у пяти больных с исходно невысоким уровнем ФА и умеренной гипергликемией. Под влиянием букарбана происходит незначительное снижение концентрации ФА (больные N 4, 5, 6, 7, 8).

Таблица 3.

Концентрация глюкозы в крови (мМ/ л) н фруктозамина (мкМ/ л) у интактиых крыс и при аллоксановом диабете через 30 дней ежедневного введения букарбана в дозе 0,075 г/ кг и адебита в дозе 0,005 г/ кг

Показатель Интактные крысы, п = 9 У крыс с аллоксановым диабетом

До введения препарата, п= 9 После 30 - дневного введения букарбана, п = 9 До введения препарата, п = 9 После 30 - дневного введения адебита, п = 9

Глюкоза 3,91+0,39 15,34 + 2,56 13,88 + 3,09 13,41 + 1,89 11,76+1,82

Фруктозамин 3,63 + 0,16 7,68 + 0,22 5,70 + 0,24*** 7,57 + 0,11 5,44 + 0,14***

*** р < 0,001 по сравнению с графой « До введения препарата»

Таблица4

Концентрация фрукгтозамна и средний уровень, гликемии у больных ИЗСД

№ больного Фруктозамин, мкМ/ л Гликемия, мМ/ л, (М + ш )

до назначения букарбана после назначения букарбана до назначения букарбана после назначения букарбана

1 ¡3,7 9,8 13,20 + 0,57 13,58 + 0,66

2 12,4 10,2 11,90 + 0,50 10,86 + 0,25

3 11,7 9,1 12,35 + 0,79 12,84 + 0,40

4 9,4 8,7 9,60 + 0,25 8,40 + 0,39*

5 8,6 8,2 8,28 + 0,44 9,03 + 0,34

6 8,6 8,6 10,16 + 0,71 7,90 + 0,82

7 7,8 6,8 7,74 + 0,68 8,32 + 0,44

8 7,2 7,2 9,19 + 0,50 11,06 ±0,67*

*р < 0,05 по сравнению с графой «До назначения букарбана»

Оценка достоверности различий уровня ФА до и после лечения, проведенных в одной и той же группе больных с применением разностного метода, показала достоверное уменьшение ФА под влиянием терапии букарбаном: М ± m составила 1.35 ± 0,49 мкМ/л (п=8, р<0,05).

В контрольном исследовании, то есть когда больные получали только инсулинотерапию, уровень ФА тесно коррелировал со средними цифрами глюкозы (1=0,841, п=12, р<0,001). После назначения букарбана отмечена потеря корреляции между ФА и средним уровнем гликемии ( г=0,431, п=8, р>0,05). В данном случае глюкоза не является единственным определяющим фактором концентрации ФА. Потеря корреляции свидетельствует о способности букарбана тормозить гликозилирование сывороточных белков.

Мы обнаружили новое свойство у ранее применяемых препаратов - это способность уменьшать образование ФА. Полученные результаты приобретают особое значение, так как именно гликозилирование белков лежит в основе формирования ангиопатий. По-видимому, наши результаты могут служить предметом дискуссии о целесообразности применения этих препаратов совместно с инсулином при ИЗСД в тех случаях, когда компенсация углеводного обмена по каким-либо причинам затруднена и имеется угроза формирования диабетических ангиопатий.

ВЫВОДЫ

1. При декомпенсированном инсулинозависимом сахарном диабете отмечается усиление перекисного окисления липидов, которое выражается в накоплении малонового диальдегида и диеновых конъюгатов. Не обнаружено достоверных различий в уровне продуктов пероксидации как при впервые выявленном диабете, так и при длительно текущем заболевании, осложненном микроангиопатиями.

2. Общая антиоксидантная активность плазмы как интегральный показатель неферментативной противоперекисной системы возрастает при впервые выявленном диабете и возвращается к норме при формировании МАП, что на фоне оксадантного стресса способствует развитию сосудистых осложнений.

J.A;;tiwhoc'ü. янтиоксидантных противоокислительных ферментов-супероксиддисмутазы и каталазы сыворотки, глутатионпероксидазы >рл itíui.'í roe у больных с впервые выявленным диабетом и у лиц с длительно текущим заболеванием, осложненным микроангиопатиями, не отличается от ::оры. Исключение составляет группа больных с тяжелым течением млгроанлгепагкй, сопровождающимся нарушением функции органов. У них отмечено повышения активности супероксиддисмутазы, что может быть связано с деструкцией клеток и выходом фермента из цитозоля в сыворотку. 4. Концентрация селена в сыворотке крови больных инсулинозависимым сахарным диабетом подвержена значительным индивидуальным колебаниям и статистически достоверно не отличается от концентрации селена у здоровых лиц.

i Отмечена положительная корреляция между концентрацией селена '.¡¡•сго кк крови и атерогенными факторами - липопротеинами низкой ялоптс-и, обшим холестерином, триглицеридами и отрицательная "■(VpjjisnaK с лнтиагерогенным фактором - липопротеинами высокой íuo.KocTH у }доровы.ч лиц. У больных инсулинозависимым сахарным /чк.б-пом отмечено нарушение корреляции между уровнем селена сыворотки н лнпндами. что может способствовать развитию сосудистых осложнений при дилбете.

6. У больных инсулинозависимым сахарным диабетом отмечается снижение в сыноротке концентрации одного из компонентов неферментативной антиокислительной системы - мочевой кислоты.

7. Гликозилирование липопротеинов низкой плотности in vitro сопровождается накоплением в них малонового диальдегида. Это связывает процессы гликозилирования и перекисного окисления лииидов, которые могут стимулировать развитие диабетических сосудистых поражений.

?>. В сыворотке крови как здоровых людей, так и больных инсулинозависимым сахарным диабетом обнаружены термоустойчивые низкомолекулярные соединения, которые в физиологических концентрациях препятствуют гликозилированию сывороточного альбумина человека. К ним относятся мочевая кислота, аргинин и в меньшей степени креатинин. 9. Сформулировано понятие о существовании в организме ахггигликозилирующей системы, препятствующей образованию

фруктозамина. Эндогенные вещества, имеющие в своем составе аминогруппу, способны, очевидно, конкурировать с глюкозой за связывание с аминогруппами белка и, таким образом, ингибировать гликозилирование.

10. Лекарственные препараты, имеющие аминогруппу предпочтительно у ароматического ядра (букарбан, бетаназ) или имеющие гуанидиновую группировку (адебит), способны препятствовать гликозилированию сывороточного альбумина человека in vitro в концентрации 10"3М.

11. Ежедневное введение крысам с аллоксановым диабетом букарбана или адебита в течение месяца в высших суточных дозах снижает концентрацию фруктозамина, не изменяя уровня гипергликемии. Это свидетельствует об антигликозилирующем действии букарбана и адебита в целом организме.

12. Пероральный прием букарбана в дозе 0,5 г 2 раза в сутки в течение 25 дней совместно с инсулинотерапией у больных инсулинозависимым сахарным диабетом приводит к уменьшению концентрации фруктозамина при неизменном среднем уровне гипергликемии.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

На основании нашего исследования высказано утверждение о возможности влияния на процесс гликозилирования эндогенных факторов сыворотки крови (мочевой кислоты, аргинина, креатинина), то есть о существовании антигликозилирующей эндогенной системы. Практически важно изучение компонентов этой системы с целью создания лекарственных препаратов нового типа действия, препятствующих гликозилированию белков и предупреждающих формирование микроангиопатий. В то же время таким эффектом могут обладать и лекарственные препараты, имеющие в своем составе аминогруппы. К ним относятся производные сульфонилмочевины и бигуаниды. На основе этих препаратов возможно создание новой группы антигликозилирующих средств, которые могут быть применены для профилактики сосудистых осложнений диабета. Букарбан, обладающий способностью препятствовать гликозилированию в опытах in vitro и in vivo и в некоторой степени у больных инсулинозависимым сахарным диабетом в терапевтических дозах , может быть испытан как средство профилактики диабетических ангиопатий.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1 Концентрация селена в сыворотке крови у больных сахарным диабетом // ?4 итоговая научная конференция профессорско-преподавательского состава военно-медицинского факультета при Куйбышевском медицинском институте. Тез.докл. - Куйбышев, 1991. - С.75-76.

2. Уровень селена и липидов в сыворотке крови больных сахарным диабетом // П Всероссийский съезд эндокринологов. Тез. докл.-Челябинск,1991. -С.120.

3. Взаимосвязь селена сыворотки крови с липидным спектром у больных сахарным диабетом 1 типа//Пробл.эндокринол.-1991.-Ыб.-

С23-25.

4 Селен крови, липиды и циклические нуклеотиды у больных сахарным диабетом //Патология человека и роль препаратов селена и пантов в ее терапии: Тез. докл. - Чита, 1993. - С.73-74.

5. Содержание продуктов перекисного окисления липидов и

состояние антиоксидантной системы при сахарном диабете 1 типа // Современные аспекты эндокринологии. Трудности, ошибки и осложнения в эндокринной хирургии: Тез. докл. Ш Всероссийского симпозиума по хирургической эндокринологии.-Самара, 1994.- С.56-57.

6. Фармакологическая блокада образования фруктозамина при гипергликемии // Актуальные вопросы экспериментальной и клинической фармакологии: Тез. докл. конф. Смоленского медицинского института.-Смсленск, 1994.- С.70-71.

7. Статус селена у здоровых и больных сердечно-сосудистыми заболеваниями Самарского региона // Всероссийская научно-практическая конференция "Экология и здоровье человека".Тез. докл.- Самара,1994.-С.99-100.( соавт. П.А.Лебедев).

8. Влияние на образование гликозилированных форм сывороточного альбумина синтетических противодиабетических средств //П Международная научно-практическая конференция "Экология и здоровье человека".Тез. докл.- Самара, 1995.- С.18 (соавт. Булатова М.В.)

10. Гликозилирование бета-липопротеидов при сахарном диабете как фа!стор развития осложнений //П Международная научно-практическая конференция "Экология и здоровье человека".Тез. докл.- Самара,!995. - С.56 ( соавт. Булатова М.В.)

11. Гликозилирование бета-липопротеидов и их перекисное окисление в опытах in vitro //Рукопись депонирована в ВНИИМИ за N Д-24796 от 14.11.1995

12. Эндогенные факторы плазмы крови, препятствующие гликозилированию сывороточного альбумина человека //Рукопись депонирована в ВНИИМИ за N Д-24797 от 14.11.1995

13. Антигликозилирующее действие некоторых лекарственных средств, применяющихся для лечения сахарного диабета // Рукопись депонирована в ВНИИМИ за N Д-24798 от 14.11.1995

14. Сульфаниламиды и бигуаниды как блокаторы неферментативного гликозилирования белков // Рукопись депонирована в ВНИТИ за N 145I-B96 от 05.05.1996.

15. Эндогенные и экзогенные вещества, предотвращающие гликозилирование белков плазмы крови при сахарном диабете //111 Российский национальный конгресс "Человек и лекарство".Тез. докл. -Москва, 1996. - С. 151.

16.Plasma antioxidants and vascular complications in poorly controlled insulindependent diabetes //1 World congress on prevention of diabetes and its complications.- Lyngby, Denmarc,1996. - P.196.( соавт.Вербовая Н.И.).

17. Медикаментозная блокада образования фруктозамина в эксперименте //Ш Всероссийский съезд эндокринологов. Тез. докл.-Москва, 1996. - С.19.

18. Диабетические микроангиопатии и антиоксидантные системы плазмы крови //Ш Всероссийский съезд эндокринологов. Тез. докл.- Москва, 1996. -С. 64.

19. Влияние компонентов плазмы крови на гликозилирование сывороточного альбумина человека//Пробл. эндокринол.- 1996.-N 3.- С.32-34.

20. Антиокислительные системы плазмы крови в патогенезе диабетических микроангиопатий // Пробл. эндокринол.-1996.-N 5.-С.10-11

21. Гликозилированные белки как инициаторы перекисного окисления липидов при сахарном диабете //Современное состояние и перспективы

научных исследований в области фармации: Тез. докл. научно-практической конференции, посвященной 25-летию фармацевтического факультета Самарского государственного медицинского университета. -Самара, 1996. -С.241-242.

22. Антигликозилнрующее действие пероральных сахароснижающих

обоснование их применения при инсулинзависимом сахарном диабете // Современное состояние и перспективы научных исследований в области фармации: Тез. докл. научно-практической конференции, посвященной 25-летию фармацевтического факультета Самарского государственного медицинского университета .- Самара, 1996.-С.242-243.

23. Фармакологическая блокада гликозилирования белков при сахарном ди:;бете производными сульфонилмочевины и бигуанидами //Экспер. и клин.

фгр'.!3"оло! 1«я.- 1996,- N 5.-С. 40-42.

21. Антиокендэтный статус плазмы крови у больных сахарным диабетом 1 vn»a J 1овые технологами в клинической медицина: Сб. научных трудов, пе;.ьлте5шый 60-леткю клиники Самарского государственного .«.,.-;• ¡донского университета . - Самара, 1996,- С.93-95.

25. Гликознлкрованные продукты и их роль в формировании сосудистых осложнений сахарного диабета: Обзор //Пробл. эндокрииол.-1997.- N1,-С.43-46. (соавт.Вербовая Н.И.)