Автореферат и диссертация по медицине (14.00.16) на тему:Антиатерогенные изменения у животных с гиперхолестеринемией под влиянием комплекса симвастатина с глицирризиновой кислотой

На правах рукописи

СТАХНЕВА Екатерина Михайловна

АНТИАТЕРОГЕННЫЕ ИЗМЕНЕНИЯ У ЖИВОТНЫХ С ГИПЕРХОЛЕСТЕРИНЕМИЕЙ ПОД ВЛИЯНИЕМ КОМПЛЕКСА СИМВАСТАТИНА С ГЛИЦИРРИЗИНОВОЙ

КИСЛОТОЙ

14.00.16 — патологическая физиология 03.00.04 — биохимия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

00347ьО14

Новосибирск 2009

003476814

Работа выполнена в Учреждении Российской академии медицинских наук Научно-исследовательский институт терапии Сибирского отделения Российской академии медицинских наук (Новосибирск) и Учреждении Российской академии медицинских наук Научно-исследовательский институт молекулярной биологии и биофизики Сибирского отделения Российской академии медицинских наук (Новосибирск)

Научные руководители:

доктор медицинских наук, профессор Рагино Юлия Игоревна

доктор медицинских наук, профессор Вавилпн Валентин Андреевич

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Колпаков Аркадий Ростиславович

доктор биологических наук Гилинский Михаил Абрамович

Ведущая организация:

Учреждение Российской академии медицинских наук Научно-исследовательский институт биохимии Сибирского отделения Российской академии медицинских наук

Защита состоится г. в --^У'. часов на заседании

диссертационного совета Д 001.048.01 в Учреждении Российской академии медицинских наук Научный центр клинической и экспериментальной медицины СО РАМН по адресу: ул. Академика Тимакова, 2, г. Новосибирск, 630117. Тел/факс 8 (383) 333-64-56

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Учреждения Российской академии медицинских наук Научный центр клинической и экспериментальной медицины СО РАМН

Автореферат разослан « >ч о» -¿^-2009 г.

Ученый секретарь диссертационного совета,

доктор биологических наук

Пальчикова Н. А.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Гиперхолестеринемия является одним из главных факторов риска атеросклероза и ишемической болезни сердца (Anderson K.M., Castelli W.P., Levy D., 1987), заболеваемость и смертность от которых продолжают оставаться чрезвычайно высокими в России (Оганов Р.Г., Масленникова Г.Я., 2002). В патогенезе атеросклероза, наряду с гиперхолестеринемией, важную роль играют воспаление, окислительный стресс, нарушение функции эндотелия, нарушения гемостаза и другие процессы (Fruchart J.C. et al., 2003, 2007). На сегодняшний день, в этиопатогенетической терапии атеросклероза и ИБС приоритет отдается применению холестерин снижающих лекарственных соединений, главными из которых являются статины - ингибиторы ключевого фермента синтеза холестерина - З-гидрокси-З-метилглутарил-КоА редуктазы (Российские рекомендации ВНОК, 2007). Статины обладают комплексным антиатерогенным механизмом действия и, кроме снижения уровня холестеринемии, ингибируют процессы воспаления и окислительного стресса, нормализуют функцию эндотелия и систему гемостаза (Bellosta S. et al., 2000; Pereira ЕС. et al., 2004; Landmesser U. et al., 2005; Fruchart J.C. et al., 2003, 2007), что в конечном итоге приводит к регрессии атеросклеротических очагов и снижению сердечно-сосудистой смертности по данным мета-анализа на 30-40% (Executive Summary of the Third Report of the National Cholesterol Education, and Treatment of High Blood Cholesterol in Adults, ATP III, 2001,2004).

Наряду с положительным антиатерогенным влиянием, у большинства статинов эффективная терапевтическая суточная доза (20-80 мг) приводит к возникновению нежелательных побочных эффектов - гепатотоксичности, миалгии, миопатии и в редких случаях - рабдомиолиза, обусловленных особенностью метаболизма этих соединений, сопряженного с процессом бета-окисления жирных кислот - основного источника энергии в мышечной ткани (Puddu Р. et al., 2001; Российские рекомендации ВНОК, 2007). Это обстоятельство подчеркивает постоянную актуальность поиска и создания новых статинов с более низкой суточной дозой, то есть более безопасных, и в то же время высоко эффективных в отношении описанного антиатерогенного механизма действия.

Одним из известных современных подходов к созданию новых лекарственных соединений является использование известных фармаконов в виде комплексов с природными комплексонами, в частности, с глицирризиновой кислотой. Ранее было продемонстрировано усиление лекарственного эффекта бутадиона, индометацина (Толстиков Г.А. и др., 1997) и нифедипина (Толстикова Т.Г. и др., 2006) при использовании их в комплексах с глицирризиновой кислотой. Этот подход был использован при создании на базе Новосибирского института органической химии им. H.H. Ворожцова СО РАН нового молекулярного комплекса симвастатина с глицирризиновой кислотой со стехиометрией 1:4 - симваглизина (Патент № 2308947: Толстиков Г.А., Никитин Ю.П., Ляхович В.В., Салахутдинов Н.Ф., Рагино Ю.И., Вавилин

В.А. «Лекарственное средство с гиполипидемическим эффектом Симваглизин», 2007), биологические эффекты которого к началу исследования были не изучены.

Цель исследования: изучить прямой механизм и механизмы некоторых плейотропных влияний антиатерогенного действия in vitrv и in vivo комплексного соединения симвастатина с глицирризиновой кислотой у животных с экспериментальной гиперхолестеринемией.

Задачи исследования:

1. Исследовать силу и тип ингибирования активности З-гидрокси-З-метилглутарил-коэнзим А редуктазы in vitro в микросомах печени крыс под влиянием комплекса симвастатина с глицирризиновой кислотой.

2. Оценить влияние симваглизина на показатели липидного профиля крови (общий холестерин, липопротеины высокой плотности, триглицериды) в сравнении с симвастатином на модели экспериментальной гнперхолестеринемии in vivo.

3. Исследовать гепато- и миотоксичные изменения под влиянием симваглизина по динамике изменений уровней ферментов аспартатаминотрансферазы, аланинаминотрансферазы и креатинфосфокиназы в сравнении с симвастатином при экспериментальной гнперхолестеринемии m vivo.

4. Исследовать влияние симваглизина на параметры окислительно-антиоксидантных нарушений в сравнении с симвастатином при экспериментальной гнперхолестеринемии in vivo.

5. Исследовать влияние симваглизина на показатели функции эндотелия в модели экспериментальной гнперхолестеринемии in vivo. Провести сравнительный анализ с симвастатином.

Научная новизна. Установлено наличие прямого и некоторых плейотропных антиатерогенных эффектов у нового комплексного соединения симвастатина с глицирризиновой кислотой - симваглизина. Механизм прямого антиатерогенного действия симваглизина состоит в ингибировании З-гидрокси-З-метилглутарил-коэнзим А редуктазы. В отличие от симвастатина, известного конкурентного ингибитора фермента, симваглизин является ингибитором З-гидрокси-З-метилглутарил-коэнзим А редуктазы бесконкурентного типа.

При экспериментальной гиперхолестеринемии у крыс и кроликов in vivo показано, что равный по силе гипохолестеринемический эффект достигается дозами симваглизина, содержащими в 2-5 раз меньше симвастатина, чем при дозировании свободного симвастатина. При этом дозозависимость снижения уровня холестерина в крови под влиянием симваглизина имеет у крыс линейный, а у кроликов экспоненциальный характер.

У крыс и кроликов с экспериментальной гиперхолестеринемией т vivo миотоксические изменения под влиянием симваглизина выражены значительно ниже в сравнении с симвастатином.

Показаны некоторые плейотропные механизмы антиатерогенного действия симваглизина у кроликов с экспериментальной гиперхолестеринемией in vivo. Так, под влиянием симваглизина в крови повышается уровень липопротеинов высокой плотности, что указывает на усиление обратного транспорта холестерина. Под влиянием симваглизина в крови снижается уровень малонового диальдегида и повышается активность параоксоназы, что свидетельствует об антиоксидантных изменениях. Снижение в крови уровней фактора Виллебранда и экдотелина-1 под влиянием симваглизина отражает нормализацию функции эндотелиоцитов. Дозы симваглизина, необходимые для проявления этих эффектов, по содержанию симвастатина в комплексе в 3-5 раз ниже, чем доза симвастатина.

Научно-практическая значимость. Теоретическое значение работы состоит в том, что в результате экспериментальных исследований симваглизина показано, что он является более эффективным и безопасным в сравнении с симвастатином гипохолестеринемическим соединением, что свидетельствует о возникновении фармакологического синергизма при комплексировании симвастатина с глицирризиновой кислотой. Продемонстрированы« разные (прямой - холестеринснижающий, плейотропные - усиление обратного транспорта холестерина, антиоксидантный и нормализующий функцию эндотелия) потенциально ангиатерогенные эффекты симваглизина отличаются разным характером дозозависимости (линейный, экспоненциальный, нелинейный обратный), что указывает на наличие у симваглизина, также как и других статинов, разных молекулярных мишеней.

Практическое значение работы состоит в том, что результаты экспериментальных доклинических испытаний симваглизина имеют значение для последующих клинических испытаний 1-й фазы, так как демонстрируют возможность снижения суточной дозы собственно симвастатина в симваглизине с целью уменьшения побочных эффектов препарата при сохранении его холестерин снижающей и в целом антиатерогенной эффективности.

Положения, выносимые на защиту:

1. Ингибирование активности З-гидрокси-З-метилглутарил-коэнзим А редуктазы в микросомах печени крыс под влиянием симваглизина происходит по бесконкурентному типу.

2. У крыс и у кроликов с экспериментальной гиперхолестеринемией под влиянием симваглизина происходит выраженное снижение уровня общего холестерина в крови.

3. У кроликов с экспериментальной гиперхолестеринемией под влиянием симваглизина наблюдаются антиоксидантные изменения и нормализация показателей функции эндотелия в регуляции тонуса сосудов.

Апробация работы. Основные положения диссертации представлены и обсуждены на Республиканской научной конференции "Создание новых лекарственных препаратов" (Томск, 2007), III съезде фармакологов России (С-Петербург, 2007), Российской научно-практической конференции "Профилактика сердечно-сосудистых заболеваний в первичном звене здравоохранения" (Новосибирск, 2008), IV съезде Российского общества биохимиков и молекулярных биологов (Новосибирск, 2008), Российско-норвежском научном симпозиуме "Защита миокарда: молекулярные, патофизиологические и клинические аспекты" (С.-Петербург, 2008), VI Сибирском физиологическом съезде (Барнаул, 2008).

Публикации. По теме диссертационной работы опубликовано 10 научных работ, го них 3 статьи в журналах, рекомендованных ВАК РФ для публикации материалов диссертационных работ.

Объем и структура диссертации. Диссертация включает следующие разделы: введение, обзор литературы, описание материала и методов исследования, 3 главы с результатами исследования, обсуждение, выводы, список используемой литературы. Текст изложен на 122 страницах машинописного текста, иллюстрирован 15 таблицами и 9 рисунками. Список цитированной литературы включает 197 работ, из них 54 отечественных и 143 зарубежных источников.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Исследование проведено в рамках Интеграционного проекта СО. РАН и СО РАМН № 053 «Поиск, создание и доклинические испытания новых биологически активных соединений сердечно-сосудистого, антивоспалительного и антипролиферативного действия. Изучение их биохимических и физиологических эффектов и механизмов взаимодействия с клеточными рецепторами». Учреждения-исполнители проекта: Новосибирский институт органической химии им. H.H. Ворожцова СО РАН (НИОХ СО РАН), Новосибирский институт химической кинетики и горения СО РАН (НИХКиГ СО РАН), НИИ терапии СО РАМН (НИИТ СО РАМН)), НИИ молекулярной биологии и биофизики СО РАМН (НИИ МББ СО РАМН). Координаторы проекта: академик РАН Толстиков Г.А., академик РАМН Никитин Ю.П. На проведение исследований с использованием экспериментальных животных получено разрешение Этического Комитета при ГУ НИИ терапии СО РАМН от 25.01.2006 г., протокол № 02/06, Эксперименты на животных проводились в соответствии с «Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных» (Приложение к приказу Министерства здравоохранения СССР от 12.08.1977 г., №755).

Синтез симваглизина (СВГ) осуществлен в НИОХ им. Н.Н. Ворожцова СО РАН. Характеристики комплекса СВГ получены в НИХКиГ СО РАН с использованием методов ядерного магнитного резонанса и электронной оптической UV-Vis спектроскопии.

Эксперименты по оценке ингибирования активности З-гидрокси-З-метилглутарил-коэнзим А редуктазы симваглизином in vitro выполнены на микросомах печени крыс с использованием 5 самцов крыс Вистар массой 180-200 г, содержащихся на стандартной лабораторной диете. Выделение микросом проводили общепринятым методом дифференциального центрифугирования в среде: 20 мМ Трис-HCl, рН 7.4, 0,15М КС1, 50мМ ЭДТА и 2мМ дитиотрейтол. Конечный осадок - фракцию микросом -ресуспендировали в среде, содержащей ОД М КН2РО4, 20 % глицерин, рН 7,4. Концентрацию белка определяли методом Лоури. Микросомальный метаболизм ГМГ-КоА в экспериментах по определению Ki симваглизина проводили по описанию Kleinsek D.A. и соавт. (1980) с небольшими модификациями. В среду инкубации: 0,1М КН2РО4, рН 7.0, 4шМ дитиотрейтол, ЮтМ ЭДТА, ЮшМ MgCl2, ImM NADPH, 4mM Гл-6-Ф, 2 ED Гл-б-ФДГ, - добавляли суспензию микросом и 2 мин преинкубировали при комнатной температуре. Затем вносили равные объемы СВГ для создания конечных концентраций 75, 150, 300 и 600 нМ и NADPH-генерирующую систему, инкубировали 8 мин при температуре 37°С при постоянном встряхивании для наработки метаболита - ингибитора 3-ГМГ-КоА редуктазы. После этого добавляли меченый субстрат 3-ГМ[3-14С]Г-КоА в конечных концентрациях 28 или 47 мкМ. Общий объем реакционной смеси составлял 100 мкл, содержание белка 0,24 мг. Через 10 мин реакцию останавливали добавлением 2,4 М НС1 и охлаждением на льду.

Подготовку проб к хроматографии начинали спустя 1 час после остановки реакции, необходимый для конверсии мевалоновой кислоты в форму лактона (Jemal М. et al., 2003). К пробам добавляли 10 М КОН для их частичной нейтрализации до величины рН 3,5-4,5, затем центрифугировали при 3000g в течение 5 мин. На колонку наносили 50 мкл надосадка. Разделение продукта (мевалоната) и субстрата (ГМГ-КоА) реакции проводили методом ион-парной обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии по методу Scharnagi Н. и соавт. (1995) на колонке Нуклеосил Cis 5 мкм 250 х 2 мм с предколонкой Vydac Cis 30-40 мкм 30 х 2 мм. Мобильной фазой служил 53 % водный раствор метанола (V/V) и 50 мМ тетрабугиламмоний фосфат, рН 5,1, Скорость потока -150 мкл/мин. Для количественной оценки продукта реакции в виалы собирали 4-минутные хроматографические фракции. Содержимое виал высушивали в токе воздуха при комнатной температуре, сухой остаток растворяли в 7 мл диоксанового сцинтиллятора. Измерения радиоактивности в пробах проводили на бета-счетчике Delta 300 (Голландия).

Эксперименты по оценке гипохолестеринемического. антиоксидантного и нормализующего функцию эндотелия влияний симваглизина выполнены на 30 самцах крыс Вистар массой 180-200 г и 25 самцах кроликов Серый гигант массой 2,5-3 кг. Крысы содержались в клетках по 5 шт., а кролики в индивидуальных клетках. Все животные имели свободный доступ к воде и пище. Для создания экспериментальной гиперхолестеринемии (ГХС) животные находились на высокожировой холестериновой диете, которая широко применяется для развития экспериментальной ГХС с последующей оценкой холестеринснижающего эффекта различных соединений, в частности статинов (Kobayashi М, Ishida F. et al.,1989; Ishida F., Watanabe K. et al.,1990; Hayashi Т., Rani P.J.A. et al,2004). Далее, в период воздействия изучаемыми соединениями, животные вновь переводились на стандартную лабораторную диету, поэтому холестеринснижающий и другие эффекты СВГ оценивались в динамике обратного развития ГХС. При этом чувствительность сравнений возрастала в результате снижения вклада поступающего алиментарным путем холестерина (ХС).

Продолжительность эксперимента на крысах была 6 недель. В эксперимент вошли 30 самцов крыс Вистар массой 180-200 г.. В течение 4 недель создания ГХС животные получали диету, содержащую 3 % ХС, 5 % животного жира, 0,1 % 6-Ы-пропил-2-тиоурацил (для подавления функции щитовидной железы) и 0,3 % таурохолата для улучшения всасывания ХС (Swift L.L. et al., 1982; Salter A.M., Hayashi R. et al, 1991). Далее был 2-х недельный период воздействия, когда 30 крыс были разделены на 6 групп (по 5 в каждой). Группа 1, без фармакологического воздействия, служила контролем. Группы со 2 по 5 в период вмешательства получали гипохолестеринемические соединения: группа 2 - СВ в дозе 200 мкг/кг/сутки; группы 3,4 и 5 - СВГ в дозах 400, 666 и 1000 мкг/кг/сутки, соответственно. В перерасчете на СВ, массовая доля которого в СВГ составляет 0,1 от молекулярной массы, эти дозы в 3, 4 и 5 группах соответствовали 40, 66 и 100 мкг/кг/сугки. Группа 6 получала глицирризиновую кислоту (ГК) в дозе 900 мкг/кг/сутки массы тела, что соответствовало её содержанию в максимальной дозе СВГ (9/10 от 1000 мкг/на кг веса/сутки). В период фармакологического воздействия все животные находились на стандартной лабораторной диете и получали препараты вместе с пищей. В дни забора крови в точках «0, 4 и 6 недель» утром у крыс забирали по 1 мл крови из хвостовой вены. За 12 часов до забора крови животные лишались корма при сохранении доступа к воде.

Эксперимент продолжительностью 80 дней был выполнен на 25 кроликах Серый гигант, массой 2,5-3 кг. В течение 30 дней создания ГХС животные получали диету, содержащую 3 % ХС и 5 % животного жира. Далее был 30-дневный период воздействия, когда 25 кроликов были разделены на 5 групп (по 5 в каждой). Описание групп и доз препаратов в них было аналогичным эксперименту на крысах. Дозы препаратов вводили 1 раз в сутки per os в 1 % крахмальной суспензии. В следовый период после введения препаратов (с 60 по 80 день) животные находились только на стандартной лабораторной

диете. В дни забора крови в точках «О, 30, 40, 50, 60, 70 и 80 дней» утром у кроликов забирали по 3 мл крови из ушной вены. За 12 часов до забора крови животные лишались корма при сохранении доступа к воде.

Показатели липидного профиля крови (общий холестерин (ХС), ХС липопротеинов высокой плотности (ЛВП-ХС), триглицериды (ТГ)) и активности аспартагаминотрансферазы (ACT), аланинаминотрансферазы (АЛТ) и креатинфосфокиназы (КФК, фракция CK-Nac) в крови определяли с использованием наборов «Biocon» (Германия) на биохимическом анализаторе «Labsystem-F-900» (Финляндия).

Об антиоксидантном влиянии препаратов судили по уровню продуктов ПОЛ в сыворотке крови, который оценивали по концентрации МДА флюориметрическим методом (Schuh J. et al., 1978) на спектрофлюориметре «VersaFluor» (Bio-Rad, США) при длинах волн Ех 515 нм и Еш 553 нм при использовании в качестве стандарта 1,1,3,3-тетраметоксипропанол (Sigma) и по активности параоксоназы (PON) в сыворотке крови, которую измеряли в трис-HCl буфере, рН=8,0 фотометрическим методом (Mackness В. et al., 1998).

О влиянии на функцию эндотелия судили по содержанию в сыворотке общего нитрита, который определяли фотометрическим методом с использованием реактива Грисса, детекция при 540 нм, измерения проводили на спектрофотометре «Unicol200/1201» (США); фактора Виллебранда, определяемого ИФА тест - системами «Technoclone», дегекция при 450 нм и эндотелина-1 (ИФА тест - система «Biomedica Group», 450 нм). Все измерения проводили на ИФА анализаторе «Multiscan EX» (Финляндия).

Статистическую обработку результатов проводили в лицензионной версии программы SPSS for Windows с применением критерия Стьюдента, корреляционного и дисперсионного анализа (One-Way ANOVA) с использованием критерия Даннета для множественного сравнения. Значения в таблицах представлены как М±т, где М - среднее арифметическое значение, ш - ошибка среднего. Непараметрические статистические расчеты, которые включали анализ различий для трех и более связанных групп по Фридмену, парные сравнения по Вилкоксону, анализ для трех и более независимых групп и парные сравнения по Манну-Уитни проводили с использованием программ Statistica 7.0. Константы ингибирования рассчитывали в программе Excel. Статистически достоверными считали различия при р<0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ II ОБСУЖДЕНИЕ

В настоящей работе основной антиатерогенный механизм действия СВГ как представителя класса статинов, заключающийся в прямом ингибировании синтеза ХС в клетке, был изучен в экспериментах in vitro с микросомами печени крыс и in vivo на модели экспериментальной ГХС у крыс и кроликов.

Ингибирование активности З-гидрокси-З-метилглутарнл-КоА редуктазы in vitro под влиянием симваглизина

Определение типа и константы ингибирования было проведено с использованием двух концентраций субстрата, равных 28 и 47 мкМ, и четырех концентраций СВГ, равных 75, 150, 300 и 600 нМ. Анализ типа ингибирования графическим методом Корниш-Боудена (рис. 1А) в координатах «отношение концентрации субстрата к скорости реакции» - «концентрация ингибитора» дал величину К,= 94,18 нМ и свидетельствовал о бесконкурентном типе ингибирования. Однозначным подтверждением бесконкурентного типа ингибирования являются параллельные прямые (рис. 1Б) для различных концентраций субстрата, получаемые в координатах «обратная скорость реакции» -«концентрация ингибитора» по методу Диксона, поскольку для такого типа ингибирования максимальная скорость реакции и константа Михаэлиса меняются в одинаковое число раз.

А

концентрация ннгнбнторп, нМ

О 100 200 300 400 500 600 700

концентрации ингибитора, им

Д концентрация субстрата 28 мкМ □ концентрация субстрата 47 мкМ

Рис. 1. Графическое определение константы и типа ингибирования ГМГ-КоА редуктазы симваглизином. А - анализ по методу Корниш-Боудена; Б - анализ по методу Диксона

Как показано ранее, сам СВ является конкурентным ингибитором З-гидрокси-З-метилглутарил-коэнзим А (ГМГ-КоА) редуктазы (Vickers S. et al., 1990; Hoffman W.F. et al., 1986). Рентгеноструктурный анализ показал, что это обусловлено оккупацией 3-метилглугарил-подобной частью статинов участка активного центра фермента, связывающего остаток 3-метилглутарил естественного субстрата - 3-метилглутарил-КоА (Istvan E.S., 2002).

Физико-химической основой изменения типа ингибирования с конкурентного, присущего СВ, на бесконкурентный, выявленный для СВГ, по-видимому, является увеличение размера комплекса в сравнении с исходной молекулой СВ и наличие несущих заряд функциональных групп у остатков ГК, что усиливает взаимодействие. Последнее, вероятно, проявляется увеличением времени распада комплекса «фермент-продукт» -кинетической основы бесконкурентного типа ингибирования (Корншн-Боуден Э., 1979).

Полученные в условиях in vitro результаты о том, что СВГ снижает и Кт, и Vmax синтеза мевалоната, обусловили целесообразность оценки его ожидаемого гипохолестеринемического эффекта у крыс и у кроликов с ГХС в условиях in vivo,

Холестеринснижающее воздействие симваглизина у крыс с гиперхолестеринемией in vivo

Результаты проведенного анализа показывают (табл. 1), что во всех группах в результате диетической нагрузки было достигнуто статистически значимое увеличение уровня общего ХС крови, а через две недели экспериментального воздействия - снижение этого показателя. Тем не менее, при сравнении показателей в нулевой точке и на 6 неделе статистически достоверными оставались различия в группе «контроль», группе с минимальной дозой СВГ и в группе с ГК. Это доказывает, что процессы спонтанного обратного развития экспериментальной ГХС с прекращением диетической нагрузки еще не завершились в группе «контроль», и фармакологические эффекты минимальной дозы СВГ и ГК были недостаточны для их завершения. И только в группах, получавших СВ в дозе 200 мкг/кг/день и СВГ в дозах 666 и 1000 мкг/кг/день снижение показателя привело к исчезновению различий с исходной точкой, что свидетельствует об эффективности исследуемых доз СВГ (табл. 1).

Анализ различий в содержании общего ХС крови между группами крыс по методу Краскела-Уоллеса в разные сроки эксперимента вьивил их отсутствие в нулевой точке (критерий Н=21,63; р=0,22) и после 4-недельного кормления крыс высоко жировой диетой (Н=3,82; р=0,575). Напротив, анализ результатов на 6 неделе эксперимента показал сильные эффекты исследуемых субстанций на уровень общего ХС крови крыс (Н=21,63, р=0,0006), поэтому были выполнены парные сравнения по критерию Манна-Уитни.

Таблица 1

Изменения уровня общего холестерина крови (мг/дл)

у крыс в динамике эксперимента in vivo

Группы Сроки наблюдений (недели) Результаты анализа по методу Фридмена Описательная статистика и результаты парных сравнений по Вилкоксону

х2(р) коэфф. Кендалла Медиана 25% квартиль 75% квартиль

0 10,0 (р = 0,0067) 1,0 93,90 93,90 97,80

Кошроль 4 148,20* 137,80 148,50

(п = 5) 6 108,0Л,# 104,70 109,50

СВ200 0 8,40 (р-0,015) 0,84 95,90 94,60 97,40

мкг/кг/сут 4 140,70* 136,30 143,40

(п = 5) 6 96,50л 96,40 97,20

СВГ 400 0 10,0 (р = 0,0067) 1,0 95,80 95,40 100,60

мкг/кг/сут 4 135,40* 134,90 144,80

(п = 5) 6 101,90А,# 100,40 105,80

СВГ 666 0 7,60 (р - 0,022) 0,76 102,40 97,30 102,50

мкг/кг/суг 4 149,80* 135,40 150,60

(п = 5) 6 98,40л 96,70 98,90

СВГ 1000 0 8,40 (р = 0,015) 0,84 101,90 98,50 102,30

мкг/кг/сут 4 139,70* 137,80 139,90

(п = 5) 6 97,60л 91,40 98,10

ГК900 0 10,0 (р - 0,0067) 1,0 97,40 96,70 101,20

мкг/кг/сут 4 145,10* 137,50 146,10

(п = 5) 6 105,10л,# 104,70 108,00

Примечание: р —- уровень значимости различий показателей;

* — р < 0,05, где р - уровень значимости различий показателей на 0 и 4 неделях эксперимента в парных сравнениях по критерию Вилкоксона;

л — р < 0,05, где р -уровень значимости различий показателей на 4 и б неделях эксперимента в парных сравнениях по критерию Вилкоксона;

# — р < 0,05, где р -уровень значимости различий показателей на 0 и 6 неделях эксперимента в парных сравнениях по критерию Вилкоксона.

В результате парных сравнений (табл. 2) было установлено, что:

1) группы, получавшие СВ и СВГ в дозах 666 и 1000 мкг/кг/день, имеют достоверно более низкие величины общего ХС в сравнении с контрольной группой;

2) группы, получавшие СВ и СВГ в дозах 666 и 1000 мкг/кг/день, имеют достоверно не различающееся содержание общего ХС в крови, то есть сходное по силе свободного СВ

воздействие достигается в 2-3 раза более низкими дозами СВ в комплексе с глицирризиновой кислотой;

3) имеет место статистически значимое дозо-зависимое нарастание воздействие СВГ;

4) глицирризиновая кислота в испытанной дозе не обладает самостоятельным холестерин снижающим эффектом.

Таблица 2

Уровни значимости различий в содержании общего холестерина между группами на 6

неделе эксперимента в парных сравнениях по критерию Манна-Уитни

Контроль СВ200 мкг/кг/cvr СВГ 400 мкг/кг/сут СВГ 666 мкг/кг/сут СВГ 1000 мкг/кг/сут ГК 900 мкг/кг/сут

Контроль

СВ 200 мкг/кг/сут 0,008

СВГ 400 мкг/кг/сут 0,22 0,008

СВГ 666 мкг/кг/сут 0,016 0,22 0,03

СВГ 1000 мкг/кг/сут 0,008 0,84 0,008 0,42

ГК 900 мкг/кг/сут 0,5 0,008 0,42 0,016 0,008

Снижение уровня общего ХС крови в сравнении с контролем в процентом выражении составило у животных, получавших СВ в суточной дозе 200 мкг/кг 10 %. Дозо-зависимое снижение от доз 666 и 1000 мкг/кг/сутки СВГ, равных в весовом эквиваленте 66 и 100 мг СВ, привело к достоверному снижению уровня общего ХС крови на 9 % и 11 %. В группе с ГК снижения уровня общего ХС крови в сравнении с контролем отмечено не было.

Полученные результаты свидетельствуют о более выраженном у СВГ в сравнении с СВ гипохолестеринемическом действии в условиях in vivo, что создает возможность снижения его дозы, имея ввиду содержание СВ в СВГ. Относительно механизмов, лежащих в основе этого усиления, можно предположить, что у комплекса большее число молекулярных мишеней, принимая во внимание его химическое строение. Кроме того, и у СВ и у СВГ мишенью является ГМГ-КоА редуктаза. Симвастатин, обладая структурным сходством с ГМГ-КоА, оккупирует его участок связывания в активном центре ГМГ-КоА редуктазы. При этом размеры фермент-статинового комплекса таковы, что NADPH-связывающий участок остается совершенно не затронутым (Istvan Е. и Deisenhofer J., 2001). Эти авторы предположили, что создание статинов, покрывающих NADPH-связывающий участок, позволит улучшить их характеристики. Вероятно, увеличение размера комплекса СВГ и наличие в комплексе функциональных групп ГК приводит к увеличению количества точек его связывания в активном центре и за его пределами, что ведет к более выраженному холестеринснижающему влиянию СВГ.

В отличие от выраженного влияния на содержание общего ХС, статистически значимые эффекты в отношении ЛВП-ХС у крыс практически отсутствовали. Исключение составили только различия между 4 и б, 0 и 6 неделями в группе с минимальной дозой СВГ и различия между 4 и 6 неделями в группе со средней дозой СВГ. В результате анализа по методу Краскела-Уоллеса было выявлено отсутствие различий между группами по этому показателю во все сроки эксперимента. В нулевой точке Н=8,05, р=0,15, после диетической нагрузки (4 недели) Н=5,71, р=0,335, после фармакологического воздействия (6 недель) Н=8,89, р=0,114.

Согласно данным других авторов, статистически достоверные изменения этих показателей можно достигнуть при использовании доз СВ, на порядок превышающие использованные нами. Так, симвастатин в суточной дозе 2,5-10 мг/кг в течение 4-6 недель у кроликов с ГХС повышает уровень ЛВП-ХС на 5-15 % и снижает уровень ТГ на 10-30 % (Kobayashi М. et al., 1989; Plosker G.L., McTavish D., 1995), причем в работе Plosker G.L. и McTavish D. статистическая достоверность не достигается. Оценки эффектов симвастатина у 4444 пациентов с ИБС показали, что уровень ЛВП-ХС повысился в среднем на 8 % после приема доз СВ 20-40 мг/сугки (Scandinavian Simvastatin Survival Study (4S), Lancet, 1994). Известно также, что действие СВ на ТГ крови опосредованное и связано со снижением образования и секреции гепатоцитами липопротеинов очень низкой плотности (ЛОНП), содержащих около 30 % ТГ, и усилением связывания и катаболизма ремнантов ЛОНП апо-В,Е-рецепторами гепатоцитов (Alberts A.W., 1990; Ginsberg H.N. et al, 1987).

Холестеринснижающес воздействие симваглмзина у кроликов с ГХС in vivo

Результаты измерения показателей липидного профиля крови у кроликов показали, содержание их на холестериновой диете в течение первых 30 дней эксперимента привело к развитию выраженной ГХС (2309,0±223,2 мг/дл) (табл. 3). В контрольной группе снижение уровня общего ХС достигло статистической значимости в сравнении с исходным значением ГХС через 20 дней — на 35 %. В то же время, в группах СВ и 3-х разных доз СВГ уже через 10 дней приема препаратов было получено снижение уровня общего ХС на 30-36 %.

Важно отметить, что в группах, получавших СВГ и СВ, показатели снижения . общего ХС были сходными, несмотря на то, что дозы СВГ были в 2, 3 и 5 раза меньше дозы СВ (табл. 3). Во всех опытных группах в сравнении с контрольной через 20 дней приема препаратов наблюдалась достоверная сходная разница в снижении уровня общего ХС на 36-47 %. Существенно, что холестеринснижающий эффект СВГ не уступал таковому у собственно СВ, несмотря на уменьшение его дозы в 2-5 раз в составе комплекса. Из этого следует, что сила воздействия СВГ превышает таковую у СВ. При сравнении силы холестеринснижающего воздействия СВГ у кроликов не было получено достоверных различий между дозами СВГ, в отличие от крыс.

Таблица 3

Изменение уровня общего холестерина крови (мг/дл) у кроликов в динамике ___эксперимента (М±т)_____

Сроки наблюдений Группы 0 дней 30 дней, исходная ГХС 40 дней 50 дней 60 дней 70 дней 80 дней

Контроль 69,2±2,8 2295,6 ±220,1 1863,5 ±201,4 15Щ6 ±167,3 1240,3 ±128,0 895,6 ±88,2 571,2 ±60,1

СВ 200 мкг/кг вес а/сутки 71,0±2,9 2281,3 ±208,5 1582,6 ±169,6 930,2 ±96,2 # 710,2 ±80,3 # 588,3 ±66,2 # 358,3 ±40,1 #

СВГ 1000 мкг/кг веса/сутки 59,7±2,6 2342,0 ±217,2 1600,5 ±167,7 798,3 ±83,9 # 676,1 ±72,5 # 540,3 ±55,0 # 295,9 ±32,1 #

СВГ 666 мкг/кг веса/сутки 70,6±3,4 2326,1 ±228,6 1477,3 ±160,2 972,8 ±100,6 # 709,7 ±81,2 # 688,8 ±66,3 # 580,5 ±60,0

СВГ 400 мкг/кг веса/сутки 73,1±3,3 2308,4 ±225,0 1610,0 ±162,2 923,2 ±96,4 # 801,0 ±75,7 # 534,2 ±55,9 # 372,1 ±40,3 #

Примечание: # — статистически значимые отличия по сравнению с контролем (р<0,05)

Поскольку достоверных различий не наблюдалось и в сравнениях эффектов всех доз СВГ с эффектом симвастатина, это указывает на то, что в использованном интервале доз сила эффекта приближается к насыщению в соответствии с известным экспоненциальным характером дозозависимости холестеринснижающего эффекта статинов (Князькова И.И. и др., 2006). В эксперименте на кроликах с ГХС, в отличие от крыс с ГХС это подтверждается особенно ярко. По-видимому, кролики не только более подвержены развитию ГХС путем кормления ХС per os, но и более восприимчивы к воздействию статинов и имеют иную зависимость эффекта от дозы СВГ в сравнении с крысами, и линейный участок дозовой зависимости у них лежит в области более низких концентраций СВГ, чем использованные в данной работе.

Уровень ЛВП-ХС в контрольной группе в динамике эксперимента не изменился. В группе СВ и в группе с максимальной дозой СВГ - значимо повысился через 20 дней приема препаратов на 25-29 % в сравнении с величиной показателя 30-го дня эксперимента (29,8±3,0 мг/дл), а через 30 дней введения препаратов был достоверно выше на 20-26 % в сравнении с контролем. Полученный результат подтверждает известный имеющийся у СВ дополнительный антиатерогенный механизм действия по активации обратного транспорта ХС (Шевченко О.П., Шевченко А.О., 2003) и указывает также на его наличие и у СВГ.

Влияния исследуемых препаратов на уровень ТГ крови в динамике эксперимента не отмечено.

Таким образом, в условиях in vivo холестеринснижающее воздействие СВГ превосходит таковое у СВ. Это свидетельствуют о фармакологическом синергизме в

результате образования комплекса симвастатина с глицирризиновой кислотой. Аналогичные проявления комплексообразования уже были показаны ранее на примере антиаритмических и гипотензивных препаратов (Толстиков Г.А. и др., 1997; Толстикова Т.Г. и др., 2006). Исходя из химического строения СВГ, можно предположить большее, чем у СВ, число молекулярных мишеней, формирующих механизм его гипохолестеринемнческого эффекта in vivo. Вероятно, реализуются все присущие СВ фармакологические свойства: ингибирование ГМГ-КоА редуктазы, что приводит к снижению синтеза ХС в гепатоцитах; стимуляция синтеза апо-В,Е-рецепторов к ЛНП на плазматических мембранах гепатоцитов, увеличение захвата гепатоцитамн ЛНП из крови и снижение уровня холестеринемии (Lennemas Н., Fager G., 1997); ингибирование синтеза апо-В и за счет этого снижение образования гепатоцитами ЛНП и ЛОНП, усиление связывания и катаболизма ремнантов ЛОНП апо-В,E-рецепторами (Ginsberg H.N. et al, 1987).

Миотоксические изменения под влиянием симваглизина in vivo

Известно, что наряду с ценным терапевтическим гипохолестеринемическим эффектом, статинам присущ ряд неблагоприятных свойств, среди которых выделяются гепато- и миотоксичность. Поэтому необходимо было оценить полученный комплекс в этом отношении.

Какого-либо повышения уровней печеночных ACT и АЛТ в крови в динамике экспериментов у крыс и у кроликов, получавших СВ и СВГ, выявлено не было, что указывает на отсутствие гепатотоксичности препаратов в использованных дозах. Более того, ранее показан гепатопротекторный эффект ГК, выражающийся в снижении активности трансаминаз и липидных пероксидов в гепатоцитах при воздействии таких токсикантов, как аллилформиат, четыреххлористый углерод (Толстиков Г.А. и др, 1997).

Миотоксичность характерна для всех статинов. Экспериментальные исследования указывают на повреждение митохондрий в качестве возможной причины миотоксичности статинов. Так, Bergman М. et al, 2003, обнаружили некроз и дегенерацию мышечных фибрилл при световой микроскопии и набухание митохондрий и разрушение миофибрилл при электронной микроскопии у мышей Balb, получавших правастатнн. Сила миотоксичности статинов прямо коррелирует с их гидрофобностью (Diaz-Zagoya et al, 1999). Поперечно-полосатая мускулатура более чувствительна к повреждающему действию статинов в сравнении с сердечной мышцей и печенью (Bergman М. et al, 2003). В качестве молекулярных механизмов миотоксичности статинов предполагают ингибирование ими бета-гидрокси-ацил-КоА-дегидрогеназы и ацил-КоА-дегидрогина-зы — ферментов цикла бета-окисления жирных кислот, в результате блокады которого нарушается синтез АТФ в митохондриях мышц и возникают миотоксические структурные изменения (Kauffmann Р. et al, 2006).

Уровень активности КФК в крови у крыс после 2-х недельного воздействия исследуемыми препаратами повысился. У крыс, получавших СВ, этот показатель возрос на 79 %, а у получавших СВГ — на 30-36 % (табл. 4). В группе животных, получающих ГК в период 2-х недельного активного вмешательства, уровень КФК крови значимо не изменился, что указывает на отсутствие миотоксических биохимических изменений у животных этой группы.

Таблица 4

Изменения уровня креатннфосфокмназы крови (ЕД/л) у крыс в динамике __эксперимента in vivo_

сроки СВ 200 СВГ 400 СВГ 666 СВГ 1000 ГК 900

наблюдений Контроль мкг/кг/сут мкг/кг/сут мкг/кг/сут мкг/кг/суг мкг/кг/сут.

0 недель 457,4 ±20,1 439,6 ±20,4 409,2 ±26,4 438,4 ±20,0 408,8 ±21,5 437,1 ±20,5

4 недели 384,7 ±20,4 386,6 ±21,4 363,2 ±18,5 373,6 ±20,4 356,5 ±18,9 380,5 ±19,4

6 недель 384,1 ±15,7 667,6 +26,0 501,0 +19,7 484,6 ±21,0 506,4 ±21,8 414,1 +20,1

Разница с ГХС 4-й недели 0% +73%* +38%* +30%* +42%* +9%

Разница с контролем +74%А +30%л +26%л +32%л +8%

Разница с группой СВ -25%** -27%** -24%** -38%**

Примечание: * — статистически значимые отличия по сравнению с данными 4 недель (р<0,05); л — статистически значимые отличия по сравнению с контролем (р<0,05); ** — статистически значимые отличия по сравнению с группой СВ (р<0,05).

Результаты измерения уровня активности КФК в крови у кроликов в динамике эксперимента показали, что в группе СВ этот показатель через 30 дней введения был на 64 % выше, чем в контрольной группе. В трех группах, получавших СВГ, уровень КФК в динамике эксперимента повышался менее выражено. Повышение было недостоверным как в сравнении с исходными значениями, так и с показателями контрольной группы, а через 30 дней введения препаратов (точка «60 дней») в группах, получавших СВГ, этот показатель был на 24-29 % ниже, чем в группе СВ.

С учетом содержания СВ в СВГ, можно констатировать сходство в силе миотоксического эффекта двух этих препаратов. Однако, более сильный гипохолестеринемический эффект обеспечивает большую безопасность СВГ, чем СВ.

Таким образом, СВГ является более эффективным и безопасным в сравнении с СВ гипохолестеринемическим соединением. Результаты работы подтверждают полученные ранее данные (Толстиков Г.А. и др, 1997; Толстикова Т.Г. и др, 2006) об эффекте фармакологического синергизма при комплексировании некоторых фармакологических соединений с ГК. В данном случае показана возможность снижения суточной дозы собственно СВ в комплексном соединении СВГ, приводящая к уменьшению побочных эффектов при сохранении эффективности.

Антиоксидантные изменения и нормализация функции эндотелия под влиянием симваглизина у кроликов с ГХС in vivo

Из известных для статинов плейотропных эффектов их в целом антиатерогенного механизма действия, осуществляемых через активацию ядерных PPAR-альфа рецепторов (C.-J. Fruchart et al., 2003, 2007), в настоящей работе, наряду с эффектом активации обратного транспорта ХС, были также оценены антиоксидантный и нормализующий функцию эндотелия эффекты СВГ.

Механизмы антиоксидантных изменений под влиянием статинов связаны с увеличение числа апо-В,Е-рецепторов на мембранах гепатоцитов и укорочением времени циркуляции частиц ЛНП в крови. Кроме того, антиоксидантные изменения под влиянием статинов напрямую могут быть обусловлены активацией обратного транспорта ХС, повышением количества частиц ЛВП и активности, связанного с ними фермента параоксоназы (PON). В совокупности эти факторы приводят к уменьшению окислительной модификации ЛНП.

Так как ранее было показано, что СВ снижает активность окислительных процессов (Pereira Е. et al., 2004) и нормализует функцию эндотелия (Huggies et al., 1998; Laufs et al., 1998; Mullen et al., 1997; Landmesser U. et al., 2005) у пациентов с ГХС и ИБС, то были исследованы антиоксидантное и нормализующее функцию эндотелия воздействие СВГ.

Оценка антиоксидантного воздействия препаратов в динамике показала, что в группе СВ после 20 дней введения препарата и далее уровень продуктов перекисного окисления липидов (ПОЛ) в крови был ниже на 23-31 % в сравнении с контролем. В группах, получавших СВГ с уменьшенной в 3 и 5 раз дозой СВ, выраженное снижение этого показателя было отмечено через 10 дней воздействия (в точке «40 дней») в сравнении с контролем на 21 % и 37 % и в сравнении с группой СВ на 27 % и 41 %, соответственно.

Активности связанному с ЛВП антиоксидантному ферменту PON, способному при взаимодействии с частицами ЛНП сдерживать их окислительную модификацию, придается важное значение в патогенезе атеросклероза (Mackness В., Mackness М., 1998). Результаты настоящего исследования показали, что в группе СВ и в 3-х группах СВГ со сниженными в 2, 3 и 5 раз дозами СВ имело место сходное повышение этого показателя в сравнении с контролем на 42-60 %, 48-54 %, 29-39 % и 37-45 %, соответственно, что указывает на антиоксидантную активность всех исследованных доз СВГ (табл. 5).

Возможное влияние СВГ на эндотелий мы оценивали по уровню в крови таких биомаркеров, как метаболиты оксида азота (NO), являющегося основным вазодилататором, постоянно секретирующимся эндотелиоцитами, фактор Виллебранда (ФВ), выделяющийся эндотелиоцитами в кровь при их стимуляции, активации или повреждении и эндотелин-1 (ЭТ1) — фактор, секреция которого при нормальной функции эндотелиоцитов не происходит, но резко увеличивается при их активации (Landmesser U. et al., 2005).

Таблица 5

Изменение активности параоксоназы крови (нМ/мин/мл сыворотки, разница __ в %) у кроликов в динамике эксперимента __

Сроки наблюдений Группы 0 дней 30 дней, ГХС 40 дней 50 дней 60 дней 70 дней 80 дней

Контроль 187,1 ±10,1 123,3 ±11,4 112,9±10,4 122,5±13,1 127,4±13,0 129,2±12,8 135,5 ±13,4

СВ 200 мкг/кг веса/сутки 128,1 ±6,5 107,7 ±10,1 160,7±15,5 и 207,3±19,3 # 204,0±21,1 # 180,2±18,1 # 141,7 ±12,8

СВГ 1000 мкг /кг всса/сутки 117,9 ±7,6 111,9 ±10,0 173,9±16,8 # 203,6±20,0 # 192,9±20,0 if 160,2±15,6 # 158,9 ±16,1

СВГ 666 мкг /кг веса/сутки 145,7 ±13,9 128,0 ±11,5 145,9±14,0 # 170,1±17,1 # 172,3±17,1 # 163,7±16,4 # 149,6 ±15,0

СВГ 400 мкг /кг веса/сутки 136.7 ±8,9 115.2 ±10,7 155.4±15,0 и 176,5±17,1 # 176,2±18,1 Р 172,2±17,1 # 159,8 ±15,4

Примечание: # — статистически значимые отличия по сравнению с контролем (р<0,05)

Результаты измерений метаболитов N0 показали, что в группах: СВ и СВГ этот показатель был выше, чем в контрольной группе. Наибольшее его повышение в сравнении с контролем - более, чем в 2 раза - наблюдалось в группе СВ, а в группах 3-х доз СВГ он был повышен в меньшей степени - на 34-41%, 49-51% и 59-75%, соответственно.

Таблица 6

Изменение уровня фактора Виллебранда в крови (мЕД/мл) у кроликов

в динамике эксперимента

Сроки наблюдений Группы 0 дней 30 дней, ГХС 40 дней 50 дней 60 дней 70 дней 80 дней

Контроль 7,3 ±1,0 30,2 ±3,0 34,2±2,5 31,5±2,1 28,4±2,1 21,5±1,8 18,7±1,5

СВ 200 мкг/кг веса/сугки 8,5 ±0,6 31,3 ±2,8 35,7±3,1 33,4±3,0 32,4±2,7 25,1±2,1 15,6±1,1

СВГ 1000 мкг /кг веса/сутки 13,2 ±1,1 32,0 ±3,1 32,2±2,9 31,7±2,8 31,9±2,8 16,7±1,4 # * 11,6±1,0#*

СВГ 666 мкг /кг веса/сутки 8,7 ±0,5 27,1 ±2,5 34,2±3,0 31,9±2,8 30,8±2,6 18,7±1,5 * 13,9±1,1 #

СВГ 400 мкг /кг веса/сутки 10,3 ±0,3 26,3 ±2,4 23,7±1,9 # * 12,2±1,0 ft * 12,0±1,0 # * 10,6±0,8# * 10,9±0,8 # *

Примечание: # — статистически значимые отличия по сравнению с контролем (р<0,05), * — статистически значимые отличия по сравнению с группой СВ (р<0,05).

Оценки содержания ФВ не выявили различий между группами СВ и контрольной (табл. 6), но в группах СВГ со сниженными в 2-3 раза дозами СВ после 30 дней введения этот показатель стал ниже, чем в контроле и в группе СВ на 22-26 % и 26-33 %, соответственно. В группе же СВГ с минимальной дозой СВ этот показатель на протяжении всего периода введения препаратов и после него был значимо ниже - на 5161 % и 58-64 % в сравнении с контролем и группой СВ, соответственно. Значимого влияния СВ и СВГ со сниженной в 2 раза дозой СВ на уровень ЭТ1 не выявлено (табл. 7).

В период после 20 и 30 дней приема препаратов СВГ со сниженными в 3 и 5 раз дозами СВ этот показатель стал ниже, чем в контроле на 32-40 % и 38-44 %, соответственно, и чем в группе СВ на 21-27 % и 29-32 %, соответственно.

Таблица 7

Изменение уровня эндотелина-1 в крови (фмоль/мл) у кроликов __ в динамике эксперимента_

Сроки наблюдений Группы 0 дней 30 дней, ГХС 40 дней 50 дней 60 дней 70 дней 80 дней

Контроль 9,7 ±0,5 19,2 ±1,5 22,3 ±1,8 21,8±1,7 20,3±1,5 15,9±1,2 12,1±1,0

СВ 200 мкг/кг веса/сутки 7,7 ±0,6 20,1 ±1,9 18,7 ±1,5 18,0±1,4 17,5±1,3 16,3±1,3 13,3±1,0

СВГ 1 ООО мкг /кг веса/сутки 6,1 ±0,5 17,9 ±1,5 18,9 ±1,5 19,1±1,6 19,0±1,6 17,6±1,4 12,8±1,0

СВГ 666 мкг /кг веса/сутки 9,8 ±1,2 17,8 ±1,4 18,7 ±1,5 13,2±1,1 # * 13,8±1,1 # * 11,3±1,0#* 7,6±0,5 # *

СВГ 400 мкг /кг веса/сутки 6,9 ±0,4 18,5 ±1,6 19,0 ±1,6 12,3±1,2 # * 12,5±1,1 # * 11,2±1,0 # * 8,2±0,8 # *

Примечание: # — статистически значимые отличия по сравнению с контролем (р<0,05), * — статистически значимые отличия по сравнению с группой СВ (р<0,05).

Корреляционный анализ выявил обратные связи между дозой СВ в СВГ и его эффектами по снижению в крови уровней продуктов ПОЛ (г Пирсона = -0,349, р<0,01), ФВ (г Пирсона = -0,289, р<0,05), ЭТ1 (г Пирсона = -0,380, р<0,01) и повышению активности ПО крови (г Пирсона = -0,237, р<0,05).

Таким образом, полученные данные свидетельствуют об антиоксидантной активности симваглизина. Вероятно, отчасти это является результатом повышения активности PON крови, в основе которого лежит увеличение при введении СВГ содержания ЛВП-ХС, отражающего увеличение количества частиц ЛВП, с которыми связан этот фермент, активация обратного транспорта ЛВП-ХС (за счет увеличения

синтеза anoAI и апоАИ и активации ЛХАТ ЛВП, липопротеинлипазы). СВГ обладает также эффектом нормализации функции эндотелия, который проявляется снижением в крови содержания ФВ и ЭТ1. Все эти воздействия симваглизина реализуются в области более низких, в сравнении с эквивалентом симвастатина, доз.

Существенно, что антиоксидантное и эндотелий-стабилизирующее воздействие симваглизина характеризуются иной дозовой зависимостью, нежели описанная выше линейная дозовая зависимость гипохолестеринемичекого влияния. Очевидно, различия в характере дозовых зависимостей этих и гипохолестеринемического эффектов обусловлены тем, что они реализуются с участием разных молекулярных мишеней. Последний, как показано выше, обусловлен способностью симваглизина ингибировать ГМГ-КоА редукгазу - скорость-лимитирующий фермент в синтезе холестерина. Опыт исследований биологических эффектов химических соединений свидетельствует о том, что отличные от линейной зависимости «доза-эффект» - U-образные и гормезис - имеют достаточно широкое распространение (Eaton D.L., Klaassen C.D., 2001). Полученные результаты свидетельствуют о том, что эндотелий-стабилизирующее воздействие СВГ может быть достигнуто в области более низких концентраций, чем холестерин снижающее воздействие.

Заключая в целом полученные результаты, необходимо отметить, что симваглизин, являясь бесконкурентным ингибитором 3-ГМГ-КоА редуктазы - ключевого скорость-лимитирующего фермента синтеза ХС в организме, продемонстрировал высокую фармакологическую активность в отношении снижения уровня общего ХС крови, превышающую таковую у симвастатина. Холестерин снижающее воздействие симваглизина in vivo является более выраженным и более безопасным в сравнении с таковым у симвастатина, что свидетельствует о наличии возможности снижения суточной дозы собственно симвастатина в симваглизине при его применении для терапии ГХС и атеросклероза. Другие имеющиеся плейотропные и потенциально антиатерогенные эффекты симваглизина - антиоксидантный и нормализующий функцию эндотелия -также дополнительно положительно характеризуют новый молекулярный комплекс.

ВЫВОДЫ

1. Симваглизин является бесконкурентным ингибитором З-гидрокси-З-метилглутарил-коэнзим А редуктазы с константой ингибирования Ki= 94,18 нМ.

2. Симваглизин снижает уровень общего холестерина в моделях экспериментальной гиперхолестеринемии in vivo у крыс и у кроликов. Гипохолестеринемическое воздействие симваглизина, в дозах, сниженных по симвастатину в 2-5 раз, сравнимо с таковым у средней терапевтической дозы симвастатина.

3. В модели экспериментальной гиперхолестеринемии in vivo у крыс и у кроликов симваглизин в исследуемых дозах не обладает гепатотоксичностью и не вызывает выраженных миотоксических изменений.

4. При экспериментальной гиперхолестеринемии in vivo у кроликов симваглизин вызывает более выраженные в сравнении с симвастатином антиоксидантные изменения, повышая активность параоксоназы и снижая уровень продуктов перекисного окисления липидов в крови.

5. При экспериментальной гиперхолестеринемии in vivo у кроликов симваглизин, способствует нормализации регулирующих тонус сосудов и систему гемостаза функций эндотелия, вызывая снижение в крови уровней эндотелина-1 и фактора Виллебранда в сравнении с симвастатином.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

Результаты экспериментальных доклинических испытаний симваглизина, свидетельствующие о возможности снижения суточной дозы симвастатина в симваглизине и уменьшения, тем самым его побочных эффектов при сохранении холестерин снижающей эффективности, необходимо учитывать в последующих клинических испытаниях препарата 1-й фазы.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Изучение холестеринснижающего эффекта и безопасности симваглизина на модели гиперхолестеринемии у кроликов / Ю.И Рагино., В.А. Вавилин, Н.Ф. Салахутдинов, С.И. Макарова, Е.М. Стахнёва, О.Г. Сафронова, Ю.П. Никитин, Г.А. Толстиков // Бюл. экспер. биол. мед.-2008. - Т. 145, №3.-С. 285-288.

2. Гипохолестеринемические свойства комплексного соединения симвастатина с глицирризиновой кислотой (симваглизина) в экспериментальных моделях. / В.А. Вавилин, Н.Ф. Салахутдинов, Ю.И. Рагино, Н.Е. Поляков, М.Б. Тарабан, Т.В. Лешина, Е.М. Стахнёва, В.В. Ляхович, Ю.П. Никитин, Г.А. Толстиков // Биомедицинская химия. -2008. - Т. 54, Вып. 3. - С. 301 -313.

3. Изучение гипохолестеринемического эффекта симваглизина in vivo у кроликов с гиперхолестеринемией. / Ю.И. Рагино, В.А. Вавилин, Н.Ф. Салахутдинов, Е.М. Стахнёва, Г.А. Толстиков, В.В. Ляхович, Ю.П. Никитин // Создание новых лекарственных препаратов: Материалы конференции - Томск, 2007. - С. 87 - 90.

4. Изучение гипохолестеринемического эффекта симваглизина in vivo у крыс с гиперхолестеринемией. / Ю.И. Рагино, В.А. Вавилин, Н.Ф. Салахутдинов, Е.М. Стахнёва, Г.А. Толстиков, В.В. Ляхович, Ю.П. Никитин // Психофармакология и биологическая наркология: Материалы III съезда фармакологов России. - 2007. - Т. 7, спец. выпуск, часть 2. - С. 1911-1912.

5. Изучение ингибирующего ГМГ-КоА-редуктазу эффекта симваглизина in vitro на модели микросомальной фракции печени крыс. / В.А. Вавилин, Н.Ф. Салахутдинов, Ю.И. Рагино, Е.М. Стахнёва, Г.А Толстиков, В.В. Ляхович, Ю.П. Никитин // Психофармакология и биологическая наркология: Материалы III съезда фармакологов России. -2007. -Т. 7, спец. выпуск, часть 1. - С. 1629 - 1630.

6. Исследование окислительно-антиоксидантных изменений липопротеинов для ранней диагностики и профилактики атеросклеротических сердечно-сосудистых заболеваний. / Ю.И. Рагино Я.В. Полонская, В.А. Баум, Е.М. Стахнёва, Н.В. Еременко, Е.В. Садовский // Профилактика сердечно-сосудистых заболеваний в первичном звене здравоохранения: Сборник тезисов докладов. - Новосибирск, 2008. - С. 171 - 172.

7. Гипохолестеринемический и антиоксидантный эффекты симваглизина in vivo у кроликов с гиперхолестеринемией. / Ю.И. Рагино, В.А. Вавилин, Н.Ф. Салахутдинов, Е.М. Стахнёва, О.Г. Сафронова, С.И Макарова, В.В. Ляхович, Ю.П. Никитин, Г.А. Толстиков // IV съезд Российского общества биохимиков и молекулярных биологов, -Новосибирск, 2008. - С.446.

8. Липидснижающий и антиоксидантный эффекты симваглизина при экспериментальной гиперхолестеринемии. / Е.М. Стахнёва, В.А. Вавилин, Н.Ф. Салахутдинов, О.Г. Сафронова, С.И. Макарова, М.И. Иванова, Ю.И. Рагино // Регионарное кровообращение и микроциркуляция: Материалы Российско-норвежского научного симпозиума. - 2008. - Т. 7, № 2. - С. 52 - 53.

9. Эффективность и безопасность симваглизина при экспериментальной гиперхолестеринемии. / Е.М. Стахнёва, В.А. Вавилин, Н.Ф. Салахутдинов, Ю.И. Рагино, О.Г. Сафронова, С.И. Макарова, В.В. Ляхович, Г.А. Толстиков // VI Сибирский физиологический съезд: Тезисы докладов. - Барнаул, 2008. - С.40.

10. Изучение антиоксидантного и нормализующего функцию эндотелия эффектов симваглизина на модели гиперхолестеринемии у кроликов. / Ю.И. Рагино, В.А Вавилин, Н.Ф. Салахутдинов, С.И. Макарова, Е.М. Стахнёва, О.Г. Сафронова, В.В. Ляхович, Ю.П. Никитин, Г.А. Толстиков // Бюл. экспер. биол. мед. - 2008. - Т. 146, № 8.-С.171-174.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ:

АСАТ — ацил-холестерин ацилтрансфераза

CYP — номенклатурное обозначение цитохрома Р450

NADPH — восстановленный никотинамидадениндинуклеотидфосфат

NO — окись азота

PON — параоксоназа

PPRA — пероксисом пролифератор-активирующие рецепторы

SREBP — стерол-регуляторный (респонсивный) элемент

AJIT — аланин-аминотранфераза

ACT — аспартат-аминотрансфераза

АТФ — аденозинтрифосфорная кислота

ВНОК — Всероссийское научное общество кардиологов

ГК — глицирризиновая кислота

Гл-6-Ф — глюкозо-6-фосфат

Гл- 6-ФДГ — глюкозо-6-фосфатдегидрогеназа

ГМГ- КоА — З-гидрокси-З-метилглугарил- коэнзим А

ГХС — гиперхолестеринемия

ИБС — ишемическая болезнь сердца

ИФА — иммуноферментный анализ

КФК — креатинфосфокиназа

ЛВП — липопротеины высокой плотности

ЛНП — липопротеины низкой плотности

ЛОНП — липопротеины очень низкой плотности

МДА — малоновый диальдегид

ПОЛ — перекисное окисление липидов

СВ — симвастатин

СВГ — симваглизин

ССЗ — сердечно-сосудистые заболевания

ТБК — тиобарбитуровая кислота

ТГ — триглицериды

ФВ — фактор Виллебранда

ХС — холестерин

ЭДТА — этилендиаминтегграацетат

ЭР — эндотелиновые рецепторы

ЭТ1 — эндотелии-1

Соискатель -г' ^ СтахнёваЕ. М.

С •• ' '' ' ---'*

Подписано в печать 21.08.2009 г. Формат 60x84/16 Бумага офсетная. Гарнитура Times. Ризография Усл. печ. л. 1,0. Тираж 100. Изд. № 213п/09

Оригинал-макет изготовлен издательством «Сибмедиздат»НГМУ г. Новосибирск, ул. Залесского, 4 Тел.: (383) 225-24-29. E-mail: sibmedisdat@rambler.ru

Отпечатано в типографии НГМУ г. Новосибирск, ул. Залесского, 4 Тел/факс: (383) 225-24-29

Актуальность темы. Гиперхолестеринемия является одним из главных факторов риска атеросклероза и ишемической болезни сердца (Anderson К.М., Castelli W.P., Levy D., 1987), заболеваемость и смертность от которых продолжают оставаться чрезвычайно высокими в России (Оганов Р.Г., Масленникова ГЛ., 2002). В патогенезе атеросклероза, наряду с гиперхолестеринемией, важную роль играют воспаление, окислительный стресс, нарушение функции эндотелия, нарушения гемостаза и другие процессы (Fruchart J.С. et al., 2003, 2007). На сегодняшний день, в этиопатогенетической терапии атеросклероза и ИБС приоритет отдается применению холестерин снижающих лекарственных соединений, главными из которых являются статины - ингибиторы ключевого фермента синтеза холестерина — 3—гидрокси—3-метилглутарил-КоА редуктазы (Российские рекомендации ВНОК, 2007). Статины обладают комплексным антиатерогенным механизмом действия и, кроме снижения уровня холестсринемии, ингибируют процессы воспаления и окислительного стресса, нормализуют функцию эндотелия и систему гемостаза (Bellosta S. et al., 2000; Pereira EC. et al., 2004; Landmesser U. et al., 2005; Fruchart J.C. et al., 2003, 2007), что в конечном итоге приводит к регрессии атеросклеротических очагов и снижению сердечно-сосудистой смертности по данным мета-анализа на 30-40% (Executive Summary of the Third Report of the National Cholesterol Education, and Treatment of High Blood Cholesterol in Adults, ATP III, 2001, 2004).

Наряду с положительным антиатерогенным влиянием, у большинства статинов эффективная терапевтическая суточная доза (20-80 мг) приводит к возникновению нежелательных побочных эффектов -гепатотоксичности, миалгии, миопатии и в редких случаях -рабдомиолиза, обусловленных особенностью метаболизма этих соединений, сопряженного с процессом бета-окисления жириых кислот — основного источника энергии в мышечной ткани (Puddu P. et al., 2001;

Российские рекомендации ВНОК, 2007). Это обстоятельство подчеркивает постоянную актуальность поиска и создания новых статинов с более низкой суточной дозой, то есть более безопасных, и в то же время высоко эффективных в отношении описанного антиатерогенного механизма действия.

Одним из известных современных подходов к созданию новых лекарственных соединений является использование известных фармаконов в виде комплексов с природными комплексонами, в частности, с глицирризиновой кислотой. Ранее было продемонстрировано усиление лекарственного эффекта бутадиона, индометацина (Толстиков Г.А. и др., 1997) и нифедипина (Толстикова Т.Г. и др., 2006) при использовании их в комплексах с глицирризиновой кислотой. Этот подход был использован при создании на базе Новосибирского института органической химии им. Н.Н. Ворожцова СО РАН нового молекулярного комплекса симвастатина с глицирризиновой кислотой со стехиометрией 1:4 — симваглизина (Патент № 2308947: Толстиков Г.А., Никитин Ю.Г1., Ляхович В.В., Салахутдинов

H.Ф., Рагино Ю.И., Вавилин В.А. «Лекарственное средство с гиполипидемическим эффектом Симваглизин», 2007), биологические эффекты которого к началу исследования были не изучены.

Цель исследования: изучить прямой механизм и механизмы некоторых плейотропных влияний антиатерогенного действия in vitro и in vivo комплексного соединения симвастатина с глицирризиновой кислотой у животных с экспериментальной гиперхолестеринемией. Задачи исследования:

I. Исследовать силу и тип ингибирования активности З-гидрокси-З-метилглутарил-коэнзим А редуктазы in vitro в микросомах печени крыс под влиянием комплекса симвастатина с глицирризиновой кислотой.

2. Оценить влияние симваглизина на показатели липидпого профиля крови (общий холестерин, липопротеины высокой плотности, триглицериды) в сравнении с симвастатином на модели экспериментальной гиперхолестеринемии in vivo.

3. Исследовать гепато- и миотоксичные изменения под влиянием симваглизина по динамике изменений уровней ферментов аспартатаминотраисферазы, аланинаминотрансферазы и креатинфосфокиназы в сравнении с симвастатином при экспериментальной гиперхолестеринемии in vivo.

4. Исследовать влияние симваглизина на параметры окислительно-антиоксидантных нарушений в сравнении с симвастатином при экспериментальной гиперхолестеринемии in vivo.

5. Исследовать влияние симваглизина на показатели функции эндотелия в модели экспериментальной гиперхолестеринемии in vivo. Провести сравнительный анализ с симвастатином.

Научная новизна:

Установлено наличие прямого и некоторых плейотропных антиатерогенных эффектов у нового комплексного соединения симвастатина с глицирризиновой кислотой — симваглизина. Механизм прямого антиатерогенного действия симваглизина состоит в ингибировании З-гидрокси-З-метилглутарил-коэнзим А редуктазы. В отличие от симвастатина, известного конкурентного ингибитора фермента, симваглизин является ингибитором З-гидрокси-З-метштглутарил-коэнзим А редуктазы бесконкурентного типа.

При экспериментальной гиперхолестеринемии у крыс и кроликов in vivo показано, что равный по силе гипохолестеринемический эффект достигается дозами симваглизина, содержащими в 2-5 раз меньше симвастатина, чем при дозировании свободного симвастатина. При этом дозозависимость снижения уровня холестерина в крови под влиянием симваглизина имеет у крыс линейный, а у кроликов экспоненциальный характер.

У крыс и кроликов с экспериментальной гиперхолестеринемисй in vivo миотоксические изменения под влиянием симваглизина выражены значительно ниже в сравнении с симвастатином.

Показаны некоторые плейотропные механизмы ангиатерогенного действия симваглизина у кроликов с экспериментальной гиперхолестеринемией in vivo. Так, под влиянием симваглизина в крови повышается уровень липопротеинов высокой плотности, что указывает на усиление обратного транспорта холестерина. Под влиянием симваглизина в крови снижается уровень малонового диальдегида и повышается активность параоксоназы, что свидетельствует об антиоксидантных изменениях. Снижение в крови уровней фактора Виллебранда и эндотелина-1 под влиянием симваглизина отражает нормализацию функции эндотелиоцитов. Дозы симваглизина, необходимые для проявления этих эффектов, по содержанию симвастатина в комплексе в 3— 5 раз ниже, чем доза симвастатина.

Научно-практическая значимость: Теоретическое значение работы состоит в том, что в результате экспериментальных исследований симваглизина показано, что он является более эффективным и безопасным в сравнении с симвастатином гипохолестеринемическим соединением, что свидетельствует о возникновении фармакологического синергизма при комплексировании симвастатина с глицирризиновой кислотой. Продемонстрированые разные (прямой — холестеринснижающий, плейотропные - усиление обратного транспорта холестерина, антиоксидантиый и нормализующий функцию эндотелия) потенциально антиатерогенные эффекты симваглизина отличаются разным характером дозозависимости (линейный, экспоненциальный, нелинейный обратный), что указывает на наличие у симваглизина, также как и других статинов, разных молекулярных мишеней.

Практическое значение работы состоит в том, что результаты экспериментальных доклинических испытаний симваглизина имеют значение для последующих клинических испытаний 1-й фазы, так как демонстрируют возможность снижения суточной дозы собственно симвастатина в симваглизине с целью уменьшения побочных эффектов препарата при сохранении его холестерин снижающей и в целом антиатерогенной эффективности.

Положения, выносимые на защиту:

1. Ингибирование активности З-гидрокси-З-метилглутарил-коэнзим А редуктазы в микросомах печени крыс под влиянием симваглизина происходит по бесконкурентному типу.

2. У крыс и у кроликов с экспериментальной гиперхолестеринемией под влиянием симваглизина происходит выраженное снижение уровня общего холестерина в крови.

3. У кроликов с экспериментальной гиперхолестеринемией под влиянием симваглизина наблюдаются антиоксидантные изменения и нормализация показателей функции эндотелия в регуляции тонуса сосудов.

Апробация работы. Основные положения диссертации представлены и обсуждены на Республиканской научной конференции "Создание новых лекарственных препаратов" (Томск, 2007), III съезде фармакологов России (С-Петербург, 2007), Российской научно-практической конференции "Профилактика сердечно-сосудистых заболеваний в первичном звене здравоохранения" (Новосибирск, 2008), IV съезде Российского общества биохимиков и молекулярных биологов (Новосибирск, 2008), Российско-норвежском научном симпозиуме "Защита миокарда: молекулярные, патофизиологические и клинические аспекты" (С.-Петербург, 2008), VI Сибирском физиологическом съезде (Барнаул, 2008).

Публикации. По теме диссертационной работы опубликовано 10 научных работ, из них 3 статьи в журналах, рекомендованных ВАК РФ для публикации материалов диссертационных работ.

Объем и структура диссертации. Диссертация включает следующие разделы: введение, обзор литературы, описание материала и методов исследования, 3 главы с результатами исследования, обсуждение, выводы, список используемой литературы. Текст изложен на 122 страницах машинописного текста, иллюстрирован 15 таблицами и 9 рисунками. Список цитированной литературы включает 197 работ, из них 54 отечественных и 143 зарубежных источников.

ВЫВОДЫ:

1. Симваглизин является бесконкурентным ингибитором З-гидрокси-З-метил глу тар и л- коз и з и м А редуктазы с константой ингибировапия Кр= 94,18 нМ.

2. Симваглизин снижает уровень общего холестерина в моделях экспериментальной гиперхолестеринемии in vivo у крыс и у кроликов. Гипохолестеринемическое воздействие симваглизина, в дозах, сниженных по симвастатину в 2-5 раз, сравнимо с таковым у средней терапевтической дозы симвастатина.

3. В модели экспериментальной гиперхолестеринемии in vivo у крыс и у кроликов симваглизин в исследуемых дозах не обладает гепатотоксичностыо и не вызывает выраженных миотоксических изменений.

4. При экспериментальной гиперхолестеринемии in vivo у кроликов еимваглизин вызывает более выраженные в сравнении с симвастатином антиоксидантные изменения, повышая активность параоксоназы и снижая уровень продуктов перекисного окисления липидов в крови.

5. При экспериментальной гиперхолестеринемии in vivo у кроликов еимваглизин, способствует нормализации регулирующих тонус сосудов и систему гемостаза функций эндотелия, вызывая снижение в крови уровней эндотелина-1 и фактора Виллебранда в сравнении с симвастатином.