Автореферат и диссертация по медицине (14.00.24) на тему:Анализ полиморфизма длины амплификационных фрагментов ДНК в судебно-медицинской идентификационной экспертизе

На правах рукописи

ГЫСКЭ ЛИДИЯ ИЛЛАРИОНОВНА

АНАЛИЗ ПОЛИМОРФИЗМА ДЛИНЫ АМПЛИФИКАЦИОННЫХ ФРАГМЕНТОВ ДНК В СУДЕБНО-МЕДИЦИНСКОЙ

ИДЕНТИФИКАЦИОННОЙ ЭКСПЕРТИЗЕ

14.00.24 — Судебная медицина

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Москва 1997

Работа выполнена в отделе судсбно-медицннскнх генетических научных и экспертных исследований Республиканского центра судебно-медицинской экспертизы Министерства здравоохранения РФ и в лаборатории молекулярно-генетической индивидуализации организмов Института молекулярной биологии имени В. А. Энгельгардта РАН.

(зав. лабораторией — доктор биологических наук П. Л. Иванов)

Научный руководитель — доктор биологических паук Л. Л. Иванов

Официальные оппоненты:

1. Доктор медицинских наук, профессор Л. О. Барсегянц".

2. Доктор биологических наук, профессор Д. А. Крамеров.

Ведущая организация — Бюро судебно-медицинской экспертизы Департамента здравоохранения Москвы.

Защита состоится ^ г?^ 1997 года,

в час, на заседании диссертационного совета Д 074.03.01 при Рес-

публиканском центре судебно-медицинской экспертизы Министерства здравоохранения РФ по адресу: 123242, Москва, Садовая-Кудринская ул., д. 3, корп. 2.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Республиканского центра судебно-медицинской экспертизы Министерства здравоохранения РФ.

Автореферат разослан ^ С> Л 1997 года.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат медицинских наук,

старший научный сотрудник О. А. ПАНФИЛ ЕНКО

Характеристика работы

Актуальность. Молекулярно-генетическая идентификация ДНК радикально изменила представления о возможностях судебно-медицинской экспертизы, обеспечивая переход к индивидуализации личности по биологическим образцам. В этой связи стали очевидными возрастающее значение судебно-медицинских исследований в следственной практике и актуальность апробации нового идентификационного метода применительно к расширившемуся кругу решаемых экспертизой вопросов.

Таким образом, значимость судебно-медицинской экспертизы, как одного из видов доказательств, определила необходимость придания методу, основанному на чисто фундаментальных исследованиях и показавшему лишь принципиальную возможность индивидуальной идентификации, судебно-медицинской направленности.

Цель и основные задачи

Целью работы явилась разработка прикладных аспектов наиболее перспективного варианта молекулярно-генетического идентификационного анализа, основанного на детекции и последующей интерпретации полиморфизма длины амплификационных фрагментов (ПДАФ) гипервариабельных локусов ядерной ДНК.

Предстояло выработать наиболее оптимальную последовательность методических и аналитических подходов, которая могла бы обеспечить получение достоверной информации об анализируемых обьектах.

В контексте вышесказанного важно было: 1. Отработать методики экстракции ДНК из различных биологических субстратов и смешанных обьектов судебно-медицинской экспертизы:

а). провести сравнительный анализ методов выделения ДНК из наиболее частых обьектов генно-идентификационной экспертизы;

б), разработать методику, позволяющая доказать присутствие и оценить (при необходимости) количество сперматозоидов в изучаемых обьектах;

в), исследовать проблемы, касающиеся избирательного извлечения генетического материала сперматозоидов из содержащих сперму смешанных биологических следов.

2. Оценить эффективность использования в судебно-медицинской практике амплификации ДНК в ПЦР и электрофоретического разделения амплификационных продуктов в агарозных гелях:

а), выяснить влияние неоптимальных условий ПЦР, касающихся исходного количества матричной ДНК и продолжительности ее наращивания на амплификационную картину гипервариабельных локу-сов хромосомной ДНК;

б), рассмотреть ряд вопросов, связанных с неудовлетворительным разделением амплифицированных последовательностей ДНК, причинами которого чаще бывают: неравномерное распределение исследуемого материала между детектируемыми дорожками и перегрузка геля, короткий путь разделения и неоптимальное окрашивание изучаемой ДНК;

в), выявить зависимость эффективности анализа ПДАФ от при- ' веденных факторов для преодоления неблагоприятного их воздействия на достоверность идентификационных исследований.

3: Обосновать аналитические подходы к экспертной оценке идентификационных признаков на основе индивидуализирующих ПДАФ-систем.

4. Оценить возможности использования разработанного комплекса методических и аналитических подходов в прикладных исследованиях.

Научно-практическая значимость работы

Настоящая работа обобщает результаты, полученные при разработке нового молекулярно-генетического подхода, основанного на анализе полиморфизма длины амплификационных фрагментов гипервариабельных локусов ядерной ДНК человека.

Впервые в отечественной судебно-медицинской практике дана совокупная оценка технологических стадий анализа ПДАФ ДНК. Представленные алгоритмы сочетают системы энзиматической амплификации наиболее изученных гипервариабельных локусов: АРОВ [Boerwinkle et al., 1989]. IGJH [Decorte et al.,1990], D17S30 [Horn et al.. 1989], D1S111 [Jeffreys et al., 1988; Ефремов и др., 1996], D1S80 [Kasal et al., 1990], RBI [Scharf et al.,1992], TH01 [Kimpton et al., 1993] и дот-гибридизационный анализ локуса HLA-DQA1 [Saiki et al., 1989] с методическими

приемами, предложенными (метод качественной и количественной оценки сперматозоидов в биологических объектах, подходы к преодолению побочных эффектов ПЦР, связанных с исходным количеством матричной ДНК и продолжительностью ее циклического наращивания) и модифицированными в данной работе (дифференциальный лизис клеток в смешанных следах, гель-электрофорезное разделение амплифицируемой ДНК в агарозных гель-субстратах).

Практическим итогом работы явилось обоснование методических и аналитических принципов анализа ПДАФ гипервариабельных локусов хромосомной ДНК, включающих возможность исследования малых количеств, в том числе и деградированной ДНК.

Публикации. По теме диссертации опубликованы 6 печатных работ. Обьем и структура работы. Диссертация написана на русском языке, состоит из оглавления, введения, 6-и глав, заключения и приложения. Введение содержит краткое изложение состояния вопроса об индивидуализации личности молекулярно-генетическими методами, целевую установку работы и задачи, подлежащие разрешению. Содержание работы изложено в 6-и главах. В первой главе приведен краткий обзор литературы, раскрывающей вопросы моле-кулярно-генетической идентификации ДНК; во второй - перечислены используемые для разрешения поставленных задач материал и методы. В последующих главах обобщены результаты исследований, в каждой из них проведено обсуждение и краткое резюме по рассматриваемым вопросам. В "Заключении" сформулированы общие выводы. Раздел "Библиография" содержит указатель цитируемой литературы. Текстовая часть вместе с иллюстрациями (36 рисунков, составленных из 59 фотографий) занимает 172 страницы машинописного текста. Библиографический указатель включает 146 источников отечественных и зарубежных авторов.

Содержание работы

1. Выбор методов выделения ДНК из различных субстратов и обьектов смешанной биологической природы

В экспертной практике первоочередное значение приобрела

апробация методов экстракции ДНК из наиболее частых объектов генно-идентификационной экспертизы. С этой целью был проведен сравнительный анализ ряда методов выделения ДНК.

При апробации методов экстракции ДНК из жидкой крови предстояло изучить возможности использования альтернативных подходов, исключающих полностью или частично фенол-хлороформную экстракцию при выделении ДНК из указанного биологического субстрата.

Экспертные задачи включали экстрагирование ДНК пятью методами из жидкой крови живых лиц давностью до 3-х месяцев с различными условиями хранения (при комнатной температуре и 4 град.С), а также из трупной крови без явлений гемолиза.

Авторами рассматриваемых методов была показана принципиальная возможность выделения препаратов ДНК из жидкой крови. Наиболее адаптированный для этих целей - метод L. Kunkel и со-авт. (1977) с модификациями [Mathew, 1984] - нами использован в контрольном эксперименте. В процессе апробации следовали рекомендациям авторов [Reymond, 1987; Johns et al., 1989] или проводили несущественные модификации [Ciulla et al., 1988; Miller et al., 1988].

Схема проведенных экспериментов представлена на рис. 1.

На первом этапе из цельной крови привнесением лизирующего раствора [Kunkel et al.. 1977] и выдерживанием при низкой температуре (4 град. С) с последующим центрифугированием, были получены гомогенные препараты ядросодержащих клеток.

В основу последующих этапов легли сходные принципы обработки тестируемых препаратов (разрушение клеточных мембран, отделение нуклеиновых кислот от белков и последующее их осаждение), для реализации которых в каждом случае предлагались разные биохимические подходы. Так. для разрушения нуклеопроте-идных комплексов использовали додецилсульфат натрия - ДСН [Kunkel et al.. 1977; Miller et al.. 1988; Johns et al.. 1989] и(или) протеиназу К [Kunkel et al., 1977; Mathew. 1984; Reymond, 1987; Miller et al., 1988]. а в одном случае - гуаниди-низотиоцианат (ГИТ) и 2-меркаптоэтанол [Ciulla et al., 1988].

Альтернативные подходы, являясь более упрощенными процедурами, в трех случаях не предусматривали использование орга-

нических растворителей [Reymond, 1987; Cialla et al.. 1988; Miller et al., 1988] , в одном случае - предполагали лишь частичное их применение [Johns et al., 1989]. Экстрагирование белков при этом проводили дегидратацией высококонцентрированными растворами солей лития [Reymond, 1987] и натрия [Cialla et al.. 1988; Miller et al., 1988; Johns et al., 1989].

исходные клетки 1 -

ОБРАБОТКА ОБРАБОТКА

хаотрооши ДЕТЕРГЕН

вщвстаом ТОН

1 ! 1

гит 2 - иеркигговтыол дсн

ОБРАБОТКА ОРОТЕОЛИТИЧЕСКИМ ФЕРМЕНТОМ

ОСМДЕВИ8 нтклкнвовых КИСЛОТ

1 1 1 1 1

мэопроаа-■ол 9Т&ВОЛ этааол нзопропа

_1 1 1 i i

преципитат ДНК

1 1 1 i i

Ciulla Т. et al., 1988 Rcynond е., 1967 Miller S. et al., 1988 Johns в. et al., 1989 Kunkel L. et al., 1977

Рис. 1. Апробация пяти методов выделения ДНК из жидкой крови.

Нами показано, что характеристики полученных пятью методами препаратов ДНК удовлетворяли требованиям технологий, предусматривающих применение рестрикционного-гибридизационного анализа или амплификации ДНК в ПЦР.

Экспертная оценка методов выделения ДНК из крови для анализа в ПЦР По мере развития молекулярно-генетических методов для

многих целей оказалось уже необязательным проводить жесткую очистку больших количеств геномной ДНК. Более того, стало возможным изучение ДНК так называемыми экспресс-методами, позволяющими за относительно короткое время получать малоочищенные, но пригодные для анализа в ПЦР препараты ДНК [Mercier et al., 1990; Walsh et al.. 1991; Allen et al., 1994].

Из апробированных нами методов наиболее простым явилась прямая ПЦР в жидкой крови с модифицированным циклом преденату-рации [Mercier et al., 1990], которая предусматривала 3-х разовую поочередную термическую обработку в течение 3 мин при 94 и 55 град.С крови в ПЦР-буфере с дезоксинуклеозидтрифосфатами с последующим добавлением олигонуклеотидных праймеров для ти-пирования соответствующих локусов, Taq-полимеразы и проведением амплификации ДНК в ПЦР.

Метод лизиса кипячением в присутствии ионообменной смолы типа Chelex [ Singer-Sam et al.. 1989; Walsh et al., 1991] также сводится к денатурации ДНК под воздействием высоких температур. Хелирующее воздействие лиганда Chelex - иминодиацета-та - на ионы двухвалентных металлов, катализирующих деградацию ДНК, предотвращает этот процесс, тем самым сохраняя ее пригодность для амплификации в ПЦР. Заметная гидрофобность используемого ионообменника способствует также денатурации белков, что немаловажно при очистке препаратов ДНК.

Сравнительный анализ полученных экспресс-методами и экстракцией высококонцентрированным раствором NaCl препаратов ДНК показал, что экспресс-методы обеспечивают получение препаратов ДНК, пригодных для амплификации в ПЦР.

При отработке метода с использованием смолы Chelex оказалось возможным получение легко воспроизводимых результатов при анализе минимальных количеств крови, в том числе и пятен на вещественных доказательствах давностью до 3 лет. Это принципиально важное преимущество обусловило более широкое его применение в экспертной практике.

Отметив столь обнадеживающие результаты, следует признать, что экспресс-подходы в молекулярно-генетическом анализе не способны решить все проблемы. В ситуациях, когда можно поступиться потерями малой части исследуемого материала, оправдан

разумный компромисс между трудоемкостью метода выделения ДНК и обеспечением надежного успеха последующих процедур. Речь идет о большем риске загрязнения (контаминации) минорными количествами посторонней ДНК, а также о риске амплификации избыточного количества матричной ДНК. предварительная оптимизация которой в этих случаях невозможна. Следует также отметить, что экспресс-методы экстракции ДНК ограничивают диапазон молекуляр-но-генетических подходов к изучению индивидуальной ДНК. к примеру, процессы денатурации исключают возможность анализа рест-рикционного полиморфизма ДНК.

Получение препаратов ДНК из обьектов с предполагаемым присутствием спермы

В практике нередки случаи, когда возможности молекуляр-но-генетических методов, помимо необратимых процессов распада, ограничиваются предельно малыми количествами исследуемого материала. Причем этот ограничивающий фактор чаще имеет вторичное происхождение, обусловленное тем, что биоматериал в большинстве случаев подвергается молекулярно-генетическому анализу после детекции иммунобиохимическими тестами. (Поэтому обнаружение сперматозоидов при первичной экспертизе не является доказательством их присутствия в остатках биологических следов).

В указанных случаях получение препаратов целых (нелизиро-ванных) клеток и ориентировочный их подсчет могут подтвердить наличие сперматозоидов в обьекте исследования и оценить шансы успешного выполнения генно-идентификационной экспертизы на начальных этапах исследования вещественных доказательств.

Нами был предложен способ первичной характеристики обьектов, представленных для проведения идентификационной экспертизы при половых преступлениях, который позволяет оценивать эти обьекты с точки зрения возможности выполнения указанного идентификационного исследования [Болдеску и др., 1990; Иванов и др.. 1991].

Позже нами более детально изучено влияние используемых экстрагентов на биологические субстраты, чаще всего примешанные к сперме (кровь и выделения из влагалища) с целью подобра оптимальных условий для наиболее полной их элиминации из обь-

ектов исследования [Гыскэ, Иванов, 1996].

Для выяснения этого вопроса мы обрабатывали индивидуальные образцы крови по.схеме дифференциального лизиса клеток в смешанных обьектах [Gill et al., 1985]. Полученные результаты дали основание усомниться в эффективности использованного способа экстрагирования смешанных следов в части лизирования других клеток (кроме сперматозоидов), в нашем примере - клеток крови. Это определило дальнейшее направление исследований.

В первую очередь был поставлен вопрос об оптимальной концентрации протеиназы К в лизирующем буфере. Для этого клетки идентичных высушенных на марле тест-образцов, приготовленных из 1 мл жидкой крови экстрагировали параллельно 5%-ным водным раствором аммиака и дистиллированной водой с последующей обработкой полученных клеточных суспензий по схеме дифференциального лизиса с введением протеиназы К в разных концентрациях. Лизис клеток проводили в присутствии 1%-ного раствора ДСН (эта концентрация не превышалась с учетом неблагоприятного воздействия ДСН на энзимный компонент ПЦР). Хорошим оказался результат, полученный для обьекта, экстрагированного дистиллированной водой и обработанного протеиназой в концентрации 500 мкг/мл, его ДНК была представлена только фракцией, полученной после I этапа лизиса. Важно подчеркнуть, что это не наблюдалось для альтернативного обьекта (экстракция раствором аммиака), обнаруживающего ДНК, соответствующую фракции нелизирован-ных на I этапе клеток. Рис. 2 иллюстрирует полученные результаты.

Рис. 2. Подбор оптимальных условий для экстракции и дифференциального лизиса клеток.

Дорожки: 6-9 - препараты, экстрагированные водным раствором аммиака, 1-4 - дистиллированной водой, 5 - ДНК фага лямбда в количестве 50 нг.

На следующем этапе необходимо было проверить адекватность подобранных нами условий для экстракции сперматозоидов. С учетом того, что экстрагирование водой может привести к осмотическому разрушению сперматозоидов [Барсегянц, Левченков, 1978]. нами в последующем применен другой зкстрагент - изотонический буфер на основе трис-НС1, рН 7,6. Это позволяет использовать на протяжении всего этапа выделения ДНК один и тот же раствор. Кроме этого, условие экстрагирования целых клеток позволяет подтвердить наличие сперматозоидов в обьекте исследования. обеспечивая принципиально важный этап молекулярно-ге-нетического анализа ДНК.

Новые высокочувствительные молекулярно-генетические подходы в экспертном исследовании выдвигают более жесткие требования к способам дифференциации на уровне ДНК в исследуемых обьектах биологических субстратов различной природы и происхождения .

В указанном аспекте необходимо было оптимизировать способы избирательного извлечения генетического материала сперматозоидов из содержащих сперму смешанных биологических следов за счет повышения эффективности процедуры дифференциального лизиса клеток, присутствующих в этих следах.

В последующей серии экспериментов пятна спермы 7-месячной давности обрабатывали раствором ДСН/протеиназа К, где фермент использовали в концентрации 500 мкг/мл и 1 мг/мл (в качестве контрольного теста). Оказалось, что обработка протеиназой К в концентрации 1 мг/мл является избыточной и вызывает разрушение сперматозоидов уже на I этапе лизиса. Это, естественно, нежелательно, и потому более подходящей нами была признана концентрация протеиназы 500 мкг/мл.

Логическим продолжением проведенной серии экспериментов явилось испытание подобранных условий дифференциального лизиса при анализе смешанных объектов заведомо известного клеточного состава. Как наиболее подходящий для этих целей нами был исследован вагинальный тампон, сопровождаемый заключением о ци-

тологическом исследовании влагалищного отделяемого. При этом, кроме сперматозоидов, были обнаружены клетки промежуточного и парабазальных слоев влагалищного эпителия, которые примечательны наличием в перинуклеарной зоне большого количества белков, содержащих БН-группы [Базарнова, 1982]. В этом случае, используя изложенную методику дифференциациального лизиса, можно было бы оценить влияние этих факторов на эффективность избирателного типирования спермальной ДНК и полноту отделения эпителиальных клеток.

Использовали 2 вида тест-образцов, отличающихся количественным соотношением присутствующих компонентов (см. рис. 3). Одни из них содержали клетки "мужского" и "женского" происхождения в одинаковых по фактическому выходу ДНК соотношениях, определенному в предыдущих экспериментах (этот подход нам представился более обьективным, ' чем подсчет выхода ДНК на клетку, так как в этом случае обработка клеток крови по схеме дифференциального лизиса не является оптимальной для выделения из них ДНК). В других образцах нами намеренно смоделирована ситуация с доминированием материала "женского" происхождения. Для этого к обьектам из следов на тампоне примешивали суспензию клеток, экстрагированных из пятен крови идентичного происхождения.

Исследуемый материал экстрагировали параллельно 5% раствором аммиака и буфером на основе трис-НС1 с последующим лизисом в 1% растворе ДСН с протеиназой К в концентрации 500 мкг/мл при 56 град.С в течение 3 ч. Поскольку речь идет о смешанных объектах, на этом этапе представилось возможным только сравнение количественных характеристик препаратов ДНК из каждой фракции клеток между собой (без оценки эффективности процедуры дифференциации) и с аналогичными фракциями альтернативного обьекта. Использованный для экстракции буфер на основе трис-НС1 позволяет экстрагировать примерно одинаковое количество сперматозоидов, что и раствор аммиака, произвести (при необходимости) подсчет сперматозоидов в изучаемом обьекте, а главное - установить их наличие морфологическим методом.

В обьекте, экстрагированном буфером на основе трис-НС1, независимо от количественных и морфологических характеристик

присутствующих в нем субстратов, удалось разделить клетки разной половой принадлежности. Генетические признаки этих препаратов ДНК при проведенном впоследствии сравнительном исследовании оказались идентичными генотипам проверяемых лиц.

Таким образом, экстракция обьектов в описанных условиях, обеспечила полное отделение присутствующих в них эпителиальных и кровяных клеток, примешанных к сперме.

В то же время, результат амплификации препаратов ДНК из обьектов, экстрагированных аммиаком подтвердили нецелесообразность применения аммиака в качестве экстрагента смешанных обьектов при генно-идентификационной экспертизе, предполагающей использование методов на основе ПЦР, поскольку разделения фракций сперматозоидов и клеток других субстратов не происходит.

т

-

Рис. 3. Электрофореграммы продуктов амплификации ДНК смешанного обьекта, экстрагированного двумя альтернативными методами.

Дорожки 1,6,11 - фрагменты ДНК плазмиды рВ1?322/А1и1; 2,3 и 7,8 - амплификаты препаратов ДНК (двух фракций) из обьектов, экстрагированных водным аммиаком, в которых примесь женских клеток преобладает над сперматозоидами в 10 раз (дорожки 2,3) или имеет равное содержание (дорожки 7,8); 4.5 и 9,10 - амплификаты препаратов ДНК (2 фракций), после экстрагирования объектов буфером на основе трис-НС1; из них дорожки 4,5 - препараты ДНК обьекта с 10-кратным преобладанием "женских" клеток над сперматозоидами, 9,10 - препараты ДНК обьекта с присутствием одинакового количества по выходу ДНК клеток "женского" происхождения. Указаны размеры фрагментов в п.н.

2. Анализ ПДАФ ДНК: возможные источники ошибок при неоптимальных условиях полимеразной цепной реакции

При амплификации ДНК в ПЦР встречаются случаи, когда наряду с ожидаемыми последовательностями ДНК амплифицируются и различные посторонние, которые так же, как истинные аллельные фрагменты, претерпевают экспоненциальное наращивание и на электрофореграммах оказываются количественно сопоставимы с ними, часто обнаруживая и позиционное сходство.

Такие артефакты ПЦР, т.н. "лишние" полосы, обьясняются разными причинами: 1) неспецифичностью праймеров и(или) неадекватно подобранным для них рабочим режимом; 2) неоптимальной концентрацией Тац-полимеразы в реакционной смеси, ее избыточным количеством; 3) присутствием в реакции неоптимальной концентрации ионов 1^2+, 4) профилем кривой нагрева реакции с неоптимальными значениями температурных скачков (это может быть вызвано неудачными техническими параметрами прибора, используемого для амплификации ДНК).

Упомянутые причины в большой степени относятся к методологическим основам ПЦР. Некоторые параметры, такие как концентрация дезоксинуклеозидтрифосфатов. олигонуклеотидных праймеров для каждого локуса, Taq-пoлимepaзы к настоящему времени уже стандартизованы фирмами-разработчиками амплификационных наборов для ПЦР-амплификации ДНК. Поэтому (для исключения возможных чисто технических ошибок) количественный и качественный

состав указанных компонентов реакционной смеси строго соответствовал рекомендациям фирм-производителей реагентов [Методические рекомендации к амплификационным наборам государственного научного центра РФ "ГосНИИгенетика," М., 1994, 1995].

Использование стандартизованных реакционных смесей, температурных и временных параметров реакции позволило сконцентрировать внимание на изучении влияния количественного содержания матричной ДНК и продолжительности ее наращивания, т.е. числа циклов амплификации, на конечный результат полимеразной цепной реакции [Гыскэ, Иванов. 1995].

Определение оптимального количества ДНК, необходимой в реакции в качестве матрицы для последующего наращивания интересующей последовательности, проводили эмпирически. Предполагалось, что оптимальным будет такое количество ДНК, которое в амплификации обеспечит эффективное наращивание ожидаемых последовательностей и предупредит синтез "ложных," а также обеспечит воспроизводимость результатов.

г * 4 5 * * г в

ттятшшттттмтштшшт

Рис. 4. Зависимость амплификационной картины ДНК от количества привнесенной в реакцию матрицы.

Дорожки 2,3,4 - продукты амплификации ДНК объекта 1; 6,7.8 -объекта 2; 1,5 и 9 - фрагменты ДНК плазмиды pBR322/AluI. Пояснения выше в тексте.

Контрольные разведения ДНК подвергали ПДР-типированию с последующим электрофоретическим разделением амплификационных продуктов. Из трех препаратов каждой из тестируемых ДНК оптимальными, т.е. обеспечивающими эффективную амплификацию только истинных последовательностей, оказались разведения с минимальным присутствием матричной ДНК, оцененные нами для каждого из обьектов как 30-40 нг.

При анализе ПДАФ-профилей неоптимальных разведений ДНК были выявлены 3 фрагмента, что несвойственно индивидуальным ДНК. При этом можно было отметить лишь незначительную количественную разницу между двумя истинными амплифицируемыми последовательностями, с одной стороны, и третьей "ложной" - с другой. Между тем. такая картина является типичной при типиро-вании препаратов ДНК смешанной природы, например, выделенных из биологических следов на вещественном доказательстве, происходящих от разных лиц. Таким образом, анализируемые картины при внешней одинаковости могут иметь совершенно разный смысл: в одном случае это артефакт эксперимента, а в другом - истинная аллельная комбинация смеси 2 или 3 ДНК.

Источником экспертных ошибок при интерпретации картин полиморфизма длины амплификационных фрагментов являются не только "лишние" фрагменты, но и разная эффективность амплификации истинных аллельных последовательностей в случае гетерозиготной ДНК [Walsh et al., 1992]. Это явление нами также наблюдалось в случае привнесения в ПЦР избыточного количества матричной ДНК при большом различии в длинах аллельных фрагментов. С увеличением количества взятой в реакцию матричной ДНК была выявлена тенденция к все менее эффективному наращиванию последовательности большей длины, что может привести к ошибочной интерпретации данного объекта как гомозиготного. Оптимальное количество матричной ДНК обеспечило впоследствие их эффективную коамп-лификацию.

При изучении феномена "лишних" полос, отмеченное явление

не всегда удавалось связать только с количеством взятой в реакцию матричной ДНК. В случае ПЦР-типирования тандемных локу-сов. присутствующих в гетерозиготном состоянии, то есть в случае коамплификации двух аллельных последовательностей разной длины, при одновременном негативном влиянии избыточного количества матричной ДНК появление "ложных" фрагментов еще более вероятно при избыточном числе циклов амплификации. Это обстоятельство обусловило необходимость оптимизации числа циклов амплификации для каждого из исследуемых локусов.

Нами определен диапазон вариаций числа циклов амплификации, который обеспечивает детекцию истинных генетических характеристик по каждому из анализируемых локусов: D1S80, АРОВ, D1S111 - 27 циклов, IGJH - 28-30 циклов, D17S30 и RB1 - 30 -33 цикла. В каждом случае амплификации подвергалось около 30 нг геномной ДНК.

Далее нами изучено влияние продолжительности циклического наращивания на картину амплификации гомозиготной и гетерозиготной ДНК, взятой в реакцию в оптимальном количестве [Гыскэ, Иванов, 1995].

Следует отметить, что при правильном подборе количества взятой в реакцию матричной ДНК, число циклов амплификации не столь принципиально. Как для гомозигот, так и для гетерозигот незначительные отклонения в ту или иную сторону от приведенного нами оптимального, диапазона числа циклов, не меняя истинную амплификационную картину, влияют лишь на количественный выход амплифицируемой ДНК. Дальнейшие эксперименты в этом направлении показали, что увеличение числа циклов при типировании гомозиготной ДНК практически не искажает истинную картину амплификации.

В то же время, амплификационное типирование гетерозиготной ДНК может дать неверные результаты при избыточном числе циклов амплификации, если предварительно не была проведена оптимизация ее исходного количества. Особенно остро эта проблема стоит при типировании локусов с короткими повторами (так называемых STR от англ. short tandem repeats).

На примере одного из таких локусов - локуса ТН01 нами изучено влияние избыточного числа циклов на картину амплифика-

НИИ ДНК. которая во всех случаях проводилась в 2 этапа, с ре-амплификацией после 26 циклов предварительной амплификации ДНК: 26 + 13 в первом; 26 + 20 - во втором случае и 26 плюс 6 - в третьем [Гыскэ, Иванов. 1995].

В последнем случае типируемые последовательности объективно отражали генетические характеристики исследуемой ДНК. что сделало возможным их адекватное сравнение с генетическими характеристиками проходящих по делу лиц.

/ 9 5 ч $6

я -И» тя <тт 4« I

ЦЕ38» »

Щ'

Рис. 5. Подбор оптимальных условий ПЦР-амплификации ДНК при детекции БТИ-локусов.

Дорожки: 1.2 - ПДАФ-профили ДНК, выделенной из следов на вещественном доказательстве, а затем амплифицированной в течение 39 циклов (26+13); 3,4 - та же ДНК. взятая в амплификацию в прежнем количестве, после 46 циклов амплификации (26+20); 5 -комбинированный образец, состоящий из маркерной лестницы и амплификата той же ДНК, полученного при оптимальном числе цик-

лов (26 циклов первичной и 6 циклов реамплификации). Каждый раз реамлифицировали одинаковые аликвоты первичной амплификации; 6 - маркерная'лестница "п х 123."

Следовательно, при исследовании сильно деградированной ДНК. присутствующей в биоматериале на вещественных доказательствах в незначительном количестве, когда не только предварительная ее оценка весьма проблематична, но и анализ локусов с относительно длинными тандемными повторами не представляется возможным, поэтапная амплификация локусов с короткими повторами оправдана, причем ее эффективность выше, когда наращивание интересующих последовательностей происходит при минимально возможном числе циклов (не менее 26) с последующей непродолжительной реамплификацией (например, как в рассмотренном нами случае. 6 циклов). Таким образом, в тех случаях, когда невозможна оптимизация количества матричной ДНК (ввиду ее присутствия в очень малых количествах), последовательная амплификация и реамплификация ДНК с минимальным числом циклов может предотвратить синтез "лишних" фрагментов и, тем самым, помочь избежать серьезных экспертных ошибок.

3. Аналитические аспекты изучения ПДАФ гипервариабельных локусов хромосомной ДНК

Наряду с параметрами, определяющими эффективность ПДАФ-анализа на этапе амплификации ДНК, выше были вскрыты артефакты, тесно связанные с неоптимальными условиями полимераз-ной цепной реакции.

Между тем при электрофоретическом фракционировании продуктов амплификации нами был замечен ряд сопутствующих факторов. проявляющихся как порознь, так и в совокупности с вышеот-меченными. Приведенные обстоятельства послужили предпосылкой для пересмотра используемых на этом этапе технологических процедур. Предполагалось, что подбор оптимальных параметров разделения по крайней мере обеспечит условия для выяснения природы наблюдаемых негативных явлений.

Условия электрофореза высокого разрешения были предопределены необходимостью максимального разделения амплифицируемых

последовательностей ДНК в предельно сжатые временные интервалы 4 приемлимыми для экспертной практики методами.

В нашем случае предполагалось исследование шести гипервариабельных локусов - АРОВ [Boerwinkle et al., 1989], IGJH [Decorte et al.. 1990]. D17S30 [Horn et al., 1989]. D1S111 Uefi-reys et al.. 1988a; Ефремов и др., 1996], D1S80 [Kasai et. al., 1990] и RBI [Scharf et al., 1992] с межаллельными различиями в диапазоне от 16 до 70 п.н. и ожидаемыми размерами амп-лифицируемых фрагментов ДНК, подлежащих разделению - от 170 до 1650 п.н. Было ясно, что невозможно подбирать гель-электрофо-резную систему, способную одновременно дифференцировать столь разнообразные генетические признаки, но систематизация этого процесса представлялась перспективной.

Выбор электрофоретических систем проводили не только с учетом теоретических значений размеров фракционируемой ДНК, но и физических свойств конкретных препаратов агарозы.

Проведенные нами исследования показали, что агарозные гель-субстраты являются оптимальной разделяющей средой для амплификационных фрагментов ДНК, получаемых на матрице гипервариабельных локусов хромосомной ДНК с относительно длинными повторами.

Для дискриминации идентификационных признаков на основе локуса D1S80 могут быть использованы 2,5% HuSieve агарозные гели; локусов АРОВ, D17S30. IGJH и D1S111 - 2,25% аналогичные гели, а локуса RB1 - 1,8% гели на основе SeaKem агарозы.

Для максимально эффективного дифференцирования амплификационных фрагментов ДНК предпочтительнее разделение в указанных гель-субстратах в течение 18 часов при градиенте напряжения 1 В/см для локуса RB1, а также 4-5 часов и 3 В/см для остальных приведенных локусов.

Выявление источников ошибок преимущественно связанных с условиями дифференцирования амплификационных фрагментов ДНК

Короткий путь разделения

Низкое дифференцирование может быть обусловлено недоста-

точным пробегом фрагментов ДНК и часто сопутствующей перегруженностью геля, когда не разделяются истинные близкоидущие аллели или не обнаруживаются замаскированные "ложные" амплифика-ционные фрагменты ДНК. При таком раскладе, кажущаяся эффективность амплификации в пользу последовательности большей длины ("лишние" полосы, как правило, расположены над ними) потребует наблюдения в динамике с увеличением времени разделения и коррекции этапа амплификации. Искажение полос, обусловленное разделением неоптимальных количеств амплифицируемой ДНК, проявит необходимость повторения аналитического электрофореза.

Тем не менее, применение этих подходов не решали указанные проблемы при разделении амплификационных фрагментов ДНК в присутствии бромистого этидия.

Неоптимальное окрашивание ДНК бромистым этидием

В гели и буферы для электрофореза с нейтральным значением рН добавляют насыщающие концентрации интеркалирующих красителей, чаще - бромистого этидия (0,5 - 1 мкг/мл). что позволяет наблюдать процесс дифференцирования ДНК в динамике [Маниатис и др., 1984]. Казалось бы, такой подход может значительно сократить временные затраты на окрашивание гелей, позволив получать оперативную информацию об анализируемой ДНК.

Основой для более подробного изучения специфики этой технологической процедуры послужили сведения о снижении скорости движения фрагментов ДНК под влиянием критических концентраций бромистого этидия, когда происходит нейтрализация зарядов связанных с красителем молекул ДНК [Маниатис и др., 1984]. Предполагалось, что отмеченный неблагоприятный эффект может сказаться на разделении амплификационных фрагментов ДНК в плане замедления процесса их дифференцирования.

Проводимые нами эксперименты преследовали цель определения меры влияния бромистого этидия на результаты разделения амплификационных продуктов, полученных на матрице вышеозначенных гипервариабельных локусов.

Первоначальные исследования сводились к изучению поведения стандартов известной длины в гелях с различными условиями окрашивания. На примере разделения рестрицированных ферментом

Мзр1 фрагментов ДНК плазмиды рВК322 нами проведен сравнительный анализ фактических (в гелях, окрашенных до и после разделения) и теоретических значений фрагментов длиной 622, 527 и 404 п.н. Можно отметить, что фактические размеры этих фрагментов были определены с экспериментальной ошибкой в среднем 1,5%), а временные затраты, необходимые для достижения примерно одинакового расстояния миграции, сопоставимы с таковыми, потраченными на окрашивание и обесцвечивание геля в альтернативном случае. С целью ослабления диффузии (особенно слабых полос) окрашивание проводили не более 15 мин в одноразовом растворе с обесцвечиванием электрофоретическим способом.

Под влиянием бромистого этидия видимо происходит некоторое замедление процесса разделения фрагментов ДНК, но это обстоятельство не сказывается на эффективности разделения значительно различающихся по длине фрагментов амплифицируемой ДНК. Более затруднительной оказалась дискриминация продуктов амплификации локусов с минимальными межаллельными различиями. Выяснилось, что присутствие бромистого этидия в геле и буфере для электрофореза в этих случаях может значительно затруднить дифференцирование близкоидущих амплификационных фрагментов ДНК (истинных или их тандемов с "ложными"). Присутствие бромистого этидия в разделяющем гель-субстрате препятствует дискриминации близкоидущих фрагментов ДНК. Оказывая нивелирующее воздействие, т. е. сглаживая межаллельные различия, указанная процедура маскирует истинную амплификационную картину.

Таким образом, при анализе продуктов амплификации, необходимым условием, способствующим получению достоверной информации, следует считать оценку эквивалентных количеств ДНК, окрашенной бромистым этидием после разделения.

Экспертная оценка идентификационных признаков на основе индивидуализирующих ПДАФ-систем Методологические основы криминалистической идентификационной экспертизы, а также многопараметрический характер моле-кулярно-генетического анализа ДНК, предполагают необходимость двухэтапного исследования полученных в ПЦР специфичных фраг-

ментов ДНК - раздельное (индивидуальное для каждого обьекта) изучение в аналитическом геле и сравнительный анализ обьектов исследования в препаративном геле. На каждом этапе предстоит решение разного уровня экспертных задач.

Раздельное исследование

На начальных этапах решению подлежат вопросы о наиболее доступных методах исследования и наиболее информативных маркерных системах на основе ДНК.

Оценке подлежит эффективность проведенной амплификации ДНК. Познание "подводных камней", возможных при ПДАФ-анализе. способствовали разработке определенной последовательности изучения выявленных на этом этапе идентификационных признаков, а именно:

- фиксирование числа амплификационных фрагментов ДНК;

- анализ амплификационной картины ДНК с целью выявления или прогнозирования возможных артефактов ("лишние" полосы, разная эффективность амплификации истинных аллельных последовательностей ДНК, перегрузка геля, короткий путь разделения и т.п.);

- коррекция амплификации ДНК в ПЦР (дополнительная обработка препаратов ДНК, уменьшение количества матричной ДНК, использование других реагентов и т.п.);

- определение оптимальных для сравнительного анализа количеств изучаемой ДНК;

- планирование наиболее информативных, в том числе и локальных. стандартов молекулярных масс;

- определение длины амплификационных фрагментов ДНК.

Итогом индивидуального изучения амплификационных фрагментов ДНК может быть решение стоящих перед экспертизой диагностических задач (ориентировочная оценка пригодности препаратов ДНК для судебно-медицинской идентификации молекулярно-генети-ческими методами с применением ПЦР. проведение генетической "паспортизации" биологических обьектов и т.п.) или хорошо выверенная схема последующего сравнительного ПДАФ-анализа в идентификационной экспертизе.

Сравнительное исследование

На этой стадии сравнением выявляют связи совпадения и различия одноименных идентификационных признаков. На основе интегрированного их анализа формулируются экспертные выводы о наличии или отсутствии тождества обьектов исследования, об установлении или исключении биологического родства.

В проводимых нами исследованиях генетическую идентичность совпадающих признаков устанавливали сопоставлением профилей ДНК исследуемых обьектов по качественному значению и количественному их выражению. Для этого сравнивали максимально близкие количества ДНК, имеющие одинаковый профиль в изучаемом геле. Для калибровки использовали набор стандартов известной длины, а также т.н. локальные стандарты с одинаковой электрофорети-ческой подвижностью, что и ожидаемые фрагменты - синтетические аналоги аллельных вариантов того или иного локуса или фрагменты индивидуальной ДНК, ранее калиброванные по стандартам известной длины. Локальные стандарты при этом располагали в непосредственной близости от интересующих фрагментов.

Корректность процедуры определения расстояния миграции амплификационных фрагментов ДНК определяется величиной допустимой экспериментальной ошибки в используемой гель-электрофо-резной системе. К примеру, Федеральное бюро расследований (FBI) разрешает отклонение в 2,5% от оцениваемой длины, в то время как Lifecodes Corporation - 1,8% [Weir, 1992]. В последующих математико - статистических расчетах влияние девиации также учитывается [Вейр, 1995]. В нашей работе мы определили экспериментальную ошибку измерения для используемых нами условий электрофореза. Эта величина в нашем случае составила 1.5-2%.

Рис. 6 иллюстрирует результаты аналитического изучения идентификационных признаков на основе локуса D1S111.

Рис. 6. Аналитическое изучение идентификационных признаков на основе локуса D1S111.

а - электрофореграмма продуктов амплификации локуса D1S111 (анализируемые препараты ДНК - дорожки 2-4 ): дорожки 1 и 8 -- маркерная лестница "n х 123."

Г Л Л * $ 6 1 %

сив 1С ЗР11ИЕ Г1Т

<кр) 1861

615 192

1 «> 626 7.7 •11

(.н 604 7.1 •10

2 ьь 626 7.7 •11

ьн 604 7.1 •10

3 ьа 604 7.1 110

Файл: 02-05-38 з2и Система: 513111

Порог разрешения (Ьр): 15 Предел разрешения (Ьр): 861

Щ ИГ Длина НШоЬа РХЬСЬр)

И 12 34 56

48 МСрж!)

Рис. 6. Аналитическое изучение идентификационных признаков на основе локуса D1S1.11.

б - компьютерная графическая интерпретация результатов биометрического анализа, сведения о длине пробега и размерах ампли-фикационных фрагментов ДНК, обозначение (номер) идентифицируемого аллеля и экспериментальная ошибка, выраженная в п.н. (парах нуклеотидов).

Применительно к рассматриваемым фрагментам ДНК можно отметить, что их фактические размеры определены с минимальной разницей от теоретических. Экспериментальная ошибка в этом случае составляет в среднем 1,7 % от длины типируемых фрагментов ДНК. что коррелирует с приведенными выше стандартами.

При сравнительном анализе в объектах исследования может быть обнаружен комплекс совпадающих идентификационных признаков, позволяющий установить генетическую идентичность сравниваемых образцов ДНК. В других случаях может быть установлено частичное (при анализе смешанных обьектов) сходство генотипа образца сравнения с генетическими характеристиками идентифицирующего обьекта. В экспертизе спорного происхождения детей сравнением может быть определено совпадение аллелей нематеринского происхождения оспариваемого ребенка с генетическими факторами предполагаемого отца. Каждый из этих случаев требует определения идентификационной значимости выявленного соответствия, т.е. оценки вероятности случайного совпадения обнаруженных генетических признаков. Статистическая оценка результатов молекулярно-генетического анализа ДНК на основе индивидуализирующих ПДАФ-систем, как косвенное доказательство, объективизирует результаты судебно-медицинской идентификации личности по биологическим образцам.

Общие выводы

1. Разработан и апробирован для целей судебно-медицинской экспертизы новый подход, основанный на молекулярно-генетичес-ком анализе гипервариабельных локусов хромосомной ДНК человека с использованием метода полимеразной цепной реакции.

2. Изучены наиболее вероятные в экспертной практике затруднения, касающиеся как неоптимальных условий полимеразной цепной реакции, так и предваряющих амплификацию ДНК этапов судебно-медицинского исследования биологических обьектов и показано их влияние на интерпретацию результатов.

3. На примере типирования гипервариабельных локусов с варьирующим числом тандемных повторов развиты аналитические аспекты экспертного изучения полиморфизма длины амплификационных фрагментов ДНК.

4. С помощью разработанных методических и аналитических подходов продемонстрировано, что индивидулизирующие системы, основанные на анализе полиморфизма длины амплификационных фрагментов ДНК, могут быть эффективно использованы для судебно-медицинской идентификации личности по биологическим образцам.

Работы, опубликованные по теме диссертации:

1. Болдеску Н.Г., Гыскэ Л.И., Гуртовая C.B., Иванов П.Л."Первичное исследование вещественных доказательств и оценка их пригодности для биологической идентификационной экспертизы методом геномной "дактилоскопии."" Судебно-медицинская экспертиза, N 4. 1990. с. 11.

2. Иванов П.Л.. Вербовая Л.В., Гуртовая C.B. , Болдеску Н.Г.. Гыскэ Л.И. "Рестриктазный анализ ДНК человека как метод определения генетического пола в судебно-медицинской экспертизе." Судебно-медицинская экспертиза, 1991, N 3, с. 26.

3. Гыскэ Л.И., Иванов П.Л. "Молекулярно-генетический подход в судебно-медицинской экспертизе биологического родства на ранних этапах эмбрионального развития," Судебно-медицинская экспертиза. H 3, 1995, с. 36.

4. Гыскэ Л.И., Иванов П.Л. "Анализ полиморфизма длины амплификационных фрагментов ДНК в судебной идентификационной экспертизе: возможные источники ошибок при неоптимальных условиях полимеразной цепной реакции," Судебно-медицинская экспертиза, N 4, 1995, с. 12.

5. Гыскэ Л.И., Иванов П.Л. "Метод дифференциального лизиса клеток в молекулярно - генетической идентификационной экспертизе вещественных доказательств: вопросы оптимизации процедуры," Судебно-медицинская экспертиза, N 1, 1996, с. 16.

6. Гыскэ Л.И.. Иванов П.Л. "Артефакты полимеразной цепной реакции как возможные источники ошибок в судебно-медицинской идентификационной экспертизе," Проблемы идентификации в теории и практике судебной медицины, 4й Всероссийский съезд судебных медиков, Владимир, 1996, с. 96.

Зак 1084

отпечатано в Щербинской типографии

113623. Москва, ул. Типографская. 10