Автореферат и диссертация по медицине (14.01.12) на тему:Влияние фитоадаптогена на лейкоцитарные интегрины при спонтанном канцерогенезе у мышей

На правах рукописи

ИЛЬЕНКО ВЕРЕНИКА АЛЕКСАНДРОВНА

ВЛИЯНИЕ ФИТОАДАПТОГЕНА НА ЛЕЙКОЦИТАРНЫЕ ИНТЕГРИНЫ ПРИ СПОНТАННОМ КАНЦЕРОГЕНЕЗЕ У МЫШЕЙ

Онкология -14.01.12 Клиническая иммунология, аллергология -14.03.09

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

1 2 [:!ДР Ш

Москва- 2012

г, ! у

005011951

Работа выполнена в ФГБУ «Российский онкологический научный центр им. H.H. Блохина» РАМН (директор - академик РАН и РАМН, профессор

М.И. Давыдов)

Научные руководители:

доктор биологических наук, профессор доктор медицинских наук, профессор

O.A. Бочарова А.Ю. Барышников

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор доктор медицинских наук, профессор

М.В. Киселевский В.К. Боженко

Ведущее учреждение: ФГБУ «Государственный научный центр Российской Федерации - Институт иммунологии»

Защита состоится « » ¿^/¿/¡^¿u^i- 2012 г. в часов на заседании диссертационного совета Д 001.017.02 при ФГБУ «Российский онкологический научный центр им. H.H. Блохина» РАМН

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБУ «Российский онкологический научный центр им. H.H. Блохина» РАМН Автореферат разослан » 2012 г.

Ученый секретарь диссертационного совета д.м.н., профессор

Ю.А. Барсуков

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Нарушение адгезивных взаимодействий считают специфическим свойством опухолевого процесса, которое обеспечивает основные проявления опухоли: потерю местного (тканевого) контроля пролиферации, анаплазию, ускользание опухоли от иммунологического надзора, инвазию и метастазирование [Kato Y. et al., 2005; Lascombe I. et al., 2006].

Известно, что на поверхности многих типов клеток присутствуют молекулы межклеточной адгезии (ICAM - intercellular adhesion molecules). С одной стороны, они являются гистонеспецифическими контактными молекулами интеграции клеток в тканевых системах, с другой стороны, служат лигандами для функционально гомологичных молекул лейкоцитарных интегринов в том числе LFA-1 (CDlla/CD18) и Мас-1 (CD1 lb/CD 18), обеспечивающих адгезию иммунных эффекторов и клеток-мишеней [Хаитов P.M. и др., 2011; Wong S. et al., 2007; Hynes R. et al., 2009].

Показано, что недостаток гистонеспецифических молекул адгезии на мембранах опухолевых клеток индуцирует в том числе снижение экспрессии соответствующих лейкоцитарных интегринов, что приводит к ослаблению их взаимодействий, сводя к минимуму элиминацию клеток-мишеней макрофагами, нейтрофилами, натуральными киллерами, цитотоксическими лимфоцитами. Это вносит определенный вклад в экранирование опухоли от иммунологического надзора [Shirai A. et al., 2003; Kawaguchi Т., 2005]. В связи с этим существенной для реализации противоопухолевого эффекта представляется коррекция экспрессии лейкоцитарных интегринов [Sumagin R. et al., 2010; Kadioglu A. et al., 2011].

Вместе с тем, благодаря исследованиям последних лет стало очевидно, что медиаторами сложных взаимоотношений между иммунной системой организма и растущей опухолью являются цитокины. С одной стороны, цитокины принимают участие в активации иммунологических реакций, направленных на лизис опухолевых клеток. С другой стороны, цитокины участвуют в прогрессии и метастазировании опухолей [Dunn G. et al., 2006; Kim D. et al., 2009]. В частности, повышенный уровень ИЛ-6 и ИЛ-10, а также слабая экспрессия молекулы адгезии ICAM-1 сопровождается подавлением иммунных функций и наоборот [Brady G. et al., 2009]. К тому же показано, что цитокины, ассоциируясь с мембранами синтезирующих их клеток, обладают в виде мембранной формы полным спектром биологической активности и проявляют его лишь при межклеточном контакте [Кетлинский С.А., Симбирцев А.С., 2008].

Таким образом, особенности ингибирования цитолитических потенций иммунных эффекторов в отношении опухолевых клеток связаны не только с нарушением рецепторного ансамбля, отвечающего за формирование конъюгатов с клеточными мишенями, но и с обязательным цитокиновым сопровождением [Барышников А.Ю. и др., 2008; Fillon М. 2011; Liang J., 2011]. Вероятно, изменение регуляции адгезионных механизмов с участием сигнальной реактивности цитокинов при опухолевом процессе может нуждаться в соответствующей коррекции препаратами с адгезиогенным действием.

Особый интерес в данном аспекте вызывают растительные препараты, относящиеся к группе адаптогенов (женьшень, родиола розовая, элеутерококк, лимонник, заманиха и др.) Известна их способность регулировать межклеточную адгезию, нормализуя тем самым процессы дифференцировки тканей, усиливая иммунологическую реактивность организма в отношении опухолей и проявляя противоопухолевый эффект [Kim S.W., Kwon Н„ 2003; Guo L. et al„ 2009].

Фитомикс-40 (ФМ-40) - комплексный фитоадаптоген, содержащий компоненты экстрактов сорока растений, в том числе адаптогенов. Состав ФМ-40 защищен патентом РФ [Бочарова O.A., 1998]. Препарат стандартизован, сертифицирован в качестве парафармацевтика. В экспериментальных и клинических исследованиях показано, что ФМ-40 проявляет выраженные антиоксидантные, антимутагенные, иммуномодулирующие, в том числе адгезиогенные и интерфероногенные свойства, а также обладает противоопухолевым действием [Бочарова O.A. и др., 2008].

В связи с вышеизложенным представляется актуальным изучение экспрессии лейкоцитарных интегринов и сывороточного уровня некоторых цитокинов при опухолевом процессе на примере высокораковой линии экспериментальных животных, а также определение значимости коррекции выявленных нарушений с помощью комплексного фитоадаптогена для подавления опухолеобразования и увеличения продолжительности жизни.

Цель исследования: изучение экспрессии лейкоцитарных интегринов у мышей, генетически предрасположенных к развитию гепатом, а также значимости её коррекции комплексным фитоадаптогеном для развития опухолевого процесса.

Задачи исследования

1. Изучение профилактического и лечебного воздействия комплексного фитоадаптогена на экспрессию лейкоцитарных интегринов у мышей-самцов

линии СВА, генетически предрасположенных к возникновению гепатокарцином.

2. Исследование возможности коррекции комплексным фитоадаптогеном сывороточного уровня ИЛ-6 и ИЛ-10 у высокогепатомных животных при разных режимах применения.

3. Определение профилактического и лечебного воздействия комплексного фитоадаптогена на частоту возникновения, количество и размеры гепатокарцином у мышей-самцов линии СВА.

4. Анализ морфологических изменений в спонтанных гепатомах мышей СВА, получавших комплексный фитоадаптоген.

5. Изучение воздействия комплексного фитоадаптогена на соматическое состояние и продолжительность жизни мышей высокораковой линии.

Научная новизна

Впервые выявлено, что при спонтанном гепатоканцерогенезе у мышей линии СВА снижена экспрессия лейкоцитарных интегринов и повышен сывороточный уровень ИЛ-б и ИЛ-10.

Получены новые данные, характеризующие особенности инфильтрации и деструкции участков опухолей лимфоцитами, уменьшение частоты образования и размеров спонтанных опухолей, повышение продолжительности и качества жизни при коррекции комплексным фитоадаптогеном экспрессии лейкоцитарных интегринов на клетках иммунитета мышей, предрасположенных к развитию гепатом.

Научно-практическая значимость работы

Коррекция экспрессии лейкоцитарных интегринов при снижении сывороточного уровня ИЛ-6 и ИЛ-10 комплексным фитоадаптогеном, существенная для профилактики наследственных опухолей, может учитываться при разработке профилактических мер, направленных на снижение уровня опухолевых заболеваний у членов "раковых" семей и людей с повышенным риском заболеваемости.

Противоопухолевый эффект, установленный при усилении экспрессии лейкоцитарных интегринов под воздействием комплексного фитоадаптогена в лечебном режиме введения, может служить основанием для изучения возможности применения аналогичных препаратов в онкологической клинике.

Изученная модель спонтанного канцерогенеза у мышей с учетом коррекции показателей лейкоцитарных интегринов, снижения частоты и размеров опухолей, их морфологических особенностей, а также повышения продолжительности и качества жизни экспериментальных животных может

использоваться для исследования препаратов, перспективных для профилактики и комплексной терапии онкологических заболеваний.

Связь диссертационной работы с планом основных научных работ

Исследования выполняли в рамках плана РАМН по темам: «Роль лейкоцитарных интегринов в опухолевом процессе» (№ Гос. Регистрации 0120.0809463; 2009-2012 гг.) и «Природные модификаторы в онкологии. Коррекция иммунобиологических реакций при спонтанном канцерогенезе комплексным фитоадаптогеном» (№ Гос. Регистрации 0120.0960417; 20102014 гг.).

Апробация работы состоялась 19 декабря 2011 года в НИИ ЭДиТО РОНЦ им. H.H. Блохина РАМН на совместной конференции лабораторий иммунофармакологии, экспериментальной диагностики и биотерапии опухолей, клеточного иммунитета, химии природных соединений, биомаркёров и механизмов ангиогенеза опухолей, синтетических противоопухолевых веществ.

Основные положения диссертации доложены на X, XVI и XVII Российских конгрессах «Человек и лекарство», Москва, 2003, 2009 и 2010 гг; IX и X Всероссийских научно-практических конференциях «Отечественные противоопухолевые препараты, Москва, 2010 и 2011 гг; XIII Международном конгрессе "Phytopharm-2009", Бонн, Германия; XIV Международном конгрессе "Phytopharm-2010", Санкт-Петербург, Россия.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 10 печатных

работ.

Объём и структура диссертации

Диссертация изложена на 131 странице машинописного текста; состоит из введения, обзора литературы, описания объектов и методов исследования, результатов собственных исследований и их обсуждения, заключения, выводов и списка литературы. Работа иллюстрирована 8 таблицами и 15 рисунками. Библиография включает 168 источников, из которых 34 -отечественных и 134 - зарубежных.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Условия эксперимента на лабораторных животных. Исследование проводили на мышах-самцах линии СВА, генетически предрасположенных к возникновению спонтанных гепатом [Медведев H.H., 1964].

Комплексный фитоадаптоген ФМ-40 применяли в двух режимах введения: 1-й (профилактический) - пероральное введение в течение 1-го месяца постнатального развития животных, захватывая «критический»

период завершения дифференцировки ткани печени, примерно за пять месяцев до возникновения гепатом; 2-й (лечебный) - введение per os (курсами), начиная с шестимесячного возраста вплоть до гибели животного. Курс введения препарата составил 3 недели, интервал между курсами - 1 неделю. Доза введения препарата была выбрана на основании предыдущих исследований [Бочарова O.A. и др., 2003; Бочарова O.A. и др., 2006].

Мыши контрольной группы, (п = 90), получали только воду в качестве питья. Мышам группы 2, опытной группы (п = 80), в течение 1-го месяца постнатального онтогенеза (профилактическое введение), в питьевую воду добавляли 10% Фитомикса-40. Поскольку препарат является водно-спиртовым экстрактом, мышам дополнительной контрольной группы (п = 60) в течение 1-го месяца постнатального онтогенеза в питьевую воду добавляли раствор этанола соответствующей концентрации. Мышам группы 3 (п = 70) препарат добавляли в питьевую воду, начиная с возраста 6 мес, курсами вплоть до гибели животного. Контрольные к этой группе мыши (п = 70) в этом же режиме получали соответственно 3%-ный раствор этанола. Всего в работе было использовано 370 мышей.

Следует отметить, что во всех контрольных группах (интактных животных и принимавших 3%-ный раствор этанола в указанных режимах) результаты определения изучаемых параметров достоверно не отличались друг от друга, что наблюдали и в предшествующих исследованиях. В связи с этим мы посчитали правомерным объединить все указанные данные в одну контрольную группу (группу 1).

Часть животных (по 10-13 мышей из каждой группы) забивали в возрасте 4, 8, 22 месяцев. Печень контрольных и опытных животных, помимо макроскопического исследования, подвергали гистологической обработке по стандартной методике и окрашиванию гематоксилином и эозином. Макроскопической ревизии подвергали и другие органы животных. Однако опухолей при этом не наблюдали.

На лимфоцитах периферической крови животных исследовали уровни экспрессии лейкоцитарных интегринов CDlla, CDllb. Содержание цитокинов ИЛ-6 и ИЛ-10 определяли в сыворотке крови. Оставшиеся животные находились под наблюдением вплоть до естественной гибели.

Объём опухолей (мм3) вычисляли по стандартной формуле. Среднюю продолжительность жизни и медиану выживаемости определяли по методу Каплан-Мейера. В позднем онтогенезе оценивали соматическое состояние животных: число животных с признаками алопеции, вес, двигательную активность. Двигательную активность определяли, используя тест «открытого поля» в автоматическом режиме с помощью системы Opto-

Varimex-3 ("Columbus Instruments", США), совместно с лабораторией общей патологии нервной системы Института общей патологии и патофизиологии РАМН (зав. лаб. - академик РАМН Г.Н. Крыжановский).

Характеристика препарата. В работе использовали комплексный фитоадаптоген Фитомикс-40 (ФМ-40), включающий компоненты 40 растительных экстрактов, в том числе женьшеня, родиолы розовой, элеутерококка, лимонника, заманихи, можжевельника, сосновых и березовых почек, калгана, бессмертника, эвкалипта, пустырника, ягод боярышника, шиповника, черной смородины и др. ФМ-40 обладает более высокой адаптогенной активностью по сравнению с отдельными фитоадаптогенами (женьшенем, родиолой розовой). [Бочарова O.A. и др., 1993; Бочарова O.A. и др., 2003]. ФМ-40 проявляет иммуномодулирующие, в том числе адгезиогенные свойства и противоопухолевую активность [Бочарова O.A. и др. 2008].

Анализ экспрессии лейкоцитарных интегринов CDlla и CDllb проводили методом непрямой иммунофлуоресценции на

лимфоцитах периферической крови животных в возрасте 4, 8 и 22 месяцев с использованием наборов фирмы BD Biosciences (США). Реакцию учитывали на проточном цитофлуориметре FACScanto lie (Becton Dickinson, США) в гейте лимфоцитов.

Уровень цитокинов ИЛ-6 и ИЛ-10 в сыворотке крови экспериментальных животных в возрасте 4, 8 и 22 месяцев определяли методом твердофазного иммуноферментного анализа с использованием наборов фирмы «Diaclone» (Франция).

Статистический анализ результатов проводили с использованием алгоритмов компьютерной программы "STATISTICА" 6.0 с помощью однофакторного дисперсионного анализа ONE-WAY ANOVA.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Изучение иммунологических показателей. Результаты работы показали (таблица 1), что у мышей-самцов линии СВА контрольной группы, предрасположенных к возникновению спонтанных гепатом, в возрасте 4 и 8 месяцев число лимфоцитов, экспрессирующих лейкоцитарный интегрин LFA-1 (CDlla), практически одинаково. В возрасте 22 месяцев этот показатель у животных снижается до уровня 35,3±1,6%. У мышей при профилактическом введении ФМ-40 (группа 2) изучаемый показатель к 22 месяцам снижается в меньшей степени (40,7±1,9%) и статистически не значимо в сравнении с таким же периодом онтогенеза у контрольных мышей.

Лечебное введение препарата (группа 3) к 22 месяцам выявило достоверное повышение данного показателя (42,3±2,9%) в сравнении с контролем.

Таблица 1. Воздействие фитомикса-40 на экспрессию С011а

антигена лимфоцитами крови у мышей высокораковой линии СВА

Группы CD 11а(%)

4 мес. 8 мес. 22 мес. Р

1. Контроль 47,8±2,6 44,1 ±2,4 35,4±1,6 Р4-8=0,31 р8.22=0,005 Р4-22=0,0003

2. Прием ФМ-40 в течение 1-го мес. 50,0±4,8 48,1±4,8 40,7±1,9 Р4-8=0,77 Р8-22=0,18 Р4-22=0,09

3.Прием ФМ-40, начиная с 6-го мес. 4б,6±3,5 47,1±3,8 42,3±2,9 Р4-8=0,93 р8.22=0,33 р4-22=0,36

Р р 1-2=0,67 Р1-з=0,83 Р2-З=0,57 Pi-2=0,45 р,. з=0,53 Р2-З=0,88 р,-2=0,09 Р)-з=0,04 Р2-З=0,5

Таблица 2. Воздействие фитомикса-40 на экспрессию С1)11Ь антигена лимфоцитами крови у мышей высокораковой линии СВА

Группы CD 11b (%)

4 мес. 8 мес. 22 мес. Р

1 .Контроль 15,7+1,1 13,6+1,2 7,8+1,0 Р4-8=0,21 Р8-22=0,0008 р4-22=0,0001

2. Прием ФМ-40 в течение 1-го мес. 19,2±2,0 17,5±1,9 11,5±1,1 Р4-8=0,54 р8-22=0,013 р4-22=0,003

3.Прием ФМ-40, начиная с 6-го мес. 16,4±2,0 20,3±2,0 12,8±1,7 Р4-8=0,18 Р8-22=0,010 Р4-22=0Д8

Р Pl-2=0,10 Р1-з=0,77 р2-з=0,16 Pl-2=0,10 Pi-3=0,01 Р2-з=0,4 PI-2=0,05 Pi-3=0,01 Р2-З=0,3

Также было показано (таблица 2), что в контрольной группе количество лимфоцитов крови мышей линии СВА, экспрессирующих лейкоцитарный интегрин Мас-1 (С011Ь), к возрасту 22 месяца достоверно снижалось до 7,8±1,0%. У опытных мышей «профилактической» (2) и «лечебной» (3) групп в возрасте 22 месяца изучаемый параметр снижался в меньшей степени в сравнении с уровнем контроля в этом возрасте (11,5+1,1 и 12,8±1,7% соответственно).

Таблица 3. Сывороточный уровень ИЛ-6 у мышей линии СВА при воздействии фитомикса-40

Группы ИЛ-6 (пг/мл) Р

4 мес. 8 мес. 22 мес.

1. Контроль 80,9±4,1 88,5±4,3 139,1±6,6 Р4-8=0,21 Р4-22=0,001 р8.22=0,001

2. Прием ФМ-40 в течение 1-го мес. 78,7±6,9 80,5±7,53 114,8±12,3 Р4-8=0,85 Р4-22=0,02 Р8-22=0,03

3. Прием ФМ-40, начиная с 6-го мес. 82,9±6,0 84,1±5,9 111,4±10,5 р4-8=0,89 Р4-22=0,04 р8.22=0,03

Р Рь2=0,78 Рьз=0,80 Р2-з=0,64 Р).2=0,40 Р1-з=0,58 р2.з=0,70 р,.2=0,05 Р1_з=0,03 р2-з=0,83

Концентрация ИЛ-6 в сыворотке крови у контрольных животных (группа 1) к 22-х месячному возрасту достоверно возросла до 139,1±6,6 пг/мл (таблица 3). При профилактическом введении ФМ-40 у опытных мышей (2 группа) сывороточный уровень ИЛ-6 к 22-х месячному возрасту также достоверно увеличился до 114,8±12,3 пг/мл, отставая тем не менее по значению от контрольной группы. Применение ФМ-40 в лечебном режиме (группа 3) сопровождалось ещё меньшим повышением сывороточного содержания ИЛ-6 (111,4±10,5 пг/мл), которое не достигло уровня у контрольных мышей в этом возрасте.

Таблица 4. Сывороточный уровень ИЛ-10 у мышей высокораковой линии СВА при введении фитомикса-40

Группы ИЛ-10 (пг/мл) Р

4 мес. 8 мес. 22 мес.

Р4-8=0,40

1 .Контроль 24,8±2,0 31,8±2,7 60,9±3,9 Р4-22=0,001 р8-22=0,001

2. Прием ФМ- Р4-8=0,27

40 в течение 20,2±2,7 25,1 ±3,4 4б,8±5,3 р4-22=0,004

1-го мес. р8-22=0,003

3. Прием ФМ- Р4-8=0,77

40, начиная с 21,5±3,4 22,7±2,7 45,1±5,6 Р4-22=0,001

6-го мес. Р8-22=0,001

Р1-2=0,26 р,. 2=0,21 Р!-2=0,07

Р Р1-з=0,52 р,.3=0,047 Р1-з=0,04

р2-з=0,61 Р2-э=0,45 Рг-з=0,82

Также выявлено (таблица 4), что сывороточный уровень ИЛ-10 у контрольных животных к 22-х месячному возрасту достоверно возрос до 60,9±3,9 пг/мл. При введении комплексного фитоадаптогена в профилактическом режиме у опытных мышей (группа 2) сывороточное содержание ИЛ-10 в позднем онтогенезе увеличилось (46,8±5,3 пг/мл), но не достигло контрольных значений. У мышей «лечебной» группы (3) при долговременном применении препарата динамика показателя ИЛ-10 аналогична таковой для 2-й группы. Вместе с тем выявлено, что содержание ИЛ-10 к возрасту 22 месяца достоверно отстаёт от контрольного уровня. Таким образом, применение комплексного фитоадаптогена на фоне возникающих спонтанных опухолей, т.е. в лечебном режиме, также может способствовать подавлению сывороточного уровня ИЛ-10.

Полученные результаты показали, что у мышей при спонтанном гепатоканцерогенезе происходит снижение экспрессии лейкоцитарных интегринов ЬРА-1 и Мас-1 на эффекторах иммунитета при повышении сывороточного уровня ИЛ-б и ИЛ-10. Кратковременное введение комплексного фитоадаптогена ФМ-40 (в течение первого месяца постнатального онтогенеза, в период, захватывающий окончательную дифференцировку ткани печени) мышам высокораковой линии способствует

долговременному увеличению числа лимфоцитов, экспрессирующих LFA-1 (CDlla/CD18) и Mac-1 (CDlib/CD 18) по сравнению с контрольными животными. Последнее сопровождается подавлением сывороточного уровня ИЛ-6 и ИЛ-10. Введение препарата в лечебном режиме, минуя «критический» период дифференцировки ткани печени, долговременно, курсами, начиная с 6-ти месячного возраста (когда образуются первые гепатомы), кардинально не меняет влияние на изучаемые показатели по сравнению с профилактическим вариантом введения ФМ-40.

Учитывая, что лигандами молекул LFA-1 и Мас-1 являются молекулы межклеточной адгезии ICAM-1, ICAM-2, ICAM-3 (которые могут находиться на опухолевых клетках), можно предполагать активизацию способности лимфоцитов, нейтрофилов, NK-клеток, моноцитов мигрировать в опухоль, контактировать с клетками-мишенями, что помогает гибели последних. Вероятно, при этом повышается иммунореактивность в осуществлении киллинга опухолевых клеток эффекторами иммунитета [Sasada Т, Suekane S., 2011]. Следует также отметить, что полученные результаты согласуются с подавлением уровней ИЛ-6 и ИЛ-10, которое способствует ослаблению образования противоопухолевых антител, блокирующих антигены опухолевых клеток и, следовательно, рецепторы эффекторов иммунитета [Jones S. et al., 2005; Szkaradkiewicz A. et al., 2010], а также снижению ингибирования экспрессии в том числе молекул адгезии ICAM-1 на клетках-мишенях [Fulghessu A., Sanna F., 2011].

В результате, вероятно, нарушается ускользание опухолевых клеток от иммунологического надзора. При этом может происходить миграция, накопление лимфоцитов в патологическом узле и образование конъюгатов эффекторов иммунитета с опухолевыми клетками-мишенями. В данном случае, во-первых, в клетки опухоли могут проникать факторы разрушения, в том числе протеиназы, лимфотоксины и реактивные интермедиаты кислорода, азота, водорода (ОН, 02, Н202, NO). Во-вторых, в этих условиях возможна активизации FasAPOl, или С095-антигена (рецептора апоптоза), запускающего механизм «самоубийтва» клетки. Все эти процессы могут иметь значение при восстановлении иммунореактивности в отношении опухолевых клеток при новообразованиях [Хаитов P.M., 2005; Dáñese S. et al., 2005].

Исследование «клинических» показателей. В возрасте 22 месяца в контрольной группе (1) опухоли были выявлены у всех животных (таблица 5), частота возникновения опухолей была равна 100%. Число опухолевых узлов на мышь составило 2,7 ± 0,3. У животных опытной группы (2), принимавших препарат профилактически, опухоли возникали реже - в

69,2% случаев (р).2 ¿1,001). Количество гепатом на мышь (1,0 ± 0,3) при этом оказалось достоверно меньшим, чем в контроле (ри ¿),001). В «лечебной» группе (3) число животных с гепатомами сравнимо со 2 группой (70,0%; р)_з <0,001). Вместе с тем число опухолевых узлов на мышь (1,6 ± 0,2) было снижено не достоверно (р].3 = 0,056).

Таблица 5. Воздействие Фитомикса-40 на частоту возникновения спонтанных гепатом у мышей линии СВА в возрасте 22 месяца

Число

Группы Число мышей Число мышей с опухолевых

в группе опухолями узлов на мышь (М±т)

1. Контроль 30 30 (100%) 2,7 ± 0,3

2. Прием ФМ-40

в течение 1 -го 13 9 (69,2%) 1,0 ±0,3

мес.

3. Прием ФМ-40 с 6-ти мес. 10 7 (70,0%) 1,6 ±0,4

р,.2 ^3,001 Pl-2 ¿1,001

Р Ри 50,001 Р2-3 >0Л р i.3=0,056 Рг-з=0,24

1400

1200

гюоо 2

I S™

О 6UO

S

400

О

200

Рисунок I. Воздействие фитомикса-40 на размеры спонтанных гепатом мышей линии СВА в возрасте 22 мес. * - р<0,05

Средний объём одного опухолевого узла у животных контрольной группы оказался равным 381,9 ± 62,0 мм3. Общий объём опухолевой массы у одного животного при этом был равен 1043,9±193 мм3 (рисунок 1). При профилактическом введении ФМ-40 (группа 2) средний объём опухолевого узла (268,4±74,9 мм3) не имел статистически значимых отличий от контроля (р = 0,48). В то же время общий объём опухолевой массы у одного животного (268,3±81,7 мм3) оказался достоверно ниже (рЬ2 = 0,02). В «лечебной» группе мышей (3) средний объём гепатомы уменьшился (115,7±30,2 мм3) не значимо (р1-з= 0,06) по сравнению с контрольной группой. Вместе с тем общий объём опухолевой массы на мышь (185,1±67,4 мм3) достоверно снизился (ри = 0,02).

Морфологические исследования ткани печени мышей-самцов линии СВА, предрасположенных к возникновению спонтанных гепатом, показали, что в возрасте 4 месяца ни в контрольной (рисунок 2), ни в опытных группах опухоли обнаружены не были.

Рисунок 2. Нормальная ткань печени самца линии СВА контрольной группы в возрасте 4 месяца (окраска гематоксилином и эозином, увеличение * 400)

На рисунке 2 представлена нормальная ткань печени мышей линии СВА контрольной группы в возрасте 4 месяцев. Микроскопическое строение ткани печени животных в возрасте 4 месяцев, принимавших ФМ-40 в профилактическом режиме, практически не отличалось от такового в контроле. То же самое можно отметить и для животных из 3-й, «лечебной» группы.

Между тем, известно, что у высокораковых самцов линии СВА первые опухоли в печени возникают в период, близкий к шестимесячному возрасту

[H.H. Медведев, 1964]. В нашем эксперименте в контрольной группе мышей в возрасте 8 месяцев макроскопически и микроскопически мы наблюдали опухоли у 10% исследованных животных. На рисунке 3 продемонстрирован гистологический препарат с гепатокарциномой контрольного животного в возрасте 8 месяцев. В данном случае опухоль можно оценить как трабекулярную гепатокарциному умеренной дифференцировки.

Рисунок 3. Трабекулярная гепатокарцинома умеренной дифференцировки у самца линии СВА контрольной группы в возрасте 8 месяцев (окраска гематоксилином и эозином, увеличение х 400)

Аналогичные по строению и частоте возникновения опухоли мы обнаружили в «лечебной» группе (3). Однако микроскопически в них были выявлены некоторые особенности. На рисунке 4 показана опухоль экспериментального животного в возрасте 8 месяцев из 3-й группы. По строению представленная гепатокарцинома сходна с вариантом опухоли на рисунке 2. Вместе с тем на данном срезе гепатокарциномы видна инфильтрация опухоли лейкоцитами, в большей степени, вероятно, с участием лимфоцитов, образующих выраженные скопления. В данном случае опухоль подвержена миграции в неё клеток иммунной системы.

Вместе с тем необходимо подчеркнуть, что у животных 2 группы, принимавших ФМ-40 в профилактическом режиме, мы не наблюдали признаков опухолевого процесса в возрасте 8 месяцев.

Рисунок 4. Инфильтрированная лимфоцитами гепатокарцинома. Экспериментальное животное в возрасте 8 месяцев при введении комплексного фитоадаптогена с 6-ти месячного возраста (окраска гематоксилином и эозином, увеличение х 400)

В возрасте 22 месяца в контрольной группе мышей линии СВА микроскопически обнаружены в том числе низкодифференцированные трабекулярно-ацинарные гепатокарциномы, т.е. опухоли смешанного строения (рисунок 5).

Рисунок 5. Трабекулярно-ацинарная гепатокарцинома низкой дифференцировки. Самец линии мышей СВА контрольной группы в возрасте 22 месяца (окраска гематоксилином и эозином, увеличение х 400)

При введении комплексного фитоадаптогена в профилактическом режиме у мышей линии СВА в возрасте 22 месяцев в спонтанных

гепатокарциномах выявлена в основном лимфоцитарная инфильтрация опухоли (рисунок 6). При этом в опухолевой ткани выражены деструктивные признаки.

Рисунок 6. Трабекулярная гепатокарцинома, инфильтрированная лимфоцитами. Самец линии мышей СВА в возрасте 22 месяца, получавший фитомикс-40 в течение 1-го месяца жизни (окраска гематоксилином и эозином, увеличение х 400)

ЙЩ Ш -> ' ' ' . " ' —.»г,' . К- ■ - , С ' ■ 1 ШЩш 1 - «щ «щ ■ ШШШШш. - •

¡¡ШййРШ; -

V 1 • " 2 - < Р

¡£§Ж'- „ - I

ШШ&Шт 1

Рисунок 7. Трабекулярно-ацинарная гепатокарцинома, инфильтрированная лимфоцитами. Самец линии мышей СВА в возрасте 22 месяца, получавший фитомикс-40 с 6-и месячного возраста постнатального онтогенеза в лечебном режиме (окраска гематоксилином и эозином, увеличение х 400).

У мышей третьей группы в возрасте 22 месяца, которым комплексный фитоадаптоген вводили в лечебном режиме, также были выявлены трабекулярно-ацинарные гепатокарциномы. Представленный на рисунке 7 участок опухоли инфильтрирован в основном лимфоцитами, которые располагаются группами и тяжами. В данном случае ткань опухоли также подвержена деструкции.

Следует отметить, что миграция лимфоцитов в опухолевые узлы является положительным прогностическим фактором для онкологического процесса [Oble D. et al., 2009]. Эффекторы иммунитета (активированные лимфоциты, макрофаги, нейтрофилы и др.) при этом контактируют с клетками-мишенями, что может являться критическим фактором, который приводит в конечном итоге к гибели опухолевых клеток [Wansom D., Light Е., 2012].

При спонтанном гепатоканцерогенезе, т.е. в контрольной группе животных, лимфоцитарной инфильтрации в опухолях не наблюдали. При этом были выявлены сниженная экспрессия лейкоцитарных интегринов, высокая частота возникновения опухолей, существенное их количество и размеры.

Морфологическая картина опухолевых узлов с признаками деструкции и инфильтрации лимфоцитами в результате воздействия комплексного фитоадаптогена при разных схемах введения сочетается с повышением экспрессии лейкоцитарных интегринов и подавлением процесса гепатоканцерогенеза у мышей линии СВА.

120% 110% Группы мышей ---1-ая (Контр, гр.) -— 2-ая гр. 3-ая гр.

90%

А

|

3 40%

2 £0 20%

0%

300 400 500 600 700 8С Время иизни 0 900 1003 1100 1200 в днях

Рисунок 8. Кривые выживаемости мышей линии СВА при разных схемах введения комплексного фитоадаптогена (р<0,001).

На основании построенных по методу Каплан-Мейера кривых выживаемости (рисунок 8) было выявлено, что средняя продолжительность жизни мышей, наследственно предрасположенных к возникновению гепатом, в среднем не достигает двухлетнего возраста (таблица 6). Профилактическое и лечебное использование комплексного фитоадаптогена способствует удлинению жизни подопытных мышей практически на 98 дней (примерно 3 мес.) и 188 дней (около б мес.) соответственно. Между тем, медиана выживаемости при профилактическом применении препарата превышает контрольную величину на 146 дней (около 5 мес.), в то время как при лечебном воздействии - на 216 дней (примерно на 7 мес.). Вместе с тем ни одно животное контрольной группы не пережило 1000 дней (около 33 мес). В «профилактической» группе указанный срок пережило 2 мыши (pi.2< 0,001). Выживаемость животных «лечебной» группы в данном случае равняется 20%, что составило 8 мышей (рю< 0,001): их выживаемость в среднем составила 1051±24 дня (около 34,5 мес). Рекорд по долгожительству из них побил самец, проживший 1099 дней (36 мес, или 3 года).

Таблица 6. Выживаемость высокораковых мышей линии СВА при разных схемах введения комплексного фитоадаптогена

Группы Кол-во живот ных Продолжительность жизни (М±ш), дни (мес) Медиана выживаемости (дни) Выживаемость > 1000 дней (%)

1 .Контрольная 116 671,2±13,7 (22) 643(21,1) 0

2. Прием ФМ-40 в течение 1-го мес. 48 769,0±21,5 (25,2) 789(25,9) 4,2±0,3

3. Прием ФМ-40 с 6 мес. 40 859,2±23,3 (28,2) 859(28,2) 20,0±2,2

Р р,.2= 0,001 рьз= 0,001 р2.3 = 0,006 Р:-2< 0,001 Рьз< 0,001 Р2-з = 0,001 Pi-2< 0,001 Pi-3< 0,001 Р2-3= 0,3

Таким образом, полученные результаты по увеличению продолжительности жизни у высокораковых мышей на 14,5% и 28,2% (по медиане - на 23% и 33,6%) соответственно при профилактическом и лечебном введении комплексного фитоадаптогена имеют существенное

значение, учитывая тот факт, что при этом выявлен противоопухолевый эффект.

Соматическое состояние подопытных животных «профилактической» и «лечебной» групп имело преимущество перед контрольными мышами.

Контроль ФМ до 1 мес ФМ с 6 мис

Рисунок 9. Вес мышей линии СВА (в граммах) в возрасте 22 месяца, получавших комплексный фитоадаптоген в разных режимах (*- р<0,01)

Вес животных опытных групп в возрасте 22 месяца был достоверно выше, чем в контроле (рисунок 9), что сочетается с подавлением сывороточного уровня ИЛ-б и ИЛ-10, которые могут негативно регулировать патогенез кахексии животных, снижая сывороточный уровень С-реактивного белка и предотвращая при этом расщепление мышечных белков, [Krzystek-Korpaska М. et al., 2008; Deans D. Et al., 2009].

ФМ-1-ймес (n=i3)

/I с 6 месив

Контроль |n=30)

без аллопеции

| | с признаками аллопеции

Рисунок 10. Характер шерстного покрова мышей СВА в возрасте 22 месяца, получавших фитомикс-40 в разных режимах

Характер шерстного покрова был полноценным в обеих опытных группах. Однако в контрольной группе мы наблюдали признаки алопеции в 16,6% случаев (рисунок 10). Полноценный шерстный покров мышей опытных групп сочетается со снижением сывороточного уровня ИЛ-6. Последнее может препятствовать потере шерсти в результате стимуляции функциональной активности волосяных фолликулов при подавлении воспалительного процесса в кожном покрове [Biswas S. et al., 2001; Yu M., 2008].

По показателям двигательной активности высокораковых мышей линии СВА в позднем онтогенезе достоверных отличий между группами мы не получили, несмотря на то, что контрольные животные на момент измерений были моложе подопытных (таблица 7). Иными словами, двигательная активность более старых животных подопытных групп 2 и 3, которые принимали ФМ-40 профилактически либо в лечебном варианте, практически не уступала таковой у более молодых (на шесть-семь месяцев) контрольных мышей. В конечном итоге, удовлетворительное соматическое состояние высокораковых мышей при профилактическом и лечебном воздействии комплексного фитоадаптогена сочетается с увеличением продолжительности их жизни по сравнению с контрольными животными.

Таблица 7. Параметры двигательной активности у мышей линии СВА в позднем онтогенезе при введении фптомикса-40

Группы (п) Возраст, мес. Пройденный путь, см Время без движения, сек Число «стоек» Число мелких движений

1. Контроль (п=16) 23,9±0,1 1089,6±74,8 82,5±7,6 10,0±1,8 220,5±21,

2. ФМ-40 в течение 1-го мес. (п=7) 30,1±0,3 933,7±150,2 109,3±16,7 5,5±1,3 195,5±20

3. ФМ-40 с 6-го мес. (п=10) 31,0±0,4 851,4± 192,5 100,5±14,2 4,8±2,0 203,9±10, 7

Р Pi-2 <0,001 Pi-з <0,001 Р2-3 = 0,1 Pi-2 =0,12 Pi-з =0,19 Р2-3 =0,77 Pi-2 =0,07 Pi-з =0,23 Р2-3 =0,69 Pl-2=0,31 Pi-з = 0,11 Р2-3 = 0,09 Pi-2 = 0,02 Pi-з = 0,13 Р2-з = 0,69

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

При спонтанном гепатоканцерогенезе у мышей было выявлено снижение экспрессии лейкоцитарных интегринов параллельно с возрастанием сывороточного уровня ИЛ-6 и ИЛ-10, высокой частотой возникновения опухолей (100%), увеличением их количества и размеров, а также средней продолжительностью жизни, не достигающей двухлетнего возраста. Выраженной инфильтрации лейкоцитами опухолей при этом не наблюдали.

Кратковременное введение комплексного фитоадаптогена с адгезиогенным действием, захватывая завершающий период дифференцировки ткани, предрасположенной к возникновению опухолей, приводит к долговременному усилению экспрессии молекул гетеротипической адгезии лейкоцитарных интегринов LFA-1 (CD 11 a/CD 18) и Мас-1 (CDllb/CD18), обеспечивающих контактные взаимодействия иммунных эффекторов и клеток-мишеней. Последнее может способствовать повышению активности противоопухолевых реакций иммунитета при инфильтрации спонтанных гепатокарцином в основном активированными лимфоцитами и деструкции опухолевой ткани. В результате, получено снижение частоты возникновения, количества и размеров наследственных опухолей, а также повышение выживаемости и качества жизни животных.

Вместе с тем продолжительное использование препарата, начиная с периода возникновения опухолей, также может поддерживать состояние коррекции экспрессии лейкоцитарных интегринов на эффекторах иммунитета, что существенно для деструктивных процессов в опухоли при её лимфоцитарной инфильтрации. Последнее, очевидно, значимо для подавления частоты возникновения и размеров спонтанных гепатокарцином (без изменения их количества у одного животного), а также улучшения выживаемости и соматического состояния старых мышей.

Таким образом, усиление экспрессии лейкоцитарных интегринов на эффекторах иммунитета, которое сопровождается признаками лимфоцитарной инфильтрации и деструкции опухолевых узлов, а также подавлением сывороточного уровня ИЛ-6 и ИЛ-10 имеет значение для реализации противоопухолевого эффекта, а также повышения продолжительности и качества жизни высокораковых животных.

Выводы

1. У мышей-самцов высокораковой линии СВА снижена экспрессия лейкоцитарных интегринов ЬРА-1 и Мас-1 на клетках крови, а также повышен сывороточный уровень интерлейкина-6 и интерлейкина-10.

2. У 100% высокораковых мышей линии СВА в возрасте 22 месяца выявлены множественные умеренно- и низкодифференцированные трабекулярные и трабекулярно-ацинарные гепатокрциномы.

3. Пероральное введение комплексного фитоадаптогена мышам линии СВА в профилактическом режиме, включая завершающий период дифференцировки ткани печени, усиливает экспрессию молекул лейкоцитарных интегринов ЬРА-1 и Мас-1, подавляет сывороточный уровень интерлейкина-6 и интерлейкина-10, а также снижает частоту возникновения, количество и размеры гепатокарцином.

4. Введение комплексного фитоадаптогена мышам линии СВА долговременно в лечебном режиме способствует коррекции показателей лейкоцитарных интегринов ЬРА-1 и Мас-1, интерлейкинов 6 и 10, уменьшает частоту возникновения и размеры гепатокарцином, не влияя на их количество у одного животного.

5. При воздействии комплексного фитоадаптогена в профилактическом и лечебном режимах выявлена лейкоцитарная, в основном с участием лимфоцитов, инфильтрация, а также деструкция опухолевых узлов.

6. Профилактическое и лечебное применение комплексного фитоадаптогена при спонтанном канцерогенезе увеличивает выживаемость экспериментальных мышей примерно на 5 и 7 месяцев соответственно по сравнению с контрольными животными.

7. Лучшую выживаемость высокораковых мышей линии СВА, получавших комплексный фитоадаптоген при разных схемах введения, сопровождает удовлетворительная двигательная активность опытных животных без признаков похудания и алопеции.

Список опубликованных работ:

1. Ильенко В.А. Возможности комплексного фитоадаптогена «Фитомикс-40» в лечении распространенного рака желудка / Бочарова O.A., Чулкова C.B., Клименков A.A., Лыженкова М.А., Ильенко В.А. // Российский иммунологический журнал. - 2008. - Т. 2. - № 2-3. - С. 304.

2. Ильенко В.А. Использование комплексного фитоадаптогена для коррекции клинических и иммунобиологических показателей у больных распространенным раком желудка / Бочарова O.A., Клименков А.А, Чулкова C.B., Лыженкова М.А., Карпова Р.В., Ильенко В.А. // Материалы XVI Российского национального конгресса «Человек и лекарство». - Москва. -2009. - С. 624.

3. Ильенко В.А. Перспективы применения фитоадаптогена в лечении распространенного рака желудка / Бочарова O.A., Давыдов М.И., Клименков А.А, Барышников А.Ю., Карпова Р.В., Чулкова C.B., Горожанская Э.Г., Ильенко В.А. // БЭБиМ. - 2009. - Т. 148. - № 7. - С. 96-99.

4. Ilyenko V. Phytoadaptogens complex is effective for far-advanced gastric cancer patients / Klimenkov A., Bocharova O., Karpova R., Chulkova S., Bocharov E., Ilyenko V. // Abstracts of the 13 International Congress «Phytopharm-2009». - Bonn, Germany. - 2009. - P. 15.

5. Ильенко В.А. Возможности фитоадаптогена-нейропротектора при лечении нейродегенеративного заболевания / Бочаров Е.В., Иванова-Смоленская И.А., Полещук В.В., Кучеряну В.Г., Ильенко В.А., Бочарова O.A. // БЭБиМ. - 2010. - Т. 149. - № 6. - С. 619-621.

6. Ильенко В.А. К механизмам противоопухолевого действия комплексного фитоадаптогена при распространенном раке желудка. / Бочарова O.A., Лыженкова М.А., Карпова Р.В., Ильенко В.А., Чулкова C.B., Клименков A.A. // Материалы XVII Российского национального конгресса «Человек и лекарство». - Москва. - 2010. - С. 55.

7. Ильенко В.А. Изменение уровня некоторых цитокинов при опухолевом процессе комплексным фитоадаптогеном / Бочарова O.A., Лыженкова М.А., Карпова Р.В., Ильенко В.А., Чулкова C.B., Клименков A.A. // Материалы IX Всероссийской научно-практической конференции «Отечественные противоопухолевые препараты» - Москва. - Российский биотерапевтический журнал. - 2010. - Т. 9. - № 1. - С. 6.

8. Ilyenko V. Phytomix-40 is effective for far-advanced gastric cancer. /Bocharova O., Klimenkov A., Lyzhenkova M„ Karpova R., Chulkova S., Ilyenko V.A. // Abstracts of the 14 International Congress «Phytofarm-2010». - St. Peterburg. - 2010. - P. 19.

9. Ильенко В.А. Коррекция адгезионных взаимодействий при опухолевом процессе перспективна для разработки нетоксических противоопухолевых препаратов. / Бочарова O.A., Барышников А.Ю., Ильенко В.А., Карпова Р.В., Лыженкова М.А., Бочаров Е.В., Казеев И.В.// Российский биотерапевтический журнал.-2011.-Т. 10. №1.-С. 11-13.

10. Ильенко В.А. Возможности комплексного лечения распространенного рака желудка с использованием Фитомикса-40. / Чулкова C.B., Клименков A.A., Бочарова O.A., Петерсон С.Б., Беневский А.И., Карпова Р.В., Лыженкова М.А. Ильенко В.А., Горожанская Э.Г., Егорова A.B., Барышников А.Ю. // Методическое пособие для врачей. Утверждено центральным координационным методическим советом ГОУ ВПО РГМУ Росздрава - Москва. - 2011. - 53 С.