Автореферат и диссертация по медицине (14.00.23) на тему:Анализ хроматина лимфоидных клеток в норме, при воздействии инкорпорированных радионуклидов при некоторых лимфопролиферативных заболеваниях

„ На правах рукописи

9 И10Л '>997

ЧЕРНЫШ Сергей Анатольевич

АНАЛИЗ ХРОМАТИНА ЛИМФОИДНЫХ КЛЕТОК В НОРМЕ, ПРИ ВОЗДЕЙСТВИИ ИНКОРПОРИРОВАННЫХ РАДИОНУКЛИДОВ И ПРИ НЕКОТОРЫХ ЛИМФОПРОЛИФЕРАТИВНЫХ ЗАБОЛЕВАНИЯХ

14.00.23. - Гистология, цитология и эмбриология 14.00.29. - Гематология и переливание крови

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Москва -1997

Работа выполнена в Научно-исследовательском институте детской гематологии МЗ РФ и в Научно-исследовательском институте физико-химической медицины МЗ РФ

Научные руководители:

доктор медицинских наук, Лауреат Государственной премии России, Заслуженный деятель науки России, профессор Э. М. Коган

доктор медицинских наук, академик РАЕН, профессор А. Г. Румянцев

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Е. В. Самочатова

доктор медицинских наук, профессор В. Я. Бродский

. Ведущее учреждение, дающее отзыв о научно-практической ценност диссертации: Московская медицинская академия им. И. М. Сеченова

Защита диссертации состоится «_»_1997 г.

в _ часов на заседании Специализированного Ученого Совет

(Д.084.64.01.) при НИИ детской гематологии МЗ РФ по адресу: 117513, Моек ва, Ленинский проспект, 117.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке института.

Автореферат разослан «_»_ 1997 г.

Ученый секретарь Диссертационного Совета Д.084.64.01.

доктор мед. наук, профессор А. Е.^Бухны

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ГХК - Галлоцианин-хромовые квасцы

ЗТЛК - Злокачественная Т-клеточная лимфома кожи

КТМДМ - Компьютерная телевизионная морфоденситометрия

МДИИ - Малые дозы ионизирующего излучения

МДМ - Морфоденситометрические

OJ1J1 - Острый лимфобласгный лейкоз

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследования:

Качество диагностики, контроля эффективности лечения и оптимизация прогноза лимфопролиферативных заболеваний требуют постоянного поиска наиболее чувствительных биологических маркеров и совершенствования технических средств и методов клинико-лабораторного исследования.

Проблема количественной диагностики на клеточном и тканевом уровнях приобрела исключительно важную роль в морфологии и клинике благодаря необходимости объективизации и связывания в единый комплекс новейших методов структурно-функционального анализа с цито- и гистохимическими, иммуноцитологическими, молекулярной биологии, проточной цитофлуори-метрии, гибридизации in situ, электронной микроскопии, которые подтверждают четкие структурные изменения субклеточных единиц (Коган Э.М., 1983; Жукоцкий А. В., 1992; Румянцев А.Г., 1993; Cornelisse С.J., 1994; Falkmer U.G., 1994).

Необходимость в новых скрининговых автоматизированных методах анализа морфологических изменений клеток крови при экзо- и эндогенных воздействиях, которые могут распознаваться и оцениваться количественно, дала толчок к развитию такого инструментально-аналитического метода как компьютерная морфометрия (Brugal G. 1984; Автандилов Г.Г., 1990, Жукоцкий A.B., 1984,1992; Лейси, 1993).

Разработанный в лаборатории цитологии НИИ физико-химической медицины МЗ РФ новый метод изучения хроматина с помощью компьютерной телевизионной морфоденситометрии (КТМДМ) дает возможность составить индивидуальный морфоденситометрический образ клеточного ядра. (Жукоцкий A.B. и соавт., 1992; Коган Э.М. и соавт., 1991, 1995).

Известно, что все клетки лейкемического клона являются потомками одной клоногенной клетки, испытавшей на себе лейкемогенное воздействие, приведшее к перестройке ее генома. Как показано в работах лаборатории раковой клетки Латвийского института экспериментальной медицины совместно с лабораторией цитологии НИИ ФХМ, количественные показатели структуры интерфазного хроматина могут служить устойчивыми детерминантами над-хромосомной организации генома (Kogan Е. М., Zhukotsky А. V., 1989; Эрен-прейсаЕ. А., 1990).

Эти данные могут расширить фундаментальные знания об эволюции лей-кемических клонов в динамике течения и лечения острого лимфобластного лейкоза (OJIJI), помочь в выявлении атипичных клеток среди других элементов лимфоидного пула даже в тех случаях, когда другие маркерные характеристики не представляют такой возможности, а также проследить влияние на клетки внешних воздействий и внутренней эволюции, составляющей основу опухолевой прогрессии. Можно полагать, что поиск информативных количественных маркеров, отражающих процессы, происходящие в ядре клетки, позволит зарегистрировать патологические изменения в самом начале патологического процесса. Особенно актуальны в этом отношении проблемы ранней диагностики злокачественных лимфопролиферативных заболеваний.

Исходя из этого, исследования, посвященные изучению структуры хроматина лимфоидных клеток при различных состояниях, представляются высоко актуальными.

Цель настоящего исследования: количественно определить характерные особенности перестроек структуры интерфазного хроматина лимфоидных клеток в норме, при воздействии инкорпорированных радионуклидов, при различных иммуноцитологических вариантах острого лимфобластного лейкоза у

детей и при злокачественных Т-клеточных лимфомах кожи, используя новый метод компьютерной телевизионной морфоденситометрии.

Для достижения указанной цели сформулированы следующие задачи исследования:

1. Адаптировать метод КТМДМ для оценки структурно-морфологических свойств интерфазного хроматина лимфоидных клеток периферической крови и костного мозга.

2. Изучить характерные особенности структуры интерфазного хроматина лейкемических лимфобластов при различных иммуноцитологических вариантах острого лейкоза.

3. Выявить наиболее информативные морфоденситометрические критерии оценки изменения структуры интерфазного хроматина при различных субвариантах ОЛЛ.

4. Провести сравнительный анализ структуры хроматина лимфоидных клеток в норме, при остром лимфобластном лейкозе и при воздействии инкорпорированных радионуклидов для определения возможных маркеров ма-лигнизации.

5. Разработать морфоденситометрические критерии ранней диагностики злокачественных Т-клеточных лимфом кожи.

Научная новизна работы: Выявлены достоверные различия и особенности надмолекулярной организации интерфазного хроматина лимфоидных клеток костного мозга и периферической крови по количественным показателям и их соотношениям в норме, при воздействии инкорпорированных радионуклидов, при различных иммуноцитологических вариантах ОЛЛ, а также при злокачественных Т-клеточных лимфомах кожи (ЗТЛК).

На основании этого дополнены дифференциально-диагностические критерии при различных субвариантах ОЛЛ у детей; показана возможность построения новых МДМ-критериев прогноза ОЛЛ; разработан способ ранней и дифференциальной диагностики злокачественных Т-клеточных лимфом кожи.

Практическая значимость: На основании примененного нами метода компьютерного телевизионного морфоденситометрического исследования пока-

зана возможность построения новых дифференциально-диагностических и прогностических критериев, критериев оценки воздействий неблагоприятных экологических факторов. Созданные компьютерные видеоархивы ядер и полученные количественные характеристики интерфазного хроматина лимфо-идных клеток могут быть использованы в дальнейших исследованиях, посвященных изучению генома при радиационном воздействии и при лимфопроли-феративных заболеваниях. Разработанный способ диагностики Т-клеточных лимфом кожи может использоваться в клинической практике для ранней и дифференциальной диагностики 3TJ1K.

Апробация работы. Материалы диссертации доложены и обсуждены на: конференциях лаборатории цитологии и Ученых Советах НИИ ФХМ (1992 -1996); Ученом Совете НИИ ДГ (1997); конференции по биомедицинской оптике "Optical diagnosis of blood and blood components" (Лос-Анджелес, 1993); 3-й конференции Европейской Ассоциации по аналитической клеточной патологии "Analytical cellular pathology" (Гренобль, 1994); на 22 Европейском конгрессе по цитологии (Амстердам, 1994); XI и XII научно-практических конференциях "Морфометрия в диагностике болезней" (Москва, 1993, 1994); III съезде детских онкогематологов республики Беларусь (Минск, 1995); международном семинаре "Роль эпидемиологических исследований в оценке риска при радиационных авариях" (Минск, 1995); International Conference on Healt Cousequences of the Chernobyl and Other Radiological Assidents (Женева, 1995); 3-м конгрессе международной ассоциации морфологов (Тверь, 1996); Всероссийской научно-практической конференции "Чернобыль: 10 лет спустя. Итоги и перспективы" (Брянск, 1996); VII Российском съезде дерматологов и венерологов (Казань, 1996); Республиканском научном симпозиуме "Пролиферативные заболевания кожи" (Москва, 1996); III Всероссийском съезде гематологов и трансфузиологов (Санкт-Петербург, 1996); конференции "Анализ изображения клеток системы крови: настоящее и будущее" (Москва, 1996).

Публикации: По теме диссертации опубликовано 16 печатных работ, в том числе б за рубежом, получен патент РФ "Способ диагностики злокачественных Т-клеточных лимфом кожи".

Структура и объем диссертации: Диссертация изложена на страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания материала и методов исследования, результатов исследования и их обсуждения, заключения, выводов, приложения и библиографического указателя, Содержание работы иллюстрировано 26 рисунками, количественные данные представлены в 25 таблицах. Библиографический указатель содержит работ отечественных и зарубежных авторов.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Набор клинического материала проводился в гематологических отделениях РДКБ МЗ РФ и МДКБ № I г. Москвы, в отделении дерматовенерологии и дерматоонкологии МОНИКИ им. М. Ф. Владимирского, в поликлиниках № 123 и № 203 г. Москвы и при обследованиях детей, проживающих в юго-западных районах Брянской области.

При выполнении работы было обследовано 328 человек: 278 детей и 50 взрослых. Характеристика обследованных пациентов представлена в таблице 1.

Таблица 1.

Характеристика обследованных пациентов

Группы ВСЕГО М/Ж Возраст

Здоровые дети (г. Москва) 95 50/45 от 1 года до 15 лет

Больные ОЛЛ 72 48/24 от 1 года до 15 лет

Дети, подвергшиеся воздействию 111 53/58 от 2 до 15 лет

МДИИ (Брянская область)

Больные ЗТЛК 30 25/5 от 43 до 80 лет

Больные доброкачественными 20 14/6 от 25 до 69 лет

дерматозами

ВСЕГО 328 190/138

Объектом данного исследования являлись мазки периферической крови и аспиратов костного мозга (кровь - у 256 человек, костный мозг - у 72 детей с ОЛЛ). Диагноз ОЛЛ устанавливался на основании общепринятых клинико-морфоцитохимических и иммунологических критериев. Все исследования проводились до начала лечения. Иммунофенотипирование лейкозных клеток проводилось методом проточной цитофлюорометрии в лаборатории иммунодиагностики и иммунного мониторинга гемобластозов (Зав. лабораторией -Байдун Л. В.) и методом быстрой щелочной фосфатазы в лаборатории диагностической и радиационной гематологии НИИ детской гематологии (Зав. лабораторией - профессор Ленская Р.В.). В работе использовались стандартные методики получения мазков цельной крови и аспиратов костного мозга (Меньшиков В. В., 1987 г.).

Проведены морфоденситометрические исследования более 4000 ядер лимфоидных клеток. Морфоденситометрические исследования проводили на системе анализа изображений "ДиаМорф" (фирма ДиаМорф, Россия). "ДиаМорф" является аппаратно-программным комплексом, в котором реализована методика компьютерной телевизионной морфоденситометрии, и включает в себя световой микроскоп, телевизионную камеру, системный монитор, устройство ввода и оцифровки изображений, ПЭВМ типа IBM PC/AT, программы базовых средств цифровой обработки изображений, программы прикладной обработки (Рис. 1).

Рис. 1 . Аппаратно-программный комплекс ДиаМорф

(фирма ДиаМорф, Россия)

Изображение, полученное с помощью системы ДиаМорф, представляет собой матрицу оптических плотностей, состоящую из отдельных элементов -пикселей, в которых измерялась оптическая плотность. Обработка изображений проводилась в программной среде ДиаМорф - CITO (Жукоцкий А. В., Марченко О. В.). Основные параметры, получаемые при морфоденситометри-ческом исследовании интерфазного хроматина лимфоидных клеток, представлены в таблице 2.

Таблица 2.

Основные параметры, получаемые при морфоденситометрнческом исследовании интерфазного хроматина лимфоидных клеток

N Параметры Определение

1 Area Площадь ядра

2 Perim Периметр ядра

3 OD Средняя оптическая плотность ядра

4 StdOD Среднеквадратичное отклонение средней оптической плотности ядра

5 IOD Интегральная оптическая плотность ядра

6 FF Фактор формы ядра

7 q 1-4 * Идентификатор компонент хроматина

8 qN 1-4 Количество связных областей компоненты в ядре

9 qAr 1-4 Средняя площадь областей компоненты в ядре

10 qPer 1-4 Средний периметр областей компоненты в ядре

11 Quota 1-4 Доля компоненты в интегральной оптической плотности ядра

12 qlOD 1-4 Интегральная оптическая плотность компоненты

13 qOD 1-4 Средняя оптическая плотность компоненты

14 qSOD 1-4 Среднеквадратичное отклонение средней оптической плотности компоненты

15 qDc 1-4 Средний диаметр равного по площади круга

16 qFF 1-4 Средний фактор формы областей компоненты

17 qGr 1-4 Средний градиент оптической плотности компоненты

18 qRaV 1,4 Радиус-вектор компонент хроматина

* - цифра обозначает соответствие параметра той или иной компоненте хроматина.

Алгоритм исследования ядер лимфоидных клеток костного мозга и периферической крови включал следующие этапы:

1. Ввод изображения ядра клетки при помощи телевизионной камеры в компьютер;

2. Улучшение качества изображения;

3. Выделение участков эухроматина и гетерохроматина;

4. Измерение традиционных (классических) морфометрических и денси-тометрических параметров ядра клетки;

5. Измерение морфоденситометрических показателей струтуры интерфазного хроматина.

6. Архивирование и хранение в памяти компьютера или на дискетах исходных изображений объектов, позволяющие при необходимости использовать их для повторного анализа.

7. Статистическая обработка результатов измерений на основе пакетов прикладных программ ИПСО и БТАТОНАРГСБ.

8. Анализ полученных данных методами графического анализа и парных корреляций.

Статистическую обработку результатов измерений проводили на 1ВМ-РС/АТ с использованием программной среды ИПСО (Жукоцкий А. В., Ломакин О. А., Якубова Н. И.). В ИПСО (ДиаМорф, Россия) реализованы разнообразные алгоритмы статистической обработки данных и теории распознавания образов, основанные на концепции информационной "воронки", сформулированной проф. Э. М. Коганом и заключающейся в выявлении из множества оптических, морфометрических и клинико-лабораторных показателей наиболее информативных признаков и построении из набора неспецифических (субклеточных, клеточных, тканевых) признаков специфической комбинации признаков, характеризующей патологическое состояние объекта.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

При выполнении методической части исследования с целью минимизации возникающих погрешностей, применявшаяся ранее традиционная методика подготовки препаратов была усовершенствована путем заключения окрашенных мазков в канадский бальзам, что привело к уменьшению шумовой сигнальной информации. Усовершенствованная в лаборатории цитологии осветительная система микроскопа и предложенное нами изменение методики подготовки препаратов позволяет более точно оценивать структуру интерфазного хроматина за счет сведения к минимуму оптических эффектов, приводящих к искажению информации, что позволяет увеличить точность измерения до пределов разрешения микроскопа.

Сравнение информативности традиционных (мсрфометрических и ден-ситометрических) и разработанных новых МДМ-параметров мы провели при изучении интерфазного хроматина лимфоцитов периферической крови детей, проживающих в загрязненных радионкулидами районах Брянской области и детей, проживающих в г. Москве. Было обследовано 40 детей в возрасте 9-14 лет, из которых 21 человек - группа детей, подвергшихся воздействию инкорпорированных радионуклидов (Красногорский район Брянской области) и 19 человек - группа сравнения (г. Москва).

На первом этапе обследования для оценки надмолекулярной организации хроматина измерялся максимально широкий комплекс денситометрических, морфометрических и производных параметров (около 200). Проведена углубленная первичная статистическая обработка обобщенных данных с получением средних значений измеренных показателей интерфазного хроматина. Используя информационный критерий Стьюдента из всего спектра параметров были выбраны наиболее информативные.

На рис. 2 и 3 представлено качество распознавания при выявлении групп детей, проживающих в зонах радионуклидного загрязнения и детей из группы сравнения с использованием только традиционных параметров (рис.2 ) и с использованием комбинации традиционных и МДМ-параметров (рис. 3).

Рис. 2. Диаграмма рассеяния в плоскости традиционных морфометрических параметров в группах: 1 - референтная группа (г. Москва); 2 - группа детей, проживающих в зонах радионуклидного загрязнения (Брянская область)

Рис. 3. Диаграмма рассеяния в плоскости традиционных и морфодепситометриче-ских параметров в группах: 1 - референтная группа (г. Москва); 2 - группа детей, проживающих в зонах радионуклидного загрязнения (Брянская область)

Процент ошибочной классификации представлен в таблице 3.

Таблица 3.

N Класс параметров Ошибка распознавания (%)

1 МДМ + традиционные 10

2 МДМ 15

3 традиционные 42

Созданы видеоархивы интерфазных ядер лимфоидных клеток и получены количественные оптические и геометрические характеристики надмолекулярной организации хроматина лейкозных лимфобластов при различных имму-ноцитологических субвариантах ОЛЛ у детей, а также лимфоцитов периферической крови здоровых детей. Фрагмент видеоархива представлен на рис. 4.

Рис. 4. Фрагмент видеоархива ядер лейкемических лимфобластов.

Результаты исследования показали, что в клетках костного мозга детей, больных ОЛЛ увеличена степень дисперсии интерфазного хроматина: достоверно увеличено среднее количество областей всех четырех компонент хроматина, при этом средние значения геометрических параметров 1-ой, 3-ей и 4-ой компонент достоверно ниже, а значения геометрических параметров окологранулярной компоненты хроматина выше, что указывает на признаки его активации.

Для лейкемических лимфобластов характерны более низкие значения всех оптических параметров как ядра в целом, так и компонент хроматина. Эти данные подтверждают концепцию ядерной ахромазии опухолевых клеток (Эренпрейса Е.А., 1990 г.), заключающуюся в снижении сродства ядер к красителю. В нашем исследовании ядерная ахромазия выявлена с помощью сте-

хиометрического красителя (ГХК), более перспективного в количественной микроскопии.

В нашем исследовании мы провели сравнительный анализ структуры хроматина б субвариантов OJIJI: Common-OJIJI (6 случаев), пре-пре-В OJ1J1 (29 случаев); пре-В ОЛЛ (7 случаев); B-клеточный вариант ОЛЛ (2 случая); пре-Т ОЛЛ (2 случая) и Т-ОЛЛ (6 случаев).

С помощью информационного анализа выявлены морфоденситометриче-ские признаки, характерные для определенных иммуноцитологических субвариантов ОЛЛ (рис.5).

Rad Vec4

-0.6602 -0.4822 -0.3043

Рис. 5. Центры групп в пространстве признаков GRAD3 и Rad_Vec4

(разброс - ошибка среднего)

1. пре-Т-ОЛЛ 4. В - ОЛЛ

2. Т - ОЛЛ 5. пре - пре-В - ОЛЛ

3. Common - ОЛЛ 6. пре-В - ОЛЛ

Выявлена определенная закономерность организации хроматина более ранних и более зрелых вариантов ОЛЛ (рис. 6). Можно предположить, что изменения надмолекулярной организации хроматина являются стадиеспецифич-ными, а не линиеспецифичными и отражают стадию созревания в большей степени, чем линию дифференцировки.

6.662

3.972

1.283

346 822 475.049 603.276 731.504

Рис. 6. Центры групп в пространстве признаков PERIMETR и O.D.

(разброс - ошибка среднего)

1. пре -Т - ОЛЛ 4.В-ОЛЛ

2. Т-ОЛЛ 5. пре - пре - В - ОЛЛ

3. Common - ОЛЛ 6. пре - В - ОЛЛ

Традиционный анализ стадий дифференцировки лимфоидных клеток проводится с помощью изучения экспрессии специфических антигенов на их поверхности и в цитоплазме. Однако неизвестно, как отражаются отдельные этапы дифференцировки В-лимфобластов на надмолекулярной структуре хроматина, степени его активации, состоянии различных его компонент.

С помощью моноклонального иммунофенотипирования были определены следующие классы иммунофенотипов лейкемических лимфобластов костного мозга В-линии при ОЛЛ у 18 детей и составлен следующий ряд их дифференцировки: I. DR+, CD19+, CD 10+, CD22-, ц-; II. DR+, CD19+, CD10+, CD22+, ц -; III. DR+, CD19+, CD10-, CD22+-, ц-; IV. DR+, CD19+, CD10-, CD22+, ц+. В этом ряду каждый последующий класс отличается от предыдущего на один из основных антигенов. Наименее дифференцированные лейкемические лимфоб-ласты I класса и наиболее дифференцированные - содержащие в цитоплазме ц -цепи иммуноглобулинов - IV класса.

В этих 4-х классах проведены МДМ-исследования и проанализированы средние значения полученных показателей. В ходе исследования выявлено,

O.D.

что по мере дифференцировки клеток в В-линейном ряду и с приобретением или утратой дифференцировочных антигенов наблюдаются: увеличение размеров ядер; ядра становятся более округлыми; оптические и интегральные оптические показатели ядер вначале снижаются (с приобретением CD22), а затем повышаются. В ходе исследования показано, что достоверно отличаются ядра клеток IV иммунофенотипа большей площадью ядра, большей интегральной плотностью ядра, большей интегральной плотностью 2-й и 3-й компонент хроматина при снижении доли 4-й компоненты в интегральной плотности ядра. На этой стадии в клетке идет активный синтез белка, который должен сочетаться с высокой активностью РНК при пониженной пролифератив-ной активности. Такого же характера, хотя и менее выраженные изменения структуры хроматина выявлены в ядрах II класса, отличающихся приобретением CD22-aHTHreHa. Наименее дифференцированные В-лимфобласты I класса имеют наименьшую площадь и интегральную оптическую плотность гранул, наименьшую площадь 2-й компоненты, наибольшую долю 4-й компоненты хроматина в интегральной оптической плотности ядра и наибольшую среднюю оптическую плотность ядра. Ядра III класса достоверно не отличаются от других вариантов лейкемических клеток В-линии. Возможно, с процессом дифференцировки более связаны показатели окологранулярной компоненты, а с активностью пролиферации - 4-й компоненты хроматина.

Анализ изменений параметров интерфазного хроматина показал, что с приобретением дифференцировочных признаков наблюдаются сложные изменения в структуре хроматина ядра клетки, фазные, неоднонаправленные, связанные с противоречивыми влияниями как минимум двух процессов - дифференцировки и пролиферации.

Сравнительный анализ морфоденситометрических показателей интерфазного хроматина В- и Т-линейных вариантов OJIJI у детей позволил оценить отражается ли линейная принадлежность на стурктуре хроматина. Проанализировав изменения параметров интерфазного хроматина клеток В- и Т-линик можно сказать, что ядра лейкозных бластов В-линии более "светлые". Это, возможно, объясняется большей выраженностью активности синтетических процессов в В-клетках. Возможно также клетки Т-линии более "темные" по сравнению с В-линейными из-за меньшей выраженности феномена ядерной

ахромазии. Известно, что в Т-лимфоцитах имеется больше разрывов ДНК, а феномен ядерной ахромазии обратнопропорционально зависит от количества разрывов ДНК: чем больше разрывов, тем меньше выраженность ядерной ахромазии. Линия дифференцировки лимфоидных клеток в большей степени отражается на состоянии окологранулярной компоненты интерфазного хроматина: наибольшее количество достоверных (р < 0.05) различий мы обнаружили по параметрам именно этой компоненты.

В нашем исследовании мы также провели сравнительный анализ хроматина в группах больных с одинаковыми иммунофенотипами, отличающимися только по наличию или отсутствию одного из активационных антигенов (Tdt, DR, CD30). Компактизация гранул и окологранулярной компоненты, снижение интегральных оптических параметров и повышение доли наиболее активных областей эухроматина в интегральной оптической плотности ядра свидетельствуют о выраженных процессах активации хроматина в лимфобластах, имеющих в своем фенотипе один из активационных антигенов.

В связи с аварией на Чернобыльской АЭС и загрязнением огромных территорий радионуклидами значительно возрос интерес ученых и врачей всего мира к изучению механизмов, эффектов и, особенно, последствий длительного хронического воздействия малых доз радионуклидов на организм человека.

Известно, что наиболее значимой опухолью, вызываемой радиацией, является острый лейкоз (Boice J. D., 1981). По прогнозам многих исследователей ожидается рост заболеваемости злокачественными новообразованиями, включая лейкозы (Norman С., Dickinson D.,1986; Anapaugh L.R., Catlin R. J., Goldman M.,1988; Gofman J.W., 1990). Вместе с тем, некоторые авторы считают риск развития радиогенных лейкозов после аварии на ЧАЭС минимальным (Свирновский А. И.,Иванов Е. П. и др., 1995). Проведение ретроспективных эпидемиологических исследований не выявило устойчивой тенденции к росту заболеваемости гемобластозами у детей Брянской области в поставарийный период. Средняя заболеваемость и структура гемобластозов не отличается от других регионов Российской Федерации (Чернов В. М. с соавт., 1994).

Морфоденситометрические исследования интерфазного хроматина лимфоцитов периферической крови показали, что основные отличия групп детей, подвергшихся воздействию инкорпорированных радионуклидов и референтной группы, заключаются в изменении оптико-геометрических параметров: относительной контрастности ядра, размельченности гранулярной компоненты, относительной контрастности гранулярной компоненты, отношения разности оптической плотности вершины гранулы и оптической плотности начала гранулы к средней плотности гранулы. При этом выявлено достоверное изменение "микроанатомии" плотных участков хроматина, что позволило предположить большую чувствительность компактного хроматина к действию излучения, связанного с инкорпорированием радионуклидов или общим загрязнением среды. Изменение этих микрогеометрических показателей намного выше, чем изменение интегральных оптических показателей ядра. Выявлены изменения взаиморасположения и количества гранул хроматина. Изменение расстояний между гранулами высоко достоверно.

Основная задача, которую мы попытались решить в данном исследовании, заключалась в поиске закономерностей изменений структуры интерфазного хроматина и определении возможных маркеров малигнизации на основе мор-фоденситометрического анализа лимфоидных клеток при воздействии инкорпорированных радионуклидов и при остром лимфобластном лейкозе у детей. Для этого были проанализированы значения морфоденситометрических показателей хроматина лимфоидных клеток в норме (здоровые дети из г. Москвы -группа сравнения), при воздействии инкорпорированных радионуклидов (группа детей - "накопителей", проживающих в Красногорском районе Брянской области, имеющих активность накопленных в организме радионуклидов свыше 300 нКи) и при манифестации острого лимфобластного лейкоза (группа первичных больных ОЛЛ до начала лечения).

Чувствительность метода КТМДМ и информативность применяемых нами морфоденситометрических параметров позволяют регистрировать индивидуальные особенности ядер клеток даже при их визуальном сходстве. На рис. 7. представлены ядра лимфоидных клеток в норме, при воздействии МДИИ, при ОЛЛ и соответствующие им одномерные сканограммы профилей интенсивно-стей оптической плотности. Как видно из рисунка, даже при улучшенном ка-

честве изображения, визуально различить ядра довольно сложно, тогда как по профилю интенсивностей хорошо выявляются их различия.

¡Л'-А

.нг^Ч'У}!

> « % н

У

Нормальный лимфоцит Вомействие МДИИ

Лимфобласт при ОЛЛ

"* и л л щ« к ц\

:: . ! I1 Л :: ] ' V

г 1------

Рис. 7. Улучшенные изображения ядер лимфоидных клеток в норме, при воздействии инкорпорированных радионуклидов, при ОЛЛ и соответствующие им одномерные сканограммы

Проанализировав изменения хроматина по параметрам РБ и Оиага, можно сделать вывод, что при воздействии МДИИ происходит перераспределение интерфазного хроматина <33, (при ОЛЛ - С?3 -> 02), т. е. подтверждается наша гипотеза о "патологической активации" хроматина при воздействии инкорпорированных радионуклидов (конденсация гетерохроматина за счет слияния блоков, наряду с выраженной дисперсией эухроматина).

Методами корреляционно-регрессионного и многомерного статистического анализа выявлена общая структурно-функциональная инварианта процессов реорганизации хроматина при ОЛЛ и при воздействии инкорпорированных радионуклидов: переход нуклеоида 2-го типа в нуклеоид 1-го типа. Такая однонаправленность в реорганизации хроматина свидетельствует о процессах активации генома, имеющих место в обоих случаях.

Значительный интерес представляют параметры, по которым не выявляются достоверные различия при сравнении групп ОЛЛ-МДИИ и в тоже время есть достоверные отличия от нормы. Возможно, выявленные нами параметры, по которым нет различий при сравнении ОЛЛ-МДИИ, но есть различия с нормой, могут использоваться в качестве маркерных характеристик для выделения групп риска при скрининговых обследованиях детей, проживающих на

загрязненных радионуклидами территориях. Для этого необходимо более тщательное динамическое наблюдение за детьми, у которых значения этих МДМ-параметров ядер лимфоцитов оказались близки по своим количественным характеристикам к аналогичным параметрам лейкемических лимфобластов, повторные МДМ-исследования и ретроспективная оценка полученных результатов.

Следующий фрагмент нашего исследования посвящен изучению хроматина при злокачественных Т-клеточных лимфомах кожи. В клинической практике наиболее часто приходится дифференцировать эритродермические варианты ЗТЛК и эритродермии, возникающие при других заболеваниях. Существующие методы диагностики Т-клеточных лимфом кожи не могут полностью удовлетворить клиницистов, так как позволяют установить диагноз только при наличии выраженной клинической картины, трудоемки в исполнении (иммунологические, цитохимические, цитогенетические и др.) и достоверно не отражают изменения в популяции лимфоцитов, характеризующие злокачественность процесса.

Одним из наиболее известных диагностических методов является обнаружение атипичных форм лимфоцитов (клеток Сезари) у больных эритродер-миямипри ЗТЛК.

Нами сформированы две группы (обучающие выборки): больные ЗТЖ и больные доброкачественными воспалительными дерматозами, у которых были проведены морфоденситометрические исследования. Диагнозы больных, составивших обучающие выборки, подтверждены гистологическими и иммунологическими исследованиями, проведенными в отделении дерматовенерологии и дерматоонкологии МОНИКИ (исследования проведены совместно с к.м.н, Лезвинской Е. М.).

Особенности строения ядер клеток Сезари лучше заметны при слабом окрашивании ядер (Гаврилов О. К. с соавт., 1985), что подтверждается и применяемой нами специальной стехиометрической окраской ГХК. Однако, оценка лимфоцитов методом световой микроскопии дает лишь ориентировочные данные, а характерные черты лимфоцитов при ЗТЖ можно выявить только при значительной генерализации процесса и присутствии большого количества клеток Сезари в популяции лимфоцитов периферической крови. Поэтому

для разработки дифференциально-диагностических критериев 3TJIK в наших исследованиях использовались морфологически неотличимые от нормальных лимфоциты периферической крови.

Для проведения дискриминантного анализа были отобраны наиболее информативные и некоррелирующие между собой показатели структуры интерфазного хроматина, характерные для данной патологии: qOD4 - оптическая плотность эухроматина; FF - фактор формы ядра; qIOD2 - интегральная оптическая плотность гетерохроматина; Area - площадь ядра. Для комплексной оценки этих показателей рассчитывается интегральный параметр:

DF = -0,14379 * qOD4 + 0,00003 * qIOD2 + 10,4952 * FF + 0,0001 * * Area- 11,1241.

Формула для расчета параметра DF получена применением линейного дискриминантного анализа (Афифи А., Эйзен С., 1982) при помощи стандартного пакета статистических программ. При отрицательном значении показателя DF диагностируют Т-клсточную лимфому кожи.

Совпадение результатов проведенных тестов на экзаменационной выборке (в 86 % случаев) с использованием количественных характеристик структуры хроматина и клинической картины заболевания говорит о специфичности разработанного нами способа диагностики Т-клеточных лимфом кожи(эритродер-мических вариантов).

В результате данного исследования показана высокая чувствительность новых морфоденситометрических параметров интерфазного хроматина, специфичность комбинации примененных нами показателей для более ранней диагностики 3TJIK и дифференциальной диагностики эритродермий (рис. 8 ).

Призна к и

уеовершенст» усоаоршенств

методика методика

изготовления изготовления

препаратов , препаратов

традиционные. I МДМ

. параметры J ^ параметры

Рис.8. Сравнение чувствительности традиционных и морфоден сигом ет-рических параметров при дифференциальной диагностике Т- клеточных лимфом кожи, нейродермита и псориаза.

ВЫВОДЫ

1. Модифицирован способ подготовки препаратов для компьютерной телевизионной морфоденситометрии, позволяющий получать комплексную оценку состояния хроматина лимфоидных клеток костного мозга и периферической крови.

2. Видеоархивы изображений ядер и количественные характеристики надмолекулярной организации хроматина лимфоидных клеток в норме, при воздействии инкорпорированных радионуклидов, при различных иммуноцитоло-гических субвариантах ОЛЛ у детей, при злокачественных Т-клеточных лим-фомах кожи, которые использовались в данной работе, могут быть взяты за основу в дальнейших исследованиях.

3. Выявлена ядерная ахромазия лейкемических лимфобластов с помощью более перспективного в количественной микроскопии морфо-стехиометриче-ского красителя.

4. Выявлены морфоденситометрические признаки, позволяющие с высокой достоверностью отличить определенный иммуноцитологический субвариант ОЛЛ от остальных, которые могут быть использованы в качестве дополнительных диагностических критериев.

5. Наличие в иммунофенотиле лейкозных лимфобластов одного из активационных антигенов сочетается с выраженными признаками перераспределения и активации хроматина.

6. Выявлена общая закономерность процессов реорганизации хроматина при ОЛЛ и при воздействии инкорпорированных радионуклидов: переход нуклеоида 2-го типа в нуклеоид 1-го типа. Зарегистрирована "патологическая" активация хроматина при воздействии инкорпорированных радионуклидов.

7. Разработан способ ранней диагностики злокачественных Т-клеточных лимфом кожи на основе морфоденситометрических показателей интерфазного хроматина лимфоцитов периферической крови.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

¡.Полученные в данной работе морфоденситометрические характеристики ядер лейкемических лимфобластов могут быть использованы в качестве дополнительных диагностических критериев.

2. Разработанный способ диагностики Т-клеточных лимфом кожи может использоваться в клинической практике для ранней диагностики ЗТЖ.

3. Морфоденситометрический метод исследования хроматина лимфоцитов периферической крови может быть использован при скрининговых обследованиях детей, проживающих на загрязненных радионуклидами территориях.

4. Усовершенствованную методику подготовки цитологических препаратов рекомендуется использовать при исследованиях с помощью световой сканирующей аппаратуры.

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ РАБОТ

1. Computer Morphodensitometry Analysis of the Blood Cells at Low Dose Radiation. - III SPIE's Int. Symp. "Biomedical Optics", Los Angeles, Cal. USA, 22-29 Jan. 1994 y.: Techn. Abstr. -Los Angeles, USA, 1994. - P. 145. - Paper 2136A-21. (соавторы: Kopylov V. F., Kogan E. M., Putina T. G., Marchenko O. V., LomakinaE. В., Zhukotsky A.V.)

2. Computerized Morphodensitometric Analysis of Blood Cells from Individuals Exposed to Low-Dose Radiation. - Progress in biomedical optics. Proc. of Bio-chem. Diagnostic Instrumentation. SPIE Los-Angeles, USA, January 1994, Vol. 2136, P. 154-162. (соавторы: Kopylov V. F„ Kogan E. M., Putina T. G„ Marchenko О. V., Lomakina E. В., Zhukotsky A.V.)

3. Rapid new technique for computer morphometry of blood cells in research and of AIDS. - SPIE's Intern. Symposium LosAngeles, USA, 22-29 January, 1994. Techn. abst. (соавторы: Kopylov V. F., Kogan E. M., Putina T. G., Marchenko О. V., Lomakina E. В., Zhukotsky A.V.)

4. Компьютерный морфоденситометрический анализ клеток крови при воздействии малых доз радиации. - В кн. "Молекулярно-генетические механизмы действия малых доз радиации" - Труды НИИДГ МЗ РФ, Москва, 1993,

С. 145-163. (соавторы: Коган Э.М., Жукоцкий A.B., Копылов В.Ф., Ломакина Е.Б., Путина Т.Г., Молодцов М.Ю.)

5. Computerized Television Morphodensitometry in Clinical Application of Cytopathology. - J. Analytical Cellular Pathol., Vol. N3, April 1994, P. 218. (соавторы: Kopylov V., Marchenko O., Lomakin O., Zhukotsky A., Putina T., Kogan E.)

6. Computational Morphodensitometry of Chromatin Structure in Acute Lymphocytic Leukemia. - Acta Cytologica, Vol. 38, No. 4, 1994, P. 626-627. (соавторы: A. G. Rumyantsev, E. M. Kogan).

7. Компьютерная морфоденситометрия и ее возможности в экспериментальных и клинических исследованиях. - Вестник РАМН, N3 1995, С 3340. (соавторы: Жукоцкий A.B., Коган Э.М., Копылов В.Ф., Ломакин O.A., Молодцов М.Ю., Путина Т.Г.)

8. Морфоденситометрический анализ надмолекулярной организации хроматина лимфоидных клеток при воздействии инкорпорированных радионуклидов и при остром лимфобластном лейкозе у детей. - Тез. докл. международного семинара "Роль эпидемиологических исследований в оценке риска при радиационных авариях" - Минск, 1995, С. 15. (соавторы: Жукоцкий А. В., Коган Э. М.).

9. Сравнительный видеокомпьютерный анализ ядер лимфоидных клеток у детей, проживающих в зонах радионуклидного загрязнения и при лимфопро-лиферативных заболеваниях. - Тез. докл. 3-го съезда детских онкогематологов Республики Беларусь, Минск, 9-11 ноября 1995, С. 7 - 8. (соавторы: Жукоцкий А. В., Лория С. С., Копылов В. Ф., Якубова Н. И., Марченко О. В., Коган Э.М.).

10. Морфоденситометрические характеристики хроматина лейкозных клеток в сравнении с композицией дифференцировочных антигенов при остром лимфобластном лейкозе у детей. - Тез. докл. 3 -го съезда детских онкогематологов Республики Беларусь, Минск, 9-11 ноября 1995, С. 26 -27. (соавторы: Жукоцкий А. В., Копылов В. Ф., Коленкова Г. В., Байдун Л. В., Ленская Р. В., Коган Э. М.).

11. Integral indexes - the most important criteria of health evaluation of children, underwent low doses irradiation. - International Conference on Health

Conséquences of the Chernobyl and other Radiological Accidents, 20-23 November 1995, Geneva, Switzerland - 6p. (соавторы: S. Loria, A. Zhukotsky, I. Alelcseev A. Rumyantsev).

12. Структура хроматина лимфоидных клеток при воздействии инкорпорированных радионуклидов и при остром лимфобластном лейкозе у детей. ■ Мат. Всероссийской научно-практ. конф. "Чернобыль: 10 лет спустя. Итоги у перспективы", Брянск, 15-17 мая 1996, часть 1, С. 123. (соавторы: Жукоцкий А.В., Копылов В.Ф., Марченко О.В., Коган Э.М.)

13. Компьютерный морфоденситометрический анализ лимфоцитов в диагностике эритродермий. - Тез. докл. VII Российского съезда дерматологов и венерологов, часть И, С. 10-11, Казань 1996. (соавторы: Е.М. Лезвинская,

A.В. Жукоцкий, Э.М. Коган)

14. Морфоденситометрия структуры хроматина интерфазных ядер в норме и при некоторых воздействиях. - Морфология, N2 1996, С. 52. (соавторы: А.

B. Жукоцкий, В. Ф. Копылов, Э. М. Коган, Ю. М. Лопухин).

15. Сравнительный морфоденситометрический анализ структуры хроматина больных различными эритродермиями. - Тез. докл. Респ. науч. симп. "Пролиферативные заболевания кожи". - Москва, МОНИКИ, 1996, С. 13. (соавторы: Е. М. Лезвинская, А. В. Жукоцкий, В. Ф. Копылов, Э. М. Коган).

16. Морфоденситометрические параметры хроматина в ряду лейкемиче-ских клеток В-линии при остром лимфобластном лейкозе у детей. - Актуальные вопросы гематологии и трансфузиологии. - Тез. док. Ш-го Всероссийского съезда гематологов и трансфузиологов. Санкт-Петербург, 26-28 ноября 1996,

C. 122. (соавторы: Ленская Р. В., Коленкова Г. В., Жукоцкий А. В., Коган Э. М.).

ИЗОБРЕТЕНИЯ

1. Способ диагностики злокачественных Т-клеточных лимфом кожи. -Патент РФ N гос. регистрации 95107348/14 (012818) от 16.01.97. (соавторы: Коган Э. М., Жукоцкий А. В., Копылов В. Ф., Лезвинская Е.М.)