Анализ гломерулярных межклеточных взаимодействий как новый подход в изучении морфо- и патогенеза гломерулопатий

Иванов, Алексей Алексеевич

Диссертации по медицине → Патологическая анатомия

Автореферат и диссертация по медицине (14.00.15) на тему:Анализ гломерулярных межклеточных взаимодействий как новый подход в изучении морфо- и патогенеза гломерулопатий

АВТОРЕФЕРАТ

Иванов, Алексей Алексеевич Москва 1992 г.

Ученая степень: доктора медицинских наук

ВАК РФ: 14.00.15

Автореферат диссертации по медицине на тему Анализ гломерулярных межклеточных взаимодействий как новый подход в изучении морфо- и патогенеза гломерулопатий

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ МОСКОВСКАЯ МЕДИЦИНСКАЯ АКАДЕМИЯ имени И.М.СЕЧЕНОВА

на правах рукописи

ИВАНОВ

АЛЕКСЕЙ АЛЕКСЕЕВИЧ

АНАЛИЗ ГЛОМЕРУЛЯРНЫХ МЕЖКЛЕТОЧНЫХ ВЗАИМОДЕЙСТВИЙ КАК НОВЫЙ ПОДХОД В ИЗУЧЕНИИ МОРФО- И ПАТОГЕНЕЗА ГЛОМЕРУЛОПАТИЙ

(14.00.15 - патологическая анатомия)

Автореферат диссертации в форме доклада на соискание ученой степени доктора медицинских наук

Москва 1992

Работа выполненана в Московской медицинской академии имени И.М.Сеченова.

Научный консультант

Лауреат Государственной премии СССР, член-корреспондент РАМН профессор М.А.Пальцев

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Ю.Л.Перов, доктор медицинских наук, профессор А.Б.Шехтср, член-корреспондент РАМН, профессор В.Л.Шахламов.

Ведущее учреждение - Университет Дружбы народов им.П.Лумумбы.

Защита состоится " ¿СС& С^Р_1992 года в " ¡4 " час.

на заседании специализированного Ученого Совета (д.074.05.05.) при Московской медшцшской академии им. И.М.Сеченова (Москва, Абрнкосовский пер., д.1)

С докладом можно ознакомиться в бибилиотеке академии. (Зубовская площадь, д.1)

Автореферат разослан "_"_]_1992 г.

Ученный секретарь специализированного совета доктор медицинских наук

профессор В.А.Паршанскнй

российская j

ГОС У ¡J, А Г ü T 0 a H И А Я

ЬЙН tlH'; ГЕМА ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы.

Последнее десятилетие ознаменовано значительными успехами в развитии нефрологии, позволившими получить принципиально новые данные, уточняющие, а в ряде случаев заставляющие пересмотреть, устоявшиеся взгляды на морфо- и патогенез гломеру-лопатий. Эти успехи обусловлены внедрением достижений иммунологии, биотехнологии, морфологии и молекулярной биологии в экспериментальную л клиническую нефролог .л

Возможность промышленного производства поли- и монокло-нальных антител к широкому спектру антигенов и использование их в патоморфологических исследованиях на светооптическом и ультраструктурном уровнях позволили получить новые данные о механизмах повреждения гломерулярного фильтра и образования депозитов иммунных комплексов при различных гломерулопатиях (Andres а,Brentjens J. 1988). В подавляющем большинстве случаев развитие гломерулопатий связано с нарушениями гуморального и клеточного иммунитета и выражается в появлении депозитов иммунных комплексов, имеющих определенную локализацию, обусловленную различными механизмами их образования (Tuomala К. 1990). По механизмам образования депозиты иммунных комплексов подразделяют на депозиты, образованные циркулирующими иммунными комплексами и депозиты, образованные in situ. Важную роль в образовании депозитов играют физико-химичзские факторы (размеры, заряд макромолекул, величина гидростатического давления в клубочке и т. д.), которые могут выступать в роли самостоятельных повреждающих агентов (Kanvar Y. S. 1984). К сожалении большинство работ носит экспериментальный характер и отражает, как правило, лишь один из аспектов механизмов образования депозитов иммунных комплексов (Couser V. G.1986).

Важным этапом в изучениии иммунобиологии и иммунопатологии почек явилась разработка способов кратковременного и длительного культивирования изолированных клубочков с получением чистых линий отдельных типов гломерул; рных клеток (Lovett D.H. et al.1986). С их помощью получены данные, позволившие пересмотреть существовавший ранее взгляд на почечный клубочек как на пассивного участника иммуновоспалительных процессов. Накопленные данные о свойствах клеток почечного клубочка, составляющих биологическую основу развития в клубочках клеточ-

- г -

но-опосредованных иммунных реакций, позволили сформулировать представление об активной роли гломерулярных клеток в различных патологических процессах (Eddy A.A. et al.1986).

При иммуногистохимическом исследовании в мезангии обнаружены la-положительные клетки, выполняющие антигенпредставляю-щуто функцию. При гломерулонефрите количество таких клеток увеличивается (Schreiner а F. .Cotran R. S. 1082). Подоциты и мееан-гиальные клетки осуществляют синтез компонентов внеклеточного матрикса в постнатаяьном периоде (Abrahamson D. R. 1986). Диско-ординация функций этих клеток приводит к активизации склеротических процессов, ведущих к развитию хронической почечной недостаточности (Border V. А. et al. 1989). Использование культуры клеток почечного клубочка подтвердило наличие в мезангии двух популяций клеток - гдздкомшечного и макрофагального типов (Striker й F. .Striker L. J. 1985). возможность синтеза мезанги-альными гладкомышечными клетками колаагета 1, ill. IV типов и коллагеназы (Haralson ML А. et al. 1987), наличие на поДоцитах ряда антигенов, отвественных ва индукцию нефрита Хеймана (Kerjasohki D. 1990), возможность секреции различных эйказанои-дов, регулирующих клубочковую гемодинамику (Arraillou R. .Baud L. 1991).

Успехи в молекулярной биологии и иммунологии привели к открытию класса многофункциональных полипептндных факторов -цитокинов и группы адгезивных молекул, обеспечивающих регуляцию взаимодействия клеток почечного клубочка мгаду собой, с внеклеточным матриксом, о клетками крови (Pober J. S. .Cotran R.S.1990).

Для изучения механизмов межклеточного взаимодействия широко используют модели экспериментального нефрита с последующим получением культуры клеток почечного клубочка. Именно такой методический подход позволил доказать роль интерлейкина-1 и интерлейкина-6 в пролиферации мезангиальных клеток (Abboud Н. Е. 1991), трансформирующего фактора роста-бета в увеличении секреции компонентов внеклеточного матрикса (Sporn MB. .Roberts A.B. 1990), инсулиноподобного ростового фактора-1 как прогрессирующего фактора (Do 1 Т. et al. 1989). Изменение спектра цитокинов способно регулировать адгезию лейкоцитов к эндотелию путем экспрессии на нем тех или иных ^дгезивных молекул (Pober J.S. .Cotran R.S.1990). Большинство сведений о ре-

гуляции межклеточных взаимодействий получено в системе in vitro, что затрудняет экстраполяцию этих результатов на про-цесы, происходящие непосредственно в почечном клубочке.

Использование современных морфологических, иммунологических, генетических и молекулярно-биологических методов исследования позволило получить данные, отражающие различные стороны пато- и морфогенеза гломерулопатий. На основании этих данных морфогенез различных гломерулопатий можно рассматривать как вариант нарушения клеточных кооперац. й, обеспечивающих выполнение специализированной функции.

Целью работы явилось изучение морфо- и патогенеза различных гломерулопатий с позиций нарушения гломерулярных межклеточных взаимодействий.

Задачи исследования:

1. Провести комплексное морфологическое исследование би-оптатов больных с различными гломерулопатиями с использованием широкого спектра антител и различных иммуногистохимических методов. уточнить классификацию морфологических вариантов гломе-рулонефрита.

2. Изучить роль антигенов главного комплекса гистосов-местимости на различных этапах развития гломерулонефрита.

3. Определить роль лимфогемопоэтических клеток, инфильтрирующих почечный клубочек при воспалительных гломерулопати-ях. в регуляции различных внутриклубочковых процессов.

4. Изучить морфогенез невоспапительных гломерулопатий и выявить общие морфогенетические признаки и причины их появления.

5. Провести анализ взаимодействия клеток почечного клубочка медду собой и с внеклеточным матриксом при различных гломерулопатиях.

6. Разработать морфологические критерии, позволяющие оценивать эффективность терапии больных хроническим гломерулонеф-ритом и прогнозировать течение заболевания.

Научная новизна.

- Комплексное изучение морфо- и патогенеза гломерулопатий с позиций нарушения гломерулярных межклеточных взаимодействий с одновременным анализом патологических изменений in vivo и In

vit.ro является принципиально новым, ранее не применявшимся подходом.

- Использование широкого спектра антител при иммуногисто-химическом исследовании почечных биоптатов доказало правомочность деления гломерулопатий на воспалительные и невоспалительные.

- На основании данных иммуногистохимического исследования. с позиций нарушения межклеточных взаимодействий, предложена гипотеза: ведущий морфогенетический признак при невоспалительных гломерулопатиях - утолщение гломерулярной базальной мембраны - связан с повреждением подоцитов и синтезом ими компонентов внеклеточного матрикса по "эмбриональному типу".

- Впервые показано, что инфильтрация почечного клубочка при воспалительных гломерулопатиях является адаптивной реакцией организма, направленной на репаративную регенерацию.

- Еыявлена сложная регуляторная роль ыононуклеарных лейкоцитов и тромбоцитов в пролиферации клеток почечного клубочка и синтезе ими компонентов внеклеточного матрикса при воспалительных гломерулопатиях.

- Впервые разработаны морфологические критерии для оценки индекса актвности и индекса склероза, позволяющие прогнозировать эффективность проводимой терапии и течение заболевания у больных хроническим гломерулонефритом.

- Впервые подобраны оптимальные условия для обработки биоптатов, позволившие использовать в диагностических целях как иммунопероксидазный метод, так и метод иммуноколлоидного золота. в зависимости от поставленных задач.

Практическая ценность.

- Разработаны легко воспроизводимые методы выявления различных антигенов на светооптическом и ультраструктурном уровнях, позволяющие улучшить диагностику гломерулопатий.

- Данные, полученные при иммуногистохимическом исследовании биоптатов больных с различными гломерулопатиями. позволили выделить две группы больных: с воспалительными и невоспалительными гломерулопатиями. требующих различного подхода при их лечении.

-Экспериментальные данные о влиянии кортикостероидов (ме-тилпреднизолон) и цитостатиков (циклофосфан) на развитие имм/-

(«воспалительного процесса в почечном клубочке обосновывают возможность их использования при лечении гломе руло нефрита.

- Разработанные для больных брайтовым нефритом индексы активности и склероза позволяют оценивать эффективность проводимой терапии, прогноз заболевания и доказывают необходимость проведения пункционных биопсий с последующим морфологическим исследованием.

Иолохзния, выносимые на защиту:

1. Гломерулопатии - гетерогенная группа заболеваний, в основе которых лежат различные патогенетические механизмы. Ко»яиексное морфологическое исследование с использованием широкого спектра антител позволило выделить две группы гломеру-лопагий: воспалительные (гломерулонефриты) и иэвоспалителышз. Для первой группы характерна эксудативно-пролиферативная реакция и гетерогенность состава депозитов иммунных комплексов одной локализации; для второй - преимущественно первичное поражение подоцитов, однотипность, состава депозитов одной локализации. наличие депозитов, не содержащих иммунных коютлексов.

2. Гетерогенность морфологической картины на ранних этапах воспалительных гломерулопатий определяют шгигены главного комплекса гистосовместимости. Дальнейшая эволюция внутриклу-бочковых изменений, характерных для той или иной морфологической форме, зависит от патогенетических механизмов и антигенов. не связанных с главным комплексом гистосовместимости.

3. Инфильтрация лейкоцитами почечного клубочка при воспалительных гломерулопатиях является адаптивной органоспецифи-ческой реакцией организма на повреждение. Мононуклеарныэ лейкоциты и тромбоциты, как ведущие эффегегорныэ клетки, регулируют различные внугриклубочковые процессы путем изменения спектра медиаторов. Шд действием ряда факторов (физико-химические свойства повреждающего агента, длительность и интенсивность его воздействия, генетические особенности иммунного ответа) этот процесс моиет приобретать черты дисрегенерации, приводя-щрй к развитию прогрессирующего склероза

4. Несмотря на гетерогенность морфологической картины при невоспалительных гломерулопатиях, ведущим морфогенетичесгаш признаком является утолщение глонерулярной базальной мембраны, обусловленное позревдением подог^.гов и ведущее к развитие

склероза и гиалинова

б. Нарушения межклеточных взаимодействий в почечном клубочке как в экперименте, так и у больных с различными гломеру-лопатиями, приводят к изменению синтеза компонентов внеклеточного матрикса, которое может выражаться в накоплении или уменьшении мезангиального матрикса . утолщении или истончении гломерулярной базальной мембраны.

6. Совокупность морфологических показателей, объединенных в индекс активности и индекс склероза, отражает функциональное состояние почек у больных с различными гломерулопатиями. Среди различных демографических, клинических и лабораторных показателей индекс активности оказался единственно достоверным параметром, позволяющим прогнозировать течение заболевания и эффективность проводимой терапии.

Апробация материалов диссертации Основные положения диссертации обсуждены и доложены на: конференциях кафедры паталогической анатомии 1 лечебного факультета лаборатории клинической морфологии и лаборатории по изучению межклеточных взаимодействий ОДА им. И. Ч Сеченова (1988,1989,1990, 1991,1992), конференциях проблемной лаборатории нефрологии и кафедры терапии и профболезней ША им. И. Ы. Сеченова (1989, 1990,1991,1992), секции нефрологии и иммунопатологии МНОТ (1989, 1991), пленуме правления ВШГ (Орунэе.1989). V пленуме союзной проблемной комиссии "Нгфрология" (Фрунзе, 1990) , XXVII и XXVIII Конгрессах европейской ассоциации по диализу и трансплантации (Австрия,1990;Италия,1991), Конгрессе международного общества патофизиологов (Москва.1991). XIII Европейском конгрессе патологов (Югославия,1991).

В работе использованы данные, полученные автором совместно с сотрудниками лаборатории по изучению межклеточных взаимодействий и проблемной лаборатории нефрологии ШЩ ЫМА им. КМ. Сеченова

- 7 -

МАТЕРИАЛЫ и тот ИХ ИССЛЕДОВАНИЯ

Исследованы биоптаты почек 126 больных хроническим гломе-»улонефритом. Из них у 52 больных проведено иммуноэлектронно-мкроскопическое исследование. Среди этих 52 больных у 13 был ¡езангиопролиферативный гломерулонефрит (ЫПГН) (у 4 - с фиб-шластической трансформацией (ФГ), у 2 - болезнь "тонких <ембран" (БТЮ). у 10 - мезангиокапиллярный гломерулонефрит МКГН) (у 3 - лобулярный гломерулонефрит СЛГШ), У 2 - фиброп-гастический гломерулонефрит (<ЕПГН), у 8 - ыеьСрапоаная нефро-1атия (Щ) (у 3 - II-III стадии, у 5 - III-IV). у 7 - мини-гальные изменения (МИ) (у 5 - болезнь «алых нозгек подоцитов, у I - БТЮ, у 10 - фокально-сегментарный гломерулосклероз (ФСГС) [у 4 - начальные склеротические изменения, у 6 - выраженные ¡клеротические измен ния), у 2 - нефросклероз.

В работе использованы линейные красы Wistar, самцы, весом 180-200 г (220 животных); линейные мыши 5 линий: СБА. С57В1. 3ALB/C. NFS. NFR, самцу. в возрасте 10-12 недель, весом 18-20 г (280 животных).

Зноперктитаткш модели

- Острый сывороточный нефрит (ОСЮ индуцировали введением цонорской лошадиной сыворотки (Flow,Англия). 1,0 мл сыворотки вводили внутриперитонеально ежедневно в течение 10 дней мышам б различных линий. Контрольным ¡алкал вводили аналогичный объем физиологического раствора. За 1 час до начала индукции ОСИ группе мышей интрагастрально вводили 0,1 мл циклофосфана (ЦФ) ив расчета 240 мг/кг. Для оценки почечной функции шаей поме-дали в метаболические клетки за 18 часов до забоя. Анализ мочи проводили на анализаторе Уротрон (Boehringer,Австрия). Обший белок, липиды. холестерин, аэот мочевины и креатинин определяли на биохимическом анализаторе "Техникон" (Англия).

- Хронизацию ОСН изучали на 30-е сутки после окончания индукции. Группе мышей на этом этапе интрагастрально вводили 0,1 мл ЦФ (240 мг/кг). Динамику клинических и морфологических изменений анализировали на 3-й и 10-е сутки после введения ЦФ.

- Нефротоксическую сыворотку (НТО) получали путем двухкратной иммунизации двух кроликов суспензией гломерулярных мембран по общепринятой методике (Фримель Г. ,1987). Для этого из коркового слоя почек крыс выделяли почечные клубочки и оз-

вучивали их до получения суспензии гломерулярных базальных мембран (ГБЮ на ультразвуковом гомогенизаторе (Col-Parmer.ClilA) Контроль чистоты суспензии проводили с помощью электронной микроскопии. НТО адсорбировали эритроцитами крысы и затем нагревали при 56 С в течение 90 мин. для удаления комплемента. Гамма-глобулиновую фракции кроличьей анти-Ш сыворотки получали сульфат-риваноловым методом с последующей очисткой на колонке с сефадексом <3-50 (coarse)(Pharmacia, Швеция). Конечная концентрация сыворотки - 260 мг/мл.

- Нефротоксический нефрит (НТН) индуцировали путем внутривенного введения 0,5 мл НГС из расчета If мг/100 г веса Контрольным крысам вводили аналогичный объем физиологического раствора. Гетерологичную фазу изучали на 3-й сутки после введения НТО, аутологичную - на 15-е сутки. Для оценки почечкой Функции крыс помещали в метаболические клетки и собирали шчу эа 18 часов до забоя. Кровь и мочу анализировали выше описанными способами. *

- ЦФ вводили интрагастрально (240 мг/кг) 8а 1 час до индукции НГЕ

- Метилпреднизолон (МП) вводили за 2 часа до индукции HIE внутрибршинно в дозе 14 мг/кг и продолжали введение в течение всего срока развития ИГЕ*

- Фенозан калия (ФК) начинали вводить 8а 30 мин. до индукции НТН внутриперитонеально в дозе 5 мг/кг и продолжали введение в течение всего срока развития НГЕ*

- Облучение крыс проводили на гамма-установке ИПК (l37Cs) вдове 700 рад (7 Гр), при мощности дозы 0,18 Гр/мин. В зависимости от задач облучение проводили за 2 суток до индукции НГН и на 5 сутки после начала индукции НТН с экранированием голени свинцовым экраном толщиной 4 мм.

Культура шзаягиальяьа клеток

- Почечные клубочки, полученные протиранием и просеиванием коркового слоя почек черев сита (поры 110 и 38 - для крыс и 75 и 38 - для мышей), обрабатывали раствором коллагеназы - 750 ед/мл (Slsrma.ClUA) в течение 1 часа при 37 С. Далее клубочки померши в 24 луночные плата, поверхность которых обработана коллагеном, и культивировали при 37 С. 95% влажности и 5Х С02 в воздухе в культуральной среде RPMI 1640, соде, .«алией 20% эмбриональной телячьей сыворотки, глотами« (20мМ). пенициллин

(100 еп/т) и стрептомицин (100 мкг/мл). Культивирование проводили в течение 20 дней под контролем фазово-контрастной микроскопии.

- На 20-й день культивирования определяли число мононук-леарных клеток в 5 поляк зрения, произвольно выбранных в каждой лунке (х 320) и выражали в виде среднего числа в поле зрения микроскопа. В связи с невозможностью подсчета мезангиаль-ных клеток из-за развития в ряде экспериментов полислоя введено 6 степеней распределения мезангиаль: а клеток: 1 - единичные клетки. 2 - редкий монослой, 3 - средний монослой. 4 -плотный монослой, 5 - бислой, б - полислой.

- Интенсивность пролиферации мезангиальных клеток оценивали по включению ЗН-тимидина в ядерную ДНК и выражали индекс ыечения в имп./мин. на бета-счетчике (LKB,Швеция).

- Интерлейкин-1 определяли в супернатанте культуры мезан-гиальных клеток, используя биотест - пролиферацию ФГА-стимули-рованних тимоцитов мышей BALB/c. ** Результаты представлены в виде имп./мин. (среднее из 3 лунок).

- Интерлейкин-1альфа, интерлейкин-1бета, фактор некроза опухоли-альфа, инсулиноподобный ростовой фактор-1 и тромбоци-тарный фактор роста определяли в супернатанте кгльтуры мезан-гиальных клеток методом радиоиммунологического анализа, используя коммерческие набора ( Atrersham. Англия). *** Результаты выражали в нг/мл.

- Штаболиты арахидоновой кислоты в супернатанте культуры меэангиалькых клеток определяли методом радиоиммунологического анализа и концентрацию выражали в пкг/мл. ****

Морфологические исследования

- Светооптическое исследование проводили на парафиновых среза... окрашенных гематоксилин-эозином, использовали PAS-ре акцию, а такмз на полутонкие срезы и в культуральные лунки, окрашенные азуром П-метиленовым синим-фуксином.

- Для иммуногистохимического исследования использованы поли- и моноклональные антитела: к J..3, IgM, lg А, СЗс. С5а, С9, альфа1-антитрипсину, фибриногену (Behring,ФРГ). к CLA, CALLA, CRI. HLA-DR. фибронектину. коллагену IV типа, вименти-ну, цитокератину, миозину, десмину (Dakopatts,Дания), к липоп-ротеину низкой' плотности аио-В (ЛШПН сыворотка получена от проф. Нагорнева В. А. ). к ламинин. (Calblochem.ClílA). к коллаге-

ну I, III, IV (Динго,Онкоцентр), к IgG крысы, меченному <ЭДГЦ; обцему лейкоцитарному антигену крысы (МЗС ОХ-1), 1а-антигену мыши (Cedarlane.Канада), к IgQ, IgM мыши, меченным ©ГГЦ (Slgra.CillA), В качестве вторичных антител использованы антитела к Ig мыши и Ig кролика, меченные ШТЦ (Dakopatts.Дания), F(ab')2 фрагменты к Ig мыши и Ig кролика,меченные пероксидазой хрена (Anersham,Англия), к Ig козы, Ig кролика, Ig мыши и белок А, меченные коллоидным золотой (5, 15, 10, 10 нм соответственно) (Janssen,Бельгия).

Иммунофлуоресцентную микроскопию проводили на криостатных срезах, толщиной 4-6 мкм и в культуре клеток почечного клубочка После фиксации материала охлажденным ацетоном использовали прямой и непрямой метод Иунса (Polak J. М., Van Noorden S. .1986).

- Для электронноыикроскопического исследования материал префиксировали в смеси глотаральдегида (ГА) и параформальдеги-да (ПФ) по Карновскому, фиксировали 1% 0s04, обезвоживали и валивали в аралдит по стандартной методике. Окрашенные урани-лацетатом и цитратом свинца ультратонкие срезы просматривали под электронным микроскопом ЕМ 410 (Philips,Нидерланды).

- Для иммуноэлектронной микроскопии материал префиксиро-вали в смеси 2Z ПФ-0.1Х ГА-0.05Х сапонина 1 час с последующей фиксацией 2% ПФ в течение 18 часов при 4 С. После промывки Физиологическим фосфатным буфером (ФФБ. рН-7,2), обработки IX боргидридом натрия и восходящими концентрациями глицерина (10 - 16 -20%), образцы замораживали и хранили при -86 С до проведения иммунопероксидазного «следования. Часть материала, после обработки боргидридом натрия, обезвоживали и заливали в водорастворимую смолу L.R. Vfrute (Newman 6. R. ,1987) для проведения исследований с иммуноколлоидным золотом. Для иммунопероксидазного метода, криостатные срезы, толвдной 12-14 мкм, обрабатывали 1% бычьим сывороточным альбумином (БСА) в течение 30 мин. и еатем инкубировали с первичными антителами 18 часов при 4 С. После промывки ШЗ, срезы инкубировали с F(ab')2 фрагментами вторичных антител, меченных пероксидазой, в течение 4 часов. Затег срезы промывали ФФВ, фиксировали IX ГА 10 мин, и инкубировали в среде, содержащей 5 мг 3,3'-диаминобензидина (Sigma) в 10 мл трис-HCl буфера (рН-7,6) и 0.01Х перекись водорода в течение 15 мин. Шсле этого срезы постфиксировали 1% 0s04,

обезвоживали и заливали в аралдит , используя метод плоскопараллельной заливки. Неокрашенные ультратонкие срезы исследовали под электронным микроскопом. Электронноплотный продукт реакции оценивали полуколичественным методом по степени интенсивности окрашивания (от - до +++). Для иммунокодлоидного золота использовали метод, предложенный Bendayan \L et al.(1983). Золотистые ультратонкие срезы помецали на никелевые сетки (200 ячеек) и инкубировали с 1% ВСА в течение 10 мин., эатем с первичными антителами 1 час. IL .ле промывки с ФИЗ-ВСА и трис-HCl- ЕСА (2 раза по 10 мин. в каждом) сревы инкубировали с иммуноколлоидным золотом в течение 30 мин., дофиксировали 1% ГА б мин. и промывали деионизированнэй водой. Окравениые водным раствором уранилацетата (5 (.дан.) и цитратом свинца (20 сек.) ультратонкие срезы просматривали под электронным микроскопом. Интенсивность метки оценивали по количеству гранул на 1 кв. см.

Статистическая обработка - Статистическую обработку основных результатов проводили по t-критерию Стыодента. Различия в интенсивности роста мезан-гиальных клеток в культуре в экспериментальных моделях оценивали по критерию х2. Для оценки значимости различных параметров у больных хроническим гломерулонефритом использован многофакторный пошаговый регрессионный анализ.

* - часть экспериментов проведена совместо со ст. научн. сотр. Е К Никифоровой (НИИ урологии Ш РФ).

** - работа проведена совместно с гл. научн. сотр. Й. П. Лесковым (Институт июлунологки)

- работа -проведена совместно с ст. научн. сотр. Е. Е Ги-телем (лаб. клинической биохимии тканевых гормонов)

**** - работа проведена совместно с ст. научн. согр. С. А. Ш-щеряковой (лаб. клинической биохимии тканевых гормонов Ш1А им. И. М. Сеченова).

- 12 -

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1. Особенности патогенеза воспалительных и невоспалительяых елэшрулопатнй.

Большинство поражений почечного клубочка, в том числе и основные формы гломерулонефрита (ГШ. связано с нарушениями гуморального и клеточного иммунитета, часто проявляющимися в виде отложений иммунных комплексов, образуемых как циркулирующими иммунными комплексами, так и локально, за счет структурных антигенов почечного клубочка и циркулируют;« в крови антител. На основании этого ГН рассматривается как одна из форм иммунопатологической реакции, имеющей характерные черты иммунного воспаления.

Использование световой, иммунофлуоресцентной и электронной микроскопии позволило выявить присутствие в почечном клубочке иммуноглобулинов, белков системы комплемента, лимфогемо-поэтических клеток и электронношютных депозитов, соответствующих иммунным комплексам и выделить ряд морфологических форм ГН, взятых за основу различных классификаций, в частности, морфологической классификации, предложенной экспертами BOG (Churg J. ,Sobin L H. 1982),

Однако ряд морфологических форм ГН не имеет тех или иных критериев ишунного воспаления. На основании этого Серов R Е,Варшавский Е А. (1987) предложили исключить из группы ГН мембрановлую нефропатию (МВД. минимальные изменения (Ш) и Фокально-сегментарный гломерулосклероз (ФСГС). Это вызвало оживленную дискуссию на страницах журнала "Архив патологии" и определенные возражения ряда авторов.

Для оценки этого предположения мы использовали метод им-иуноэлектронной микроскопии, позволяющий уточнить состав и распределение депозитов иммунных комплексов, выявить экспрессию отдельных антигенов и рецепторов. Для получения более объективной картины использовали два варианта этого методе: иммунопероксидаэный метод, при котором иммунную реакцию проводили до заключения срезов в смолу и метод иммуноколло-идного золота на ультратонких срезах. Исследование проводили на биоптатах почек больных гдомерулопатиями различного генеза с использованием широкого спектра антител.

При воспалительных гломерулопатиях отмечена инфильтрация почечного клубочка различными лейкоцитами, экспрессирукшши на своей поверхности общий лейкоцитарный антиген и альфа-1 антитрипсин, и тромбоцитами. Лейкоциты могут либо контактировать с эндотелиальными клетками путем адгезии, либо проникать в ме-зангий, стимулируя пролиферацию мезангиальных клеток (МВД. Известно, что наряду с Ш гладкомышечного '¿ипа в мезангии присутствуют ЫК макрофагалыюго типа, имеющие костномозговое происхождение и способные экспрессировать на своей поверхности антигены главного комплекса гистосовместимости, выполняя таким образом антигенпредставлящу.о функцию (Schreiner а F. .Cotran R. S. 1082).

Рис.1. Схема антигенпредставления в мезангии почечного

клубочка при воспалительных гломерулопатиях. МВД - мезангиальная клетка макрофатального типа, ЫКГМ -мезангиальная клетка гладкомышечного типа. Ае - антиген, ШС II - главный комплекс гистосовместимости. ТС/СОЗ,С04,С02,С05,С028,НЬА-А,В,г ЬРА-1 - мембраноассоци-ированные рецепторы Т-лимфоцита. иА-З,1САМ-1 - мембрако-ассоциированные рецепторы ЫКГМ, ИЛ-1 - интерлейкин 1. ИЛ-6 - интерлейкин 6. дао - фактор некроза опухоли, м -мембранный, р - рецептор.

Однако МК макрофагального типа не являются истинными ан-тигенпредставляющими клетками, как подобные клетки в лимфоид-ной ткани, посколько не несут на своей поверхности весь комплекс адгезивных рецепторов, необходимых для представления антигена Т-хеллерам. В связи с этим МК гладкомышечного типа, активированные действием воспалительных медиаторов, секретируя различные цитокины и экпрессируя на своей поверхности комплекс адгезивных молекул, могут выполнять не своийственную им функцию, обеспечивая полноценный процесс антигенпредставления (рис. 1) (Geppert Т. D. .Llpsky Р. Е. 1989). В данном случае ЫК гладкомышечного типа выступают как вспомогательные (промотор-ные) клетки. Подобную картину ш обнаружили в двух случаях ме-8ангиопролиферативного ГН (ЫПГН).

Несмотря на литературные данные, нам не удалось выявить экспрессию антигенов главного комплекса гистосовместимости II типа на ЫК Возможно, это обусловлено незначительным количеством таких клеток (5-10% от всех ЫК) и кратковременностью данного процесса, в то время как больные поступают в клинику по прошествии достаточно длительного времени после начала заболевания.

Помимо инфильтрации, воспалительные гломерулопатии сопровождаются пролиферацией резидентных клеток почечного клубочка, преимущественно ЫК гладкомышечного типа, и увеличением мезан-гиальшго штрикса. в основном ва счет коллагена IV типа, реже утолщением глоыерулярной базалыюй мембраны (ГВЦ).

При изучении состава и локализации депозитов иммунных комплексов получены данные, подтверждающие результаты, полученные другими авторами (Rossmann Р. et al. .1984; Murphy В. F. , D'Apice A.J. F. 1988). Эти данные отражены в таблице 1. Для воспалительных гломерулопатий характерна гетерогенность состава депозитов одной локализации в отдельно взятой морфологической форме. Так, при мевангиокапиллярном ГН (ЫКГЮ У отдельно взятого больного одни субэндотелмальные депозиты содержали только Igfi, другие - СЗ, третьи - С5. В то же время ряд. депозитов, преимущественно мезангиальной локализации, имел сложный состав: IgG, М, А. СЗ. С5, С9 в различных комбинациях. Помимо этого, часть депозитов, наряду с иммунными комплексами, содержала фибрин и липопротеины низкой плотности. Т&лм образом, при

воспалительных гломерулопатиях два соседних депозита могут иметь различный состав.

Таблица 1. Распределение компонентов депозитов иммунных комплексов, ряда рецепторов и компонентов внеклеточного матрикса у больных с воспалительными гломерулопатияни

Морф, форма МПГН (п-13) 1 МКГН (п-10) ФПГН

Антиген (п-7) I с ФГС п-4) 1 ВТ MC n-2) (n-7) 1ЛГНС п-3) (п-2)

CLA ++ (5) + С1) - + (4) + С1) -

альфа1-АТ ++ (5) + (1) - + (4) + (1) -

HLA-DR - - - - - -

CALLA +++ +++ ++ +++ +++ ++

CR 1 +++ ++ ++ +++ ++ +

IgG ++ (5) ++ (2) - ++ (5) ++ У

IffM ++ (а) + С 2) - + (3) +- (2) +- (1)

1гА ++ (4) ++ (2) - ++ СЗ) + (2) +-

СЗс ++ (6) + (3) . ++ ++ С 6) + -

С5а ■ ++ (4) - ? + (5) - ?

С9 -+ (2) + (3) ■н- +- (4) ++ -+

фибриноген +- (3) (2) - + (6) + (2)

ЛШ1 -+ (3) + (2) - + (3) + (2) +- С1)

фиброне;стин ++ (4) -+ +- +- -+ ?

л&мшпгн + + + + +- +-

коллаген I - - - - - -

коллаген III - - - - - -

коллаген IV + ++ + ++ +++

Примсшие: "-" - отсутствие реакции; "-+" - слабая реакция в одном клубочке; "+-" - слабая реакция в 2х и более клубочках; "+","++"."+++" - различная степень интенсивности реаглии: * -рекция в зоне мезангия; ? - не исследовали; п - количество больных; () - количество больных с положительной реакцией; ЫПГН - мезангиопролиферативный гломерулонефрит; ФГ - флброп-ластическая трансформация; БТМ - болезнь тонких мембран; МКГН - мезангиокапиллярный гломерулонефрит; ЛГН - лобулярный гломерулонефрит; ФПГН - фибропластический гломерулонефрит.

- 16 -

Такая гетерогенность состава депозитов при одной морфологической форме, очевидно, обусловлена различными механизмами образования депозитов иммунных комплексов при воспалительных гломерулопатиях. Тип клеток, инфильтрирующих почечный клубочек (нейтрофилы, лимфоциты, моноциты/макрофаги), не зависел ни от состава депозитов иммунных комплексов, ни от морфологического варианта воспалительных гломерулопатий. Возможно, что большее число наблюдений и более тщательный подбор больных помогут выявить подобную корреляцию.

При невоспалительных гломерулопатиях инфильтрация почечного клубочка лейкоцитами и пролиферация рези, ;ентных клеток, как правило, отсутствовала Однако в ряде случаев выявлена, отмеченная и другими авторами, сегментарная пролиферация № при ЫН, МИ и ФСГС, а также появление нейтрофилов и моноцитов в просвете капилляров на поздних стадиях Ш и ФСГС. В то же время, на ранних стадиях развития этих морфологических форм обнаружена потеря или значительное уменьшение экспрессии антигена острой лимфобластной лейкемии (CALLA) - характерного маркера нормальных подоцитов. При этом видимых ультраструктурных изменений в подоцитах но обнаружено. Очевидно, изменения происходят на молекулярном уровне и выражаются в потере экспрессии CALLA подоцитами. Эта находка позволила нам объединить три морфологические формы - ЫН, Щ и «ЗГС- в группу невоспалительных гломерулопатий с первичным повреждением подоцитов.

Отсутствие CALLA на подоцитах сопровождается в одних случаях появлением депозитов иммунных комплексов (при ЫН), в других - их отсутсвием (МИ, ФСГС). Изучение распределения и состава депозитов иммунных комплексов показало, что при невоспалительных гломерулопатиях характерно появление однотипных по составу депозитов одной локализации (табл. 2). Так при МН все субэпителиальные депозиты содержали IgG с СЗ или без СЗ, индивидуально для каждого случая. Помимо этого, в составе субэпителиальных депозитов в ряде случаев обнаружен фибрин. При ФСГС, у ряда пациентов, выявлены единичные мезангиальные и па-рамезангиальные депозиты, содержаще либо IgM, либо СЗ, либо С9. Кроме того, для невоспалительных гломерулопатий характерно появление депозитов, содержавших только фибрин или липопротеины низкой плотости, при отсутствии у пациентов депо итов иммунных комплексов. Появление подобных депозитов может быть обусловле-

но гемодинамическими или метаболическими нарушениями (Tsukasa Т. et al. ,1987;0Ibrlcht С. J. 1991;Sato et al. ,1991). Это может служить фоном для нарушения клеточного иммунитета и развития аутоиммунного процесса (Atkins R. С.1990).

Таблица 2. Распределение компонентов депозитов иммунных комплексов, ряда рецепторов и кимпонегтов внеклеточного матрикса у больных с невоспалительными гломерулопа-тиями.

Мэрф. форма № (п-8) Ш (п-7) ФСГС (п-10) Нефро-

Антиген II-III III-IV (п-5) БТЫ Нач. Шздн. склероз

(п-3) (п-5) (П-2) (п-4) (п-6) (п-в)

CLA - (2) - +- (2)

альфа1-АТ - (2) - - - +- (2) -

HLA-DR - - - - - ? 7

CALLA -+ + (2) + -Н- +- + ++

CR 1 +++ + ++ ++ ++ +- (2)

IgG +++ +++ - - - -+ (1) -

Гем +- (2) - - - +- (1) - -

I ff А - - - - - - -7

СЗс ++ (2) + (2) -+ (1) +- (1) - -

С5а - - - - - - ?

С9 +- (1) + (3) - + + (3) -+ (1) -

фибриноген +- (1) +- (2) +- (3J — +- (2) + (3) +-

ЛПНП +- (1) +- (1) -+ (2) +- (2) + (2) -

фибронектин -+ -+ -+ (2) -+ -+ (1) ?

ламинин 4 + + + + ■7

'коллаген I - - - - - +- (2) +

колл ген III - - - - + (1) +

коллаген IV + ++ + ++* + ++ +

Примечание: "-" - отсутствие реакции; "-+" - слабая реакция в одном клубочке; "+-" - слабая реакция в двух и более клуйоч-ках; "+","++"."+++" - различная степе-ъ интенсивность реакции; * - реакция в 8оне мевангия; ? - не исследовали; п - количество больных; () - количество больных с положительной реакцией; МН - меибрановная нефропатия; Ш - минимальные изменения; БТМ - болезнь тонких мембран; ФСГС - фокально-сегментарный глош-рулосклероз.

При традиционной электронной микроскопии депозиты, не содержаще иммунные комплексы, не выявляются иэ-эа низкой электронной плотности. Иммунофлуоресцентная микроскопия также дает отрицательный результат, обусловленный малочисленностью и малыми размерами таких депозитов. Выявление подобных депозитов носит скорее аналитический, нежели диагностический характер. и мотет бьггь использовано для уточнения классификации гломерулопатий и дальнейшего изучения патогенеза невоспалительных гломерулопатий.

Таким образом для невоспалительных гломерулопатий характерны неиммунные механизмы повреждения структур почечного клубочка. которые, в ряде случаев, могут служить фоном для развития аутоиммунных процессов. Выявление однотипных по составу депозитов иммунных комплексов, имеющих одну локализацию, косвенно свидетельствует об этом.

г. Роль антигенов главного комплекса гистосовместшэсти в развития экспериментального глоие рудо нефрита.

При изучении патогенеза ГН широко используется экспериментальные модели. Наличие большого числа экспериментальных моделей и их вариаций свидетельствует о многообразии патогенетических механизмов, многофакторности развития иммуновоспали-тельной реакции. Одним из звеньев патогенеза ГН являются генетические факторы, в частности антигены главного комплекса гистосовместимости (ГКГС), контролирующие развитие иммунного ответа (Frymoyer P.A. et al. 1S88). Для оценки роли этих факторов в различные временные отрезки развития иммунокомплексного ГН воспроизведена модель острого сывороточного нефрита (ОСЮ у мышей 5 линий с различным галлотипом: СВА (H-2k), С57В1 (Н-2Ь), BALB/c (H-2d), NFS (H-2d), NFR (H-2s). Для супрессии иммунного ответа использовали цинлофосфан (ЦФ), введение которого позволило выявить роль антигенов ГКГС в различные временные отрезки развития OCR ЦФ вводили непосредственно перед началом индукции и через месяц после ее начала (рис. 2).

При однотипном антигенном воздействии у 5 групп мышей с различным галлотипом после окончания введения антигена получе-

- 19 -

но 3 морфологических варианта ГЕ

Н-2" Н-2Ь H-2d H-2dH-2

морфологический анализ

Рис. 2. Схема индукции острого сывороточного нефрита у мышей различит: линий с и без введения циклофосфана (ЦФ). СМ - световая микроскопия; ЙФ - иммунофлуо-ресцентная микроскопия; ЗМ - электронная микроско-шм.

У мызей линии СВА обнаружена картина дкффузно-пролифера-тивного ГН, сходная с тшсовой при острой сывороточной болезни кроликов, посгстрептококковом и волчаночном нефрите человека; инфшгтрация почечного клубочка нейтрофилами, моноциты,«! и тромбоцитами, пролиферация мезангиальных и эндотелиальных клеток. единичные субэпителиальные депозиты ("горбы"), многочисленные парамезангиальные и мезангиальные депозиты (табл. 3). Изменения в клубочках почек мыше* линий С57В1 и BALB/c соответствовали картине МКГЕ- инфильтрация мезангия лейкоцитами. пролиферация интерпозиция ыезангия, мезангиальные депозиты. У мышей линий NFS и NFR наблюдали картину, близкую к МПГЕ- слабая инфильтрация почечного 1слубочка лейкоцитами, выраженная пролиферация ЫК, депозг ы иммунных комплексов меаан-

- 20 -

гиальной и парамезангиальной локализации.

Введение ЦФ перед началом индукции ГН резко уменьшало количество иммунных комплексов во всех группах мышей, кроме В этой группе уменьшение количества депозитов было незначительным и сохранялась картина ШГЕ У мышей других линий отмечена гетерогенность морфологической картина У мышей линии СБА на фоне уменьшения депозитов иммунных комплексов ( единичные депозиты локализованы в меоангии) сохранялась инфиль- ' трация почечного клубочка лейкоцитами при незначительном уменьшении пролиферации клеток почечного клубочка.

Таблица а Морфологическая и иммуногистохимическая характеристика ООН мышей на фоне и бее однократного введения циклофосфена

ООН (гу-60)

СВА1Ю7В11ВАЬВ/с(нге1НРН

ДФИГН (п-50)

СБА |С67В1IBALB/o NFR

Инфильтрация клубочка Инфильтрация мезангия Пролиферация

ык

Пролиферация -н-ЭВД

Увеличение Ш

Утолщение ГШ

Депозиты

субэпител. + субзндотел. +-мезангиальные ++

■м-

++ ++

-»+ +++

++ ++

Примечание: - отсутсвие приэнака; "+-" - незначительно выражен; »+•*."++"."+++" - разная степень интенсивности; Ш - мезангиальные клетки; ЭВД - эндотелиальные клетки; Ш - мезанги-альный матрикс; ГШ - гломерулярная базальная мембрана

У мышей линии С57В1 депозиты и инфильтративно-пролифера-тивная реакция практически отсутствовали. Зона мевангия слегка расширена эа счет увеличения мезангиального матрикса. У штей BALB/c и NFS депозиты отсутствовали, но сохранялась слайо выраженная инфильтрация почечного клубочка мононуклеарными лейкоцитами и пролиферация МК на фоне увеличения мезангиального матрикса

Таким образом, использование ЦФ, подавлявшего иммунную реакцию при ОСН. показало, что гетерогенность морфологической картины на ранних этапах ОСН во многом определяется антигенами ГКГС.

Таблица 4. Мэрфологическая и кымуногистохимическая характеристика ОСН мышей при хронизации и одно!фатноы введении циклофосфана

ОСН4хрони8ация (п~50) ОСЙ4хронизация4Цф (n-70)

СВА1С57В11BALB/c1 NFS 1NFR СВА IC57B11 BALB/c iNFSl NFRl

Инфильтрация клубочка Инфильтрация меэангия

Пролиферация + МК

Пролиферация ЭВД

Увеличение + Ш

Утолщение ГШ

Депозиты (IgQ): субзндотел. иззангиальныв +-

+++

+ ++

- 44 44

44-4

Примечание: - отсутсвие признака; "4-" - незначительно выражен; "4"."44","444" - разная степень интенсивности; ЫК - мэ-эангиалыше клетки; ЭНД - эндотелияльные клетки; Ш - мезанги-ааьный натрикс; ГБМ - гломерулярная базальная мембрана.

При этом ЦФ оказывал слабое воздействие на развитие воспалительной реакции, возникающей в ответ на иммунное повреждение. Гетерогенность иммунной реакции на фоне действия ЦФ обусловлена качественными и количественными особенностями иммунного ответа, контролируемого Н-2 антигенами ( Adler S. et al.1986). Введение ЦФ не вызывает видимых изменений в структурах почечного клубочка.

Через месяц после окончания индукции ООН у мышей всех линий, независимо от гаплотипа, обнаружена стереотипная морфологическая картина, близкая к МПГН человека. Очевидно, несмотря на генетические различия, иммунокомлексный ГН лмеет однотипный механизм повреждения (циркулирующие иммунные комплексы и комплексы, образованные in situ), приводящий к развитию данного морфологического варианта ОСЕ Морфологическая картина варьировала в зависимости от линии животного только в количественном отношении (табл. 4): по выраженности пролиферации МК, увеличения мезангиального матрикса, количеству мезангиальных депозитов. Несмотря на формальные признаки иммунного повреждения, эксудативно-пролиферативная реакция не выявлена.

Введение ЕФ на этой стадии развития ГН практически не изменяло морфологическую картину. Подобная нечувствительность к ЦФ, обладающему выраженным лимфотропным действием, свидетельствует об отсутствии влияния Ь-2 антигенов на морфологические изменения, происходящие в почечном клубочке на поздних стадиях развития экспериментального ГЕ Процессы пролиферации МК и синтеза компонентов мезангиального матрикса контролируются антигенами, не связанными с Н-2 комплексом. Отсутствие выраженной иммуновоспадительной реакции может служить противопоказанием к испольБованшо иммуносупрессивной терапии.

Таким образом, динамика развития ГН обусловлена экспрессией различных антигенов, связанных и не связанных с ГКГС.

а Роль юнонуквеарта лейкоцитов и тромбоцитов в патогенезе экспериментального глооарулонефрита.

Экспрессия тех или иных антигенов, регулируется многочисленными факторами, вызывающими активацию, пролиферацию.

миграцию клеток почечного клубочка, синтез ими компонентов внеклеточного матрикса. Среди многочисленных факторов выделяют группу низкомолекулярных полипептидов - цитокинов, обладающих многофункциональным действием (Wardlo Е. N. 1988). С помощью ряда экспериментальных работ установлено, что ведущая роль в регуляции иммуновоспалительной реакции принадлежит цитокинам и метаболитам арахидоновой кислоты (bonta I. L, ,Ben-Efralm S. 1990). Главными источниками этих факторов являются мононук-леарные лейкоциты и троьйоциты (LafTíowltli J. В. et al. 1991). Для оценки роли этих клеток в патогенезе ГН мы воспроизвели две модели экспериментальною нефрита, сопровождающиеся инфильтрацией почечного клубочка (модели ОСИ и нефротокеического сывороточного нефрита (НГН)). но имеющие различные патогенетические механизмы. При исследовании этих моделей использован принципиально новый подход - параллельный анализ клеток in vivo и in vitro. Для этого, наряду с почечной тканью, получена и исследована культура клеток почечного клубочка у мышей и крыс.

1__I__1_L_1

Рис. 3. Схема индукции гетероло"ичной фазы нефротокси-ческого нефрита (НГ№) на фоне и без облучения. НТС - не<1ротоксическая сывортка; СЦ - световая, ИФ - имукофлуоресцентная, ЗЫ - электронная, ИЗМ - им мукоэлектроюгая микроскопия.

- '¿Л. -

фи ООН и в гетерологичной фазе НГН (рис. 2 и 3) в почечном клубочке выраяена эксудативно-пролиферативная реакция, сходная для обеих моделей, хотя депозиты иммунных комплексов имели различную локализацию: преимущественно меэангиальные при ООН и в lamina densa ГБМ при HTR Пролиферация МК в почечном клубочке коррелировала с наиболее высокими показателями индекса пролиферативной активности ЫК в культуре (рис. 4). Культура клеток в обоих случаях представлена интенсивно пролифери-руюцей популяцией МК гладкомышечного типа и многочисленными мононуклеарными лейкоцитами (Ш), выявляемыми при иммунофлуо-ресцентной микроскопии с антителами к общему лейкоцитарному антигену крью и мышей.

эе ^

i w

> 251 20 . О.

I К £105 S-

Рис. 4.

Контр.

ОСИ

имп/мин ,х10'

ЯО -43

«о-39 -Ю

13 J

12 -» -

* -

3 -I

Контр. НТНг + облучение

Мононуклеариые лейкоциты мыши Монокуклеарные лейкоциты крысы Включение ®Н- тимиЭика

Индекс пролиферативной активности мезангиальных клеток и количество мононуклеарных лейкоцитов (МЮпри остром сывороточном нефрите (ООН) и в гетерологичной фазе нефротоксического нефрита (НТНг) без и на фоне облучения.

При анализе супернатаита» с помощью радиоиммунологического метода и биотеста в культуре тимоцитов. выявлена активность и повышенное содержание интерлейкина-1 (ИЛ-1 альфа и бета), фактора некроза опухоли-альфа (ФИО-альфа), простатландина Г2-альфа (ПГР2-альфа) и тромбоксана А2 (ТхА2) - основных медиаторов острой стадии воспаления (рис. 5).

-— ФИО* -Ч— ИЛ-1& ••*■•■ ИЛ-1* - »• ИПРФ-1

СГП б-кетоПГР»* <1а>

Ж ПГРа*

8КЗ ТхВз <ТхА2>

Рис.5. Уровень цитокинов и метаболитов арахидоновой кислоты при остром сывороточном нефрите (ОСЮ и гетерологичной фазе нефротоксического нефрита (НГНг). ИПРФ -1 - инсулинолодобный ростовой фактор.

Источником этих медиаторов, регулирующих пролиферацию ЫК. могут служить как МН. так и сами МК, секрегируюшие эти факторы по аутокринному или паракринному типу (Ьоуе^ 0. Н. а1.1986; ВегкИгеп К. 1988). Для решения вопроса об источнике медиаторов мы воспроизведи гетерологичнув фазу КТН у крыс, предварительно получивших сублетальную дозу облучения (700 рад)(рис. 3). На момент индукции НТН в крови содержалось менее 107. Ш от обычного уровня. Несмотря на фиксацию кроличьих иммуноглобулинов вдоль ГБМ, инфильтративно-пролиферативная реак-

ция в почечном клубочке не развивалась, протенурия была незначительной. В культуре клеток индекс пролиферации Ш ниже, чем у контрольных животных (рис. 4). Культура клеток представлена только популяцией Ш гладкомытечного типа.. МН отсутствовали как в культуре клеток, так и в почечном клубочке. Следовательно. пролиферативные процессы на ранних стадиях развития экспериментального ГН обусловлены инфильтрацией почечного клубочка Ш, секретируввдми, независимо от патогенетических механизмов, ИЛ-1, ФКО-альфа, ШТС-альфа и ТхА2. Таким образом, начальная фаза воспаления обусловлена действием стереотипных медиаторов, независимо от патогенетических механизмов повреждения.

Однако в аутологичной фазе НГН (рис. 6). протекающей по типу реакции гиперчувствительности замедленного типа (Salant D.J.1987). несмотря на инфильтрат«) почечного клубочка Ш. пролиферативная рекция не выражена

Рис. 6. Схема индукции аутологичной фазы дефротоксического нефрита на фоне различных воздействий. НТО - нефротоксическая сыворотка, МП - метилпредни-золон, ЦФ - циклофосфан, - световая. ИФМ - лмму-нофлуоресцентная. ЭМ - электронная, ИЭк - имму:юэле-ктронная микроскопия.

В почечных клубочках отмечена сегментарная пролиферация №. виражзнне: отслойка эндотелия, инфильтрация ¡сапиллярных петель МН и контакты МН с оголенной ГБМ. Депозиты, содержащие

1бгв крысы, имели субэндотелиальную локализацию и почти линейный характер распространения. ГШ местами резко истончена, в ряде мест отмечены субэпит<?лиальные скопления мембраноподобно-го вещества, не содержаще иммуноглобулины и комплемент. В культуре клеток, несмотря на незначительную пролпферативную активность клеток почечного клубочка, индекс пролиферативной активности МК достаточно высок (рис. 7).

_Й_ÉL

V/-

имп/мип . „хЮ*

ЗО ■ 43 -4035 -

so-

ie -

15 --

» -

6 -»

HTHr НТН» *Н» »обл. «Ц» *НП Контр. ОСИ *в5л

Мононуклеарные лейкоциты мыши

I--1

E3S3 •f

Мононуклеарные лейкоциты крысы Включение 'Н- тимиЗина

Рис.7. Индекс пролиферации мезангиальных клеток и количество мононуклеарных лейкоцитов в гетерологичной (ШНг) и аутологичной (НГНа) фазах нефротоксичес-кого нефрита и при остром сывороточном нефрите (ОСН) на фоне различных воздействий. ЦФ - цикле-фосфан, обл. - облучение, МП - метилпредяизолон. Контр. - контроль. Ш - мононуклеарные лейкоциты.

Очевидно в клубочке преобладало более выраженное действие еупрессорных факторов, чем в культуре. Аутологичкая фаза НТН характеризуется интенсивным образованием реактивно окисленных метаболитов, в частности перекиси водорода (Shah S. U et al. ,1987 ). которые могут блокировать экспрессию рецепторов для цитокинов (Baud L. et al. 1992) на клетках почечного клубочка. В культуре, очевидно, действие реактивно окисленных продуктов менее выражено. Использование наш антиоксиданта фе-нозана калия, ингибирующего образование перекиси водорода

(Ball S. S. et al.1986), приводило к значительному усилении пролифератиьной активности МК гладкомышечного типа как в почечном клубочке, так и в культуре.

Культура МК в аутологичной Фазе, как. и в гетерологичной фдае НГН, представлена двумя популяциями клеток - ШнЖ Часть МК гладкомьшечнсго типа имела звездчатую форму, свидетельствующую о действии в культуре супрессорных факторов (Nakewawa S. et al. 1989). Помимо этого, в культуре обнаружены интенсивные отложения коллагена IV типа, интенсивное свечение которого отмечено и вдоль ГБМ клубочка

В супернатанте культуры клеток аутологичной фазы, по сравнению с гетерологичной фазой НТН. содержание ИЛ-1 несколько выше, значительно увеличивается содержание ФНО-альфа (рис. 8). ФНО альфа является ведущим медиатором реакции гиперчувствительности замедленного типа (Marcinkiewicz J. 1991) и индуктором ангиогенееа (Leibovich S. J. et al. 1987). Очевидно, развивающаяся в аутологичной фазе отслойка эндотелия провоцирует усиленную секрецию этого фактора.

Рис.8. Изменение содержания цитокшюв в кульгуре меаанги-альных клеток на 9-е сутки культивирования в контроле (Контр.), гетерологичной и аутологичной фазах' нефротсксического нефрита (НТНг и НГНа), аутологи-ной фазе на фоне действия метилпреднизолона (МП).

иг / мл л .

—— ФНО*

ИЛ-1» ••«••■ ИЛ-1^ - »• ИПРФ-1

• 0.6-

Контр. НТНг НТНа + МП

Высокие дозы ФИО-альфа могут подавлять пролиферацию клеток (Kovacs E.J. 1991), но не влияют на синтез коллагена, который был значительно усилен в аутологичной фазе как in vivo, так и in vitro. Субэпителиальные отложения мембраноподобного вещества, выявленные в аутологичной фазе НГН. очевидно, соответствуют коллагену IV типа, синтезируемому компенсаторно по-доцитами в ответ на истончение ГЕМ. Синтез коллагена IV типа МК в культуре, очевидно, связан с действием того хе супрессор-ного фактора, что и в клубочке. Усиленная секреция коллагена IV типа, вероятно, создает условия для пролиферации МК в культуре. Этому же способствует усиление секреции инсулиноподобно-го ростового фактора-1 (ИПРФ-1) (рис. 9). Возможно подобные процессы создают условия для прогрессирования гломерулонефрита и развития склероза

нг / мл 1 i

г -

6.8 6.6 в.1 ь.г е

— ФИО*

ИЛ-lj» •*•■■ ИЛ-lw ► ИПРФ-1

Рис. 9. Динамика изменений секреции цитокинов в аутологичной фазе НТН в различные сроки культивирования ме-зангиальных клеток. ИПРФ-1 - инсулиноподобный ростовой фактор.

Следует отметить, что ни в гетерологичной фазе НГН, ни в аутологичной, ни при ОСН пролиферация МК не связана с действием тромбоцитарного фактора роста (ТцФР), хотя многие исследователи связывают пролиферацию МК с действием этого фактора (Doi Т. et al. 1989; Rovln В. Н. .Schreiner Q. F. 1991).

Для определения источника супрессорного фактора аутоло-

гичшй Фазы НТН, крысы получали сублетальную дозу облучения (700 рад) через б суток после индукции ЕГН (в начальную стадию аутологичной фазы)(рис. 6). В почечном клубочке отслойка эндотелия и инфильтрация почечного клубочка МН не выражена, проте-шурия значительно ниже, чем в аутологичной фазе без облучения. При ишунофлуорссцентной микроскопии обнаружены отложения крысиного линейного характера примерно в половине всех клубочков. 3 других клубочках отложения носили очагово-гранулярный характер. Гомогенная ГВМ не истончена, субэпителиальные отложения мембраноподобного вещзстЕа отсутсвовали, интенсив-кость свечения коллагена IV типа близка к нормальной. В культуре .«леток индекс пролиферативной активности ЫК ниже, чем в контроле (рис. . 7). Культура клеток представлена популяцией ЫК и единичными МН, секреция коллагена IV типа незначительна. Анализ полученных данных свидетельствует, что источником суп-рессорного фактора, как и факторов, регулирующих пролиферацию клеток почечного клубочка, являются МН. Однако не исключена возможность того, что клетки почечного клубочка, активированные развивающейся иммунной реакцией, могут служить источником данного супрессорного фактора

Для оценки роли клеток почечного клубочка в секреции суп-рессорного фактора подавляли развитие иммуновоспалительной реакции, с помощью метилпреднизолсна (МП) и ЦФ (рис. 6).

МП. как и другие кортикостероиды. проявляет свое анти-воспалителыюе и ишуносупрессорное действие, подрчляя синтез ИЛ-1 и ФНО-ааьфа (АПегге М.-Ь. еЬ а1.1991). При иммунофлуо-ресцектном исследовании аутологичной фазы НГН на фоне действия Ш обиаружшы интенсивные отложения крысы вдоль ГВЦ. Однако, несмотря на повреждение гломерулярного фильтра и развивающееся протенурию, инфильтрация почечного клубочка МН не обнаружена. &го, возможно, связано с отсутствием на эндотелии экспрессии адгезивного рецептора 1САМ-1. развивающейся на фоне йнгибирования секреции ИЛ-1 МП (<3е1~з1ег Р. е1 а1.1990). При достаточно сохранной структуре гломерулярного фильтра выявлено увеличение мезангиального матрикса. которое соотвествовало интенсивному свечению коллагена IV типа в области мезангия. В культуре клеток, представленной популяцией МК и единичными МН. инлэкс про.' лферативкой активности МК ниже, чем в контроле (рис. 7), секреция коллагена IV типа не выражена, в отличии от

процесса, протекающего в почечном клубочке. В супернатанте содержание ИЛ-1 и ФИО-альфа близко к значениям у контрольных т-еотных (рис. 8). Следовательно, супрессорный фактор, усиливающий секрецию коллагена в почечном клубочке, не связан с МК и не зависит от действия ИЛ-1 и ФНО-альфа. Возможным источником фактора, стимулирующего накопление коллагена в меэангии, могут быть как мононуклеарные лейкоциты, секретирующие этот фактор по эндокринному типу, так и клетки почечного :слубочка (подоци-ты и зндотелиальные клетки), активированные развивающимся иммунным повреждением в почечном клубочке.

Для определения источника супрессорного фактора мы изучили развитие аутологичной фазы НТН на Фоне действия ЦФ. При им-мунофлуоресцентном исследовании отложения крысы косили

очаговый характер и в ряде клубочков отсутствовали, протеину-рия значительно снижена по сравнению с аутологичной фазой НТН. В то же время отмечена интенсивная инфильтрация почечного клубочка МН и тромбоцитами. Это свидетельствует об отсутствии антивоспалительного действия ЦФ и выраженном подавлении им анти-телыюго ответа. Пролиферативкая реакция в клубочке не выражена, отслойка зкдотелия отмечена лишь на незначительных участках капиллярных петель. ГБМ обычной толщины, однако ее плотность значительно усилена, что коррелировало с интенсивны,'I свечением коллагена IV типа вдоль ГБМ. В культуре клеток индекс пролиферативной активности МК снижен, однако выше, чем у контрольных животных (рис. 7). Культура клеток представлена двумя типами клеток: МК и Ш, причем количество МН было значительно выше, чем в культуре клеток при аутологичной фазе НГН (рис. 7). В культуре клеток при НГН на фоне действия ЦФ обнаружены более интенсивные отложения коллагена IV типа, чем в аутологичной фазе.

Таким образом ЦФ, снижая степень иммунного повреждения почечного клубочка, не уменьшает степень инфильтрации его МН, а дахв усиливает. Причем, наряду с МН, в капиллярных петлях появляются тромбоциты. Усиление инфильтрации почечного клубочка не стимулирует пролиферативную активность, а наоборот, снижает ее, усиливая при этом секрецию коллагена IV типа Следовательно наиболее вероятным источником супрессорного фактора, усиливающего синтез коллагена IV типа, являются Ш и тромбоциты. Роль подоцитов и эндотелиальных клеток в секреции данного

фактора, при незначительности иммунного повреждения почечного клубочка, представляется маловероятной.

Для полного исключения роли подоцитов и эндотелиальных клеток в секреции супрессорного фактора, а также влияния на них циклофосфанс.. мы изучили аутологичную фазу НГН на фоне действия ЦФ. На 5-е сутки развития НТН крыс облучали субле-талыюй дозой (700 рад)(рис. 6) При иммунофлуоресцентном исследовании отложения крысы не выявлены. Толщина и плот-кость ГБМ, а также интенсивность свечения коллагена IV типа близка к нормальной. Инфильтрация почечного клубочка МН и тромбоцитами не выражена. В культуре клеток индекс пролифера-тивной активности МК близок к контролю (рис. 7). Культура клеток представлена популяцией МК и немногочисленными МН. Секреция коллагена IV типа в культуре не выражена.

Таким образом МН и тромбоциты являются наиболее вероятным источником фактора, снижающего пролкферативнуп активность и усиливашёго секрецию компонентов внеклеточного матрикса (коллагена IV типа) в почечном клубочке. Основываясь на литературных данных и результатах собственного исследования, можно предположить, что наиболее вероятным кандидатом является трансформирующий фактор роста-бета (Со1тЬга Т. еЬ а1.1991).

Полученные данные позволили нам рассматривать инфильтрацию почечного клубочка лейкоцитами как адаптивную реакцию организма, направленную на устранение повреждения.

Для проверки этого предположения мы изучили развитие ООН у мышей линии С57В1 на фоне действия ЦФ (рис. , 2). Основные морфологические изменения, наблюдаемые в клубочке, описаны во Второй главе собственных результатов. Следует только отметить, что увеличение мезангиального матрикса коррелировало с интенсивным свечением коллагена IV типа в области мезангия. ЦФ предотвращал инфильтрацию мезангия МН, но в просвете капилляров клубочка выявлены МН и тромбоцита В культуре клеток индекс пролиферативной активности ЫК риже. чем при ОСН (рдо. 8). Культура клеток, как и при НТН. представлена дзумл популяциями клеток: МК и МН, причем и здесь количество Ми выше, чем при ОСН (рис. 8). В культуре клеток также обнаружены интенсивные отложения коллагена IV типа. Таким образом, несмотря на различия патоген.тических механизмов повреждения структур почечного клубочка, ЦФ, уменьшая степень иммунного повреждения, вызывает

идентичную реакцию - усиление инфильтрации почечного клубочка Ш и тромбоцитами на фоне снижения пролиферативной активности клеток почечного клубочка и усиление секреции коллагена IV типа. Причем накопление коллагена происходило преимущественно в местах образования депозитов иммунных комплексов: при НТН - в ГБМ. при ОСИ- в мезангии. Следовательно, накопление коллагена IV типа в почечном клубочке можно рассматривать как проявление репаративной регенерации.

Полученные результаты дают представление о роли МН и тромбоцитов в регуляции иммуновоспалительной реакции. Инфильтрацию МН и тромбоцитами почечного клубочка можно рассматривать как адаптивную органоспецифическую реакцию организма в ответ на повреждение, приводящую к репаративной регенерации. Причем репаративная регенерация регулируется как наличием определенных медиаторов, так и присутсвием самих клеток. Отсутсвие МН и тромбоцитов в зоне повреждения, как в моделе НТН на фоне действия МП, ведет к бессистемному накоплению внеклеточного матрикса. В результате репаративный процесс может приобретать неадекватный прогрессирующий характер. Очевидно в процессе репаративной регенерации важную роль играют мембраноассоциированные медиаторы клеток воспаления, оказывающие контактное действие. Подобное явление потери защитно-приспособительного характера воспалительно-репаративной реакции получило термин - дисрегенерации (Иэхтер А. К , Серов ЕВ. 1691). Помимо бессистемного накопления внеклеточного матрикса этот термин подразумевает гипо- или гиперсекрецию различных медиаторов, изменение спектра их секреции. Подобные .изменения могут быть вызваны сильным или длительным повреждением. генетическими особенностями иммунного ответа. В результате этого, несмотря на инфильтрацию почечного клубочка клетками крови, развивается процесс дисрегенерации. В качестве примера можно привести аутологичную фазу НТН и модель ОСЕ Изменяя до-эу нефротоксической сыворотки, можно получить широкий спектр изменений - от сегментарного МПГН, заканчивающегося полным восстановлением структур почечного клубочка, до некротизирую-щего ГЕ Острый постинфекционный ГН также часто заканчивается полным выздоровлением. В то же время, при однотипной индукции мышей с различным гаплотипом можно подучить различные морфологические варианты иш^юкомплексного ГЕ

4. Мэрфогенеттескиз особенности невоспалительных гломерулопа-тий.

При не вое таит е льных гломерулопатиях. инфильтрация почечного клубочка о.аутстьует. Однако в ряде экспериментальных моделей, соответствующих МН. Ш и <ЮГС, обнаружено увеличение секреции ИЛ-1 и ФНО-альфа в почечном клубочке (Diamond J. R. «Rosel; 1.19Э1). Источником данных факторов могут быть и сами клетгл почечного клубочка, активированные целым рядом физико-химических. гемодинамических И метаболических факторов (Kreisberg J. 1.1988;Мэпе Р. et al. 1988). При изучении этих моделей целым рядом исследователей было установлено, что, несмотря на морфологическую гетерогенность невоспалительных гломеру-лопатий, их объединяет первичное поражение подоцитов и изменение синтеза ими компонентов пнеклеточного матрикса (Diamond J. R. .Karnovsky M. J. 1986; Takeuchi A. et al.1989), хотя причины этого поражения и не ясны.

При изучении биоптатов почек больных с невоспалительными гломерулопатиями (ЫН, Ш. ФСГО) впервые обнаружено уменьшение экспрессии CALLA на подоцитах, вплоть до его полного исчезновения, особенно на ранних стадиях, без изменения ультраструктуры клеток. Хотя механизмы, вызывающие эти изменения не ясны и могут быть различны для ЫН. Ш и ФСГО. они приводят к утолщению ГБМ - ведущему ыорфогенетическому признаку этих гломеру-лопатий. При МН ГБМ увеличивается за счет lamina ra--a externa, а при МИ и ЗСГС - за счет lamina rara interna Однако и в том. и в другом случае утолщение ГБМ является результатом- деятель-, ности подоцитов.

CALLA - полипептидный гликопротеин (100 кД). является лимфогемопоэтическим антигеном (CD 10) и выявляется на зрелых подоцитах и щеточной кайме проксимальных канальцев. Исчезновение экспресии CALLA на подоцитах очевидно связано с внутриклеточными процессами, протекающими не молекулярном уровне и выявляющимися только с помощью иммуногистохимичеоких методов. Отсутствие CALLA на подоцитах характерно для ранних стадий эмбриогенеза и для культивируемых подоцитов (Van der Wende F.J. et al. 1987). На основании этого >-4 выдвинули гипотезу о возможности си теза подоцитами при МН. МИ и 2СГС компонентов ГБМ

по "эмбриональному типу", приводящего it ее быстрому утолщению. 1Ьд действием неизвестных факторов в подоцитах происходит изменение синтетического профиля (качественного или количественного) , морфологически выражающегося в изменении экспресии CALLA.

В эмбриогенезе и на ранних стадиях постнатаньного развития. сопровождающихся быстрым формированием внеклеточного мат-рикса, его ведущим компонентом является ламичин (Ekblom P. ot al. 1980). В то же время у больных с ИН и в модели нефрита Хей-мана, соответствующего МН. показано утолщение ГБМ преимущественно за счет ламинина (Fukatsu A. et al. 1988). Нз моделе МИ (пуромицина аминонуадеозидной) также выявлен усиленный синтез ламинина и коллагена IV типа, приводящий к утолщению ГБМ (Tsukigawa Y. et al. 1991). Эти данные подтверждают нашу гипотезу. Однако Fogol М. A. et al. ,(1991), изучая модель нефрита Хеймана с помощью метода гибридизации in situ, не обнаружил увеличение м-РНК для ламинина и коллагена IV типа Возможно, более широкое использование молекулярно-бислогических методов исследования совместно с морфологическими методами поможет прояснить этот ьопрос. Предпринятое нами изучение распределение ламинина у больных с МН, МИ и 2СГС не дата однозначного результата Распределение ламинина в ГБЫ варьировало в пределах одной группы и мало отличалось от нормы. Очевидно, это обусловлено либо природой используемых нами клоноз антител, определяющих различие получаемых результатов, либо структурой самого ламинина, имеющей некоторые отличия в эмбриогенезе (Danjanov 1.1990). Использование различными исследователям широкого спектра клонов антител для характеристики рапределе-ния внеклеточного матрикса привело к публикации данных, часто противоречащих друг другу (Verroust Н. et al. 1985). Решение этого вопроса требует дальнейших специальных исследований, но полученные нами данные, независимо от результатов по распределению компонентов внеклеточного матрикса. позволили объединить в одну группу такие разнородные по морфологической картине невоспалительные гломерулопатии как МН, Ш и ÍCl'O. Основной мор-фогенетический признак - утолщение ГБМ - обусловлен первоначальным повреждением подоцитов, выражающимся в потере экспресии ими CALLA.

5. .Взаимосвязь изменений клеточных структур почечного клубочка с распределением компонентов внеклеточного матрикса при воспалительных и невоспалительных гдомерулопатиях.

Проведенный нами эксперименты позволили установить связь между гемопоэтическими клетками и клетками почечного клубочка, осуществляемую с помощью ряда растворимых медиаторов. Помимо этого, важная роль в регуляции деятельности клеток почечного клубочка принадлежит их взаимодействию с внеклеточным мат-риксом. Эта связь носит обратный характер и выражается как в изменении распределения компонентов внеклеточного матрикса. так и появлении или исчезновении ряда антигенов.

В предыдущей главе показано, что исчезновение CALLA на подоцитах связано с утолщением ГБМ при невоспалительных гдомерулопатиях. Следовательно, возникающее утолщение ГБМ можно с полным основанием связывать с изменением функции подоцитов. Следует отметить, что экспрессия CALLA восстанавливается на поздних стадиях ЗСГС и. иногда, МН., При этом в почечном клубочке отмечены повреждения его капсулы, появление синехий и значительных отложений коллагенов I, III и IV типов. Очевидно это обусловлено активацией других, помимо подоцитов, источников внеклеточного матрикса - МК и клеток интерстиция, поскольку в клубочке появляются иитерстициальные коллагена Восстановление экспрессии CALLA служит ещз одним доказательством взаимосвязи функции подоцитов с утолщением ГБМ пр" МН, МИ и ФСГО. Накопление в почечном клубочке коллагенов I. III и IV типов вне ГБМ не требует активизации синтеза компонентов внеклеточного матрикса подоцитами, приводя к восстановлению экспрессии CALLA на их поверхности.

Восстановление CALLA на подоцитах сопровождается потерей ими другого антигенного маркера - CR 1. CR 1, экспрессируемый также на моноцитах/макрофагах и эритроцитах, обеспечивает фиксацию и элиминацию этими клетками иммунных комплексов при развитии иммунного ответа (Wilson J.6. et al. 1387). Потеря CRI подоцитами свидетельствует о нарушены* процесса элиминацки иммунных комплексов в почечном клубочке (Macanovic M, .Kíarcanovlc К. 1939) и характерна, помимо 5СГС, для диабетического гломеру-лосклероза, 5олезни Вегенера, синдрома Гудпасчера (Kazatchklne R D. et al. 1982), т.е. процессов, сопровождающихся появлением

интерстициальных коллагенов и развитием гиалиноза. Тагам образом, потеря CR 1 может служить маркером поздних стадий склеро-8а с исходом в гиалиноз.

Как при воспалительных, так и невоспалительных гломеруло-патиях, ранние стадии склероза обусловлены накоплением коллагена IV типа преимущественно в зоне мезангия. Нам не удалось выявить отложений интерстициального. коллагена даже на поздних стадиях склероза при неповрежденной капсуле клубочка, несмотря на способность МК продуцировать интерстициальные коллагены в культуре (Haralson М. A. et al. 1987). Полученные рядом авторов иные данные обусловлены, очевидно, перекрестной реакцией используемых антител (Striker L.J. et al. 1989). Помимо накопления коллагена IV типа в почечном клубочке, ранние склеротические изменения характеризуются появлением в зоне склероза отложений компонента комплемента С9. Причем отложения С9 могут появляться кад в составе депозитов иммунных комплексов, так и непосредственно во внеклеточном матриксе. При выраженных фиб-ропластических изменениях в почечном клубочке и нефросклерозе отложения С9 не выявлены. Следовательно, С9 можно рассматривать как один из маркеров ранних склеротических изменений. Появление С9 связано с активацией мембраноатакующего фагаора (С5Ь-С9), обуславливающего лизис компонентов внеклеточного матрикса (Rooney I. A. et al. 1991). Т ким образом, появление С9 на ранних стадиях развития склеротических процессов можно рассматривать как проявление защитной реакции организма.

При воспалительных гломерулопатиях пролиферация Ж характерна для большинства морфологических форм. Пролиферация ,МК приводит к увеличению межклеточных контактов, которое, по мнению ряда авторов, может являться триггерным механизмом для секреции компонентов внеклеточного матрикса и увеличения мезангиального матрикса (Ishlnura Е. et al.1989). При экспериментальных нефритах (модель ООН, гетерологичная фаза НТН) эта пролиферация на ранних стадиях приводит почти к полному исчезновению мезангиального матрикса. Причем мезангиолизис не зависит от наличия или отсутствия в мезангки МН. Очевидно, уменьшение мезангиального матрикса связано с активацией коллагепази МК гладкомышечного типа. В то же время при МПГН и МКГН человека пролиферация МК сопровождается выраженным накоплением мезангиального матрикса. Стадия ыезангиолизиса ни в ол"ом случае

не обнаружена фи МПГН отмечено увеличение в мезангиальном матриксе фибронектина, особенно в зоне контакта мезангия с эндотелием. Причем накопление фибронектина происходит лишь в некоторых зонах такого контакта. Известно, что фибронектин обладает повышенной адгезивной способностью для МН ( Border W. A. et al. 1989). Таким образом появляется плацдарм, облегчающий внедрение МН в мезангкй. Причина избирательного накопления фибронегаина не ясна и может быть обусловлена локальным действием медиаторов, секретируемых как активированными МК. так и МН.

Нарушения функции клеток почечного кубочка могут приводить не только к утолвению ГБЫ, но и вызывать обратные изменения. Так гематурия при воспалительных и невоспалительных гло-мерулопатиях обусловлена появлением "тонких мембран", фи им-муиогистохимическом исследовании часто выявляются мезангиаль-ные депозиты, содержащие СЗ и С9. При изучении распределения компонентов внеклеточного. матрикса выявлена атипичная локализация коллагена IV типа в почечном .клубочке. Большая часть метки локализована в мезангии, в ГБМ - преимущественно в lamina гага interna, вместо lamina densa. Наличие значительной части метки в эндотелиальных клетках, очевидно, связано с повышенной утилизацией ими компонентов ГБЫ при снижении синтеза этих компонентов подоцитами. Увеличение коллагена IV типа в мезангии носит, вероятно, компенсаторный характер. Таким образом, феномен "тонких мембран" связан с нарушением синтеза коллагена IV типа подоцитами и перераспределением его в почечном клубочке.

Полученные данные отражают тесную взаимосвязь изменений внеклеточного матрикса с изменениями функций клеток почечного клубочка .

6. Значение индекса активности и индекса склероза для оценки эффективности проводимой терапии ï? прогноза воспалительных и не воспалительных г ломе руло патий.

Основными средствами патогенетической терапии, способными' затормозить прогрессировала хрсчического глсмерулонефрита (ХГН) и привести к ремиссии нефротического синдрома (НО), являются кортикостероиды и цитостатики (Kincaid-Smíth

P., 1972; Тареева И. Е, и до. 1901; 1989). Стремление повысить действенность иммуноеупрессивной терапии и уменьшить риск осложнений привело к поиску различных схем лечения, анализу клинических и морфологических признаков с целью выяснения предикторов достигнутого эффекта. В попытке найти морфологические признаки, способные предсказать результаты терапии. Austin Н. et al.(1983) предложил оценивать признаки активности и склероза у больных с волчаночным нефритом и сопоставлять их с результатами терапии. Прогностическая важность величин индексов активности и склероза при волчаночном нефрите отмечена в рядо работ (Austin Н. et al. ,1986;toffil et al. .1988;Schwartz M et al.,1989). Значимость этих показателей у больных ХГН не исследована, поэтому данный подход был использован в нашей работе.

Результаты анализа биоптатов почек больных и экспериментального материала легли в основу оценки индекса активности и индекса склероза у больных с ХГЕ За основу взяты критерии, предложенные для волчаночного нефрита, и модифицированы с учетом полученных нами данных. В частности, в индекс активности введены следующие морфологические параметры: пролиферация/активация подоцитов, пролиферация/активация МК, депозиты иммунных комплексов, инфильтрация почечного клубочка (нейтро-филы, моноциты, лимфоциты, тромбоциты). В индекс склероза -склеротические изменения мезангиальь->го матрикса. В дополнение к ранее предложенным параметрам, совокупность всех морфологических признаков отражает функциональное состояние клеток и внеклеточного матрикса почечного клубочка, канальцев и ин-терстиция, т.е. речь идет о функциональной характеристике почки.

Индексы активности и склероза оценивались у 37 больных с тяжелым течением ХГН, отобранных для проведения пульс-терапии ДФ и в большинстве своем ранее безуспешно леченных имыуносуп-рессивными препаратами. У 8 больных был МПГН, у - 10 МКГН, у 4 - ФПГН, у 3 - Ш и у 12 - ФСГС. Каждый . из морфологических признаков оценивался по шкале от 1 до 3 баллов. Суша баллов составляла величину индексов активности и склероза (рис. 10).

а в □ □

П . Ш

В Э

Ш Е

Рис. 10. Зависимость результатов терапии от величины индексов склероза и активности.

У всех больных были выражены склеротичесгае изменения (индекс склероза от 4 до 17) и влияние этого показателя на результаты терапии выявлено не было (рис.10). Напротив, индекс активности (от 1 до 7) значимо влиял на результаты терапии:-положительный эффект получен лишь у больных с высоким индексом активности (рис. 10). Для оценки эффективности терапии (исход) выделены следующие критерии: I - ремиссия НС, протеинурия менее 3 г/сут; II - улучшение (неполная ремиссия), III - ухудшение. перепетирование НС с дальнейшим прогрессированием почечной недостаточности; IV - уремия; V - смерть 9т почечных и внепочечных причин.

Данные анализа биопсий почек больных поручили экспериментальное подтверждение на модели хронизации ОСН с проведением пульса ЦФ (рис. 2). Результаты оценены на 3-й и 10-е сутки а момента проведения пульса и отражены в таблице 4. Несмотря на наличие депозитаз иммунных комплексов в меэангии и выраженную в равной степени пролиферацию МК. остальные морфологические параметры индекса активности не выражены (индекс активности от 2 до 4). Таким образом, ЦФ не оказал видимого „лияния на клинические показатели (уровень протеинурии сохранялся) и морфологическую картину в почечном клубочке.

Принт"гя во внимание влияние демографических, клинических. лабораторных и морфологических показателей на исход

терапии больных ХГН, предпринят многофакторный пошаговый регрессионный анализ для выяснения прогностической значимости этих показателей. Оказалось, что среди ¿0 различных показателей (пол, возраст, длительность нефрита и НС к моменту начала терапии, наличие артериального давления, уровень сывороточного креатинина до начала лечения, через б месяцев и в конце наблюдения; эффект от предыдущей терапии, ее длительность, суммарная доза ЦФ за время лечения» ' среднемесячно доза, длительность наблюдения, наличие ремиссии и условия, при которых она наступала (длительность лечения, доза, число пульсов); морфологический вариант гломерулопатии, индексы активности и склероза) единственны),« прогностически значимым признаком, позволяющим предсказать эффективность терапииявляется индекс активности (козффициент-0,00457;р- 0,05). Положительный результат лечения - отсутствие прогрессирования - наблюдался при высоком индексе активности; при низком его значении прогрессирование болезни приостановить не удавалось.

Таким образом индекс активности может служить достоверным критерием для оценки эффективности терапии и прогноза лечения ХГН. При волчаночном нефрите этот признак не только коррелировал с клиническими и иммунологическими признаками активности болезни, но и использовался для контроля терапии при повторных биопсиях (Ballow J.E. et al. .1984).

ЗАКШЕНИЕ.

В данной работе осуществлен комплексный подход к изучению морфо- и патогенеза различных гломерулопатий с позиций анализа гломерулярных межклеточных взаимодействий.

Цель и задачи исследования определяли использование различных иммуногистохимических методов, экспериментальных моделей и одновременного изучения патологических процессов in vivo и in vitro.

Детальная иммуногистохимическая характеристика биопсий почек больных позволила выявить специфические л общие для ряда морфологических форм признаки и на основании этого разделить гломерулопатии на воспалительные и невоспалительнке. Для воспалительных гломерулопатий характерна выпатенная ;;ммуио-воспалительная реакция, в развитии которой важную роль кграот

антигены ГКГС и зффекторные димфогемопоэтические клетки. Эти данные подтверждены и в ряде экспериментальных моделей. Для невоспалительных гломерулопатий, несмотря на гетерогенность морфологической картины, присущи обще морфогенетические черты: утолщение ГSM. связанное с изменением функции подоцитов, и депозиты, состав которых предполагает вторичность иммунного повреждения, возникающего на фоне гемодинамических и метаболических нарушений.

Изменения, возникающие при воспалительных и невоспалительных гломерулопатиях, на ранних этапах носили компенсаторный характер и расценены как проявления адаптивной органоспе-цифической реакции организма на повреждение, направленные на репаративную регенерацию. Под действием ряда факторов (физико-химические свойства повреждающего агента, сила и длительность его воздействия, генетические особенности организма) компенсаторный процесс приобретал черты дисрегенерации (гипо-или гиперсекреция растворимых медиаторов, регулирующих межклеточные взаимодействия в почечной клубочке), приводя к развитию прогрессирующего склероза Подобное изменение спектра секреции медиаторов МН и тромбоцитов, инфильтрирующих почечный клубо-' чек, продемонстрировано наш на экспериментальных моделях (ОСИ, НГЮ воспалительных гломерулопатий. Процесс дисрегенерации при невоспалительных гломерулопатиях могут отражать изменения экспресии CALLA и CÍR1 на подоцитах, приводящие в конечном итоге к развитию склероза беэ выраженной воспалительной реакции. Появление эффекторных клеток (источника воспалительных медиаторов) при невоспалительных гломерулопатиях служит, свидетельством активизации патологическое процесса и возможности его коррекции кортикостероидами.

На основании полученных данных изучения экспериментального и клиничес1юго материала предложена гипотетическая схема патогенеза воспалительных и невоспалительных гломерулопатий (рис. 11).

Рис.11.

Гипотетическая схема патогенеза воспалительных гмомерулопатий.

Повреждение структур почечного клубочка

Репаративная регенерацш -— Воспаление: (инфильтрация почечного клубочка НФ.МН.Тц; секреция медиаторов)

Дисрегенерация: внесистемное накопление внеклеточного матрикса гипо- и гиперсекреция медиаторов, изменение спектра их секреции

Персистенция повреждения

■ Хроническое воспаление

Прогрессирующей склероз

Гипотетическая схема патогенеза невоспалительных

гломе рулопатий.

_ (-----------

_1_I_

Повреждение структур почечного клубочка

Репаративная регенерация п | I М Дисрегенерация

I I I I

Эффекторные клетки

Персистенция повреждения

| I

Прогрессирующий склероз

стероидочувствительные гломерулопатии

I I

[ [ стероидорезистентные

I | гломерулопатии

-I I___________

- 44 -

шоде

1. Комплексное морфологическое исследование биоптатов почек больных различными гломерулопатиями с использованием широкого спектра антител доказало правомочность их деления на воспалительные (гломерулонефрит) и невоспалительные. Для гломерулонефрита, помимо наличия эксудативно-пролиферативной реакции или ее последствий, характерно наличие гетерогенных по составу депозитов иммунных кохшлексов одной локализации. Для невоспалительных гломерулопатий характерно первичное поражение подоцитов. выражающееся в потере или уменьшении экспрессии антигена острой лимфобластной лейкемии, наличие однотипных по составу депозитов иммунных комплексов одной локализации и депозитов. не содержащих иммунных комплексов.

2. Гетерогенность морфологической картины на ранних этапах развития экспериментального гломерулонефрита связана с антигенами главного комплекса гистосовместиыости. В более поздние сроки специфичность внутриклубочковых изменений определяют патогенетические механизмы и антигены, не связанные с главным комплексом гистосовместимости.

3. Пролиферативная реакция на ранних стадиях развития экспериментального гломерулонефрита, независимо от патогенетических механизмов, связана с действием ИЛ-1, ФИО-альфа и ТхА2, источником которых является мононуклеарные лейкоциты, инфильтрирующие клубочек.

4. Шнонуклеарные лейкоциты и тромбоциты в процессе развития экспериментального гломерулонефрита изменяют спектр секреции медиаторов, регулируя пролиферацию клеток почечного клубочка, а также продукцию ими компонентов внеклеточного матрикса ' •

. 5. Инфильтрация лейкоцитами почечного клубочш является органоспецифической фазой воспалительно-репаративной реакции организма на повреждение. Подавление воспалительной реакции кортикостероидами вызывает бессистемное накопление внеклеточного матрикса, препятствующее репаративной регенерации. Уменьшение иммунного повреждения циглофосфаном, не влияющим на развитие воспалительной реакции, стш -лирует репаративную регенерацию.

6. Ведущий морфогенетический признак иевоспалительных

гломерулопатий - утолщение гломерулярной базальной мембраны -связан с повреждением подоцитов, выражающимся в потере ими экспрессии антигена острой лимфобластной лейкемии.

7. Нарушение взаимодействия клеток почечного клубочка между собой и с клетками крови приводит к перераспределению компонентов внеклеточного матрикса, выражающемуся в истончении или утолщении гломерулярной базальной мембраны, увеличении или уменьшении мезангиального матрикса. Ранние склеротические изменения в мезангии и гломерул. рной базальной мембране при различных нефропатиях сопровождаются появлением отложений компонента комплемента С9. Поздние - накоплением коллагена IV типа, преимущественно в мезангии, при сохранении целостности капсулы клубочка; коллагенов I и III типа при нарушении ее целостности. Появление интерстициальных коллагенов сопровождается полной или частичной потерей подоцитами CR 1. В основе феномена "тонких мембран" лежит нарушение распределения коллагена IV типа в почечном клубочке.

8. Индекс активности, используемый для оценки функционального состояния почек, при многофакторном регрессионном анализе является единственно достоверным параметром, позволяющим прогнозировать эффективность терапии и течение заболевания у больных с различными гломерулопатнямк. Низкий уровень активности является прогностически неблагоприятным признаком. У больных с низким уровнем активности, как и у экспериментальных животных (модель хронизации острого сывороточного нефрита), иммуносупрессивная терапия не эффективна.'

Список работ, опубликовавши во тешз диссертация

1. Шилов Е. М. «Гордовская а К .Иванов А. А. .Лесков К П. .Сура К Е Клеточные аспекты иммуновоспалительного поражения почек. // Тер. архив.- 1987.- N 11.- С. 150-154.

2. Серов К Е , Пальцев М. А., Иванов А. А. Перспективы имму-номорфологического изучения гломерулонефрита. V Архив патологии. - 1988.- N9.- С. 86-91.

3. Дедов И. И. .Пальцев м. А. .Абугова И. А. .Будяк Л. Е .Трифонов Л. В. .Севергина Э. С. .Иванов А. А. Клинические, гормонально-метаболические и ультраетруктуркые критерии ранних проявле-

ний диабетических осложнений. // Тезисы докл. III Всесоюзн. съезда эндокринол.. Ташкент.- 1989.- С. 189-190.

4. Иванов А. А. .Пальцев М. А. .РазгулинаЛ. Е. .ГЬклонова Е а Использование иммунозлектронной микроскопии при диагностике заболеваний почек. // Архив патологии.- 1989.- N 3.- С.79-81.

5. Тареева И. Е., Гордовская Е Б., Гладских 0. П.. Иванов А. А., Краснова Т. Н., Мирошниченко К Г., Шлянцева Л. Р.. Самойлов Д. Е . Шилов Е. М. Лечение хронического гломерулонефрита цитоста-тиками. // Тер.архив.- 1989.- N 6.- С.9-14.

6. Шилов Е. М. .Гордовская Е Б. .Иванов A.A. Влияние ци-тостатической терапии на течение хронического гломерулонефрита. // Тезисы докл. пленума правления ВНОТ, Фрунзе. - 1989. -С. 162.

7. Габрилевская О.Е ,Гладских О. Е .Иванов А. А. .Лесков ЕЕ.Шилов Е. М. Мононуклеарные лейкоциты и продукция интерлей-кина-1 в культуре гломерулярных клеток при экспериментальном нефрите. // Материалы V пленума сошной проблемной комиссии "Нефрология", Фрунзе.- 1990.- С.5.

8. Габрилевская О.Е .Иванов А. А. .Терехов С. М. .Шилов Е. М. Выделение и характеристика клеток первичной культуры почечных клубочков крыс. // Бюлл. зксп. биол. мед. - 1990.- N 1.- С. 57-60.

9. Габрилевская О.Е.Шилов Е. М., Иванов А. А. .Гладских 0. Е , Пальцев Ы. А.. Тареева И. Е. Метилпредниэолон при нефро-токсическом нефрите, крыс: анализ действия с помощью культуры гломерулярных клеток. // Актуальные вопросы зксп. и клинич. медицины. Сб.научн. трудов,М. - 1990. - С. 14.

10. A.c. 1605278 (СССР) Способ моделирования нефропатии. Есилевский Ю. М. .Пальцев М. А. .Уфимцева А. Г. .Севергина Э. С. .Иванов A.A. // Опубл. в Бюлл.откр. и изобр.- 1990.- N 41.

11. Иванов А. А. .Самойлов Д. R. Гладских О. Е , Шилов Е. М. Влияние Н-2 антигенов на активность экспериментального гломерулонефрита и его чувствительность, к иммунодепрессаятам. // Материалы V пленума союзной проблемной комиссии ''Нефрология". Фрунзе. - 1990.- С. 14-16.

12. Самойлов Д. Е . Иванов А. А. . Гладских О. Е . Краснова Т.Е. Шилов Е. М.. Пальцев М. А. , Танеева И. Е. Действие цикло-фосфана при различных морфологических вариантах гломерулонефрита мшей. // АрхИЕ патологии. - 1990. - N4. - С. 53-57.

13. SarnoJ iov D. V.. Ivanov А. A. .Sladsklch О. Р. .shhov Е. М

Cyclophosphano "pulses" In three inbred strains of mice with experimental immune complex nephritis. // Nephron.- 1990.-V. 55. - N 3. - P. 338.

14. Серов R R.Пальцев M. А. »Иванов A. A..Севергина Э. С. Нефрогенная артериальная гипертензия и изменения почечного ин-терстиция. // Материалы сателлитного симпозиума "Тубуло-ин-терстициальные нарушения", Иркутск. - 1990.- С. 46-47.

15. Tareeva I. Е. .Paltsev М. A. .Shilov Е. М. , Ivanov А. А., Gabrllevskaja 0. V. Mononuclear leukocytes (MNL) and interleukin-1 (1L-1) production in the glomerular cells cultures in experimental glomerulonephritis. // Ргос. XXVII Congr. EDTA. Vienna, Austria - 1990.- P. 68.

16. Шилов E. Ы. .Гордовская E Б..Габрилевская 0. E .Краснова Т.Е. Иванов A. A. . Савицкий С.Е.Самойлов Д. R Клиническая и экспериментальная оценка иммуно-воспалительной активности гло-мерулонефрита. // Материалы V пленума союзной проблемной комиссии "Нефрология", $рунзе.~ 1990,- С. 47.

17. Габрилевская О. R , Гладских О.Е.Иванов А. А., Лесков R Е . Никифорова Е R , Шилов Е. М., Тареева И. Е.. Пальцев И А., Кир-патовский R И. Продукция интерлейкина-1 мононуклеарными лейкоцитами и мезаигиальными клетками при экспериментальном нефро-токсическом нефрите. // Бюлл. эксп. биол. мед. - 1991.- N3.-С. 229-232.

18. Sabri levskaja О. V. .Gladsklch 0. P., Ivanov A. A. .Leskov V.P.. Shilov E. M.,Paltsev M. A. Production of interleukln-1 by mononuclear leukocytes and mesangial cells in experimental nephritis. // Nephron.- V.58.- N 1.- P. 112-113.

19. Gabrilevskaja О. V. .Gladsklch 0. P.. Ivanov A. A. .Leskov V. P. . Shilov E. М.» Paltsev M.A.,Tareeva I.E. Mononuclear leukocytes and production of lnterleukin-1 in glomerular cell cultures in experimental, glomerulonephritis. // Proc. Congr. Intern. Soc. Pathophlsiol.. bfoskow. USSR. - 1991.- P. 165.

20. Иванов А. А. .Шилов E. M.. Гладских О. E .Габрилевская 0. R , Никифорова E R . Пальцев M. А. Иммуногистохимическая характеристика нефротоксического сывороточного нефрита у кыс: роль интерлейкина-1 в развитии гетерологичной и аутологичной фаз. // Архив патологии. -1991.- N 7. - С. 15-19.

21. Краснова Т.Е.Шилов Е. М., Иванов А. А., Самойлов Д. В. , Гордовская Е Б. , Мирошниченко Е Г. .Тареева ЕЕ. Лечение

хронического гломерулонефрита сверхвысокими дозами циклофосфа-на // Тер. архив. - 1991.- N 6.- С. 115-118.

22. Неверов Е И.. Иванов А. А. .Севергина Э. С. .Никитина Е. А. .ТамОовцева Е. В. .Тареева И. Е. Морфологические аспекты неф-ротической гилерлипидемии. // Тер. архив. - 1991.- N 6.- С. 33-37.

23. Neverov К.. Ivanov A. .Severalпа Е. .Kolonduck N. .Srlnl-vas К. .Tareeva I. Cytoplasmic lipid inclusions and low density lipoprotein depositions in renal biopsies of nephrotic patients. // Proc. XXVI11 Congr. EDTA. Rlmlnl. Italy. - 1991.-P. 44.

24. Paltsev M. A.. Ivanov A.A..Shllov E. M. .Gabrllevskaja 0. V. .Qladsklch 0. P. The effects of potassium phenozanl on heterologous phase of nephrotoxic nephritis. // Abstr. XI11 Eur.Congr.Pathol. .Ljubljana, Pathol. Res.Praot. - V. 187. - N 6.-P. 174.

25. Шилов E. Ы., ГаОрилевская 0. R . Иванов A. A.. Гладских О. П.. Лескйв Bl П., Пальцев Ы. А.. Тареева И. Е. Роль мононуклеарных лейкоцитов в патогенезе гломерулонефр,ита // Тер. архив. - 1991. -N 6.- С. 21,-26.

26. Иванов А.А..Шилов Е. М.. Гладских О.П. .ГаОрилевская О. Е .Никифорова a R .Пальцев М. А. Иммуногистохимическая характеристика нефротоксического нефрита у крыс: влияние мэтилпред-иизолона и фенозана калия . // Архив патологии. - 1992. - N 1. -С. 45-50.

27. Шилов Е. Ы.. Краснова Т. Е. Иванов А. А., Аккуратова Е В.. Мирошниченко Е Г., Гордовская Е Б.. Тареева. И. Е. Прогноз больных волчаночным нефритом, леченних сверхвысокими дозами циклофосфана // Тер. архив. - 1992. - N 8. - С. 232-236.

Автореферат диссертации по медицине на тему Анализ гломерулярных межклеточных взаимодействий как новый подход в изучении морфо- и патогенеза гломерулопатий

Похожие научные работы

Каталог диссертаций