Автореферат и диссертация по медицине (14.00.36) на тему:Аллельный полиморфизм гена интерлейкина-18 и использование дендритных клеток и интерлейкина-18 для модуляции иммунного ответа при хроническом вирусном гепатите в in vitro

—^иччи/86

На правах рукописи

ХРИПКО ОЛЬГА ПАВЛОВНА

АЛЛЕЛЬНЫИ ПОЛИМОРФИЗМ ГЕНА ИНТЕРЛЕИКИНА-18 И ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ДЕНДРИТНЫХ КЛЕТОК И ИНТЕРЛЕЙКИНА-18 ДЛЯ МОДУЛЯЦИИ ИММУННОГО ОТВЕТА ПРИ ХРОНИЧЕСКОМ ВИРУСНОМ ГЕПАТИТЕ В IN VITRO

14 00 36 - аллергология и иммунология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

1 6 пчт ?

Новосибирск-2008

003448786

Работа выполнена в Государственном учреждении научно-исследовательском институте клинической иммунологии Сибирского отделения РАМН

Научный руководитель:

доктор медицинских наук, профессор

Сенников Сергей Витальевич

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор

Аутеншлюс Александр Исаевич ГУ НИ институт молекулярной биологии и биофизики СО РАМН г Новосибирск

кандидат биологических наук

Голованова Ольга Валерьевна ГУ НИ институт клинической и экспериментальной лимфологии СО РАМН г. Новосибирск

Ведущая организация:

ГОУ ВПО Российский государственный медицинский университет Росздрава

заседании диссертационного совета Д 001.001 01 при Государственном учреждении научно-исследовательском институте клинической иммунологии СО РАМН по адресу 630099, г. Новосибирск, ул Ядринцевская, 14

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГУ НИ институт клинической иммунологии СО РАМН

Автореферат разослан » Се*«?л 2008 г Ученый секретарь диссертационного совета

доктор биологических наук О Т. Кудаева

Защита состоится «_»

2008 г в

часов на

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы

Вирусный гепатит В - инфекция, широко распространенная в человеческой популяции Часто она протекает безеимптомно и оканчивается без неблагоприятных последствий В ряде случаев инфекция проявляется болезнью, которая может протекать тяжело и даже переходить в хроническую форму Согласно данным мировой статистики, гепатит В, прежде всего за счет хронических форм, входит в первые 10 причин смертности населения В мире насчитывается примерно 350 миллионов человек-носителей вируса гепатита В (ВГВ), из которых от заболеваний, связанных с инфекцией, умирает примерно 0,5-1 млн человек в год [Loe AS, 2005] Активный хронический вирусный гепатит В - это заболевание, проблема лечения которого не решена

Вирусный гепатит можно отнести к числу социальных болезней, возникновение которых связано с условиями жизни населения В связи со способами передачи вируса, причинами эпидемиологического неблагополучия являются ухудшение социально-экономических условий, снижете уровня жизни населения, рост числа лиц, принимающих наркотики, рождение детей от зараженных вирусом матерей, другими причинами заболевания хроническим вирусным гепатитом являются множественные инвазивные медицинские манипуляции и гемотрансфузии Вирусный гепатит В у взрослых чаще всего характеризуется острым течением, заканчивающимся в 80-90% случаев спонтанным выздоровлением, в случае заражения в детском возрасте, особенно а случае интранатального инфицирования, болезнь приобретает хроническое течение в 90% случаев [Robinson W S , 1996]

Развитие вирусного гепатита В с переходом в хроническую форму зависит от особенностей формирования иммунного ответа [Maim МК, 2000] К факторам риска развития хронической инфекции относят факторы, ухудшающие состояние иммунной системы, такие как ВИЧ-инфекция, иммуносупрессивная терапия, диабет, алкоголизм, а также генетическая предрасположенность

В стандартную терапию хронического вирусного гепатита входит применение интерферонов и противовирусных препаратов Такая терапия часто остается неэффективной, поэтому необходим поиск новых подходов в лечении Химиотерапия некоторыми противовирусными средствами приводит к развитию лекарственно-устойчивых штаммов вируса [Liaw Y-F, 1999] и поэтому становится неэффективной, кроме того, большинство противовирусных средств обладает выраженными побочными эффектами, в частности, гепатотоксическим действием В настоящее время развиваются новые подходы к лечению этого заболевания, связанные с использованием возможностей собственной иммунной системы и их возможной модуляции Протективный иммунный ответ в течение вирусного гепатита В связан с индукцией клеточного звена иммунной системы и реализуется посредством Т хелперов 1 типа [Chisari F, 1995] Важное значение в патогенезе хронического вирусного гепатита В принимают цитокины, такие как ИНФ-а, ИНФ-Г, ИЛ-1, ФНО-а и, в частности, ИЛ-18 [Koziel MJ, 1999] ИЛ-18 - плейотропный цитокин, продуцирующийся многими типами клеток, главным образом, активированными моноцитами и дендритными клетками [Nakanishi, 2001], который участвует в формировании врожденного и приобретенного иммунных ответов [Dmarello СА.1999] Профиль циркулирующих цитокинов при хроническом вирусном гепатите В связан с уровнем репликации вируса и степенью повреждения печени [Bozkaya Н, 2000] Было показано, что ИЛ-18 ингибирует репликацию ВГВ в печени трансгенных мышей [Lynch DH, 1995] При исследовании нециголитических механизмов элиминации вируса показано, что некоторые из ИФН- у - индуцирующих цитокинов, в частности ИЛ-18, демонстрируют возможность ингибирования репликации ВГВ [Kimura К, 2002] С другой стороны, повышение уровня эндогенного ИЛ-18 при хронических заболеваниях печени связано с активацией механизмов иммунного повреждения печени, опосредованного через

Fas лиганд [Sun Y, 2003] У пациентов с хроническим вирусным гепа гитом В снижена продукция ИНФ-у и ИЛ-18 мононуклеарными клетками периферической крови С другой стороны, снижение продукция цитокииов может быть связано с генетическими механизмами В функционально-активных участках промотора гена ИЛ-18 обнаружено несколько одиночных нуклеотидных полиморфизмов [Giedraitis V, 2001] Эти полиморфизмы, находящиеся в позициях -607С—>А и -137G-»C, могут влиять на уровень продукции ИЛ-18 и вероятность развития хронического течения вирусного гепатита В

С другой стороны активность адаптивного звена иммунной системы напрямую зависит от представления антигена Т клеткам и их направленной дифференцировки Представление антигена и определение типа иммунного ответа осуществляется антиген-презентирующими клетками, в частности, дендритными клетками (ДК) [Кузнецова, 2003] ДК являются профессиональными антиген-презентиругощими клетками и обладают специальными механизмами захвата и представления антигена Т-кпеткам Направленность иммунных реакций определяется профилем цитокинов (ИЛ-4, Ш1-10, ИЛ-12, ИЛ-18) и уровнем их продукции ДК В настоящее время активно исследуется возможность индукции с помощью дендритных клеток специфических иммунных реакций, как m vitro, так и m vivo [Mohamadzadeh, 2004, Ridgway, 2004, O'Neill, 2004]

Таким образом, исходя и J роли ИЛ-18, ДК и генетических факторов в патогенезе хронического вирусного гепатита В и, с другой стороны, возможности их использования в качестве иммунотерапии заболеваний, опосредованных поражением иммунной системы, представлялось актуальным и значимым исследовать ассоциированность определенного полиморфного варианта промотора гена ИЛ-18 с развитием хронического вирусного гепатита В и уровнем продукции ИЛ-18, а так же влияние антиген специфических дендритных клеток и ИЛ-18 на функциональные свойства мононуклеарных клеток периферической крови больных хроническим вирусным гепатитом В m vitro

Цель работы: исследовать ассоциацию полиморфизма промотора гена ИЛ-18 с хроническим вирусным гепатитом В и возможность модуляции НВс антиген-специфического иммунного ответа с помощью аутологичных дендритных клеток и интерлейкина-18 m vitro

В связи с поставленной цепью предстояло решить следующие задачи

1 Исследовать частоту встречаемости генотипов промотора гена ИЛ-18 в позициях -607С-М и -137G-»C у больных хроническим вирусным гепатитом В и здоровых доноров Юго-Западной Сибири

2 Изучить влияние полиморфных вариантов -607С-»А и -137G-»C промотора гена ИЛ-18 на уровень продукции ИЛ-18 МНК ПК

3 Исследовать влияние HBcAg индуцированных дендритных клеток и ИЛ-18 на пролиферативную активность, продукцию цитокинов и экспрессию перфорина МНК периферической крови

Научная новизна работы

Впервые определена частота встречаемости генетических вариантов промотора гена ИЛ-18 у здоровых доноров Юго-Западной Сибири и показана связь между генотипами промотора гена ИЛ-18 в точках -607С-»А и -137G-»C и уровнем его продукции мононуклеарными клетками периферической крови

Впервые определена частота встречаемости генотипов промотора гена ИЛ-18 в точках -607С->А и -137G-»C у больных хроническим вирусным гепатитом В в популяции Юго-Западной Сибири и показано увеличение частоты встречаемости у больных аллелей, ассоциированных с низкой продукцией белка.

Впервые показана возможность применения ИЛ-18 для регуляции взаимодействия иммунокомпетентных клеток и формирования направленного клеточного иммунного ответа при хроническом вирусном гепатите В m vitro

Теоретическая и практическая значимость работы.

Показана ассоциация аллеля С в позиции -137 промотора гена ИЛ-18 с низким уровнем ЛПС-стимулированной продукции ИЛ-18 Показано статистически значимое увеличение уровня ЛПС-стимулированной продукции ИЛ-18 МНК ПК здоровых доноров несущих генотип СА по сравнению с генотипом СС в позиции -607 При исследовании частотных распределений генотипов ИЛ-18 в позиции -607 промотора гена ИЛ-18 показано увеличение частоты встречаемости носителей аллеля А среди лиц с высоким уровнем спонтанной продукции ИЛ-18 Полученные результаты демонстрируют увеличение частоты встречаемости генотипов с низким уровнем продукции белка среди больных хроническим вирусным гепатитом В

Полученные результаты расширяют представления об иммунорегуляторном потенциале дендритных клеток моноцитарного происхождения при хроническом вирусном гепатите В, вносят существенный вклад в понимание механизмов элиминации вируса гепатита В, демонстрируют возможность влияния цитокинов и антигенов на направленность противоинфекционного иммунного ответа

Разработанный способ модуляции противовирусного клеточного иммунного ответа с помощью мононуклеарных клеток, активированных при помощи антиген специфических аутологичных дендритных клеток и ИЛ-18, может быть использован в качестве подхода к лечению больных хроническим вирусным гепатитом В Основные положения, выносимые на защиту

1 Полиморфные варианты -607С->А и -1370->С промотора гена ИЛ-18 ассоциированы с различным уровнем продукции Ш1-18 мононуклеарными клетками периферической крови

2 ДК, нагруженные НЬсАй, в присутствии рчИЛ-18 эффективно стимулируют пролиферативный потенциал, продукцию 1КЫ-у и индуцируют увеличение количества перфорин-содержащих клеток в культурах аутологичных мононуклеарных клеток больных хроническим вирусным гепатитом В

Апробация материалов диссертации

Материалы диссертации доложены и обсуждены на 1) Московской международной конференции «Биотехнология и медицина» (Москва, 2006), 2) Российской научно-практической конференции «Современные технологии в иммунологии иммунодиагностика и иммунотерапия» (Курск, 2006), 3) III Международная конференции "Фундаментальные науки - медицине" (Новосибирск, 2007), 4) Межрегиональной научно-практической конференции «Дни иммунологии в Сибири» (Омск, 2007), 5) Объединенном иммунологическом форуме (Санкт-Петербург, 2007, 2008), 6) Семинарах группы лаборатории молекулярной иммунологии ГУ НИИ КИ СО РАМН (Новосибирск, 2006, 2007) 7) Семинаре научного отдела ГУ НИИ КИ СО РАМН (Новосибирск, 2007)

Публикации. По теме диссертации опубликовано 10 работ, в том числе 1 статья в журнале, рекомендованном ВАК для публикации результатов исследований диссертации на соискание ученой степени кандидата наук

Объем и структура работы. Диссертация написана в традиционном стиле и состоит из введения, обзора литературы, главы результатов собственных исследований, обсуждения полученных результатов, заключения и выводов Материал изложен на 135 страницах машинописного текста, включающего 17 рисунков, 6 таблиц Прилагаемая библиография содержит ссылки на 279 литературных источника, в том числе 275 иностранных.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Объект исследования МНК ПК условно здоровых доноров в возрасте от 20 до 50 лет (40 человек) и больных хроническим ВГВ (30 человек) ДНК лейкоцитов периферической крови условно здоровых доноров (147 человек) и доноров положительных по HbsAg (107 человек) в возрасте от 20 до 50 лет, выборки здоровых доноров и больных хроническим вирусным гепатитом В не различались по возрасту и полу

Выделение клеток из периферической крови

1 Выделение МНК ПК осуществлялось в градиенте плотности фиюолл-урографииа [Boyum, 1968]

2 Выделение моноцитов периферической крови проводилось методом адгезии на пластике

3 Выделение лейкоцитов периферической крови проводилось в лизирующих растворах 1 (320 мМ сахароза, 1 мМ Tris HCI рН 7,8, 10 мМ MgCI2, Triton Х-100 1%) и 2 (10 мМ NaCl, 10 мМ Tris НС1 рН 7,8,10 мМ MgC12,) до белого осадка

Получение зрелых ДК

Дифференцировка моноцитов в незрелые ДК под действием рчГМ-КСФ (50 нг/мл) и ИЛ-4 (100 нг/мл) в течение 24 часов Культивация незрелых ДК в присутствии HbcAg (5мкг/мл) 2 часа Созревание ДК под воздействием ФНО-а (25 нг/мл) 24 часа

Культивирование клеток проводилось в полной среде RPMI-1640, содержащих 10% FCS (РАА Австрия), 2мМ L-глутамина (ГНЦ ВБ «Вектор», 10 мМ HEPES буфера (Sigma), 5x10-5 мМ меркаптоэтанола (Sigma), 80 мкг/мл гентамицина (АО «Самсон» Санкт-Петербург), 100 мкг/мл (ЗАО «Синтез» Курган) в атмосфере 5% С02 при 37 °С

Анализ фенотипическихи функциональных показателей ДК методом проточной цчтофлюрометрии (FACSCahbur (BD))

1 Для анализа фенотипических характеристик ДК использовались моноклональные антитела anti-CD83 PE, anti-CD86 FITC (BD Pharmingen), anti HLA-DR ИТС («Сорбент», Москва)

2 Для оценки эффективности захвата антигена полученными ДК определялась их способность к рецептор-опосредованному эндоцитозу ИТС-декстрана (Sigma) при +4 "С и +37 °С

Совместное культивирование неприлипшей фракции МНК ПК и ДК

Полученные ДК подвергались совместному культивированию с неприлипшей фракцией МНК ПК (нМНК) в течение 48 часов для праймирования специфического антигена (в соотношении МНКДК=101) с добавлением рчИЛ-18 (ООО «Центр инженерной иммунологии», Новосибирск) или без него (группы МНК+ДК+ИЛ-18, МНК+ДК, соответственно) В качестве контроля использовались нМНК культивированные в тех же условиях ( группы МНК и МНК+ИЛ-18), а так же, культивированные в присутствии ДК, которым не представлялся HBcAg (МНК+ДК (без антигена))

После совместного культивирования нМНК и ДК в присутствии или отсутствии рчИЛ-18, а также контрольных групп, клетки отмывали и затем культивировали с HBcAg (1 мкг/мл) в течение 72 часов Для определения эффективности ответа на специфический антиген мы использовали

1 Количественное определение клеток, продуцирующих ИЛ-4 и ИНФ-у с помощью технологии ELISpot (R&D Systems)

2 Определение продукции ИЛ-4 и ИНФ-у с помощью иммуноферментного анализа («Вектор-Бэст», Новосибирск)

3 Определение пролиферативной активности МНК по включению 3Н-тимидина в нуклеопротеиД1ше фракции клеток 3Н-тимидин вносили 1 цС|/лунка за 16 часов до окончания культивирования

4 Определение содержания перфорин-позитивных клеток с помощью anti-perforin FITC (BD Pharmmgen) с последующим анализом на проточном цитофлюорометре (FACSCalibur (BD))

Выделение ДНК из лимфоцитов проводилось с помощью набора Проба-НК (ДНК-технология, Россия)

Определение генотипов ИЛ-18. Исследование проводилось методом Real-time PCR в амплификаторе íqCycler (Bio-Rad, USA) Реакционная смесь в объеме 15 мкл содержала 0,3 микромоль праймера специфического к - 607 и - 137, а также каждого праймера контрольной амплификации, ПЦР буфер (16 мМ трис-HCl, pH 8 9, 2,4 мМ MgC12, 65 мМ (NH4)2S04), 0,2 мМ dNTP, lx SYBRE green, 1 ед Taq-полимеразы, 5 iff геномной ДНК Специфические праймеры 137С 5'-ТАА TGT ААТ АТС ACT ATT TTC ATG AAA TC-3', 137G 5'-ААТ GTA ATA ТСА СТА ТТТ ТСА TGA AATG-3', 607С 5'-GTT GCA GAA AGT GTA AAA ATT ATT AC-3\ 607A 5'-GTT GCA GAA AGT GTA AAA ATT ATT AA-3' Праймеры внутреннего контроля LTM1 TGGGTGCTAGAGGTATAATCG и LTM2 TTAGAGGAAGCTGGGTAAGAG Условия проведения ПЦР денатурация (95оС, 3 мин), 5 циклов в режиме 95оС - 10 сек, 57оС - Юсек, 72оС - Юсек, далее 30 циклов в режиме 95оС - 3 сек, 59оС - Зсек; 72оС - Зсек, 78оС - Юсек (съем флуоресценции), 82оС - 10сек (съем флуоресценции), затем съем кривой плавления 60 циклов с 65оС при инкременте температуры 0,5оС и съеме флуоресценции на каждом цикле Полученные данные интерпретировали исходя из анализа графиков накопления флуоресценции, специфичность оценивалась с помощью кривой плавления

Определение уровня ffJI-18 проводили методом ELISA (Bender Med Systems, Австрия), согласно заводской инструкции

Статистическая обработка данных Статистическая обработка результатов производилась при помощи программ «Stattstica 6 0» и Epi Info и Arleqiun 3 1 При нормальном распределении выборки, для статистической проверки использовался t-криггерий Стьюдента, данные представлены в виде средней и стандартной ошибки средней (М±т) Если исследуемые выборки не подчинялись нормальному распределению, использовались непараметрические критерии Манн-Уитни и Уилкоксона, данные представлены в виде медианы (Me) и размаха квартилей

Для выделения качественно отличающихся между собой уровней продукции ИЛ-18 использовали методы квантильно-ранговой классификации по алгоритму Мостеллера и Тыоки [Мостеллер Ф, 1982, Гублер ЕВ 1979, Лакин ГФ, 1990] Для суждения о достоверности различий встречаемости качественных признаков и частоты событий в различных диапазонах варьирования уровня ИЛ-18, применяли критерий х2 (Рх) и точный метод Фишера для малых выборок (Ртиф)

Расчет соответствия частот встречаемости генотипов распределению Харди-Вайнберга и неравновесное сцепление изучаемых точек проводили с использованием критерия ц2 (Arleqiun 3 1) Анализ таблиц сопряженности проводился с помощью критерия у2 (Пирсона) (Epi Info)

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Анализ распределения полиморфных вариантов гена ИЛ-18 среди здоровых доноров Юго-Западной Сибири и больных хроническим вирусным гепатитом В

Распределение аллелей генов предрасположенности/резистентности, формирующие риск развития заболевания или устойчивости к нему, являются уникальными для каждой популяции, что может быть одной из причин разнообразного иммунного ответа на антиген Поэтому, учитывая патогенетическую роль ИЛ-18 в

формировании гепатита В представлялось интересным исследовать распределение аллепьных вариантов гена ИЛ-18 Полиморфные позиции, изучаемые нами, были выбраны в соответствии с имеющимися литературными данными [Giedraitis V, 2001] Известно, что одиночные нуклеотидные полиморфизмы в позиции -607С/А и -137G/C расположены в промоторе гена ИЛ-18 и следовательно могут влиять на уровень продукции белка ИЛ-18

Исследование двух полиморфизмов промотора гена ИЛ-18 (-607С-»А и -137G->C) было проведено в группе практически здоровых лиц (п=147) и больных хроническим вирусным гепатитом В (п=103) Распределение генотипов промотора гена ИЛ-18 среди здоровых доноров Юго-Западной Сибири подчиняется закону Харди-Вайнберга и составляет следующие значения -607СС 38,1%, -607СА 46,3%, -607АА 15,6%, -137GG 44,2%, -137GC 41,5%, -137СС 14,3%, среди доноров, больных хроническим вирусным гепатитом В -607СС 45,6%, -607СА 49,5%, -607АА 4,8%, -137GG 49,5%, -137GC 34,9%, -137СС 15,5% В группе больных хроническим вирусным гепатитом В выявлено снижение частоты встречаемости генотипа -607АА полиморфного участка гена ИЛ-18 по сравнению со здоровыми донорами (х2=9,45, рх2<0,002). При анализе различий в распределении генотипов полиморфного участка -137 G-»C гена ИЛ-18 между группами больных и здоровых лиц статистически значимые отличия не выявлены

Для определения ассоциированности наличия заболевания хроническим вирусным гепатитом В с определенным генотипом был проведен анализ распределения генотипов среди здоровых и больных индивидов При анализе генотипов здоровых доноров были выявлены следующие частоты -607АС/-137СС - 8,2%, -607AA/-137GG - 0,7%, -607АА/-137GC - 11,6%, -607AC/-137GG - 12,2%, -607АА/-137СС - 3,4%, -607CC/-137GG - 31,3 % , тогда как среди лиц больных хроническим вирусным гепатитом В преобладали следующие генотипы -607CC/-137GG, -607AC/-137GC, -607AC/-137GG (35,0%, 31,1%, 12,6 % соответственно), доля генотипа -607СС/-137СС составила 6,8%, генотипа -607АС/-137СС - 5,8%, -, генотипы -607CC/-137GC, -607АА/-137СС и -607AA/-137GG, по 3,9%, 2,9% и 1,9% соответственно При сравнительном анализе встречаемости генотипов в двух изучаемых группах было выявлено снижение частоты встречаемости генотипа -607АА/-137CG (0%) и увеличение частоты встречаемости генотипа -607СС/-137СС до 6,8% среди больных вирусным гепатитом В

У больных хроническим ВГВ в китайской популяции достоверно чаще встречаются аллельные варианты промоторного участка гена ИЛ-18 -137GG и -607СА, и, наоборот, у людей с аллелем С в позиции -137 промотора гена ИЛ-18 достоверно реже встречается гепатит В [Zhang РА, 2005] В другом исследовании показана ассоциация генотипа -607АА с предрасположенностью к развитию хронического ВГВ в тайской популяции [Hirankarn N, 2006] Согласно нашим данным у больных хроническим гепатитом В реже встречаются генотипы - 607АА и в частности генотип -607AA/-137CG, при этом увеличена частота встречаемости генотипа -607СС/-137СС, что отличается от данных по встречаемости генотипов у больных вирусным гепатитом В в азиатских популяциях. Возможно, что такое отличие во встречаемости генотипов у больных хроническим ВГВ в популяции Юго-Западной Сибири связано с изначальными генетическими различиями между популяциями Различия встречаемости генотипов у больных хроническим ВГВ в различных популяциях может бьггь связаны с тем, что во многих случаях наблюдается неравновесное сцепление негативных и протективных аллелей различных генов Причем для разных популяций могут наблюдаться различные комбинации таких сцепленных аллелей, при этом в сумме отрицательное влияние отдельных одиночных полиморфизмов может накладываться, как усиливая негативный эффект, так и нивелируя его

Полиморфизм генов цитокинов, в частности в промоторном регионе, может быть одним из механизмов, который участвует в формировании индивидуальной вариабельности уровня продукции белка При патологии этот феномен может играть

важную роль, поскольку цитокины являются ключевым фактором формирования эффективного иммунного ответа.

Изучение ассоциированности продукции ИЛ-18 в культуре МНК ПК с генотипом ИЛ-18.

Изучение ассоциированности продукции ИЛ-18 в культуре МНК ПК здоровых доноров с генотипом - 607 С->А ИЛ-18

Аллельные варианты промоторных участков генов цитокинов не влияют на аминокислотную последовательность белка, но могут приводить к изменению уровня продукции цитокина и, как следствие, выраженности иммунных реакций. Известные полиморфные варианты промотора гена ИЛ-18 -607С—>А и -137G-»C, расположенные в сайтах связывания для транскрипционных факторов CREB, (cAMP response-element binding protein) и H4TF-1 ядерного фактора, соответственно, могут влиять на экспрессию ИЛ-18 и приводить к изменению уровня его продукции [Giedraitis V, 2001].На следующем этапе было проведено исследование концентрации ИЛ-18 в кондиционных средах МНК ПК здоровых доноров. Средний уровень продукции ИЛ-18 составил для спонтанной продукции 48,07±3,96 пкг/мл, для ЛПС-стимулированной - 80,42±4,56 пкг/мл.

При сопоставлении уровня продукции ИЛ-18 МНК ПК здоровых доноров с вариантами генотипа ИЛ-18 в позиции - 607 получены следующие данные (Рисунок 1). 140l--- 120 -

□ ОС

аес

aGG

спонтанная стимулированная

Рис. 1 Ассоциированность полиморфного варианта промогорного участка гена ИЛ 18 в позиции -607А—>С с уровнем продукции ИЛ-18 МНК ПК (данные представлены в виде медианы и размаха квартилей) (п=143 <-»рмит-ш™=0,049).

спонтанная

стимулированная

Рис.2 Ассоциированность полиморфного варианта промогорного участка гена ИЛ 18 в позиции -137С->С с уровнем продукции ИЛ-18 МНК ПК (данные представлены в виде медианы и размаха квартилей) (п=143 <->рм™-иипг=0,049).

Показано статистически значимое увеличение уровня ЛПС-стимулированной продукции ИЛ-18 МНК ПК здоровых доноров несущих генотип СА по сравнению с генотипом СС в позиции -607 промотора гена ИЛ-18. Поскольку сопоставление средних величин продукции не всегда отражает реальный уровень продукции белка у каждого конкретного индивида, мы исследовали различные уровни продукции ИЛ-18 МНК ПК здоровых доноров в сопоставлении с генотипами промотора гена ИЛ-18.

При анализе частотных распределений генотипов дня различных уровней продукции ИЛ-18 все эмпирически наблюдаемые концентрации этого цитокина были подразделены на классы «низкой», «средней» и «высокой» величины продукции. В класс «средней» величины продукции ИЛ-18 были отнесены уровни концентраций внутри интервала значений 15% и 85% квантилей (3,5-93,5 пкг/мл) для спонтанной продукции ИЛ-18. В классы «низкой» и «высокой» величины продукции включались уровни продукции выходящие за пределы этих значений квантилей (Таблица 1). При исследовании частотных распределений генотипов ИЛ-18 в позиции -607 промотора гена ИЛ-18 показано статистически значимое увеличение частоты встречаемости аллеля А в

позиции - 607 промотора гена ИЛ-18 у лиц с высоким уровнем спонтанной продукции ИЛ-18

Таблица 1 Распределение частоты встречаемости генотипов промотора гена -607С/А ИЛ-18 и

Квантили уровней продукции ИЛ-18 Диапазон значений -607СС N -607AN N Р тмф

Спонтанная низкий (0-15%) 0-3,4 7 И 0,203

средний (15-85%) 3,5-95,3 44 57

высокий (85-100%) 95,4-138 5 19 0,024

ВСЕГО (ii=143> 56 87

Таким образом, показано увеличение частоты встречаемости носителей аллеля А среди доноров с высоким уровнем спонтанной продукции ИЛ-18 и статистически достоверное увеличение уровня ЛПС-стимулированной продукции ИЛ-18 ассоциированное с генотипом -607СА по сравнению с генотипом -607СС

Изучение ассоциированности продукции ИЛ'18 в культуре МНК ПК здоровых доноров с генотипом -1370-*С ИЛ-18

Далее уровень продукции ИЛ-18 был сопоставлен с полиморфными вариантами -137 С-К} промоторного участка гена ИЛ-18 (рисунок 2) Показан статистически значимо меньший уровень ЛПС-стимулированной продукции ИЛ-18 МНК ПК у лиц несущих генотип СС относительно лиц с генотипом вв в позиции -137 промотора гена ИЛ-18 Для дальнейшего исследования провели анализ частотных распределений генотипов для различных уровней продукции ИЛ-18, оценив ассоциированность частоты встречаемости изучаемых аллельных вариантов с разными уровнями продукции ИЛ-18 Результаты распределения представлены в Таблице 2

Таблица 2 Распределение частоты встречаемости генотипов промотора гена -1370/С ИЛ-18 и

Квантили уровней продукции ИЛ-18 Диапазон значений -137GG N -137CN N Р fisher

Стимулированная низкий (0-15%) 0-25,6 3 14 0,0098

средний (15-85%) 25,7-114,2 48 50

высокий (85-100%) 114,3-298,4 14 14 0.1445

ВСЕГО (п=143) 65 78

Показано статистически значимое увеличение частоты встречаемости аллеля С в позиции - 137 промотора гена ИЛ-18 у лиц с низким уровнем (уровень менее 25,6 пкг/мл) ЛПС-стимулированной продукции ИЛ-18, что согласуется с литературными данными, полученными в исследовании Arimitsu с соавторами [2006] Так, в частности, продемонстрировано, что у добровольцев с генотипом -137 GG была выше спонтанная и ЛПС-стимулированная продукция ИЛ-18 по сравнению с генотипом -137GC

Таким образом, показана сниженная ЛПС-стимулированная продукция ИЛ-18 у лиц с генотипом СС относительно доноров с генотипом GG в позиции -137 промотора гена ИЛ-18, так же наблюдается повышение частоты встречаемости доноров несущих аллель С в группе с низким уровнем стимулированной продукции ИЛ-18, т е аллель С в позиции -137 промотора гена ИЛ-18 ассоциирован с низким уровнем продукции ИЛ-18 МНК ПК

Изучение влияния генотипа промотора гена ИЛ-18 на уровень продукции ИЛ-18 в культуре МНК ПК

Оба изучаемых нами полиморфизма находятся в неравновесном сцеплении, что согласуется с данными Tiret с соавторами [2005], поэтому мы исследовали все возможные комбинации аллелей Показано, что наличие минорного генотипа -607CN /-137GN (по 607 гетерозиготы 16 из 19) ассоциировано с повышенной спонтанной продукцией ИЛ-18 в

сравнении с минорными генотипами -607АА/-137СЫ и -607СЫ/-137СС. Увеличение ЛПС-стимулированной продукции ИЛ-18 ассоциировано с минорным генотипом -607С1Ч'/-137СЫ в сравнении с -607СЫ/-137СС (Рис. 3).

Для генотипов промотора гена ИЛ-18 был показан следующий уровень спонтанной продукции белка ИЛ-18 МНК ПК: гомозиготами ССЛЗО и АА/СС 43,1±[16,2;65,8]; 54,4±[30,6;96,2] пкг/мл соответственно, стимулированная продукция ИЛ-18 73,6±[35,8;105,7], 69,7±[40,8; 102,2] пкг/мл соответственно, индекс стимуляции составил 63,6 и 17%, соответственно. У гетерозигот СА/СС, С А/СО, А А/ОС наблюдался следующий средний уровень спонтанной продукции белка ИЛ-18 МНК ПК: 18,9±[2;90,8], 32,4±[7,1;102,2] и 13,8+[10,6;34,0] пкг/мл, соответственно, уровень стимулированной продукции составляет 70,0±[25,4;85,4], 97,1±[44,3;129,2] и 58,4±[40,4;89,8] пкг/мл соответственно, индекс стимуляции составил 27,29, 100,3 и 286,0 %, соответственно, тогда как для генотипа ААЛЗО спонтанная и стимулированная продукция были 84,8 пкг/мл, индекс стимуляции равнялся 0%. Генотипам СС/СС, СА/ОС и ССЮС соответствуют следующие уровни продукции ИЛ-18: спонтанный 9,5±[9,5;36,6] пкг/мл, 44,2±[17,2;102,2] пкг/мл и 30,7±[5,9;101,0] пкг/мл, стимулированный 25,4±[3;79,9] пкг/мл, 81,1±[55,0;115,3] пкг/мл и 57,6±[47,9;78,0] пкг/мл, индекс стимуляции составил соответственно 80,1, 57,1 и 483,5% соответственно.

140'т----------------------- ----------------Рис. 3. Ассоциирован-

ность уровня продукции ИЛ-18 МНК ПК с полиморфными вариантами -607/-137 промотора гена ИЛ-18 (п=143) (данные

представлены в виде медианы

pg/ml

B-607CN/-1.37GN S -607АА/-137 GN U-6G7CN/-137CC

квартилей)

№■<0,05).

размаха

(^РМапп-

spontarieOus production

LPS-stimulated production

Таким образом, показана сниженная ЛПС-стимулированная продукция ИЛ-18 у лиц с генотипом СС относительно доноров с генотипом GG позиции -137 промотора гена ИЛ-18, так же показано повышение частоты встречаемости доноров несущих аллель С в группе с низким уровнем ЛПС-стимулированной продукции ИЛ-18. Показано статистически значимое увеличение уровня ЛПС-стимулированной продукции ИЛ-18 МНК ПК здоровых доноров несущих генотип СА по сравнению с генотипом СС в позиции -607. При исследовании частотных распределений генотипов ИЛ-18 в позиции -607 промотора гена ИЛ-18 показано увеличение частоты встречаемости носителей аллеля А среди лиц с высоким уровнем спонтанной продукции ИЛ-18.У больных хроническим гепатитом В статистически достоверно чаще встречается генотип -607СС/-137СС, ассоциированный со сниженной спонтанной и стимулированной продукцией ИЛ-18, и этот факт может негативно отражаться на функционировании всех пулов иммунокомпетентных клеток и, в частности на формировании противовирусного иммунного ответа.

Низкий уровень продукции ИЛ-18 может, в том числе, приводить и к ослаблению взаимодействия между ДК и Т-клетками, что наблюдается у пациентов с хроническим вирусным гепатитом В [Zheng B.J., 2005]. В то же время показана возможность индукции с помощью ДК специфических иммунных реакций in vitro, в частности противовирусных и противоопухолевых [Mohamadzadeh М, 2004]. Для «перепрограммирования» иммунных

реакций используют стимуляцию ДК различными антигенами и цитокинами [O'Neill D W, 2004] Поэтому мы предприняли попытку модулировать специфический иммунный ответ против антигена вирусного гепатита В с помощью цитотоксических клеток, полученных при культивировании совместно с антиген-презентирующими ДК и рекомбинантным ИЛ-18

Таблица 5 Ассоциация генотипа ИЛ-18 с уровнем спонтанной, стимулированной продукции и индексом стимуляции__

генотип остальная популяция

N спонтанная ЛПС- стимулированная индекс стимуляции спонтанная ЛПС- стииулированная индекс стимуляции

-607АА/. 137СС 5 75,3 [30 6101,0] 73,6 [35,8-105,7] 17,0* [-7,8-35,2] 31,6 [10,6-68,8] 74,0 [41-103,7] 80,1 [16,7-316-7]

-607АА/-137GC 18 13,8* [10,6-34,0] 58,4 [40,4-89,81 268,0 * [44,9-366,71 38,8 [12,6-83.9] 75,4 [41,0-106,71 58,6 [12Л-235Д1

-607АА/-137GG 1 84,1 84,1 0

-607СА/ ■ 137СС 8 18,9 [2-90,8] 70,0 [25,4-85,4] 27,29 [-25,722796,3] 34,1 [10,6-74,4] 74,7 [41,0-105,3] 76,9 [16,9-272Д]

-607СА/ -137GC 38 44,2 [17,2-101,0] 81,1 [55,0-115,61 57,1 [21,0-202,0] 30,6 [9,5-68,8] 72,7 [40,4-101,01 76,9 [11,9-331,8]

-607СА /-137GG 18 32,4 [7,1-102,2] 97,1 [44,3-129,21 100,3 [24,5-525,11 34,1 [10,6-65,8] 72,7 [40,4-103,01 63,6 [12,1-268,01

-607СС /-137СС 4 9,5* [9,5-36,6] 25,4* [3-79,9] 80,1 [-68,7542,51 34,1 [10,6-78,2] 74,7 [41,0-103,7] 70,3 [16,8-287,6]

-607СС/-137GC 6 30,7 [5,9-101,0] 57,6 [47,9-78,0] 483,5 [39,1-842,9] 34,1 [10,6-76,6] 74,7 [40,8-103,7] 63,7 [15,41333,5]

-607СС/ -137GG 46 45,2 [16,2-68,8] 69,7 [40,8-102,21 63,6 [6,3-180,1] 29,9 [9,5-84,8] 74,9 [41,0-105,71 83,5 [17 4-339,3]

Примечание '-достоверные различия по сравнению с основной популяцией (р Ма1Ш-Уитни<0,05). Данные представлены в виде медианы и размах квартилей (п-143)

Влияние рчЯП-18 на модуляцию специфического иммунного ответа с помощью ауталогичныхДК при хроническом вирусном гепатите В

Для модуляции специфического иммунного ответа против ВГВ использовались аутологичные ДК При использовании данного протокола в популяции ДК больных хроническим вирусным гепатитом В в процессе созревания статистически достоверно увеличивается количество CD83+, HLA-DR+, и дубль позитивных CD83+CD86+ и CD83+ HLA-DR+ клеток (Рис 4) При исследовании функциональных свойств незрелых ДК больных хроническим ВГВ было показано, что они эффективно захватывают антиген (FITC-dextran) Захват антигена статистически достоверно повышается с 6б,9±11,4 при +4°С до 241,0±43,6 при +37°С

Полученные нами незрелые ДК больных хроническим ВГВ способны эффективно захватывать антиген (FITC-dextran) При созревании на ДК статистически достоверно повышается экспрессия костимуляторных молекул CD83+, CD86+, HLA-DR ДК больных хроническим вирусным гепатитом В, полученные из прилипающей фракции МНК ПК являются функционально сохранными т vitro

Одним из перспективных методов лечения хронического вирусного гепатита В является введение ДК. В работе Tsai [2006], показано, что иммунный ответ Тх1 типа необходим для полного ответа на антивирусное лечение или для самовыздоровления

Одним из подходов к лечению хронического ВГВ является введение ДК презентирующих тот или иной антиген вируса. Показано, что введение активированных ДК презентирующих HBsAg ВГВ-трансгенным мышам вызывает сероконверсию и отсутствие генома вируса гепатита В в периферической крови [АкЬаг БМ, 1999]. При использовании незрелых ДК для вакцинации больных с хроническим вирусным гепатитом В происходит сероконверсия НВеА§ и снижение уровня ДНК ВГВ в периферической крови [АкЬаг БМ, 2005]. Однако такая вакцинация незрелыми ДК может быть неэффективной, поскольку антигены вирусного гепатита снижают эффективность созревания ДК и стимулируют выработку иммуносупрессорных цитохинов [Нуоёо N.. 2004]. Исходя из этих данных самым привлекательным подходом в лечении хронического вирусного гепатита В является использование для формирования направленного специфического иммунного ответа мононуклеарных клеток стимулированных с помощью аутологичных активированных ДК, обработанных специфическим антигеном. Использование в лечение больных хроническим вирусным гепатитом В ДК может быть ограничено их сниженной активностью, что может приводить к снижению эффективности терапии заболевания. Формирование иммунного ответа т уИго снижает вероятность активации иммунносупрессорных механизмов и влияния вирусных антигенов на его формирование. Таким образом, для лечения хронического вирусного гепатита В представляется более перспективным использование не ДК, а МНК стимулированных аутологичными ДК.

,-<У

4

/

А Л Л

1 В 1

V

Щ 1 1 г/ г

1 * И 1)

1 т 4

л

эдцсЕые

бсльныв

Рис.4 СО маркеры дендритных клеток больных хроническим вирусным гепатитом В. ДК получены по протоколу 1А (п=б) (данные представлены в виде медианы и размаха квартилей, *р»'аь,»>»<0.05).

Рис. 5 Уровень пролиферации МНК П К(А) здоровых доноров (п=19) и бальных хроническим ВГВ (п=20) и уровень секреции ИФН-у МНК ПК (Б). Параметры оценивались через 72 часа после совместного культивирования с ДК (48 часов) Для стимуляции использовался НВсАд в конечной концентрации 1 мкг/мл (данные представлены в виде медианы и размаха квартилей, <-»р<0,05, различия внутри группы

Для определения возможности модуляции специфического иммунного ответа с помощью полученных аутологичных активированных ДК мы исследовали их влияние на пролиферацию МНК ПК, продукцию цитокинов (ИНФ-у и ИЛ-4) МНК ПК методами ИФА и ЕЬКрй и количество МНК, экспрессирующих молекулы перфорина.

Известно, что персистенция вируса гепатита В развивается в результате подавления индукции и реализации иммунного ответа. Механизмами ускользания вируса из-под иммунного ответа являются: интеграция генома вируса в геном иммунокомпетентных клеток; изменение протективных эпитопов каждые 5-6 лет; истощение антивирусных Т-клонов; аутоагрессия против Т-клеток, экспрессирующих вирусные пептиды; блокирование представления собственных антигенов за счет снижения синтеза ФНОа; репликация вируса в органах, не подлежащих иммунному надзору; персистенция вируса в иммунокомпетентных клетках и разобщение всех клеток иммунной системы. В связи с чем иммунокомпетентные клетки больных вирусным

гепатитом являются функционально несостоятельными Для исследования возможности модуляции иммунного ответа аутологичными активированными ДК изучалась пролиферативная активность МНК ПК и продукция ими ИНФ-у после совместного культивирования со зрелыми ДК При сравнении пролиферативного потенциала МНК ПК здоровых доноров и больных хроническим ВГВ показано, достоверное снижение уровня спонтанной и стимулированной с помощью ДК пролиферации МНК у больных хроническим вирусным гепатитом В по сравнению со здоровыми донорами (Рис 5) Так же у больных хроническим вирусным гепатитом снижен по сравнению со здоровыми донорами уровень пролиферации МНК, сокультивированных с ДК, как в ответ на стимуляцию HbcAg, так и спонтанный Также у больных хроническим вирусным гепатитом В наблюдается сниженная продукция ИНФ-у МНК ПК после совместного культивирования с аутологичными активированными ДК и отсутствие статистически значимой стимуляции продукции в ответ на совместное культивирование в отличие от здоровых доноров (Рис 5)

Таким образом, показано что аутологичные активированные ДК больных хроническим вирусным гепатитом В в отличие от аутологичных активированных клеток здоровых доноров обладают сниженным стимуляторным потенциалом в отношении МНК ПК Сниженный стимуляторный потенциал ДК больных хроническим вирусным гепатитом В показан в работах многих исследователей [van der Molen R G, 2004, Duan XZ, 2003] Более того, показано, что между пациентами, отвечающими и неотвечающими на интерферонотерапшо отсутствуют различия в индексах стимуляции пролиферативного ответа с помощью HBcAg [Roy MJ, 2000] Для стимуляции и поддержания дифференцировки наивных Т клеток в Тх1 и снижения иммуносупрессорного влияния вируса мы использовали добавление рчИЛ-18 при сокультивировании ДК и МНК ПК ИЛ-18- ИНФ-у индуцирующий фактор, активирует иммунный ответ Тх1 типа Использование ИЛ-18 для направления иммунных реакций может стать перспективным подходом к лечения хронического вирусного гепатита В С другой стороны иммуносупрессию вызывают вирусные агенты персистирующие внутри иммунокомпетентных клеток, а рчИЛ-18 снижает репликацию вируса в клетках больных хроническим вирусным гепатитом В [Roy MJ, 2002] Исходя из этого можно предположить, что использование рчИЛ-18 может усилить формирование иммунного ответа т vitro, и направить его по пути Тх1

Поскольку известно, что ИЛ-18 способен стимулировать клеточный иммунный ответ Тх 1типа и продукцию ИФН-у, а так же то, что при хроническом ВГВ зачастую развивается анергия иммунокомпетенных клеток, мы исследовали возможность и эффективность использования рчИЛ-18 для модуляции противовирусного иммунного ответа с помощью дендритных клеток В качестве активатора функциональной активности МНК ПК и ДК мы использовали провоспалительный цитокин - рчИЛ-18 (40 нг/мл), добавленный при совместном культивировании клеток Как видно из Рисунка 6, наблюдается достоверное усиление пролиферативного ответа МНК ПК на HBcAg, при этом рчИЛ-18 достоверно более эффективно усиливает антигенстимулированную пролиферативную активность как МНК ПК, так и МНК ПК культивированных совместно с ДК по сравнению как с МНК ПК, так и МНК ПК, окультивированными с ДК

Таким образом, показано, что рчИЛ-18 усиливает пролиферативную реакцию МНК ПК, и, более того, в комбинации с ДК достоверно стимулирует пролиферацию МНК в ответ на антиген по сравнению с эффектами рчИЛ-18 и ДК по отдельности

Эффективность индукции специфического иммунного ответа оценивалась с помощью методики ELISpot, в которой тестируется количество ИФН-у-продуцирующих клеток. Среди цитокинов, ИФН- у - один из самых важных медиаторов иммунной системы, кроме того, этот фактор способен проявлять ингибирующий эффект в отношении репликации вируса [Farrar MF, 1993, Boehm U, 1997] Показано, что при

индукции специфического иммунного ответа у больных хроническим вирусным гепатитом В не наблюдается статистически значимого увеличения количества ИФЦ-у-продуцирующих клеток в ответ на совместное культивирование с ДК, презентирующими HbcAg, однако применение рчИЛ-18 при совместном культивировании МНК ПК и ДК достоверно увеличивает количество МНК ПК продуцирующих ИФН-у по сравнению как с МНК ПК, культивировавшимися в отсутствии ДК, так и после совместного культивирования МНК ПК и ДК или применения только одного рчИЛ-18. Кроме того, количество ИНФ-у продуцирующих клеток статистически значимо увеличивается в ответ на стимуляцию НЫ^ в группе МНК ПК сокультивированными с ДК в присутствии рчИЛ-18 (Рис. 7).

--------------------------------------------------------------. ^Поюнгатая ОНЬсог <д{

оооо --—-----(исгонгэннэя ОНЬсогА

8000

7000

6000 гр

•шп тЬ Г

.Р

1000 5—1Э № ! : Ь {; -

ГШ ,

| 400

£

♦ 200

■ НК-ДК (шлучешыа бвэНВсоИЦ

МНК*ДК МНК»Д<с1Ыв

ЫНК.ДК (лол^п^мльебм МВсо-^ц)

Рис.6 Влияние на пролиферацию МНК ПК больных хроническим вирусным гепатитом В ДК (протокол 1А). Совместное культивирование проводилось в течение 48 часов. Пролиферацию оценивали по включению 5Н-тимидина на 72 часах культивирования (п=16). (данные представлены в виде медианы и размаха квартилей, оо\М1кохоп<0.05)

Рис. 7. Влияние аутологичных активированных ДК и рИЛ-18 (40нг/мл) на количество ИНФ-у продуцирующих МНК ПК больных хроническим вирусным гепатитом В Совместное культивирование проводилось в течение 48 часов. Количество ИНФ-у продуцирующих клеток через 72 часа культивирования (п=17). (Данные представлены в виде среднего±ошибка среднего, Ор1уиь;хоп<0,05)

Так как ИЛ-18 может в том числе стимулировать и продукцию цитокинов Тх2 профиля, и в частности, продукцию ИЛ-4, было проведено исследование количества клеток, продуцирующих ИЛ-4 с помощью метода Е1Л8ро1. Показано, что ИЛ-18 и ДК как по отдельности, так и вместе не влияют как на количество клеток продуцирующих ИЛ-4, так и собственно на продукцию ИЛ-4 МНК ПК в ответ на НВсА§ (данные не представлены)

Таблица 4. Влияние на продукцию ИНФ-у МНК ПК больных хроническим ВГВ аутологичных активированных ДК. Совместное культивирование проводилось в течение 48 часов.

МНК МНК+1Ь-18 МНК+ДК (полученные без HBcoгAg) МНК+ДК МНК+ДК с 18

спонтанная 12,3 пг/мл [6,1;15,1] (21,7) 11,7 пг/мл и [4.3;18,61 (45,4) 13,8 пг/мл * [5,2;47,21 (57,2) 17,4 пг/мл * [7,3;45,7] (67,5) 16,8 пг/мл* [6,7,35,0] (57,9)

НЬсог 14,8 пг/мл # [9,9,18,5) (77,1) 15,5 пг/мл Н [6,6; 81,5] (99,0) 16,7 пг/мл № Р,6;742] (46,3) 16,7 пг/мл #,& [3,7,69,7) (107,0) 20,4 пг/мл *, & [2,9; 171,6) (138)

Данные представлены в виде медианы [размах квартилей] и (среднее). * достоверные отличия от МНК; достоверные отличия от" МНК +ДК+ИЛ18; &- достоверные отличия от спонтанного уровня (р\\^1кохоп<0,05)

Цитокины играют ключевую роль в защите против вирусных инфекций, как непосредственно, через ингибирование вирусной репликации, так и косвенно, через определение трафика развития протективного цитотоксического иммунного ответа, опосредованного Т хелперами 1 типа и продуцируемыми ими цитокинами. Профиль циркулирующих цитокинов при хроническом гепатите В связан с уровнем репликации вируса и активности заболевания печени [Вогкауа Н, 2000]. Для определения

направленности иммунных реакций мы исследовали продукцию ИНФ-у МНК ПК культивированных в присутствии ДК. Показано увеличение спонтанной и антигенстимулированной продукции ИНФ-у МНК ПК после совместного культивирования с аутологичными активированными ДК в присутствии рчИЛ-18 по сравнению с МНК ПК обработанных только рчИЛ-18 или сокультивированными с аутологичными ДК (Таб. 4).

Таким образом, показано, что присутсвие рчИЛ-18 при совместном культивировании МНК ПК с аутологичными активированными ДК смещает профиль цитокшюв в сторону медиаторов Тх-1 типа.

Цитотоксические Т лимфоциты играют важную роль в контроле вирусной инфекции, особенно в случае инфицирования нецитопатическими вирусами. Разрушение ЦТЛ клеток мишеней происходит, прежде всего, за счет экзоцитоза гранул содержащих перфорин и гранзимы [Kagi D., 1994; Walsh, С. М., 1994]. Показано, что перфорин-зависимое разрушение инфицированных гепатоцитов играет важную роль в остром вирусном гепатите у лесного североамериканского сурка [Hodgson PD, 1999]. Показано повышение частоты перфорин+С04+ клеток, но не перфорин+С08+ клеток у пациентов с повышенным уровнем ACT. Концентрация перфорин+С04+ в МНК ПК больных хроническим вирусным гепатитом колеблется от 1 до 40%. Присутствие таких клеток в периферической крови ассоциировано с тяжестью течения заболевания и стадией развития цирроза печени [Asian N., 2006]. Косвенным подтверждением необходимости использования ИЛ-18 может служить то, что культивицация МНК с HbcAg и рчИЛ-18 усиливает цитотоксический потенциал этих клеток, против клеточной линии HepG2.2.15 трансфецированной геномом вируса гепатита В [Asian N., 2004]. Протективный иммунный ответ включает в себя разрушение зараженных вирусом клеток. Для определения потенциальной цитотоксической активности лимфоцитов устанавливалось содержание клеток, экспрессирующих внутриклеточный белок перфорин. Показано, что HBcAg обладает достоверно более выраженным индуцирующим эффектом на уровень экспрессии перфориновых гранул в МНК ПК. МНК ПК после совместного культивирования показывают тенденцию к увеличению уровня экспрессии перфорина, при этом добавление рчИЛ-18 к совместному культивированию МНК ПК и аутологичных активированных ДК приводит к достоверно значимому увеличению уровня экспрессии перфорина, как одними МНК ПК, так и в ответ на HBcAg (Рис 8).

-4-■«-

А- -►

г:

-

II ■ : . .;.. : У

-

т

□спонтанная BHbCQf Aq

Рис 8. Влияние на экспрессию перфорина МНК ПК больных хроническим ВГВ аутологичных активированных ДК полученных по протоколу 1А. Совместное

культивирование проводилось в течение 48 часов. Экспрессию перфорина определялась

методом проточной цитометрин через 72 часа культивирования (п=16) (данные представлены в виде среднего и ошибки среднего, ор,<0,05)

МНК МНК«1Ыв МНК»ДК0 МНК+ДК МНК»ДКС1|.-

16

Таким образом, показано, что применение рчИЛ-18 при совместном культивировании МНК ПК и аутологичных активированных ДК обладает достоверно более выраженным индуцирующим эффектом на уровень экспрессии перфориновых гранул МНК ПК.

В результате проведенных исследований показано, что использование ДК для стимуляции иммунного ответа у больных хроническим вирусным гепатитом В не приводит к эффективной активации мононуклеарных клеток, что выражается в отсутствии эффекта стимуляции ДК уровня пролиферации МНК, продукции ими ИНФ-у, а также увеличения количества клеток содержащих гранулы перфорина и количества ИФН-у продуцирующих клеток, что указывает на неспособность HBcAg активированных ДК к стимуляции клеточных иммунных реакций В то же время использование таких клеток у здоровых доноров приводит к активации МНК, что проявляется в усилении их пролиферативного потенциала, стимуляции уровня продукции ИНФ-у Совместная культивация зрелых ДК, презентирующих НВсА§ и МНК ПК больных хроническим ВГВ в присутствии ИЛ-18 способствует стимуляции антиген-специфических клеточных реакций, что подтверждается увеличением количества МНК ПК продуцирующих ИФН-у и уровня продукции ИФН-у, количества лимфоцитов экспрессирующих перфориновые гранулы и увеличением пролиферативного потенциала МНК ПК

ВЫВОДЫ

1 При изучении распределения генотипов промотора гена ИЛ-18 среди здоровых доноров Юго-Западной Сибири и больных хроническим ВГВ установлено, что больные хроническим ВГВ характеризуются снижением частоты встречаемости генотипов -607АА и -607АА/-137СС и увеличением частоты встречаемости генотипа -607СС/-137СС по сравнению со здоровыми донорами, что указывает на роль генетического фактора в патогенезе вирусного гепатита В

2 Показана сниженная ЛПС-стимулированная продукция ИЛ-18 у лиц с генотипом СС относительно доноров с генотипом йО позиции -137 промотора гена ИЛ-18, так же показано повышение частоты встречаемости доноров несущих аллель С в группе с низким уровнем ЛПС-стимулированной продукции ИЛ-18, что указывает на взаимосвязь аллельного полиморфизма промотора гена ИЛ-18 в позиции -137 с уровнем его продукции

3 Показано статистически значимое увеличение уровня ЛПС-стимулированной продукции ИЛ-18 МНК ПК здоровых доноров несущих генотип СА по сравнению с генотипом СС в позиции -607 При исследовании частотных распределений генотипов ИЛ-18 в позиции -607 промотора гена ИЛ-18 показано увеличение частоты встречаемости носителей аллеля А среди лиц с высоким уровнем спонтанной продукции ИЛ-18, что указывает на взаимосвязь аллельного полиморфизма промотора гена ИЛ-18 в позиции -607 с уровнем его продукции

4 Повышенная спонтанная и ЛПС-стимулированная продукция ИЛ-18 ассоциирована с минорным генотипом -607СЫ/-137СЫ и пониженная спонтанная продукция ИЛ-18 ассоциирована с минорными генотипами -607ССУ-137СС и -607АА/-137СС, что указывает на взаимосвязь аллельного полиморфизма промотора гена ИЛ-18 в позиции -607 и -137 с уровнем его продукции

5 ДК больных хроническим вирусным гепатитом В неспособны индуцировать статистически значимое увеличение уровня продукции ИФН-у МНК ПК, а также количества клеток содержащих гранулы перфорина и количества ИФН-у продуцирующих клеток, что свидетельствует об их функциональной несостоятельности в отношении формирования клеточных иммунных реакций

6 Совместная культивация зрелых ДК, презентирующих НВсА§ и МНК ПК больных хроническим ВГВ в присутствии ИЛ-18 способствует стимуляции антиген-специфических клеточных реакций, что подтверждается увеличением количества МНК ПК продуцирующих ИФН-у и уровня продукции ИФН-у, количества лимфоцитов

экспрессирующих перфориновые гранулы и увеличением пролиферативного потенциала МНКПК

7 ИЛ-18 является патогенетическим фактором при хроническом вирусном гепатите В, так как при этой патологии повышена частота встречаемости генотипа промотора гена ИЛ-18 ассоциированная с низким уровнем спонтанной и стимулированной продукции ИЛ-18 (-607СС/-137СС), а добавление ИЛ-18 при сокультивировании зрелых ДК, презеитирующих HBcAg и МНК ПК больных хроническим вирусным гепатитом В восстанавливает способность к формированию антиген-специфических клеточных иммунных реакций

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ СОИСКАТЕЛЯ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1 Сенников С В, Жеребцова Н О, Хрипко О П, Шевченко 10 А, Якушенко Е В, Облеухова И А, Гончаров М А, Романов В В, Пронкина Н В, Кожевников В С, Сизиков А Э, Бровкина Г И, Толоконская Н П, Позднякова Л Л, Красильникова И В, Козлов В А Модуляция специфического иммунного ответа аутологичными активированными дендритными клетками т vitro // Материалы Московской международной конференции «Биотехнология и медицина», 14-17 марта 2006 — стр 141

2 Якушенко Е В , Хрипко О П, Шевченко Ю А, Пронкина Н В, Красильникова И В, Романов В В, Сенников С В, Козлов В А Модуляция противоинфекционного иммунного ответа аутологичными активированными дендритными клетками при гепатите и туберкулезе легких in vitroll Russian Journal of Immunology - 2006 - v 9, suppl 3 - p 138 Материалы Российской научно-практической конференции «Современные технологии в иммунологии иммунодиагностика и иммунотерапия»

3 Хрипко О П, Шевченко Ю А, Якушенко Е В, Пронкина Н В, Кожевников В С, Сенников С В, Козлов В А Индукция иммунного ответа против Hbcorag т vitro с помощью аутологичных активированных дендритных клеток// Иммунология Урала-№1(5)-2006 стр 32-33

4 Хрипко О П , Сенникова Н С Лопатникова Ю А, Хрипко Ю И, Филиппенко М Л, Якушенко Е В , Сенников С В, Козлов В А Аллельный полиморфизм гена ИЛ-18 и уровень его продукция мононукпеарными клетками здоровых доноров Юго-Западной Сибири //Вестник Уральской медицинской академической науки 2006, №3,1(14), стр 266-269

5 Хрипко О П, Якушенко Е В, Красильникова И В, Позднякова Л Л, Толоконская НП, Сенников С В Козлов В А Использование интерлейкина-18 для генерации цитотоксических мононуклеарных клеток больных гепатитом в in vitro //3rd International Confer Basic Science for Medicine - September 2-8, 2007, p 91

6 Хрипко О П , Сенникова Н С Лопатникова Ю А, Хрипко Ю И, Филиппенко М Л, Якушенко Е В, Сенников С В, Козлов В А Аллельный полиморфизм гена ИЛ-18 и уровень его продукции мононуклеарными клетками здоровых доноров Юго-Западной Сибири// Мед иммунология, 2007, Т 9, № 2-3, с 314-315

7 Хрипко О П, Якушенко Е В, Сенников С В, Пронкина Н В, Красильникова И В, Позднякова Л Л, Толоконская Н П , Кожевников В С , Козлов В А Модуляция противовирусного иммунного ответа аутологичными активированными дендритными клетками при гепатите В in vitro// Омский научный вестник -2007 JV» 3, приложение 2, с 376-8

8 Khnpko О Р, Senmkova N S , Lopatnikova Y А, Khripko Y I, Filipenko M L, Yakushenko E V, Kozlov V A, Sennikov S V Allele polymorphism of IL-18 gene and level its production by mononuclear cells of healthy donors of Southwest Siberia// IMMUNORI02007 13th International Congress of Immunology, Rio de Janeiro, 2007 -P 98

9 Сенникова Н С, Хрипко О П, Лопатникова Ю А, Хрипко Ю И., Филиппенко МЛ, Якушенко Е В, Козлов В А, Сенников С В Влияние аллельного полиморфизма промотора гена интерлсйкина-18 на уровень его продукции моионуклеарными клетками// Российский иммунологический журнал - 2008 - Т 2(11), №

10 Якушенко Е В , Шевченко Ю А , Хрипко О П, Жеребцова Н О , Облсухова И А, Силков А Н Сенников С В , Козлов В А Методические подходы к оценке эффективности генерации дендритных клеток и модуляции специфического иммунного ответа// Российский иммунологический журнал - 2008 - Т 2( 11), № 2-3 -С 126

Отпечатано в типографии Новосибирского государственного технического университета 630092, г.Новосибирск, пр. К.Маркса, 20, тел. 346-08-57 формат 60x84/16, объем 1.25 п.л., тираж 100 экз., заказ № 314 подписано в печать 29.09.08г.

2-3 -С 136

Вирусный гепатит В - инфекция, широко распространенная в человеческой популяции. Часто она протекает бессимптомно и оканчивается без неблагоприятных последствий. В ряде случаев инфекция проявляется болезнью, которая может протекать тяжело и даже переходить в хроническую форму. Согласно данным мировой статистики, гепатит В вирусная инфекция, прежде всего за счет хронических форм, входит в первые 10 причин смертности населения. В мире насчитывается примерно 350 миллионов человек-носителей вируса гепатита В (ВГВ), из которых от заболеваний, связанных с инфекцией, умирает примерно 0,5-1 млн. человек в год [145]. Активный хронический^ вирусный гепатит В- это*заболевание, проблема лечения которого не решена.

Вирусный гепатит можно^ отнести к числу социальных болезней, возникновение которых связано с условиями жизни населения. В связи со способами передачи вируса, причинами эпидемиологического неблагополучия являются- ухудшение социально-экономических условий, снижение уровня жизни населения, рост числа лиц, принимающих наркотики, рождение детей от зараженных вирусом матерей, другими причинами заболевания хроническим вирусным гепатитом являются множественные инвазивные медицинские манипуляции и гемотрансфузии. Вирусный гепатит В у взрослых чаще всего характеризуется острым течением, заканчивающимся в 80-90% случаев спонтанным выздоровлением; в случае заражения в детском возрасте, особенно в случае интранатального инфицирования, болезнь приобретает хроническое течение в 90% случаев [200].

Развитие вирусного гепатита В с переходом в хроническую форму зависит от особенностей формирования иммунного ответа [150]. К факторам риска развития хронической инфекции относят факторы, ухудшающие состояние иммунной системы, такие как ВИЧ-инфекция, иммуносупрессивная терапия, диабет, алкоголизм, а также генетическая предрасположенность.

В стандартную терапию хронического вирусного гепатита входит применение интерферонов и противовирусных препаратов. Такая терапия часто остается неэффективной, поэтому необходим поиск новых подходов в лечении. Химиотерапия некоторыми противовирусными средствами приводит к развитию лекарственно-устойчивых штаммов вируса [143] и поэтому становится неэффективной, кроме того, большинство противовирусных средств обладает выраженными побочными эффектами, в частности, гепатотоксиче-ским действием. В настоящее время развиваются новые подходы к лечению этого заболевания, связанные с использованием возможностей собственной иммунной системы и их возможной модуляции. Протективный иммунный ответ в течение вирусного гепатита В связан с индукцией клеточного звена иммунной системы и реализуется посредством Т хелперов 1 типа [50]. Важное значение в патогенезе хронического вирусного гепатита В принимают цитокины,, такие как ИНФ-а, ИНФ-у, ИЛ-1, ФНО-а и, в частности, ИЛ-18. ИЛ-18 - плейотропный цитокин, продуцирующийся многими типами клеток, главным образом, активированными моноцитами и дендритными клетками [168], который участвует в формировании врожденного и приобретенного иммунных ответов [61]. Профиль циркулирующих цитокинов при хроническом вирусном гепатите В связан с уровнем репликации вируса и степенью повреждения печени [31]. Было показано, что ИЛ-18 ингибирует репликацию ВГВ в печени трансгенных мышей [149]. При исследовании нецитолитиче-ских механизмов элиминации вируса показано, что некоторые из ИФН- у -индуцирующих цитокинов, в частности ИЛ-18 [132]1, демонстрируют возможность ингибирования репликации ВГВ. С другой стороны, повышение уровня эндогенного ИЛ-18 при хронических заболеваниях печени связано с активацией механизмов иммунного повреждения печени, опосредованного через Fas лиганд [224]. У пациентов с хроническим вирусным гепатитом В снижена продукция ИНФ-у и ИЛ-18 мононуклеарными клетками периферической крови. Снижение продукции цитокинов может быть связано с генетическими механизмами. В функционально-активных участках промотора гена

ИЛ-18 обнаружено несколько- одиночных нуклеотидных полиморфизмов [80]i Эти* полиморфизмы, находящиеся в. позициях -607С—»А и -137G—»С, могут влиять на уровень продукции ИЛ-18 и вероятность развития хронического течения вирусного гепатита В.

Активность адаптивного звена иммунной системы в значительной степени зависит от представления антигена Т клеткам и их направленной дифференцировки. Представление антигена и- определение типа иммунного ответа осуществляется антиген-презентирующими клетками, в частности, дендритными клетками (ДК) [2]. ДК являются профессиональными антиген-презентирующими клетками и обладают специальными механизмами захвата и представления, антигена Т-клеткам. Направленность иммунных реакций определяется-профилем-цитокинов продуцирующихся ДК. В > настоящее время активно исследуется!возможность индукциих помощью дендритных клеток специфических иммунных реакций, как in-vitro, так и-in vivo [163; 183, 199].

Таким образом, исходя из роли ИЛ-18, ДК и генетических факторов в-патогенезе хронического вирусного гепатита В и, с„другой-стороны, возможности их использования- в качестве иммунотерапии заболеваний, опосредованных поражением иммунной системы, представлялось актуальным и значимым исследовать ассоциированность определенного полиморфного варианта промотора гена- ИЛ-18 с развитием хронического вирусного гепатита В и уровнем продукции ИЛ-18, а-так же влияние антиген специфических дендритных клеток и ИЛ-18 на функциональные свойства мононуклеарных клеток периферической крови больных хроническим вирусным гепатитом В in vitro.

Цель работы:

Исследовать ассоциацию полиморфизма промотора гена ИЛ-18 с хроническим вирусным гепатитом В и возможность модуляции НВс антиген специфического иммунного ответа с помощью аутологичных дендритных клеток и интерлейкина-18 in vitro.

В связи с поставленной целью предстояло решить следующие задачи:

1. Исследовать частоту встречаемости генотипов промотора гена ИЛ-18 в позициях -607С-»А и -137G—»С у больных хроническим вирусным гепатитом В и здоровых доноров Юго-Западной Сибири.

2. Изучить влияние полиморфных вариантов -607С—»А и -137G—»С промотора гена ИЛ-18 на уровень продукции ИЛ-18 МНК ПК

3. Исследовать влияние HBcAg индуцированных дендритных клеток и ИЛ-18 на пролиферативную активность, продукцию цитокинов и экспрессию перфорина МНК периферической крови.

Научная новизна работы.

Впервые определена частота встречаемости генетических вариантов промотора гена ИЛ-18 у здоровых доноров Юго-Западной Сибири и показана связь между генотипами промотора гена ИЛ-18 в точках -607С-»А и -137G—>С и уровнем его продукции мононуклеарными клетками периферической крови.

Впервые определена частота встречаемости генотипов промотора гена ИЛ-18 в точках -607С-»А и -137G—»С у больных хроническим вирусным гепатитом В в популяции Юго-Западной Сибири и показано увеличение частоты встречаемости у больных аллелей, ассоциированных с низкой продукцией белка.

Впервые показана возможность применения ИЛ-18 для регуляции взаимодействия иммунокомпетентных клеток и формирования направленного клеточного иммунного ответа при хроническом вирусном гепатите В in vitro.

Теоретическая и практическая значимость работы

Показана ассоциация аллеля С в позиции -137 промотора гена ИЛ-18 с низким уровнем ЛПС-стимулированной продукции ИЛ-18. Показано статистически значимое увеличение уровня ЛПС-стимулированной продукции ИЛ-18 МНК ПК здоровых доноров несущих генотип СА по сравнению с генотипом СС в позиции -607. При исследовании частотных распределений генотипов ИЛ-18 в позиции -607 промотора гена ИЛ-18 показано увеличение частоты встречаемости носителей аллеля А среди лиц с высоким уровнем спонтанной продукции ИЛ-18. Полученные результаты демонстрируют увеличение частоты встречаемости генотипов с низким уровнем продукции белка среди больных хроническим вирусным гепатитом В.

Полученные результаты расширяют представления об иммунорегуля-торном потенциале дендритных клеток моноцитарного происхождения при хроническом вирусном гепатите В, вносят существенный вклад в понимание механизмов элиминации вируса гепатита В, демонстрируют возможность, влияния цитокинов и антигенов на направленность противоинфекционного иммунного ответа.

Разработанный способ модуляции противовирусного клеточного» иммунного ответа с помощью мононуклеарных клеток, активированных при помощи антиген специфических аутологичных дендритных клеток и ИЛ-18, может быть использован в качестве подхода к лечению больных хроническим вирусным гепатитом В. Основные положения, выносимые на защиту

1. Полиморфные варианты -607С->А и -137G->C промотора гена ИЛ-18 ассоциированы с различным уровнем продукции ИЛ-18 мононуклеар-ными клетками периферической крови.

2. ДК, нагруженные HbcAg, в присутствии рчИЛ-18 эффективно стимулируют пролиферативный потенциал, продукцию IFN-y и индуцируют увеличение количества перфорин-содержащих клеток в культурах аутологичных мононуклеарных клеток больных хроническим вирусным гепатитом В.

Апробация материалов диссертации

Материалы диссертации доложены и обсуждены на:

1. Московской международной конференции «Биотехнология и медицина» (Москва, 2006)

2. Российской научно-практической конференции «Современные технологии в иммунологии: иммунодиагностика и иммунотерапия» (Курск, 2006)

3. III Международная конференции "Фундаментальные науки - медицине" (Новосибирск, 2007)

4. Межрегиональной научно-практической конференции «Дни иммунологии в Сибири» (Омск, 2007)

5. Семинарах группы лаборатории молекулярной иммунологии ГУ НИИ" КИ СО РАМН (Новосибирск, 2006, 2007)

6. Семинаре научного отдела ГУ НИИ КИ СО РАМН (Новосибирск, 2007)

7. Объедененный иммунологический форум. (Санкт-Петербург, 2008) Публикации

По теме диссертации опубликовано 10 работ, в том числе 1 статья в журнале, рекомендованном ВАК для публикации результатов исследований диссертации на соискание ученой степени кандидата наук.

Самостоятельность выполненной работы.

Результаты, представленные в данной работе, получены лично автором на базе лаборатории молекулярной иммунологии ГУ НИИ КИ СО РАМН. Большую признательность автор выражает научному руководителю работы профессору, д.м.н. С.В. Сенникова за подробное конструктивное обсуждение полученных результатов, а также всем сотрудникам лаборатории молекулярной иммунологии за благожелательное отношение в ходе выполнения работы.

Большую признательность автор выражает сотрудникам лаборатории профессора, д.м.н. Кожевникова B.C. за доброжелательное отношение и помощь при получении данных с помощью прибора FACSCalibur, сотрудникам группы фармакогеномики НИИ ХБиФМ СО РАН и лично к.б.н Филипенко M.JL за доброжелательное отношение и помощь в генотипировании выборки, а также сотрудникам 8 отделения МИКБ№1 г. Новосибирска за помощь в формировании выборки пациентов, больных хроническим вирусным гепатитом В.

выводы

1. При изучении распределения генотипов промотора гена ИЛ-18 среди здоровых доноров Юго-Западной Сибири и больных хроническим ВГВ установлено, что больные хроническим ВГВ характеризуются снижением частоты встречаемости генотипов -607АА и -607AA/-137CG и увеличением частоты встречаемости генотипа -607СС/-137СС по сравнению со здоровыми донорами, что указывает на роль генетического фактора в патогенезе вирусного гепатита В.

2. Показана сниженная ЛПС-стимулированная продукция ИЛ-18 у лиц с генотипом СС относительно доноров с генотипом GG позиции -137 промотора гена ИЛ-18, так же показано повышение частоты встречаемости доноров несущих аллель С в группе с низким уровнем ЛПС-стимулированной продукции ИЛ-18, что указывает на взаимосвязь ал-лельного полиморфизма промотора гена ИЛ-18 в позиции -137 с уровнем его продукции.

3. Показано статистически значимое увеличение уровня ЛПС-стимулированной продукции ИЛ-18 МНК ПК здоровых доноров несущих генотип С А по сравнению с генотипом СС в позиции -607. При исследовании частотных распределений генотипов ИЛ-18 в позиции -607 промотора гена ИЛ-18 показано увеличение частоты встречаемости носителей аллеля А среди лиц с высоким уровнем спонтанной продукции ИЛ-18, что указывает на взаимосвязь аллельного полиморфизма промотора гена ИЛ-18 в позиции -607 с уровнем его продукции.

4. Повышенная спонтанная и ЛПС-стимулированная продукция ИЛ-18 ассоциирована с минорным генотипом -607CN/-137GN и пониженная спонтанная продукция ИЛ-18 ассоциирована с минорными генотипами -607СС/-137СС и -607AA/-137GC, что указывает на взаимосвязь аллельного полиморфизма промотора гена ИЛ-18 в позиции -607 и - 137 с уровнем его продукции.

5. ДК больных хроническим вирусным гепатитом В неспособны индуцировать статистически значимое увеличение уровня продукции ИФН-у МНК ПК, а также количества клеток содержащих гранулы перфорина и количества ИФН-у продуцирующих клеток, что свидетельствует об их функциональной несостоятельности в отношении формирования клеточных иммунных реакций.

6. Совместная культивация зрелых ДК, презентирующих HBcAg и МНК ПК больных хроническим ВГВ в присутствии ИЛ-18 способствует стимуляции антиген-специфических клеточных реакций, что подтверждается увеличением количества МНК ПК продуцирующих ИФН-у и уровня продукции ИФН-у, количества лимфоцитов экспрессирующих перфориновые гранулы и увеличением пролиферативного потенциала МНК ПК.

7. ИЛ-18 является патогенетическим фактором при хроническом вирусном гепатите В, так как при этой патологии повышена частота встречаемости генотипа промотора гена ИЛ-18 ассоциированная с низким уровнем спонтанной и стимулированной продукции ИЛ-18 (-607СС/-137СС), а добавление ИЛ-18 при сокультивировании зрелых ДК, презентирующих HBcAg и МНК ПК больных хроническим вирусным гепатитом В восстанавливает способность к формированию антиген-специфических клеточных иммунных реакций.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Обобщая полученные результаты, можно заключить следующее: в результате проведенных исследований продемонстрирована связь продукции ИЛ-18 с генотипом промотора гена ИЛ-18. Показано изменение частоты встречаемости генотипов промотора гена ИЛ-18 у больных хроническим вирусным гепатитом В. У пациентов достоверно ниже встречается генотип — 607АА связанный с низким спонтанным уровнем продукции ИЛ-18, но нормальным стимулированным; и повышение частоты встречаемости генотипа связанного с пониженным спонтанным и ЛПС-стимулированным уровнем продукции ИЛ-18

В результате проведенных исследований модифицирован протокол получения функционально активных зрелых дендритных клеток, презентирующих HBcAg. Полученные зрелые дендритные клетки больных хроническим вирусным гепатитом В обладают необходимыми функциональными и фено-типическими характеристиками в соответствии со стадией развития. Незрелые ДК способны эффективно захватывать антиген. При созревании на ДК увеличивается экспрессия поверхностных маркеров и костимуляторных молекул CD 83, CD 86, HLA-DR.

Зрелые ДК больных хроническим вирусным гепатитом В в отличие от ДК здоровых доноров не способны активировать функциональную активность мононуклеарных клеток периферической крови больных хроническим ВГВ, в частности увеличивать продукцию ИНФ-у.

Поскольку у больных хроническим вирусным гепатитом В повышена частота встречаемости генотипа промотора гена ИЛ-18 ассоциированная с низким уровнем продукции ИЛ-18, имеются все основания полагать, что использование мононуклеарных клеток, активированных дендритными клетками в присутствии рчИЛ-18 может быть эффективным подходом к восстановлению специфического иммунного ответа in vitro у больных хроническим вирусным гепатитом В.

РчИЛ-18 влияет на силу и направленность иммунных реакций индуцируемых аутологичными активированными ДК больных хроническим ВГВ, увеличивая количество МНК ПК продуцирующих ИФН-у после совместного культивирования с ДК и уровень продукции ИНФ-у, таким образом, смещая профиль продукции цитокинов в сторону Тх-1. Применение рчИЛ-18 при совместном культивировании также вызывает увеличение пролиферативного потенциала МНК ПК больных хроническим вирусным гепатитом В, а так же усиливает уровень экспрессии перфориновых гранул МНК ПК.

На основании проведенных исследований можно заключить, что уровень продукции ИЛ-18 является патогенетическим фактором при хроническом вирусном гепатите В, так как при этой патологии повышена частота встречаемости генотипа с низким уровнем спонтанной и стимулированной продукции ИЛ-18 (-607СС/-137СС), а добавление ИЛ-18 при сокультивиро-вании зрелых ДК, презентирующих HBcAg и МНК ПК больных хроническим вирусным гепатитом В восстанавливает способность к формированию антиген-специфических клеточных иммунных реакций.