Автореферат и диссертация по медицине (14.00.40) на тему:Активность теломеразы при раке предстательной железы

На правах рукописи

ПОЛЯКОВСКИЙ КОНСТАНТИН АЛЕКСАНДРОВИЧ

АКТИВНОСТЬ ТЕЛОМЕРАЗЫ ПРИ РАКЕ ПРЕДСТАТЕЛЬНОЙ ЖЕЛЕЗЫ

14 00 40 - урология и 03 00 04 - биохимия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Ои-э

Москва - 2007

003176166

Работа выполнена в Московской медицинской академии им И М Сеченова

Заслуженный деятель науки РФ, НАУЧНЫЕ РУКОВОДИТЕЛИ член-корр РАМН, профессор

Юрий Геннадьевич Аляев

Член-корр РАЕН, лауреат государственной премии СССР, профессор Евгений Гаврилович Зезеров

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ Доктор медицинских наук, профессор

Андрей Дмитриевич Каприн

Доктор медицинских наук, доцент Петр Заурбекович Хасигов

ВЕДУЩАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ: ГОУ ВПО «Московский государственный медико-стоматологический университет РОСЗДРАВА»

Защита диссертации состоится «19» ноября 2007 г в 13 00 на заседании диссертационного Совета Д 208 040 11 при Московской медицинской академии им И М Сеченова по адресу 119992 г Москва, ул Трубецкая, д 8, стр2

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ММА им И М Сеченова по адресу 117998 г Москва, Нахимовский проспект, д 49

Автореферат разослан «_»_ 200_г

Ученый секретарь Диссертационного Совета, доктор медицинских наук, профессор

Тельпухов Владимир Иванович

Актуальность темы

Рак предстательной железы (РПЖ) является наиболее распространенной формой рака среди мужчин и занимает второе место в структуре онкологической смертности мужского населения европейских стран и США Общепринятым маркером рака предстательной железы является простатспецифический антиген (ПСА) благодаря его высокой чувствительности и низкой стоимости Однако, несмотря на высокую чувствительность, низкая специфичность ПСА остается повсеместной проблемой Ложное повышение уровня ПСА наблюдается при таких распространенных заболеваниях как хронический простатит и доброкачественная гиперплазия предстательной железы (ДГП) [Гориловский Л М , 1998, БаЬоп Б Ь , 1989] В результате у пациентов с уровнем ПСА от 4 до 10 нг/мл (так называемая «серая зона шкалы») позитивная предсказательная ценность ПСА в выявлении рака не превышает 25% [Пушкарь Д Ю , 2003, Матвеев Б П , 1991] Столь низкая специфичность приводит к большому количеству ненужных биопсий простаты В то же время все более частой гистологической находкой становится простатическая интраэпи-телиальная неоплазия (ПИН), относящаяся к разряду дисплазий эпителия Ряд авторов считают ПИН «предраком» и настаивают на выполнении повторных биопсий [Мазо Е Б , 2001], другие относят ее к разряду фоновых изменений [Гориловский Л М , 2003] Так или иначе, лечебная тактика в отношении ПИН до конца не определена Один из путей решения этой проблемы заключается в поиске новых высокоспецифичных маркеров

Одним из таких маркеров является фермент теломераза, высокая активность которого наблюдается в большинстве злокачественных опухолей По данным литературы при РПЖ активность теломеразы (AT) выявлена в 47 - 92% [Chieco Р , 2001], а при наличии ПИН в 16% - 73% наблюдений [Koeneman К S , 1998] При ДГП и в нормальной ткани простаты теломераза активна до 10,5% наблюдений, причем уровень ее активности существенно ниже, чем таковой в раковых клетках [Kallakury В V , 1997]

Наличие активности теломеразы у пациентов с ПИН и ДГП большинство авторов объясняют ранней стадией злокачественной трансформации эпителия простаты, не определяемой при гистологическом исследовании [Koeneman К S , 1998, Lin Y , 1998] Однако ни в одной из существующих работ не проводилось длительного наблюдения за этой категорией больных, результаты которого могли бы подтвердить или опровергнуть вышеуказанное предположение

В большинстве зарубежных работ для определения AT применялся стандартный

изотопный метод TRAP (Telomenc Repeat Amplification Piotocol) [Kim N W , 1994] По-Ч

мимо высокой стоимости, данный метод требует использования меченых радиоизотоп., ми нуклеотидов, что существенно затрудняет его внедрение в широкую клиническую

РПЖ

практику В лаборатории молекулярной биологии НИИ медицинской экологии департамента здравоохранения г Москвы разработан модифицированный неизотопный метод TRAP, при котором для оценки продуктов реакции вместо меченых нуклеотидов используется высокочувствительный краситель Sybr Gold [Глухов АИ, 1999] Испытание модифицированного метода на клеточных линиях андрогензависимого рака простаты LNCaP продемонстрировало сопоставимые со стандартным методом TRAP результаты Однако остается неясным, можно ли применять модифицированный неизотопный метод для работы с образцами ткани простаты

Отсутствие достаточных сведений по вышеуказанным проблемам явилось основанием для проведения собственного исследования

Цель работы- оценить возможность использования неизотопного метода TRAP для определения активности теломеразы в ткани предстательной железы и улучшить результаты диагностики рака предстательной железы Задачи.

1 Использовать модифицированный метод TRAP и оценить его возможности для выявления активности теломеразы в образцах ткани простаты

2 Исследовать активность теломеразы у здоровых мужчин с нормальным уровнем ПСА

3 Исследовать активность теломеразы у пациентов с наличием рака предстательной железы

4 Исследовать активность теломеразы у пациентов с повышенным уровнем ПСА и наличием доброкачественной гиперплазии простаты, хронического простатита и простатической интраэпителиальной неоплазии

5 Изучить клиническую ценность определения активности теломеразы у пациентов с наличием рака предстательной железы

6 Изучить клиническую ценность определения активности теломеразы в прогнозировании развития рака простаты у пациентов с доброкачественной гиперплазией простаты и простатической интраэпителиальной неоплазией

Научная новизна

• исследована активность теломеразы у пациентов с нормальным уровнем ПСА и пациентов с повышенным уровнем ПСА и различными заболеваниями предстательной железы (рак предстательной железы, доброкачественная гиперплазия простаты с сопутствующей простатической интраэпителиальной неоплазией, хронический простатит) Установлено, что определение активности теломеразы позволяет не только улучшить диагностику рака простаты, но и прогнозировать развитие РПЖ у пациентов с ДГП и ПИН

• разработан и внедрен в клиническую практику новый диагностический метод - исследование активности теломеразы модифицированным неизотопным методом TRAP, который обладает высокой специфичностью и позитивной предсказательной ценностью диагностики РПЖ

• определена клиническая ценность исследования активности теломеразы в диагностике рака предстательной железы

• определена клиническая ценность исследования активности теломеразы в прогнозировании развития рака простаты у пациентов с доброкачественной гиперплазией простаты и простатической интраэпителиальной неоплазией по результатам динамического наблюдения сроками от 2 до 5 лет

Практическая значимость.

• исследование активности теломеразы - новый высокочувствительный и высокоспецифичный метод диагностики рака предстательной железы

• исследование активности теломеразы не только улучшает диагностику рака предстательной железы, но и позволяет уточнить стадию заболевания

• исследование активности теломеразы у пациентов с доброкачественной гиперплазией простаты и простатической интраэпителиальной неоплазией позволяет выделить группу пациентов с высокой вероятностью развития рака предстательной железы

• исследование активности теломеразы у пациентов с РПЖ, прошедших лечение методом сфокусированной ультразвуковой аблации простаты (Hi-Fu), позволяет выявить местный рецидив рака простаты на ранней стадии

Основные положения, выносимые на защиту

1 Определение активности теломеразы в биоптатах предстательной железы позволяет улучшить диагностику рака простаты

2 Наличие активности теломеразы у пациентов с доброкачественной гиперплазией предстательной железы и простатической интраэпителиальной неоплазией свидетельствует о высокой вероятности злокачественной трансформации эпителия простаты

3 Отсутствие активности теломеразы у пациентов с доброкачественной гиперплазией предстательной железы и простатической интраэпителиальной неоплазией свидетельствует о низкой вероятности развития рака простаты

Связь диссертации с планом научных исследований.

Диссертация выполнена в рамках плановых тем научно-исследовательской работы кафедры урологии ММА им И М Сеченова - «Разработка новых методов диагностики и лечения урологических заболеваний» (регистрационный номер 01 200 110504) и кафедры биохимии ММА им ИМ Сеченова - «Обоснование и разработка молекулярно-

биологических методов ранней диагностики рака предстательной железы и его микрометастазов» (регистрационный номер 012 00118808)

Апробация работы.

Материалы диссертации представлены • на совместной научно-практической конференции кафедры и клиники урологии ММА им И М Сеченова, 31 мая 2007г

Внедрение в практику.

Практические рекомендации, предложенные в диссертации, применяются в уроло-I ической клинике ММА им И М Сеченова при обследовании больных с подозрением на рак предстательной железы Результаты проведенных исследований используются при обучении студентов, интернов, ординаторов на кафедре урологии ММА им И М Сеченова и кафедре биохимии ММА им И М Сеченова

Публикации.

По теме диссертации опубликовано 5 научных работ (из них одна в центральной печати и одна в зарубежном издании)

Структура и объем диссертации

Диссертация состоит из введения, 5 глав, включающих обзор литературы, собственные данные, заключение, выводов, практических рекомендаций, указателя литературы Диссертация изложена на 171 странице машинописного текста, включает 12 таблиц, 18 диаграмм, 59 рисунков, 4 схемы Список литературы включает 177 источников, из них 24 отечественных и 153 зарубежных авторов

Содержание работы Характеристика обследованных пациентов

В основу работы, носившей проспективный характер, легли результаты обследования 92 больных, находившихся на стационарном обследовании и лечении в Урологической клинике ММА им И М Сеченова в период с 2002 по 2007 год Средний возраст больных составил 66,2 (40-81) лет Критерием включения в исследование являлись повышенный уровень ПСА (>4 нг/мл) и/или подозрительные на рак данные пальцевого ректального исследования (ПРИ) и трансректального ультразвукового исследования (ТРУЗИ) Группу контроля составили 8 пациентов с нормальным уровнем ПСА и наличием ДГП, которым по поводу неадекватного мочеиспускания выполнялась операция -трансуретральная резекция простаты (ТУР) В операционном материале этой группы больных активность теломеразы не найдена

Уровень ПСА был повышен у 89 из 92 (96,7%) пациентов и находился в диапазоне от 4,2 до 688 нг/мл Кроме того, у 75 пациентов дополнительно к общему ПСА был

определен уровень свободной фракции ПСА с соответствующим расчетом их соотношения (%СПСА). При этом у 55 пациентов показатель %СПСА был менее 15% и указывал на РПЖ, а у 20 пациентов %СПСА превышал минимально допустимый порог в 15%.

Объем простаты, измеренный в ходе ТРУЗИ, варьировал от 10 до 160 см3 и в среднем равнялся 57,3 см3. Полученные результаты объема простаты использовались для расчета показателя плотности ПСА (ППСА). Соответственно, рассчитанный уровень ППСА варьировал от 0,02 до 14 нг/мл/см3 и в среднем равнялся 0,8 нг/мл/см3. В качестве порогового значения ППСА нами был принят уровень в 0,1 нг/мл/см3, при этом показатель ППСА оказался превышенным у 85 больных (92,4%), и только у 7 больных (7,6%) находился в пределах нормы.

Данные ПРИ были подозрительны в отношении РПЖ у 47 (51,1%) пациентов, причем у 33 больных (35,8%) изменения локализовались в пределах одной доли простаты, а у 14 больных (15,2%) в обеих долях простаты.

Результаты ТРУЗИ выявили участки со сниженной эхогенностыо у 47 больных (51,1%), причем у 37 (40,2%) больных участки локализовались в одной доле простаты, а у 10 больных (10,9%) в обеих долях простаты. Обобщенные результаты обследования приведены на диаграмме 1.

■ Число обследованных ■ Число пациентов с отклонениями от нормы

Диаграмма 1. Результаты обследования пациентов

Всем 92 больным выполнена пункционная биопсия простаты, при этом у 89 пациентов показанием к выполнению биопсии явился повышенный уровень ПСА (96,7%), а у 3 (3,3%) пациентов подозрительные на РПЖ данные пальцевого ректального исследования при нормальном уровне ПСА. В ходе выполнения биопсии дополнительно получали два биоптата простаты для определения активности теломеразы (АТ).

По результатам гистологического исследования у 41 из 92 пациентов выявлен РПЖ (44,6%), а у 51 пациента ДГП в сочетании с ПИН низкой или высокой степеней (55,4%).

В случае верификации диагноза рака предстательной железы стадирование опухолевого процесса проводилось согласно Международной классификации ТИМ, предложенной в 1997 году

Пациентам с выявленным РПЖ в зависимости от стадии опухолевого процесса проводилось соответствующее лечение (радикальная простатэктомия (РПЭ), НьБи-терапия, гормональная терапия) В подгруппе больных, которым была выполнена РПЭ, активность теломеразы повторно исследовалась в операционном материале

За всеми пациентами с ДГП и ПИН (51 пациент) после биопсии простаты проводилось динамическое наблюдение, включавшее ежегодное (по показаниям через 3 или 6 месяцев) определение уровня ПСА, пальцевое ректальное исследование и ТРУЗИ В зависимости от даты первой биопсии сроки наблюдения за пациентами варьировали от 6 месяцев до 5 лет

Характеристика методов исследования

Всем больным выполнен стандартный диагностический комплекс, включавший клинические и биохимические анализы крови, определение уровня ПСА (общей и свободной фракций), общий анализ мочи, Зх-стаканную пробу, урофлоуметрию, пальцевое ректальное исследование (ПРИ) и трансректальное ультразвуковое исследование простаты (ТРУЗИ) с последующим расчетом плотности ПСА Некоторым пациентам дополнительно выполнялась динамическая магнитно-резонансная простатовезикулография (ДМРПВГ)

Завершающим этапом обследования выполняли полифокальную трансректальную пункционную биопсию предстательной железы под ультразвуковым наведением Для исследования применялся ультразвуковой сканер «В&К 3535» фирмы ВК-Медюа1 с би-плановым секторным механическим ректальным датчиком 6558/Т/8 с рабочей частотой 7,5 мегагерц

Биопсия простаты проводилась по определенной схеме Помимо забора образцов ткани из стандартных мест (основания, средней части и верхушки обеих долей) мы выполняли биопсию из всех участков с подозрительными на РПЖ изменениями по данным ТРУЗИ или ДМРПВГ Для определения активности теломеразы мы дополнительно получали 2 биоптата из обеих долей простаты С целью сведения к минимуму возможных расхождений в месте взятия материала для гистологического исследования и определения АТ мы использовали в качестве ориентира подозрительные участки со сниженной эхогенностью В большинстве случаев такие участки присутствовали в обеих долях простаты Ориентируясь на гипоэхогенный участок, сначала получали биоптат для гистологического исследования, помещали его в отдельный контейнер и помечали как биоптат из «подозрительного участка» Затем из того же участка получали биоптат для определе-

ния AT Поскольку размеры гипоэхогенных участков в подавляющем большинстве случаев не превышали 0,5 см, разница в месте забора материала сводилась к минимуму В случае если структура простаты была однородной (меньшая часть больных), то биоптаты для определения AT брали из середины периферической зоны простаты Затем, не изменяя положения ультразвукового датчика, брали контрольный биоптат для гистологического исследования После извлечения биоптаты для определения AT помещались в отдельные герметичные контейнеры и немедленно замораживались в жидком азоте В дальнейшем полученный материал хранили при -70 С

Определение активности теломеразы в биоптатах простаты и операционном материале проводили с использованием модифицированного А И Глуховым и соавторами стандартного метода TRAP Приносим глубокую благодарность автору методики профессору А И Глухову за неоценимую помощь в качестве консультанта

Получение экстрактов из ткани простаты

Экстракты из тканей (или лизаты) получали в буфере, содержащем детергент CHAPS (3[(3-холамидопропил)-диэтиламмоний]-пропансульфонат) Ткань простаты взвешивали, промывали холодным физиологическим раствором, осушали фильтровальной бумагой, помещали в стеклянный мини-гомогенизатор К ткани добавляли ледяной лизирующий буфер CHAPS, содержащий ЮмМ tns-HCl (рН 7,5), 1мМ MgCl2, 1мМ EGTA, ОДМм РМ8Р(фенилметилсульфонилфторид), 5мМ р-меркаптоэтанол, 0,5% CHAPS, 10%глицерин и стеклянный песок Лизирующий буфер добавляли из расчета 30 мкл на 10 мг ткани, а стеклянный песок - 7,5мг на 10мг ткани Далее ткань гомогенизировали на льду в течение 1 мин через каждые 5 мин Такое прерывистое гомогенизирование проводили в течение 30 мин Полученный гомогенат ткани центрифугировали 30 мин при 4°С и 12000g, надосадок (экстракт) переносили в чистые пробирки, немедленно замораживали и хранили при -70°С до использования

Получение экстрактов из клеток рака простаты линии LNCaP

В качестве положительного контроля наличия AT использовалась перевиваемая культура клеток андрогензависимого рака простаты LNCaP Культуру клеток помещали в пластиковые пробирки, замораживали и хранили при температуре - 70°С Экстракты из клеток LNCaP получали следующим образом Клетки трижды промывали холодным фосфатно-солевым буфером, рН 7,4, собирая центрифугированием при 4° С и 1000g После промывания к клеткам добавляли ледяной лизирующий буфер CHAPS из расчета 1 мкл на 10000 клеток Взвесь ресуспендировали и инкубировали на льду в течение 30 мин, перемешивая интенсивно через каждые 4 мин Полученный лизат клеток центрифу-

гировали 30 мин при 4°С и 12000g, надосадок (экстракт) отбирали и замораживали в жидком азоте Экстракты хранили при -70°С до использования Модифицированный метод TRAP Стандартный метод TRAP основан на ПЦР-амплификации продуктов теломераз-ной реакции, полученных при удлинении ферментом специфического праймера [Kim N W , 1994] В данной работе метод TRAP использовали с некоторыми модификациями Для повышения точности исследования в каждом опыте мы использовали от 4 до 6 проб исследуемого клеточного экстракта, содержащих 4, 2,8, 1,4, 0,7, 0,35 и 0,175 мкг общего белка соответственно Элонгацию олигонуклеотидного субстрата (TS-праймер) и последующую амплификацию проводили в 50 мкл реакционной смеси, содержащей 67 мМ tiis-HCl (pH 8,8), 16,6 мМ (NH4)2S04, 0,01% Tween-20, 1,5 мМ MgCl2, 1 мМ EGTA, 50 мкМ каждого dNTP, 0,1 мкг TS-праймера (5'-AATCCGTCGAGCAGAGTT-3'), 1 мкл экстракта, содержащего 4, 2,8, 1,4, 0,7, 0,35 или 0,175 мкг общего белка соответственно На поверхность реакционной смеси наслаивали 40 мкл легкого минерального масла для предотвращения испарения жидкости Реакционную смесь инкубировали при 37°С в течение 25 мин По окончании инкубации смесь выдерживали при 96°С 10 мин для инактивации теломеразы, затем добавляли 0,1 мкг СХ-праймера (5'-СССТТАСССТТА СССТТАСССТАА-3') и 2,5 ед Taq ДНК-полимеразы Реакционную смесь подвергали 30 циклам ПЦР в следующем режиме 94°С-60 с, 50°С-60 с, 72°-90 с В качестве отрицательного контроля использовалась проба, не содержащая экстракта Положительным контролем служила проба, содержащая экстракт клеток LNCaP, теломеразная активность в которой была определена заранее

Разделение и визуализация амплифицированных продуктов теломеразной реакции

Разделение амплифицированных продуктов осуществляли методом электрофореза в 10% неденатурирующем полиакриламидном геле (ПААГ) и tns-6opaTHOM-EDTA (IxTBE) буфере Образцы вносили в лунки геля в объеме 10 мкл Визуализацию разделенных продуктов проводили на УФ-трансиллюминаторе 300 нм) после выдерживания геля в течение 30 мин в растворе красителя SYBR Gold Окрашенные гели фотографировали цифровой камерой DARKROOM CN-UV/WL фирмы VILBER LOURMAT (Франция) (рисунок 1)

Оценка полученных результатов активности теломеразы Полученные цифровые фотографии амплифицированных продуктов теломеразной реакции (TRAP-продукты) оценивали визуально и с помощью графического редактора ImageJ (Kodak) При этом исследуемые пробы экстракта сравнивались с контрольным образцом, содержащим клетки рака простаты LNCaP Теломеразная активность в контрольном образце условно принималась за 100% В случае присутствия в исследуемом

экстракте активной теломеразы продукты ее активности после амплификации, разделения методом электрофореза и окраски выглядят как горизонтальные полоски, располагающиеся на равном расстоянии друг от друга и отличающиеся на длину теломерного повтора (ТТАССС). На рисунке 1 видно, что в пробах 1-5 выявлена высокая активность теломеразы. В пробе 6 наблюдается низкая активность теломеразы.

Количество общего белка в пробе, мкг

2,8 1,4 0,7 0,35 0,175 0,7 0

Рисунок 1. Результат амплификации продуктов теломеразной реакции после разделения последних методом электрофореза в 10% ПААГ и окраски красителем Sybr Gold. В данном образце ткани выявлена высокая AT. Дорожки 1-6 соответствуют исследуемым пробам экстракта, содержащим 4, 2.8, 1.4, 0.7, 0.35 и 0.175 мкг общего белка соответственно. Дорожка К+ соответствует положительному контролю (экстракт клеток рака простаты линии LNCaP), дорожка К- соответствует отрицательному контролю (проба, не содержащая клеточного экстракта). Стрелками указаны полосы, соответствующие продуктам теломеразной реакции в исследуемых пробах тканевого экстракта и контрольном образце.

На рисунке 2 наблюдается отсутствие горизонтальных полос в исследуемых пробах тканевого экстракта, в то время как в контрольном образце они присутствуют. Следовательно, в данном образце ткани AT отсутствует.

Рисунок 2. Результат исследования AT в тканевом экстракте (фотография 10%-ПААГ, окрашенного Svbr Gold). Дорожки 1-6 соответствуют исследуемым пробам экстракта, содержащим 4, 2.8, 1.4, 0.7, 0.35 и 0.175 мкг обгцего белка соответственно. Дорожка К+ соответствует положительному контролю (экстракт меток рака простаты линии LNCaP), дорожка К- соответствует отрицательнол/у контролю (проба, не содержащая клеточного экстракта). Стрелками указаны полосы, соответствующие продуктал\ теломеразной реакции в контрольном образце. В исследуемых пробах тканевого экстракта А Т отсутствует.

Для полуколичественной оценки AT использовался графический редактор ImageJ (Kodak), позволяющий сравнивать интенсивность окрашивания полосок, соответствующих продуктам теломеразной реакции, исследуемых проб тканевого экстракта с полосками контрольного образца, интенсивность окрашивания которых принималась за 100%. Исходное содержание общего белка в контрольном образце составляло 0,7 мкг. В исследуемых пробах тканевого экстракта содержалось 4, 2.8, 1.4, 0.7, 0.35 и 0.175 мкг общего белка. Соответственно, при расчете отношения интенсивности окрашивания исследуемого и контрольного образцов использовались поправочные коэффициенты, равные 0,175; 0,25; 0,5; 1; 2 и 4 (таблица 1). Рассчитанные результаты активности теломера-зы для каждой пробы тканевого экстракта, выраженные в процентах, использовались нами для расчета среднего показателя активности, который, на наш взгляд, наиболее близко отражает активность теломеразы во всем экстракте. Пример расчета AT с использованием графического редактора ImageJ приведен в таблице I.

1 I I »------Г - Т---

Таблица 1. Расчет активности теломеразы по цифровой фотографии геля с ТЯАР-продуктами, приведенной на рисунке 1.

Название Подсчитанная Содержание Поправоч- Перерасчет ин- Активность Средняя ак-

образца интенсивность общего бел- ные коэффи- тенсивности с теломеразы, тивность

окрашивания, ка в пробе, циенты учетом коэф- % теломеразы,

у.е. мкг фициентов %

1 6041 4 0,175 1057 11,5%

2 4147 2,8 0,25 1036,8 11,25%

3 3369 1,4 0,5 1684,5 18,3% 22,1%

4 2520 0,7 1 2520 27,4%

5 1147 0,35 2 2294 24,9%

6 902 0,175 4 3608 39,2%

К+ 9212 0,7 1 9212 100%

Полученные нами средние показатели активности теломеразы тканевых экстрактов использовались для статистических расчетов. Вместе с другими клиническими и лабораторными показателями значения AT были обработаны в программе Excel 2003. Вычислялись дескриптивные статистические показатели (средняя и среднее квадратическое отклонение). Для доказательства значимости отличий между ними (р) использовался критерий Стьюдента. Установленный критерий значимости соотносился с общепринятыми границами достоверности, равными 0,05 и 0,01.

Активность теломеразы при раке простаты

По результатам гистологического исследования у 41 пациента выявлен РПЖ. Возраст этих больных варьировал от 53 до 79 лет (в среднем 66,7 года). У 40 (97,6%) пациентов уровень ОПСА был повышен и находился в диапазоне от 5 до 688 (в среднем 64,4) нг\мл, а у 1 (2,4%) пациента ОПСА был в пределах нормы и равнялся 3,7 нг\мл. Показатель ППСА был также повышен у 40 (97,6%) больных и находился в диапазоне от 0,105 до 14,04 (в среднем 1,365), а у 1 пациента (2,4%) с нормальным уровнем ОПСА (3,7 нг\мл) плотность ПСА также находилась в пределах нормы и составила 0,092 нг\мл\см3. У 31 пациента был определен показатель %СПСА, который указывал на РПЖ у 27 (87%) пациентов и варьировал от 1% до 14,7% (в среднем 8,7%), а у 4 (13%) пациентов находился в пределах нормы и варьировал от 15% до 36% (в среднем 24,25%). Данные ПРИ были подозрительны на РПЖ у 30 (73,1%) пациентов. У 28 (68,3%) пациентов по данным ТРУЗИ выявлены изменения, подозрительные на РПЖ, а именно наличие одного или несколько участков со сниженной эхогенностью, причем у 13 больных по данным цветного допплеровского картирования (ПДК) имело место сопутствующее локальное усиление кровотока с наличием огибающих сосудов. Обобщенные данные

50 40 30 20 10 0

Число обследованных Ш Число пациентов с подозрительными на РПЖ изменениями

Iii I

ОПСА %СПСА ППСА ПРИ ТРУЗИ

Диаграмма 2. Результаты обследования пациентов с выявленным РПЖ (п=41).

По степени дифференцировки РПЖ пациенты распределились следующим образом: у 9 пациентов высокодифференцированный РПЖ, у 23 умереннодифференцированный, у 9 низкодифференцированный (диаграмма 3).

22% 22%

□ Высокодифференцированный РПЖ

©

□ Умереннодифференцированный РПЖ И Низкодифференцированный РПЖ

56%

Диаграмма 3. Распределение пациентов по степени дифференцировки РПЖ.

По стадии выявленного РПЖ пациенты распределились следующим образом: Tic - 7 пациентов (17,1%), Т2а - 9 (22%), Т2в - 8 (19,5%), ТЗа - 4 (9,8%), ТЗв - 1 (2,4%), ТЗс - 5 (12,2%), Т4 - 7 (17,1 %) (диаграмма 4).

22,0%

19,5%

17,1%/ W \ ШТ2в DT3a

□ Tic ЯТ2а

9,8%

1ТЗв üT3c

17,1% ' 2,4%

12,2% ИТ4

Диаграмма 4. Распределение больных по стадии выявленного РПЖ. 14

Высокая активность теломеразы выявлена у 40 пациентов (97,5%) В зависимости от стадии РПЖ активность теломеразы выявлялась следующим образом Tic - 6 из 7 (85,7%) больных, Т2 - 17 из 17 (100%), ТЗ - 10 из 10 (100%), Т4 - 7 из 7 (100%) Таким образом, зависимости между фактом качественного выявления AT и стадией РПЖ нами не установлено Результаты количественного исследования уровня AT в зависимости от стадии РПЖ также показали отсутствие такой связи

Аналогичные результаты мы получили при качественном и количественным сравнении наличия и уровня AT и степени дифференцировки РПЖ

Как упоминалось выше, для определения AT мы использовали биоптаты, взятые из обеих долей простаты При этом AT оценивалась отдельно в каждом биоптате, чтобы иметь возможность сравнивать активность теломеразы со стадией и локализацией РПЖ По результатам гистологического исследования биопсийного материала РПЖ локализовался в пределах одной доли у 14 из 41 пациентов (34,2%) и в обеих долях у 27 пациентов (65,8%) AT выявлена у 13 из 14 (92,9%) пациентов с локализацией рака в одной доле простаты, причем у 5 пациентов AT выявлена в биоптате из одной доли простаты на стороне поражения, а у 8 пациентов активность теломеразы найдена в биоптатах из обеих долей простаты (схема 1)

Схема 1 Раздельное определение активности теломеразы в обеих долях простаты

После верификации диагноза 3 из 5 пациентов с выявленным РПЖ и АТ в пределах одной доли простаты (стадия Т1с-Т2а) выполнена РПЭ с последующим взятием образцов ткани удаленной простаты для повторного исследования АТ При этом у одного пациента после удаления и рассечения простаты визуализирован опухолевый узел в области вер-

15

хушки правой доли, что позволило взять образец ткани для исследования AT непосредственно из опухолевого узла Дополнительно взяты образцы из прилежащих к опухолевому узлу отделов простаты на расстоянии 0,5, 1 и 2 см, а также образец из противоположной доли У 2 из 3 пациентов после рассечения простаты явных опухолевых очагов визуально и пальпаторно не найдено, взято по 1 образцу ткани для определения AT из периферических отделов обеих долей Гистологическое исследование удаленной предстательной железы подтвердило локализацию РПЖ в пределах одной доли простаты во всех 3 наблюдениях, что полностью совпадает с результатами дооперационной биопсии и коррелирует с выявленной до операции AT Определение AT в операционном материале также подтвердило наличие активности на стороне поражения и отсутствие ее в противоположной «здоровой» доле простаты во всех наблюдениях Кроме того, у 1 пациента с макроскопически видимым опухолевым узлом AT обнаружена не только в самом узле, но и в прилежащих к нему тканях на расстоянии 0,5-1см По всей видимости, это обусловлено инфильтрацией раковыми клетками прилежащих тканей [Lm Y , 1998, Sommerfeld HJ, 1996]

У 8 из 14 (57,1%) пациентов с выявленным РПЖ в пределах одной доли простаты AT найдена в обеих долях простаты (схема 1) 2 из 8 пациентов (Т1с-Т2а) выполнена РПЭ, при этом гистологическое исследование подтвердило локализацию РПЖ в обеих долях простаты в обоих наблюдениях, что полностью совпадает с результатами дооперационной биопсии и коррелирует с выявленной до операции AT Исследование AT в операционном материале также продемонстрировало наличие активности фермента в обеих долях простаты

Таким образом, выявленная при биопсии AT в обеих долях простаты позволила заподозрить наличие рака в обеих долях простаты несмотря на результаты дооперационной биопсии Это может объясняться тем, что опухолевые клетки из противоположной доли не попали в биоптат, или начальной стадией злокачественной трансформации эпителия противоположной доли простаты, когда при наличии AT морфологические изменения отсутствуют

У 1 из 14 пациентов с наличием РПЖ в пределах одной доли простаты AT в биоп-сийном материале не обнаружена По результатам проведенного обследования и данным биопсии пациенту установлен диагноз рак простаты TlcNOMOGl, выполнена РПЭ После удаления и рассечения простаты в верхушке левой доли пальпаторно определяется опухолевый узел до 0,5 см Для определения AT взято по 2 образца ткани из обеих долей простаты AT выявлена в 1 из 2 образцов, взятых из левой доли простаты, и не найдена в 2 образцах из правой доли Гистологическое исследование всей простаты подтвердило локализацию РПЖ в левой доле Анализируя данное наблюдение, мы пришли к вы-

воду, что активность теломеразы отсутствовала в биопсийном материале этого пациента вследствие того, что биоптат для определения AT был взят из середины левой доли простаты (ввиду отсутствия подозрительных на РПЖ изменений по данным ТРУЗИ), а опухолевый очаг локализовался в области верхушки левой доли При этом в отличие от ранее описанных наблюдений, инфильтрация прилежащей к опухолевому узлу ткани простаты раковыми клетками отсутствовала из-за ранней стадии и, возможно, высокой степени дифференцировки опухоли

В группе больных с локализацией рака в обеих долях простаты по данным биопсии (п=27) высокая AT выявлена в биоптатах из обеих долей простаты во всех наблюдениях (схема 1) 2 из 27 пациентов (стадии Tic и ТЗа) выполнена РПЭ, при этом результаты гистологического исследования всей предстательной железы и определения AT в образцах из обеих долей полностью совпали с данными дооперационной биопсии и до-операционного исследования AT Кроме того, у пациента с дооперационной стадией ТЗа в ходе операции выявлено врастание опухоли в шейку мочевого пузыря Для уточнения стадии взяты 2 образца ткани из правой и левой части шейки мочевого пузыря, при этом высокая AT обнаружена в правой части, что совпало с результатами гистологического исследования В левой части шейки мочевого пузыря гистологически рак не найден, но выявлена низкая AT, что может свидетельствовать о начальной стадии злокачественной трансформации, не определяемой морфологически [Takahashi С , 1997, Wulhch В , 1999] В последние годы в нашей клинике широко применяется новый метод лечения рака предстательной железы - трансректальная сфокусированная ультразвуковая аблация простаты (Hi-Fu) Основными преимуществами метода являются его неинвазивность и хорошая переносимость больными Однако необходимо отметить, что не у всех пациентов удается добиться полного излечения за один сеанс и предотвратить дальнейшее прогрессирование опухолевого процесса В связи с этим большую актуальность приобретают проблемы контроля радикальности проведенного лечения и ранней диагностики рецидива РПЖ после сеанса Hi-Fu В настоящее время контроль за лечением осуществляется с помощью контрольных биопсий простаты А поскольку после сеанса Hi-Fu отмечается значительное уменьшение простаты в объеме с утратой зональной анатомии и гетерогенностью паренхимы, то в большинстве случаев контрольные биопсии выполняются «вслепую» по стандартной методике В результате чувствительность таких биопсий невелика [Royver О ,2006] С целью повышения чувствительности контрольной биопсии простаты мы исследовали AT в биопсийном материале у 3 пациентов до и после сеанса Hi-Fu (таблица 2)

Количество больных 1 1 1

Стадия РПЖ Т1сКГхМ(Ю2 Т1сКхМ002 Т2ЫЯхМ002

Исходный ПСА, нг/мл 11,1 11,8 37,2

Исходная АТ Правая доля высокая высокая высокая

Левая доля высокая высокая высокая

Радикальность проведенного сеанса Ш-Ри полная Не обработана часть правой доли полная

ПСА через 3 мес, нг/мл 0 - 0,7

ПСА через 6 мес, нг/мл 0,12 3,84 1,15

Результаты контрольной биопсии ДГП, ПИН низкой степени ДТП ДГП

АТ Правая доля низкая высокая высокая

Левая доля низкая низкая высокая

Анализируя приведенные в таблице 6 данные, можно предположить, что значительное снижение АТ по сравнению с исходным уровнем после сеанса Ш-Би у первого пациента свидетельствует о высокой эффективности проведенного лечения В пользу этого свидетельствует низкий уровень ОПСА и результаты контрольной биопсии Сохраняющийся низкий уровень АТ в биопсийном материале этого пациента может быть обусловлен выраженной лимфоидной инфильтрацией ткани простаты, выявленной при контрольной биопсии Высокий уровень АТ в биоптате из правой доли простаты у второго пациента может свидетельствовать либо о местном рецидиве РПЖ, либо о недостаточной эффективности проведенного лечения (при лечении правой доли вместе с переходной зоной передние отделы простаты остались без воздействия вследствие больших размеров простаты (переднезадний размер более 3,8 см)) Высокий уровень АТ в биоптатах из обеих долей простаты у третьего больного наиболее вероятно указывает на местный рецидив РПЖ несмотря на отсутствие рака в контрольной биопсии Через 2 года у 1 из 2 пациентов с подозрением на местный рецидив РПЖ и высокой АТ уровень ПСА повысился до 12 нг/мл Выполнена контрольная биопсия, в обеих долях простаты выявлены очаги умереннодифференцированной аденокарциномы Таким образом, наличие высокой АТ в обеих долях простаты указывало на наличие местного рецидива РПЖ при том, что данные ПРИ, ТРУЗИ и контрольной биопсии не свидетельствовали в пользу рака

Активность теломеразы при ДГП п ПИН.

В группе больных с неподтвержденным по результатам биопсии РПЖ (п=51) во всех наблюдениях выявлена доброкачественная гиперплазия простаты с сопутствующей ПИН низкой и высокой степеней (таблица 3).

Таблица 3. Распределение больных с ДГП по степени сопутствующей ПИР/ (п=51).

Результаты биопсии Количество больных

Абс. %

ДГП + ПИН низкой степени 45 88,24

ДГП + ПИН высокой степени 6 11,76

АТ выявлена у 11 из 51 больных (21,5%), причем у 10 больных обнаружен высокий уровень АТ, а у 1 пациента низкий уровень АТ. У оставшихся 40 больных АТ не найдена (78,4%). Зависимость между выявлением АТ и степенью ПИН приведена в диаграмме 5. Достоверной зависимости между уровнем АТ и степенью ПИН нами не отмечено.

( п= \ 36; V. \80 18 д / Ш\ 1 Г ) 1 п / V 67°/У- \ 33%\ =6 У Ш Высокий уровень АТ □ Низкий уровень АТ □ АТ не найдена

ПИН низкой степени ПИН высокой степени

Диаграмма 5. Зависимость между выявлением АТ и степенью ПИН.

За всеми пациентами с ДГП и ПИН (п=51) после биопсии проводилось динамическое наблюдение, включавшее ежегодное (по показаниям через 3 или 6 месяцев) определение уровня ПСА, пальцевое ректальное исследование и ТРУЗИ. В зависимости от даты первой биопсии сроки наблюдения за пациентами варьировали от 6 месяцев до 5 лет (таблица 4).

В ходе динамического наблюдения по показаниям (рост уровня ПСА, появление подозрительных на РПЖ изменений по данным ПРИ и ТРУЗИ) выполнялись одна или несколько повторных биопсий. В ряде случаев по показаниям (неадекватное мочеиспускание) выполнялась трансуретральная резекция простаты (ТУР) с тщательным гистологическом исследованием удаленного материала. По количеству повторных биопсий и трансуретральных резекций пациенты распределились следующим образом (таблица 5).

Период наблюдения Количество пациентов

Абс %

5 лет 12 23,5

4 года 9 17,7

3 года 8 15,7

2 года 14 27,5

1 год 5 9,8

6 месяцев 3 5,9

Таблица 5 Распределение больных с ДГП и ПИН по числу повторных биопсий (п=51)

Количество повторных биопсий Количество пациентов

Абс %

5 1 1,96

4 1 1,96

3 4 7,8

2 5 9,8

1 19 37,25

0 21 41,17

В течение периода наблюдения на сроках от 6 месяцев до 5 лет по результатам повторных пункционных биопсий у 6 из 10 пациентов с наличием высокого уровня АТ выявлен рак простаты (60%) (схема 2)

Схема 2 Результаты наблюдения за пациентами с наличием АТ и ПИН

АТ обнаружена 11 больных

-I _,

Высокий уровень АТ 10 больных

Низкий уровень АТ 1 пациент

I

Повторные биопсии 7 больных

Выявлен РПЖ 6 больных (60%)

ПИН низкой степени ПСА выше нормы

1 больной (10%)

Повторные биопсии не проводились, наблюдение 3 больных

Отрицательная

динамика 1 больной (10%) Положительная

динамика 1 больной (10%)

Отказ от наблюдения 1 больной (10%)

Через 2 месяца ТУР простаты, РПЖ не найден

=3===:

Через 5 лет снижение уровня ПСА до нормы

Таким образом, из 10 пациентов с одновременно выявленными в одной биопсии АТ и ПИН (низкой или высокой степени) у 6 (60%) через 7 месяцев - 5 лет гистологиче-

ски верифицирован РПЖ, то есть AT может выявляться еще до наступления характерных для РПЖ гистологических изменений

Результаты наблюдения за оставшимися 4 пациентами с высоким уровнем AT не позволяют полностью исключить наличие у них рака Высокий уровень AT у этих больных может указывать либо на наличие микрофокусов РПЖ, либо на начальную стадию злокачественной трансформации клеток, не определяемую рутинными гистологическими методами [Scates 1997, Sommerfeld 1996, Wymenga 2000]

Наблюдение за пациентом с низким уровнем AT не подтвердило наличие у больного РПЖ Через 2 месяца после биопсии пациенту выполнена ТУР простаты При гистологическом исследовании выявлен хронический простатит с выраженной лимфоид-ной инфильтрацией стромы После операции отмечено постепенное снижение уровня ОПСА и его производных В настоящий момент, спустя 5 лет после биопсии, уровень ОПСА, а также показатели %СПСА и ППСА находятся в пределах нормы Данные ПРИ и ТРУЗИ также не свидетельствуют в пользу рака Мы предполагаем, что низкий уровень AT в этом наблюдении был обусловлен выявленной при гистологическом исследовании выраженной лимфоидной инфильтрацией ткани простаты, поскольку низкий уровень AT может присутствовать в лимфоцитах [Bioccoli 1995, Igarashi 1997, Weng 1996]

Результаты наблюдения за 40 пациентами с отсутствием AT в биопсийном материале не подтвердили наличия у них РПЖ (схема 3) Сроки наблюдения за этими больными составили от 6 месяцев до 5 лет

Схема 3 Результаты наблюдения за пациентами с отсутствием AT

AT не обнаружена у 40 больных 36 больных с ПИН НС* и 4 больных с ПИН ВС

Повторные биопсии выполнены 15 больным 14 с ПИН НС и 1 с ПИН ВС

Отрицательная динамика (повышение ПСА) отмечена 4 больных (27%) ч Зс ПИН НС и 1 с ПИН ВС

Положительная динамика 5 больных (33%) с ПИН НС

Снижение уровня ПСА до нормы 6 больных (40%) с ПИН НС

Повторные биопсии не выполнялись 25 больным

22 с ПИН НС и 3 с ПИН ВС

1 больной с ПИН ВС умер через месяц после биопсии (4%)

Отрицательная динамика (повышение ПСА) отмечена у 1 больного (4%) с ПИН НС

Положительная динамика отмечена у 4 больных (16%) 3 с ПИН НС и 1 с ПИН ВС

Снижение уровня ПСА до нормы 15 больных (60%) с ПИН НС

Отказ от наблюдения 4 больных (16%) 3 с ПИН НС и 1 с ПИН ВС

' ПИН НС - ПИН низкой степени, ПИН ВС - ПИН высокой степени

Таким образом, у 30 из 40 (75%) пациентов с отсутствием АТ за период от 6 месяцев до 5 лет отмечена положительная динамика, выражавшаяся в снижении уровня ОПСА, причем у 21 (52,5%) пациента к окончанию наблюдения показатель ОПСА снизился до пределов нормы, данные ПРИ и ТРУЗИ также не свидетельствуют в пользу РПЖ Наконец, сравнительное обобщение данных анализа ПСА крови и теломеразы биоптатов урологических пациентов с разной патологией простаты (РПЖ, ПИН, ДТП и хронический простатит) показало следующее При наличии в ткани патологически измененной предстательной железы активной теломеразы средняя концентрация ПСА в крови в 2 раза больше, чем в случае отсутствия ее активности Это соответствует данным о том, что оба эти белковых фермента продуцируются эпителием простаты, а активная теломераза является патогенетическим фактором интенсивной пролиферации именно эпителия и следовательно при этом возрастает количество ПСА-продуцирующих клеток

Заключение

Подводя итоги, можно отметить, что модифицированный неизотопный метод Т11АР дает возможность с высокой точностью и чувствительностью оценивать АТ в образцах ткани простаты Чувствительность АТ в диагностике РПЖ составила 97,5% Раздельное определение АТ в обеих долях простаты позволило подтвердить локализацию РПЖ в пределах одной доли у 5 пациентов и в обеих долях у 35 пациентов, в то время как у 8 из 35 пациентов данные биопсии свидетельствовали о локализации РПЖ только в одной доле простаты Таким образом, определение АТ в биоптатах простаты не только улучшает диагностику РПЖ, но и уточняет стадию опухолевого процесса

Результаты исследования АТ у 3 пациентов с наличием РПЖ до и после сеанса Н1-Ри позволяют предложить использовать определение АТ для оценки эффективности проведенного лечения и раннего выявления рецидива РПЖ

Обнаружение АТ у пациентов с ДГП и ПИН выделяет из общей массы группу пациентов с высоким риском развития РПЖ и, соответственно, снизить количество выполняемых биопсий и возможных осложнений Отсутствие АТ в биопсийном материале свидетельствует о низкой вероятности злокачественной трансформации, что позволяет воздержаться от повторных биопсий в случае положительной динамики уровня ПСА и данных ПРИ и ТРУЗИ

ВЫВОДЫ:

1 Модифицированный неизотопный метод ТИАР может быть использован для оценки активности теломеразы в образцах ткани простаты

2 В ткани простаты у здоровых мужчин с нормальным уровнем ОПСА активность теломеразы отсутствует При наличии в ткани патологически измененной предстатель-

ной железы активной теломеразы концентрация ПСА в крови статистически достоверно выше, чем при отсутствии фермента

3 При раке предстательной железы активность теломеразы выявляется в 97,5% случаев Выявление АТ в различных отделах предстательной железы коррелирует с распространенностью опухолевого процесса

4 Определение активности теломеразы у пациентов с РПЖ позволяет не только улучшить диагностику рака простаты, но и уточнить стадию опухолевого процесса Определение АТ у пациентов с РПЖ после сфокусированной ультразвуковой аблации простаты позволяет диагностировать рецидив рака на ранней стадии

5 Активность теломеразы выявлена у 11 из 51 больных (21,5%) с ДТП и ПИН, причем высокая АТ выявлена у 10 больных, а у 1 пациента низкая АТ

6 Для 60% (6 из 10) пациентов одновременное выявление активной теломеразы и ПИН (низкой или высокой степени) предшествует на 7 месяцев - 5 лет гистологически доказанному РПЖ

7 В случае отсутствия АТ у 36 пациентов с ПИН низкой степени и 4 пациентов с ПИН высокой степени при дальнейшем наблюдении в течение 6 месяцев - 5 лет РПЖ не выявлен

8 Активная теломераза существенно повышает риск развития РПЖ у пациентов с ПИН

9 Определение активности теломеразы у пациентов с ДТП и ПИН позволяет выделить из общей массы группу пациентов с высоким риском развития РПЖ и существенно снизить количество выполняемых биопсий простаты

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1 При выполнении биопсии простаты в связи с повышенным уровнем простатспецифи-ческого антигена, особенно если уровень последнего находится в пределах «серой зоны» шкалы, рекомендуется исследование активности теломеразы в биопсийном материале

2 Наличие высокой активности теломеразы у пациента с доброкачественной гиперплазией простаты и простатической интраэпителиальной неоплазией свидетельствует о высоком риске развития рака простаты и требует тщательного динамического наблюдения с выполнением повторных биопсий простаты

3 При отсутствии активности теломеразы у пациента с неподтвержденным раком предстательной железы выполнение повторной биопсии нецелесообразно В этой ситуации рекомендуется динамическое наблюдение (контроль уровня простатспецифического антигена, пальцевое ректальное и трансректальное ультразвуковое исследования)

4 У больных раком предстательной железы, прошедших лечение методом сфокусированной ультразвуковой аблацин простаты, рекомендуется определение активности те-ломеразы до и после операции для контроля радикальности лечения и исключения прогрессирования опухолевого процесса

Список работ, опубликованных по теме диссертации-

1 Aliaev U G , Vmarov A Z, Rapoport L М, Grigorev N А , Bezmkov Е А , Polyakovski К A The use of dynamic contrast-enhanced MRI to access the efficacy of neoadjuvant hormonotherapy of prostate cancer 8th Mediterranean Congress of Urology (September 11-14,2003-Herakleion, Greece) Book of abstracts, P 159

2 Коваленко H A , Зезеров E Г , Поляковский К A , Винаров A 3 , Безруков E A , Аляев Ю Г , Северин Е С Активность теломеразы при раке простаты Материалы конференции «Онкологическая урология от научных исследований к клинической практике (современные возможности диагностики и лечения опухолей предстательной железы, мочевого пузыря и почки)» (Москва, 2-4 декабря 2004 года) Москва, 2004 год, С 6869

3 Е Г Зезеров, Н А Коваленко, О М Забежинская, С А Лесничук, Р В Курынин, Э Г Асламазов, А 3 Винаров, Е А Безруков, К А Поляковский, Д В Бутнару, В Б Спири-чев, Н А Бекетова, О Г Переверзева, О Н Попова, Г К Барашков, Л И Зайцева, А И Глухов, Н Н Белушкина, Ю Г Аляев Изучение клинической ценности определения активности теломеразы, ДНК-плоидности, содержания в крови витаминов, микроэлементов и мРНК-продуцирующих клеток для диагностики простатической интраэпите-лиальной неоплазии, рака предстательной железы и его микрометастазов //Вопросы биологической медицинской и фармацевтической химии, 2005, №3, С 44-54

4 Зезеров Е Г , Северин Е С , Аляев Ю Г, Коваленко Н А, Асламазов Э Г, Винаров А 3 , Лесничук С А , Спиричев В Б , Безруков Е А , Барашков Г К, Бутнару Д В , Курынин Р В , Забежинская О М , Бекетова Н А , Поляковский К А Некоторые молекулярно-биологические маркеры рака предстательной железы (РПЖ) и простатической интра-эпителиальной неоплазии (ПИН) // Материалы 2-й международной конференции «Молекулярная медицина и биобезопасность» (Москва, 20-21 октября 2005 года) Москва, 2005 год, С 138-139

5 К А Поляковский, А И Глухов Активность теломеразы при раке простаты, простатической интраэпителиальной неоплазии и доброкачественной гиперплазии предстательной железы // Материалы 3-й Всероссийской конференции «Мужское здоровье» (Москва, 18-20 октября 2006 года) Москва, 2006 год, С 151-152

Заказ № 197/10/07 Подписано в печать 15 10 2007 Тираж 75 экз Уел пл 1,5

^ ООО "Цифровичок", тел (495) 797-75-76, (495) 778-22-20 'TV^4 www cfr ru , e-mail info@cfr ru

Л

Рак предстательной железы (РПЖ) в настоящее время является наиболее распространенной формой рака среди мужчин и занимает второе место в структуре онкологической смертности мужского населения европейских стран и США. В России за период с 1998 по 2003 годы прирост показателя заболеваемости РПЖ составил 28% [161]. Столь значительный прирост заболеваемости РПЖ может быть обусловлен как растущей настороженностью в отношении этого заболевания среди практикующих врачей и населения, так и повсеместным внедрением в клиническую практику определения уровня простатспецифического антигена (ГГСА) в сыворотке крови с последующим проведением пункционной биопсии предстательной железы. Повсеместное определение уровня ПСА у мужчин старше 50 лет значительно улучшило диагностику локализованных форм РПЖ и, как следствие, повысило число выполняемых радикальных простатэктомий, что способствовало повышению общей выживаемости от 67% до 89%) за последние 20 лет [16].

К сожалению, несмотря на то, что применение ПСА продемонстрировало высокую чувствительность диагностики рака простаты с использованием максимально допустимого уровня, равного 4 нг\мл, низкая специфичность ПСА остается повсеместной проблемой. Ложное повышение уровня ПСА наблюдается при таких заболеваниях как простатит и доброкачественная гиперплазия предстательной железы (ДТП) [43, 46, 54, 56, 62, 68, 103, 104, 111, 113, 117, 131, 148, 163] . В результате у пациентов с уровнем ПСА от 4 до 10 нг\мл (так называемая «серая зона» шкалы) позитивная предсказательная ценность выявления РПЖ по разным данным составляет от 18 до 25% (средняя 21%) [28, 36, 37, 116, 123, 125, 134, 152, 164]. Столь низкая специфичность этого маркера приводит к большому количеству ненужных биопсий и связанных с ними осложнений. Еще одним настораживающим фактором является рост случаев выявления РПЖ при уровне ПСА менее 4 нг\мл, причем, согласно данным Catalona и соавторов, у 17% пациентов с верифицированным раком простаты и уровнем ПСА от 2,6 до 4 нг\мл РПЖ был местнораспространенным [35]. Снижение порогового уровня ПСА ниже 4 нг\мл, как рекомендуют некоторые исследователи, еще больше усугубит проблему низкой специфичности этого маркера.

Повсеместное выполнение пункционных биопсий простаты в случае повышения уровня ПСА привело к выявлению такого патоморфологического феномена как простатическая интраэпителиальная неоплазия (ПИН). ПИН относится к разряду дисплазий эпителия и разделяется на ПИН низкой и высокой степеней. Если в отношении ПИН низкой степени врачебная тактика более или менее общепринята и сводится к динамическому наблюдению с контролем уровня ПСА, то ПИН высокой степени до сих пор является предметом дискуссий. Ряд авторов считает ПИН высокой степени «предраком» и настаивает на выполнении повторных биопсий с интервалом от 1 до 3 месяцев [1], другие авторы не столь критичны и рекомендуют динамическое наблюдение с выполнением повторной биопсии только в случае роста уровня ПСА. При этом вероятность выявления РПЖ при повторной биопсии даже в случае наличия ПИН высокой степени невелика и большинство биопсий оказываются ненужными.

Таким образом, несмотря на низкую специфичность, ПСА хорошо зарекомендовал себя как неинвазивный скрининг-тест из-за высокой чувствительности, простоты методики определения и низкой стоимости. По всей видимости, в этом качестве определение ПСА останется методом выбора на ближайшие годы. Однако необходимы новые маркеры РПЖ, обладающие большей раковой специфичностью.

В зарубежной литературе активно обсуждается возможность использования фермента теломеразы в качестве универсального онкомаркера. Этот фермент содержится в ядре клетки и его биологическая роль заключается в восстановлении утраченных концов хромосомной ДНК (теломер) после каждого клеточного деления. В большинстве соматических клеток активность теломеразы (AT) отсутствует, что приводит к тому, что после определенного числа клеточных делений (примерно 80-100) длина концевых теломерных последовательностей ДНК уменьшается до критического уровня и клетка подвергается апоптозу — запрограммированной клеточной гибели. Фермент теломераза позволяет избежать-*этого, восстанавливая утраченные теломеры на концах хромосом, благодаря чему клетка становится условно «бессмертной». Неудивительно, в большинстве злокачественных опухолей обнаруживается высокая активность этого фермента. При этом практически во всех нормальных клетках активность теломеразы не определяется. Активность теломеразы обнаружена только в некоторых здоровых тканях человека. Это, прежде всего, ткани зародышевой линии взрослого организма, ткани эмбриона [151, 159]. Теломераза также экспрессируется в интенсивно пролиферирующих тканях взрослого организма: эндометрии [77], эпидермисе [147], слизистой кишечника [60] и др. Однако даже в активно пролиферирующих здоровых клетках AT значительно ниже, чем в злокачественных опухолях.

Первые данные об активации теломеразы в опухолях человека были опубликованы в 1994 году Counter и соавторами [42]. AT была обнаружена в клетках асцитной жидкости больных карциномой яичника. Примерно в это же время Kim и соавт. разработали очень чувствительный метод определения активности теломеразы TRAP (Telomeric Repeat Amplification Protocol), с помощью которого удалось продемонстрировать наличие AT в 90 случаях из 101 при исследовании двенадцати различных типов опухолей и полное отсутствие фермента во всех 50 исследованных образцах нормальных тканей

72]. Чувствительность используемого для анализа AT метода TRAP настолько высока, что позволяет обнаружить активность теломеразы всего в 1-10 клетках. Наличие AT в доброкачественных и диспластических тканях может свидетельствовать о начале злокачественной трансформации.

Согласно данным зарубежных авторов, при аденокарциноме предстательной железы AT выявляется в 47 - 92% случаев [17, 39, 64, 70, 71, 82, 83, 110, 130, 138, 143, 144, 146, 150, 160, 162, 166]. При простатической инграэпителиальной неоплазии AT выявляется от 16% до 73% случаев [39, 64, 74, 166]. При доброкачественной гиперплазии предстательной железы и в нормальной ткани простаты AT выявляется от 0 до 10,5% случаев, причем ее уровень существенно ниже, чем в раковых клетках [31, 70, 74, 82, 83, 130, 138, 146, 150, 162, 166]. Наличие AT у пациентов с ПИН и ДГП большинство авторов объясняют ранней стадией злокачественной трансформации, не определяемой при гистологическом исследовании.

Вышеуказанные данные свидетельствуют о том, что определение AT в ткани простаты может не только улучшить диагностику РПЖ, но и прогнозировать его развитие у пациентов с ПИН и ДГП. Отдаленное наблюдение за пациентами с наличием AT и не выявленным РПЖ поможет подтвердить или отвергнуть это предположение.

К сожалению, в отечественной литературе мы не встретили работ, посвященных изучению активности теломеразы при заболеваниях простаты. Отчасти это может объясняться высокой стоимостью применяемого большинством зарубежных авторов изотопного метода TRAP. Помимо высокой стоимости, данный метод определения AT требует использования меченных радиоизотопами нуклеотидов, и, как следствие, может применяться только в условиях специализированной лаборатории. Это обстоятельство что еще более затрудняет внедрение метода в широкую клиническую практику. В лаборатории молекулярной биологии НИИ медицинской экологии департамента здравоохранения г. Москвы разработан модифицированный неизотопный метод TRAP, при котором для оценки продуктов реакции вместо меченных радиоизотопами нуклеотидов используется высокочувствительный краситель Sybr Gold. Испытание модифицированного метода на культуре клеток андрогензависимого рака простаты LnCap продемонстрировало сопоставимые со стандартным методом TRAP результаты [Глухов А.И., 1998]. Однако остается неясным, можно ли применять модифицированный неизотопный метод для работы с тканью простаты, а точнее с пункционными биоптатами простаты. Кроме того, в проанализированной зарубежной литературе отсутствуют отдаленные результаты наблюдения за пациентами с наличием AT и не выявленным РПЖ. В результате вопрос о возможности использования AT для прогнозирования развития РПЖ у больных с ПИН и ДТП остается открытым. Неясность по вышеуказанным вопросам явилась основанием для проведения собственного исследования.

Цель исследования оценить возможность использования пеизотоппого метода TRAP для определения активности теломеразы в ткани предстательной железы и улучшить результаты диагностики рака предстательной железы

Задачи исследования:

1. Использовать модифицированный метод TRAP и оценить его возможности по выявлению активности теломеразы в образцах ткани простаты

2. Исследовать активность теломеразы у здоровых мужчин с нормальным уровнем ПСА

3. Исследовать активность теломеразы у пациентов с наличием рака предстательной железы

4. Исследовать активность теломеразы у пациентов с повышенным уровнем ПСА и наличием доброкачественной гиперплазии простаты, хронического простатита и простатической интраэпителиальной неоплазии

5. Изучить клиническую ценность определения активности теломеразы у пациентов с наличием рака предстательной железы

6. Изучить клиническую ценность определения активности теломеразы в прогнозировании развития рака простаты у пациентов с доброкачественной гиперплазией простаты и простатической интраэпителиальной неоплазией

Научная новизна:

• исследована активность теломеразы у пациентов с нормальным уровнем ПСА и пациентов с повышенным уровнем ПСА и различными заболеваниями предстательной железы (рак предстательной железы, доброкачественная гиперплазия простаты с сопутствующей простатической интраэпителиальной неоплазией, хронический простатит). Установлено, что определение активности ■ теломеразы позволяет не только улучшить диагностику рака простаты, но и прогнозировать развитие РПЖ у пациентов с ДГПиПИН.

• разработан и внедрен в клиническую практику новый диагностический метод - исследование активности теломеразы модифицированным неизотопным методом TRAP, который обладает высокой специфичностью и позитивной предсказательной ценностью диагностики РПЖ.

• определена клиническая ценность исследования активности теломеразы в диагностике рака предстательной железы

• определена' клиническая ценность исследования активности теломеразы в прогнозировании развития рака простаты у пациентов с доброкачественной гиперплазией простаты и простатической интраэпителиальной неоплазией по результатам динамического наблюдения сроками от 2 до 5 лет

Практическая значимость: исследование активности теломеразы - новый высокочувствительный и высокоспецифичный метод диагностики рака предстательной железы исследование активности теломеразы не только улучшает диагностику рака предстательной железы, но и позволяет уточнить стадию заболевания исследование активности теломеразы у пациентов с доброкачественной гиперплазией простаты и простатической интраэпителиальной неоплазией позволяет выделить группу пациентов с высокой вероятностью развития рака предстательной железы исследование активности теломеразы у пациентов с РПЖ, прошедших лечение методом сфокусированной ультразвуковой аблации простаты (Hi-Fu), позволяет выявить местный рецидив рака простаты на ранней стадии

ВЫВОДЫ:

1. Модифицированный неизотопный метод TRAP может быть использован для оценки активности теломеразы в образцах ткани простаты.

2. В ткани простаты у здоровых мужчин с нормальным уровнем ОПСА активность теломеразы отсутствует. При наличии в ткани патологически измененной предстательной железы активной теломеразы концентрация ПСА в крови статистически достоверно выше, чем при отсутствии фермента.

3. При раке предстательной железы активность теломеразы выявляется в 97,5% случаев. Выявление АТ в различных отделах предстательной железы коррелирует с распространенностью опухолевого процесса.

4. Активность теломеразы выявлена у 11 из 51 больных (21,5%) с ДГП и ПИН, причем высокая АТ выявлена у 10 больных, а у 1 пациента низкая "АТ.

5. Активная теломераза существенно повышает риск развития РПЖ у пациентов с ПИН.

6. Определение активности теломеразы у пациентов с РПЖ позволяет не только улучшить диагностику рака простаты, но и уточнить стадию опухолевого процесса. Определение АТ у пациентов с РПЖ после сфокусированной ультразвуковой аблации простаты позволяет диагностировать рецидив рака на ранней стадии.

7. Для 13%) пациентов выявление активной теломеразы предшествует на 7 месяцев - 2,5 года гистологически доказанному РПЖ.

8. Определение активности теломеразы у пациентов с ДГП и ПИН позволяет выделить из общей массы группу пациентов с высоким риском развития РПЖ и существенно снизить количество выполняемых биопсий простаты.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

При выполнении биопсии простаты в связи с повышенным уровнем простатспецифического антигена, особенно если уровень последнего находится в пределах «серой зоны» шкалы, рекомендуется исследование активности теломеразы в биопсийном материале.

Наличие высокой активности теломеразы у пациента с доброкачественной гиперплазией простаты и простатической интраэпителиальной неоплазией свидетельствует о высоком риске развития рака простаты и требует тщательного динамического наблюдения с выполнением повторных биопсий простаты.

При отсутствии активности теломеразы у пациента с неподтвержденным раком предстательной железы выполнение повторной биопсии нецелесообразно. В этой ситуации рекомендуется динамическое наблюдение (контроль уровня простатспецифического антигена, пальцевое ректальное и трансректальное ультразвуковое исследования).

У больных раком предстательной железы, прошедших лечение методом сфокусированной ультразвуковой аблации простаты, рекомендуется определение активности теломеразы до и после операции для контроля радикальности лечения и исключения прогрессирования опухолевого процесса.