Автореферат и диссертация по медицине (14.00.14) на тему:Активность протеолитических ферментов и их ингибиторов у больных раком толстой кишки

¡2 Ч

л —

АКЛДВШ МЕЦЩШСШ НАУК РОССИИ

НЛУЧШЫКЕЛЗДОВАТКМИЯ ИНСТИТУТ оншогии . ТОМСКОГО НАУЧНОГО ЦЕНТРА ЛИН РОССИИ ■

•' На празах рукописи'

. ВАРБАНЕЦ Валерий Филиппович

УДК 616.345-006.6:612.321

АКТИВНОСТЬ ПРОТЕОЛИТМЧЕСКИХ ФЕРМЕНТОВ И ИХ ИНГИБИТОРОВ У БОЛЬНЫХ РАКОМ. ТОЛСГОЗ КИШКИ •

14.00.Р» - онкология

А о т о р о $ о р а т

дисзбртэции на соискание ученой степени кзидидзга медицинских наук

. "Трмск - 19У2

О -)

>, А

. Работа выполнена в Одесском медицинском институте Им.Н.И. Пярогова на -Йазе Одесского областного онкологического диспансера и в'лаборатории биохимии Всесоюзного селекционно - гене- ■ Ч-ического института. ' Л ' '

' • НАУЧНЫЕ ЕУКОВОДГГШ : '.,;.■•. •

'' -.доктор медицинских•наук, профессор С.А.ГЕШЕПИН;

- доктор биологических наук C.B.ВОВЧУК. • .г \

' СйадШ1Ь№1Е ОППОНШ1ТЫ • - ■."'''".•'

•' • доктор медицинских наук, профессор Г.И,КОВАЛЕНКО; .' "

- кандидат медицинских'наук В.В.УДУТ. ■ ■ '

* 11 ! - ' : Ведшая организация — Институт"проблем онкологии ,им.P.E. Ка-бр.цко^о АН Украины.'- • ■; '.. •

Зашита состоится

",2 Г" <M.XJ h g 1992г . .в ■ часор

. иа'заседании спевддлиэиро.ванного сЬвета'К OOI.P4.OI при научно-' лоследователъском институте онкологии Томского научного Центра А.МЧ России по а,цре'су: 634001,г.Томск,пер.Кооперативный,5

'. С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке НИИ онкологии ТНЦ АШ России. : .. - '

Автореферат разослан "c/fe" bUkCLfiX

: 1992г.

'Ученнд секретарь ...

специализйрованного совета , i'

кан,ципат «едидннаких наук, , '

старят ü на учдар, сотрудник ''■ . ' В.М.ТИХОШВ

if.' Актуальность теш*. Клинические, лабораторные, рентгенологи. чбск'ао, эндоскопические и даае наиболее точные морфологические п методы исследования не обеспечивают абсолвтной достоверности s дифференциальной диагностика между доброкачественными и злокачественными опухолями ¡толстой кишки, не обеспечивают. своевременной ди-, агностики рецидивов и метастазов, не всегда представляют достаточно объективные критерии эффективности лечения. В эксперименте . Adelman S.?., 1982; Becker P.P., 1981 И др.) И клиндае (Близ-нюк Б.Ф., 198?; Вереыеенко К.Н. с соавт., 1986; АЪесазз1з X. et al.,

• 1084} Vaaishta A. et al., 1984 и др.)-доказано участие протеоли-тической системы в канцерогенезе, выявлены существенные различия.

• между протволитическими характеристиками сыворотки крови и ткани опухоли больных доброкачественные и злокачественными опухоляик различных локализаций. Протеолитлческая система сыворотки крови, опухолей и регионарных лимфоузлов у больных опухолями толстой кишки мало изучена. Это обусловливает актуальность исследования про-,. теолитическоЯ системы больных опухолями толстой кивки и позволяет •

' рассчитывать -на выявление новых, нетрадиционных критериев диагностики, прогноза и оценки качества лечения.

Цель и задачи исследования. Цель исследования - разработать знэииопогические критерии диагностики и эффективности лечения.рака толстой кивки. В соответствии с избранной целью были поставлены следующие задачи: » ;

I. Изучить активность протеиназ и их ингибиторов в опухоли, неизмененной гкани кишки, регионарных лимфоузлах и сыворотке крови больных ракоы толстой-кишки.

¿..Выявить зависимость между показателями активности протео-литической систеш и основным характеристиками опухолей толстой кишки -, дифференцировкой ткани, распространенностью. ■

3. Определить изменения в показателях активности протеолити-'ческой систеиы сыворотки крови после радикальных и паллиативных

. операций.

4. Определить влийние.лучевой терапии на показатели активности протеиназ и ингибиторов в опухоли, неизмененной ткаяи кишки.

5. Определить энзимологические критерии радикальности операции, эффективности лучевой терапии, а такге диагностики рецидивов и метастазов рака толстой кишки после операции.

Научная новизна. Впервые в работе обобщены результаты конп-

лексного исследования активности компонентов. протеолитичвской системы в сыворотке крови (до и в различные сроки после оперативного ЕлешателЕсгва), опухо.. неизмененной ткани кишечной стен-

• ки, лимфоузлах у больных доброкачественными опухолями и ракой . ■ -толстой кишки.

..■ Впервые предлозен критерий энзииологической диагностики ре- '' аидивов и (или) метастазов рака толстой'кйшки после предшествующа-' . го оперативного лечения;

Изучено влияние интенсивной'предоперационной, лучевой терапии на показатели активности: кошшентов протеолитичвской системы

• опухоли прямой киеки.

Теоретическое значение полученных результатов. Выявленное ; нааи достоверное увеличение уровня активности нейтральных и кас-. лых протеиназ в,раковой опухоли -одетой кички относительно их-ак-тивности в неизмененной стенке кишки и доброкачественной опухоли •пряиой киики подтверждает участие протеолитичес: лх ферментов в '. . .'канцерогенезе. ; '

Высокий уровень активности ингибитора трипсина в сыворотке . крови больных раком толстой кишки, снижающаяся,после выполнения радикальной операции до нормальных величин, позволяет рассматри- . вать. данный феномен,, как за'щитвую реакцию организма на раковув агрессии. ; . • ~ . .

Практическое 'значена результатов. Уровень активности-.инги-' битора трипсина в сыворотка крови оперированных больных слунит. диагностически критерием развития-рецидивов и (или) метастазов-рака толстой кишки в различные сроки после хирургического вмеаа- . ■тельства.

. Сникение его до'нормальных величин свидс-¡льствувт о ради-: .'калькой харектере выполненной .операции. .Сохранение показателей ингибиторной активности сыворотки крови на,высокой уровне свид'е-. тельствует о паллиативной характере операции и позволяет внести соответствующие коррективы в лечебнуо тактику.

•Достоверное снижение активности протеиназ в.облученной опухоли, при отсутствую лучевого патоморфоза, кокет свукить одним -з критериев эффективности лучевой терапии* \

'. Внедрение 'результатов наследования.' Исследование компонентов протеолитичаской системы в сыворотке крови, ткани опухоли и лимфоузлах внедрено в Одесской областном онкологическом диспансера.

• Апробацк' -работы. Материала диссертации долокены на УП рес-' лубликанскоы съезде онкологов УССР (Симферополь, 1985),-1У всесоюзной съезде онкологов (Ленинград, 1986)* иендународной Звро-пейскоы'конгрессе онкологов (Броссапь; 1990). По теые диссертации опубликовано б статей, 3 тезисов- выступлений «а съездах и конференциях. Получена приоритетная справка на "Способ диагнозтики рецидивов и метастазов рака толстой, кики".

Объеи и структура диссертации.- Диссертация изложена на 126

• страницах машинописного текста и состоит из введения, трех г;.ав, вйводол и списка литературных источников."Текст иллюстрирован

25 таблицами и 9 рисунками. Библиография включает 165 источников (65 - русских, 100 - иностранных).

Работа выполнена за период 1985-1990 гг. на базе Областного онкологического диспансера'г.Одессы (главный врач Засл.врач УССР, кандидат медицинских наук Степула В.В.) и в лаборатории .биохимии (зав.дог.тор биологических наук Вовчук C.B.) Всесоюзного сепек-г ционно-генетического института. "

■■'••' СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Глава I. В аналитической обзоре литературы изложены резульг.. таты экспериментальных и клинических исследований активности комт понентов протеолитической системы у подопытных животных с пзреви^ тыии злокачественными опухолями и онкологических больных.

• Результаты эксперииентальных исследований на аивогных сви- ' детельствуот о том, что активность протеиназ и их ингибиторов в . злокачественных опухолях и сыворотка крови животных с перевитым'и-злокачественныаи опухолями отличается от показателей здоровой ткани ила сыворотки здорового'кивотного. Это связано с участием про-

• теолитичебкой системы в канцерогенезе: протеиназы стимулируют . пролиферацию клеток, рост опухоли, инвазии и^етастазированиа, ингибиторы тормозят эти процессы. .

Результаты клинических исследований согласуйся .с данными экспериментов: высокая активность протаиказ обнаружена в ткани рака грртани, злокачественных опухолях яичника, латки,-желудка, легкого, молочной келезы. Активность ингибитора трипсина в ткани злокачественных опухолей.-различных локализаций низе, чем в здоровой ткани. Большинство исследователей указывает-на-высокое содер-аание к ¿гибитора в сыворотке крови онкологических больных.

Протеолитическая активность опухолевой ткани и сыворотки крови больных раком толстой к.'?лки изучена недостаточно, а полученные результаты противоречивы. Не изучена зависимость активности протеиназ 'и их ингибиторов у больных ракой толстой киски от степени дифференцировки ткани, стадии заболевания, оставтся неяс-

• ниш: зозможности использования энзиыологических показателей для оценки радикальности операции, эффективности лучевой терапии, не

. разработаны ферментативные критерии диагностики,мониторинга и прогноза. Дальнейшее исследование активности компонентов прогео-■литической системы, v больных ракой толстой кишки представляет- • теоретический и практический интерес.

Тлава 2. Представляет материал и методы исследования. Изучены показатели активности протеолитчческях ферментов и ингибчгорз. .трипсина у 32 здоровых доноров, среди которых было 14 мужчин и 18' ненцин, 'а такке у 168 больных раком .золетой кигаи и доброка- „ чественныии опухолями прямей киски. Среди больных ракой толстой кишки - б? мукчин и 85 хешцин. Ворсинчатой аденомой болели 7 мугчин и 9 кенвдн. .'

Исследовано 32 -сыворотки крови доноров, 203 сыворотки крови больных, 139 биоптата ткани опухоли, 117 проб ткана толстой киш-

• ки вне олу'холи, Щ биоптата регионарных лимфоузлов (табл.1).

• Исследования-выполнялись на больных, диагноз которых сформу-лировзн на основании результатов традиционного исследования -клинического (осмотр, пальпация), 'лабораторного (анализы крови и мочи, содержание сахара.в крови, реакция Вассермана, определяемых по' показаниям -. соде^зшние билирубина, проФромбина, белка и бел-, ковых фракций,, мочевины, активности АЛТ, ACT, ИФ, ГГТП), рентгенологического (ирригоскопия, ФГ или ре^геноско^ия грудной клетки)-и морфологического (предоперационное и послеоперационное цитологическое и гистологическое исследования). Окончательный диагноз морфологически верифицирован з всех больных. Активность коа--понентов протеолитической системы изучалась по апробированным методикам. Активность нейтральных протеиназ определяли по гидролизу казеина методом M.Kunttz, активность кислых протеиназ - по гидролизу геиэглобина или методой м.ашзоп и' A. Ulrolcy. Содержание ингибитора Трипсина по тормокению гидролиза казеина кристаллическим трипсина! по А.П.Левицкому.

' Таблица I

Распределение материала по объектам исследования

Обьект исследования : Сыворотка « Опухоль \ крови . : * Неизмв-: ценная г Региоиар-: ные пкнфа-

Группа " : ткань : тические

• кашки : узлы

исследованных : и сс л е дова н •

Доноры.

Ворсинчатая ; . опухоль

Рак правой половины ободочной

кишки ■•

Рак левой половины' ободочной кишки

'Рак .прямой кишки

32 16

26

38

88

32 20х

47

46" 90

16

19

29 . 69

.19

29 .69

44

Число объектов исследования часто не соответствует числу больных по следующий причина!«: I) у ряда Сольных сыворотку исследовала неоднократно - до и после операции; 2) у больных^ перенесших симптомаические операцки, исследовали только сыворотку; У) у части больных исследование не состоялось по техническим .причииам. ' '

ь

Глава 3 представляет результаты собственных исследований и их обсуждение. .

Клинические, ренггенологлческае, ультразвуковые, радиоизо-. тонные и даке наиболее точные морфологические методики не пред. ставляют абсолютно достоверных критериев дифференциальной диагностики менду доброкачественными опухолями и раком прямой кишки, не позволяют своевременно выявлять рецидивы и метастазы. Отсутствие достоверных диагностических тестов делает актуальным поиск иных, неморфологических подходов к дифференциальной диагностике опухолей толбтой кишки и доклинической диагностика рецидивов и. метастазов;

Исследование сыворотки крови у доноров, больных раком толстой кишки и ворсинчатой аденомой прямой кишки показало, что активность ингибитора трипсина у б'-ьных раком достоверно выше, -чем у доноров и больных ворсинчатой аденомой (табл.2).

Активность нейтральных и кислых п^отеиназ г г зсех группах исследованных на представляет статистически достоверных различий. При исследовании уровня ингибитора трипсина в различные сроки после операции выявлено, что спустя I месяц и более после операции активность ингибитора трипсина в сыворотке зависит от характера выполненной операции. У больных,, перенесших радикальную операцию активность ингибитора снижается- до уровня, который -• соответствует показателям нормы или больных с доброкачественной опухолью. После симптоматических или паллиативных вмешательств активность ингибитора остается на высоком уровне (рис.1). У больных с рецидивами и (или) метастазами после радикальных операций уровень активности ингибитора трипсина оказывается в 2 раза выше, чем у здоровых доноров (рис.2).

Статистическая обработка материала позволила выявить показатель (Ц+2С>) активности ингибитора трипсина в сыворотке крови, являющийся максимальным для 95$ вариантов всей генеральной сово-- купнос.ти больных без рецидивов и метастазов. Если уровень ингибитора трипсина после радикальной операции равен или превышает 1,83, с 95% достоверностью моано утвервдать, что у больного рецидив и (или) метастазы рака толстой киши. .

Изучение активности протеолиза в 96 опухолях и неизмененной /анке толстой кишки показало, что активность нейтральных и кис-дих.протеиназ в ткани рака толстой кишки в 1,75-2,0 раза выше, цем в неизмененной кишечной стенке'. В доброкачественной опухоли -

ч Таблица 2

Показатели активности протеиназ и ингибитооа трипсина в сыворотке крови здоровых доноров, больных ворсинчатой вденоысй пряной кишки и реком толстой кишки (м+т)

Р- достоверность различий с показателен доноров.

3,2

3.0. 2,8. г,В.

2.1. - 2,2.

2,ош

),5

'¿■А (.о, о,в.

О,в. 0,4.

о.

г/л

Здородые' доноры

Радикальные операции

Лаллиатибные симптоматические операции

Ш.

ш

1

. Рис.1. Показатели содержания ингибитора трипсина & сыЬоротке кради доиороб ' и . бальных раком толстой кишки б аабисимости от радикальности Ьотолнвниай операции .•'•'.. / - до операции . ' • • •

" - 2 - иер'ез О недели после. операции :'

з- через- 1 месяц и более после операции

3.0,

г/л

1 г*

2,6 _ 2,4. 2,2.

<>*.

0,6. 0,6, 0,<

ОЛ. о

Здоробые домры

Без рецидиба и (или) метастазоб

■ РгиидиЬ и (или) метастазы

\ ч Р

I

I

¥

Рис. г.. Показатели ! содержания ингибитора трипсина д сыворотке кроби здоровых ■ доноров и Ъольпых . раком толстой кашки, переиесщих радикальные операции 1 - до операции

й- через /месац после ■операции з через б месяцев и более (до 4.5лет) после операции

ворсинчатой аденоме прямой кишки активность как нейтральных, . так и кислых протбиназ достоверно не отличается от соответсг-вующи4 показателей в ткани неизмененной стенки прямой кишки.

Активность ингибитора трипсина в ткани рака- толстой кишки в 1,68-1,84 раза ниже, чем в неизмененной кишке.

Расчеты показали, что отношение' ингибитор8 Б TKaHlí Рака толстой кишки как по нейтральным, так и по кислым протеиназам в 3,2-3,5 раза выше, чем в неизмененной стенке кишки, ч 2,43,9 раз выше, чем в ткани ворсинчатой аденомы (рис.3);

•Сопоставление -оказателей активности прогеиназ и ингибитора трипсина в опухолях не-позволило выявить достоверных различий в зависимости от степени-дилеренцировки ткани.

'Лсследовано 44 лимфоузла. В 23 лимфоузлах обнарухены метастазы, в 21 лимфоузле признаков метастазировакия не'выявпеко. Оказалось, что активность нейтральных протеиназ в метастатических лимфоузлах е 3,5 раза, а кислых прогеиназ в 2,2 раза выше, чем в лимфоузлах непораженных метастазами. Активность ингибитора трипсина в метастатических лимфоузлах достоверно не отличается от соответствующего показателя непораженных лимфоузлов. '

Сопоставление результатов исследования коипонентов протео-питичоской системы в опухоли'и неизмененной ткани пряной кишки у 21 облученного больного и 48 необлученных больных представлены в таблице 3. ••''"'.

Облучение проводилось по интенсивной методике аппаратом "Агат-Р". Разовая очаговая доза - 6,5 Гр. Суммарная очаговая доза 19,5 Гр. Оперировали больных через 24 часа после последнего сеанса лучевой терапии.

В облзченных опухолях активность нейтральных протеиназ 'оказывается-в 3,6 раза, в кислых протеиназ в 2,8 раза ниже, чем в необлученных. В связи с. противоположной направленностью изменений -активности ингибитора трипсина в облученных тканях, нами исследовано отношение "^гибитор^ в облученной и необлученной' опухоли. Отношение активности нейтральных протеиназ к. активности ингибитора в опухолевой ткани после лучевой терапии в 4 раза меньше, чем в необлученной опухоли. Для кислых протеиназ этот показатель после облучения в 3,1 раза ниже, чем до него.

При облучении в интенсивном режиме патоморфологическйе изменения в опухоли, являющиеся традиционным критерием эффектов-

$000. вооо,

7000. 6000 _ 5000 4000 зооо _ 2000 IООО

нкат/г

Нейтральны* нротешшзы Хцсцие протеина зы

ингибитор трисп'ини

щ

У//

ш

итиоигор трипсина

Фл

N

Рис.5.' Отношение протеинам -к ингибитору допухолах и неизмененной ткани прямой кишки ¡/ бальных раком прямой кишки и ворсинчатой адеиимоО прямой' кишки

I - неизмененная ткань кишки . г - ткань ворсинчатой аденомы прямой КIК ' /1\ ц • 3 - ткань ■рака прямой кишки

о

. ' Таблица 3

Активность протеиназ и ингибитора трипсина в ткани опухоли и неизме-. ненной стенке кишки у больных ракой пряней киски в зависимости от

применения лучевой тер?пии

Показатель • Протвиназы, нкат/кг : Ингибитор

Объект исследования — : п _» ' нейтральные | м+п : • кислые , Ы+т : трипсина, : г/кг. I • %т

■ао мх. Ш&я Без облучения После облучения • 48 21 548,37+70,18' .153,05+38,46 Р <~Ь,05 609,45+81,34 " 217,56+42,36 Р< 0,05 0,106+0,011 0,118+0,011 Р V 0,05

'А К «В Я еа к Я . я ¡в о а ООЬ5 ГС в О » Без облучения После-облучения 48 21 274,68+54,13 . 97,81+21,12 ■ Р < 0,05 326,06+56,18 ' 126,13+27,69 , Р <-"*0,05 ' 0,178+0,013 0,167+0,013 Р > 0,05

Р - достоверность различий между показателями облученной в необдучэнной ткани опухоли ц неизмененной стенки пряной кишки. '

и ости лучевой терапии, не успевают развиться. Поэтому показатели активности протеолитической системы, могут служить Крите риэи эффективности гаима-терапии у больных ракой прямой кишки.

.'•ВЫВОДЫ

.1. Активность ингибитора-трипсина в сыворотке крови больных ракой толстой кишки достоверно выев, чем у доноров и болышг. ворсинчатой вденоиой пряиой кишки.

2. Через 1 месяц после выполнения радикальной операции уровень активности ингибитора трипсина сыворотки крови больных ра- ■ кои толстой кивки соответствует показателям нории.

У больных, перенесших паллиативные или симптоматические операции,- показатели ингибитора трипсина остаются на высоком уровне.

• 3. В отдаленные сроки после радикальной операции (через 6-12 месяцев й. более) повъшеш'г. содернания ингибитора трипсина достигающее или превышающее 1,86'г/л достоверно свидетельствует о появлении рецидивов и (или) метастазов. При отсутствии признаков прогрессирования либо рецидива заболевания.-уровень ингибитора трипсина сохраняется на нормальном урозне.

Ткань рака толстой-киваса характеризуется высокой актив-• ностью протеолитическихферментов и низкой активностью ингибитора трипсина. Поэтому отношение ингибитор^ипсина33' Б июни опухоли монет спукить дополнительный диагностическим критерием между раком и ворсинчатой аденомой. . •

5. В пораженных метастазами лимфоузлах уровень активности прогеиназ достоверно выше,.чем а интактных.

6. В облученной опухолевой ткани активности протаиназ достоверно нине. чем в необлу ченной. Поэтому показатели активности протаиназ могут слуаигь критерием эффективности лучевой терапии.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО'ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Активность лротеолитических ферментов и их ингибиторов в опухолях и сыворотке крови больных со злокачественными новообразованиями // Клиническая онкология.' - Вып.З. - Киев, 1983.

- C.I08-II0.

2. Протеолитические ферменты и их ингибиторы в клинической и экспериментальной онкологии // Вопросы оккопогии. -.T.IXX,

№ 10. - £984. - С.9-18 (соавт. С.А.Гешеяин, С.В.Вовчук.'Б.Ф.Близ-нвк). . . • '

3. Активность протеолигических.ферментов и их ингибиторов . у больн : злокачественными новообразованиями иопочной «епезы и желудочно-кишечного тракта. Тез.докл. 1У Всесоюзного съезда он-'•

. кологов. '- Ленинград, "I?8S. - С.507-508 (соавт. С.А.Гевелин, С.В.Вовчук, Б.Ф.Близнюк).

4. Активность протеолитических ферментов и их ингибиторов в опухолях толстой'кишки // Вопросы медицинской химии. - 1990. ;; 2. - С.33-35. • ■'. "

5. Activity of "proteinases et inhibitor of tripsin^ Ъу oncological patienta. V Congreoo of European socieaty of surgical oncology. - Brussels. Belcium, October 17-20,-1990. - p.128 . (S.Geshelin, M.Ibragim, S-.Vovtchu.lc, B.Bliznyk, A.Dtsik, A.Zgura).

6. Протеиназы и их ингибиторы в сыворотке.крови больных' раком толстой кишки. Тез.. докл>. областной научно-практической : конференции. "Онкологические принципы в хирургии". - Одесса, 1991. - С;8-9 (соавт. С.А.Гешепин, С.В.Вовчук). ' . . .