Автореферат и диссертация по медицине (14.00.16) на тему:Активация клеток гипоталамических структур крыс при введении антигенов после электроболевого раздражения

На правах рукописи

Гаврилов Юрий Владимирович

АКТИВАЦИЯ КЛЕТОК ГИ ПОТ АЛА.\1 ИЧЕСКИХ СТРУКТУР КРЫС ПРИ ВВЕДЕНИИ АНТИГЕНОВ ПОСЛЕ ЭЛЕКТРОБОЛЕВОГО РАЗДРАЖЕНИЯ

14 00 16 - патологическая физиология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

ЧИН»

Санкт-Петербург -2007

Работа выполнена в Отделе общей патологии и патологической физиологии

Государственном Учреждении Научно-исследовательский институт экспериментальной медицины Российской Академии Медицинских Наук.

Научный руководитель' доктор медицинских наук, академик РАМН,

профессор Корнева Елена Андреевна

Официальные оппоненты- доктор медицинских наук,

профессор Петрищев Николай Николаевич

доктор медицинских наук,

профессор Малинин Владимир Викторович

Ведущая организация- Военно-медицинская академия им С М Кирова

Защита диссертации состоится 18 октября 2007г. в И часов на заседании диссертационного совета Д001 022.02 при ГУ Научно-исследовательский институт экспериментальной медицины РАМН по адресу 197376, Санкт-Петербург, ул Акад Павлова, д. 12

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке ГУ Научно-исследовательский институт экспериментальной медицины РАМН по адресу 197376, Санкт-Петербург, ул. Акад Павлова, д 12

Автореферат разослан «14» сентября 2007 г

Ученый секретарь диссертационного совета

Петрова Е.С

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

1.1. Актуальность проблемы

В процессе жизнедеятельности человек постоянно подвергается воздействию физических, эмоциональных, психологических нагрузок, вызывающих стрессорные реакции, которые могу! приводить к снижению активности защитных функций организма, вследствие чего повышается риск развития заболеваний инфекционной, аллергической и опухолевой природы В практической медицине данные нарушения характеризуются как вторичные иммунодефицита индуцированной или спонтанной формы (Хаитов Р М, 1999)

Экспериментальными и клиническими работами доказано влияние стресса на изменение функции иммунной системы Так, иммобилизационный стресс у мышей на фоне гриппозной инфекции подавляет клеточный иммунитет (Sheridan J F et al ,1991) GJ Brenner and JA Moynihan (1997) исследовали эффект электроболевого раздражения (ЭБР) после заражения мышей вирусом герпес HSV-1, и выявили снижение уровня антител к IgM anti-HSV и повышение уровня инфицированное™ у мышей S N Shanin et al (2005) показали снижение цитотоксической активности NK клеток при электроболевом раздражении крыс, причем интенсивность этого снижения зависела от силы стрессорного воздействия Исследования, проведенные R Glaser (1990) выявили подавление экспрессии гена ИЛ-2 мРНК и ИЛ-2 в Т-лимфоцитах периферической крови человека при психоэмоциональном стрессе (экзамены у студентов)

Впервые влияние мозга на течение инфекционного процесса показано в работах И Г Савченко (1891), Е С Лондона (1899), а вопрос о возможности участия мозга в регуляции иммунологических реакций впервые поставлен С Метальниковым (1925) Позже, было установлено влияние разрушения структур головного мозга (Корнева Е А, Хай Л М, 1963) и электростимуляции заднего гипоталамического поля (Корнева Е А и др, 1967, Корнева Е А и др, 1978) на развитие иммунных реакций Полученные результаты позволили показать, какие структуры гипоталамуса участвуют в процессе центральной регуляции функций иммунной системы

В настоящее время разработан ряд молекулярно-биологических и биохимических методов исследования, позволяющих выявлять отдельные клетки головного мозга, активирующиеся в ответ на различные воздействия Одним из таких методов является

определение маркерных генов активации клеток нервной системы, в частности протоонкогена c-fos и его производаого белка c-Fos (Curran Т, 1982, Bullitt Е, 1990)

Конститутивный уровень экспрессии c-fos гена в нервных клетках незначителен (Curran Т, 1988), однако, воздействие внешних стимулов различных видов приводит к быстрому и кратковременному повышению экспрессии гена c-fos в нейронах мозга (Giuha С et al, 1986, Bullitt Е, 1990, Guthrie К М, 1995, Oladehin А 1995, Muller Y М et al, 1997, Hata R et al, 1998, Conde G L et al, 1999, Girotti M et al, 2006, Ueyama T et al, 2006)

При анализе структур мозга, отвечающих на введение антигена, часто используется бактериальный липонолисахарид (ЛПС), тимус-независимый антиген, который является мощным индуктором синтеза провоспалительных цитокинов (Elmquist J К et al, 1993, Rivest S et al, 1995, Yokoyama C, 1999, Datta SC et al, 2007), тогда как, бычий сывороточный альбумин (БСА) - тимус-зависимый антиген вызывает менее выраженные неспецифические реакции (Абдуллаева 3 Д, 1989, Torres В, 2001)

Сравнительные исследования особенностей паттерна активации структур головного мозга на введение антигенов различной природы до настоящего времени не проводили

Стрессиндуцированные изменения реакций мозга на введение различных антигенов так же не исследованы

Изучение особенностей паттерна активации структур мозга при воздействии антигенов различной природы, а также эффектов сгрессорного воздействия, в частности электроболевого, на алгоритм антиген индуцированной активации клеток и структур центральной нервной системы представляет особый интерес, поскольку эти знания являются основой для поиска путей коррекции стресс индуцированных дисфункций иммунной системы

Таким образом, работа посвящена изучению стрессиндуцированных изменений реакций мозга на введение антигенов различной природы Данные изменения являются проявлением нарушения одного из центральных механизмов взаимодействия нервной и иммунной системы в условиях применения иммуносупрессивного стимула (стрессирующего фактора) Результаты исследования создают предпосылки для поиска рациональных способов коррекции стрессиндуцированной супрессии функции иммунной системы, что характеризует актуальность проводимого исследования, важного для фундаментальной науки и клиники

1.2. Цель и задачи исследования

Целью работы явилось изучение реакций мозга и иммунной системы на введение антигенов различной природы и их изменений после воздействия электороболевого раздражения

В задачи работы входило

1 Исследование особенностей паттерна активации клеток и структур гипоталамуса крыс при внутривенном введении антигенов различной природы (липополисахарида или бычьего сывороточного альбумина)

2 Сравнительный анализ алгоритмов активации гипоталамических структур после внутривенного введения антигенов различной природы (липополисахарида или бычьего сывороточного альбумина)

3 Исследование паттерна активации клеток и структур гипоталамуса крыс после электроболевого раздражения

4 Сравнительный анализ изменения паттерна активации нейронов гипоталамических структур крыс после воздействий антигенной (липополисахарида или бычьего сывороточного альбумина) и не антигенной (электроболевого раздражения) природы

5 Анализ эффектов действия электроболевого раздражения на инициированный введением различных антигенов (липополисахарида или бычьего сывороточного альбумина) паттерн активации гипоталамических структур крыс

6 Анализ эффектов действия электроболевого раздражения на интенсивность иммунного ответа крыс, индуцированного внутривенным введением различных антигенов (липополисахарида или бычьего сывороточного альбумина)

7 Сравнительный анализ алгоритма активации гипоталамических структур головного мозга и интенсивности продукции антител после последовательного применения электроболевого раздражения и внутривенного введения антигенов (липополисахарида или бычьего сывороточного альбумина)

1.3. Научная новизна работы

Впервые определены различия паттерна проявляющегося изменением характеристики степени интенсивности и соотношения активации клеток и структур гипоталамуса крыс (по количеству с-Ров позитивных клеток) характерных для реакции на введение различных антигенов - липополисахарида или бычьего сывороточного альбумина Электроболевое раздражение приводит к снижению степени интенсивности иммунного ответа на введение антигенов различных природы (липополисахарида, бычьего сывороточного альбумина), а так же степени и паттерна активации клеток и структур гипоталамуса, характерных для реакций на ведение антигенов

Полученные результаты позволяют предположить возможность участия выявленных изменений реакций мозга на антигены в механизмах развития реализации стрессиндуцированной иммуносупрессии и создают основы для поиска путей направленной коррекции нарушений, возникающих при приобретенных дисфункциях иммунной системы

1.4. Теоретическая и практическая значимость работы

Работа является необходимым этапом изучения центральных (птоталамических) механизмов реализации реакции организма на антигенное воздействие и развития стрессиндуцированной иммуносупрессии, что создает основы для поиска способов лечения вторичных (стрессиндуцированных) иммунодефицитов

Результаты работы могут быть использованы в научной практике, в том числе, при разработке способов терапии приобретенных стрессиндуцированных иммунодефицитов, а так же войти в курс преподавания физиологии, патофизиологии, и иммунологии

1.5. Основные положения, выносимые на защиту

1 Внутривенное введение крысам антигенов (липополисахарида или бычьего сывороточного альбумина) приводит к активации определенных птоталамических структур, паттерн которой различен

2 Степень активации птоталамических структур после внутривенного введения крысам липополисахарида более выражена, чем после инъекции бычьего сывороточного альбумина, что соответствует уровню интенсивности иммунного ответа количество антителобразующих клеток в селезенке более высоко после внутривенного введения липополисахарида

3 Электроболевое раздражение приводит к выраженной активации определенных гипоталамических структур

4 Активация гипоталамических структур крыс после электроболевого раздражения более выражена, чем после введения липополисахарида или бычьего сывороточного альбумина

5 Применение электроболевого раздражения приводит к снижению степени активации клеток структур гипоталамуса, вызванных внутривенным введением антигенов, причем снижение реакции на введение липополисахарида более выражено, чем на введение бычьего сывороточного альбумина

6 Электроболевое раздражение приводит к снижению количества ангителобразующих клеток в селезенке крыс, образующихся в ответ на внутривенное введение липополисахарида или бычьего сывороточного альбумина, которое более выражено после введения липополисахарида

7 Снижение степени активации гипоталамических структур на введение липополисахарида или бычьего сывороточного альбумина после электроболевого раздражения сочетается со снижением интенсивности иммунного ответа на эти антигены

1.6. Апробация работы:

Материалы исследования представлены на Российских и Международных научных Форумах The 6Л International Society for NeuxoImmunnoModulation (Athens, 2005), VIII Congress of International Society for Adaptive Mdicme (Moscow, 2006), Дни иммунологи в Санкт-Петербуге- 2006, Научная конференция Отдела общей патологии и патологической физиологии ГУ НИИ ЭМ РАМН (Санкт-Петербуг, 2007), Научная конференция молодых ученых, посвященная 115 годовщине со дня основания Института Экспериментальной медицины (Санкт-Петербуг, 2007), International symposium, International of the nervous and mumme systems m health and disease (Saint-Petersburg, 2007)

1.7. Структура и объем работы:

Диссертация изложена на 144 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов работы, результатов собственных исследований и их обсуждения, выводов Библиографический список использованной литературы содержит 287 источника Работа проиллюстрирована 1 таблицей, 22 рисунками

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Эксперименты выполнены на 88 крысах-самцах Wistar, массой 180-220 г Животных, адаптированных к условиям эксперимента, подвергали электроболевому раздражению в течение 60 минут или внутривенно вводили антиген (ЛПС или БСА), а так же проводили ЭБР и через 1 час после его окончания, внутривенно вводили ЛПС или БСА. В качестве контроля использовали интактных животных, крыс, получивших ложное ЭБР, внутривенное введение апирогенного физиологического раствора, а так же их сочетание

ЭБР производили через электроды, установленные в область голеностопных суставов Сила электрического импульса постоянного тока составляла 2,5мА, длительность - 1 сек, 10 ударов/мин в случайном порядке В качестве антигенов использовали бактериальный липополисахарид E-coli (Sigma, L-2880) в дозе 25 мкг/кг и бычий сывороточный альбумин (Sigma А 9543) в дозе 25000 мкг/кг веса животного в 200 мкл физиологического раствора (0,9% NaCl)

По окончании эксперимента животные были наркотизированы нембуталом (60 мг/кг веса) с последующей интракардиальной перфузией теплым физиологическим раствором (50 мл), содержащим 10 ед/мл гепарина, со скоростью протекания 10-15 мл/мин, затем 250 мл фиксирующего раствора 4% парафармальдегида и 0,2% пикриновой кислоты в 0,1 М фосфатном буфере рН 7,4 C-Fos позитивные клетки, выявляли иммуногистохимически непрямым методом (Broune,1983) с применением поликлональных антител к белку c-Fos («Sigma», 1 5000, Lot 079Н 4859)

Подсчет клеток производили, используя компьютерную систему Иста-Видио-Тест (Санкт-Петербург) Фронтальные срезы мозга исследовали под световым микроскопом марки Jenamed 2 После иммуногистохимического выявления c-Fos позитивных клеток определяли их количество

Поскольку количество c-Fos позитивных клеток в гипоталамических структурах у контрольных животных (после введения физиологического раствора, ложного ЭБР или введения физиологического раствора после ЭБР) различно, для сравнительной оценки степени активации структур гипоталамуса вычисляли относительный коэффициент активации (ОКА) по формулам 1-3

Формула 1

количество c-Fos-позитивных клеток после введения антигена (.ЛПС или БСА)

Относительный коэффициент активации при внутривенном введении антигена (липополисахарида

или бычьего сывороточного альбумина)

количество c-Fos-позитиных клеток после введения физиологического раствора

Формула %

количество c-Fos- позитивных клеток

Относительный коэффициент активации при электроболевом раздражении

после электроболевого раздражения

количество c-Fos-позиттных клеток после ложного электроболевого раздражения

Формула 3.

Относительный коэффициент активации при элемроболевом раздражении сочеганном с внутривенным введении антигена (липополисахарида или бычьего сывороточного альбумина)

количество c-Fos-noзumuвныx клеток после электроболевого раздражения сочетанного с введением физиологического раствора

количество c-Fos- позитивных клеток после электроболевого раздражения сочетанного с введением антигена(ЛПС или БСА)

Для определения интенсивности иммунного ответа у крыс после введения антигенов (ЛПС или БСА), а так же после проведения ЭБР с последующим введением антигенов (ЛПС или БСА), использовался метод локального гемолиза (безгелевый) (Фримель Г, 1987) Через 7 суток после воздействий, определяли количество зон гемолиза, в центре которых находились ангителообразующие клетки селезенки

Результаты экспериментов обрабатывали с помощью стандартных методов вариационной статистики Достоверность различий оценивали по t-зависимому критерию Стыодента Графики выполнены на IBM PC при помощи программы Excel с использованием компьютерных программ Rat Brain Maps (Swanson L W ,1992)

3.1. Изменение количества c-Fos позитивных клеток в гипоталамических структурах крыс после введения ЛПС или БСА

Введение физиологического раствора вызывает повышение количества c-Fos позитивных клеток, в AHN, DMH и VMH по сравнению с их количеством у интактных животных

При внутривенном введении, как ЛПС так и БСА отмечается увеличение количества c-Fos-позиотвных клеток в AHN, PVH, LHA,VMH, DMH, PH крыс по сравнению с их количеством у животных, которым внутривенно вводили физиологический раствор (Таб 1)

3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

При анализе количества c-Fos позитивных клеток в каждой структуре выявлено, что введение ЛПС приводит к более выраженной активации клеток гипоталамических структур AHN, PVH, LHA-28, DMH, PH, по сравнению с реакцией клеток этих же структур на введение БСА

После введения ЛПС наибольшее количество c-Fos-позитивных клеток выявлено в AHN, PVH, а после введения БСА - в PVH Наименьшее количество c-Fos-позигивных клеток обнаружено в VMH, как после введения ЛПС, так и после введения БСА (Таб 1) Таким образом, при введении антигенов различной природы (ЛПС или БСА) наибольшее количество c-Fos-позитивных клеток обнаружено в PVH, а наименьшее - в VMH

3.2. Количество c-Fos позитивных клеток в гипоталамических структурах после электроболевого раздражения.

Для оценки изменения количества активированных клеток в конкретных гипоталамических структурах после применения ЭБР определяли количество c-Fos позитивных клеток в каждой структуре, в качестве контроля использовали крыс, подвергнутых ложному ЭБР

Проведение ЭБР вызывало значительное увеличение количества активированных нейронов в AHN, PVH, LHA,VMH, DMH, PH Несмотря на то, что ЭБР приводит к активации клеток всех исследованных структур гипоталамуса, наибольшее количество c-Fos позитивных клеток выявлено в AHN и PVH, а наименьшее - в VMH (Таб 1), как это характерно и для реакций гипоталамических нейронов на введение антигенов

3.3. Активация клеток: гипоталамических структур при введении антигенов (липополисахарида или бычьего сывороточного альбумина) после электроболевого раздражения.

При анализе количества c-Fos позитивных клеток в гипоталамических структурах крыс после сочетанного проведения ЭБР с последующим внутривенным введением антигена (ЛПС или ВСА), в качестве контроля использовали животных, которым производили внутривенную инъекцию апирогенного физиологического раствора после ЭБР

Выявлено снижение реакции на ЛПС у животных, подвергнутых ЭБР (по количеству активированных клеток в структуре), что констатировано в AHN, PVH, LHA-28 и VMH (Табл 1) ЭБР, сочетанное с введением БСА, не изменяет количества активированных клеток структур гипоталамуса, характерного для реакции на введение БСА (Табл 1)

Таблица 1. Количество с-Роэ-позитивных клеток в структурах гипоталамуса крыс при сочетанием применении электроболевого воздействия и внутривенного введения антигенов

(липополисахарида или бычьего сывороточного альбумина)

Количество с-Роэ-позитивных клеток в структурах гипоталамуса

АШ РУН ЬНА-25 ЬНА-28 РМН УМН РН

Интактные 1 5+0,3 1±0,3 0 9+0,2 0 6±0,2 0 5+0,1 0 8+0,3

После

ложного электроболевого раздражения 1 8+0 3 2 9+0 5 2 6+0 6 1+0 3 4 5+1 1 5+0 3 0 5+01

внутривенного введения физиологического раствора 4 3+18 4+2 2 2 6+12 2+0 8 5 8+0 9 1 8+0 3 2 8+1 1

электроболевого раздражения 18 9+3 2 ••АА 25 4 +4,3 • •АА 14 2+2 3 • АА 9 8+2 7 • А 11 1+2 • А 6+1 6 • А 9 8+21 • А

электроболевого раздражения и внутривенного введения физиологического раствора 7 3+1,5 ••АА 264+ 3,4 ••АА 104+2 • АА 7 4+ 1,3 • А 12 6+3 • А 7 8+ 1,1 • АА 9 3+28 • А

внутривенного введения липополисахарида 17 2+ 2,3 •*1ПГ 26 8+ 3 2 •*1ПГ 10 1 +1,4 4 114+0,7 13 6+17 6 2+05 *1Г 11 5+2 «II-

внутривенного введения бычьего сывороточного альбумина 9 1+1,3 ••ш 18 2+2,3 •ннн 10 8+2,5 НЬ 8 8+0,5 9 5+1,5 56+14 *1Г 6 8+17 •1

электроболевого раздражения и внутривенного введения липополисахарида 8 6+1,5 • •$АА€# 153+25 ..■Н=де*# 8 6+1,4 •1А6 2 2+0 5 «Ц=А€ *# 15 7 ч*« 4 6+0,3 Ч-дс 8 7+ 1,3 ЧгАе

электроболевого раздражения и внутривенного введения бычьего сывороточного альбумина 12 3+3 3 .•Н-дде 33 6+ 6,7 8 9+2,1 Н1=А€ 7 6+ 1,7 •$А€ 9 9+1,3 <А€ 5 9+1 1 9 5+ 1,6 •*Де

Достоверность различий по сравнению с количеством с-Ьоу позитивных клеток в гипоталамических структурах

у интакгных животных - • -Р<0,02, •• -Р< 0,01,

после

ложного электроболевого раздражения - А - Р< 0,02, А А -Р< 0,01, введения физиологического раствора - ^ - Р< 0,05, - Р< 0,02, элекгроболевого раздражения - € - Р< 0,05,

элекгроболевого раздражения и внутривенного введения физиологического раствора-*- Р< 0,05, внутривенного введения липополисахарида - # - Р< 0,05, внутривенного введения бычьего сывороточного альбумина - & - Р<0,05, элекгроболевого раздражения и внутривенного введения липополисахарида - £ - Р< 0,05

3.4. Сравнительный анализ степени относительной активации гипоталамических структур крыс после различных воздействий: введения антигенов (липополисахарида или бычьего сывороточного альбумина), электроболевого раздражения.

Сравнительный анализ степени активации структур гипоталамуса после применяемых воздействий в целях выявления наиболее активированных структур после конкретного воздействия, потребовал определения относительного коэффициента активации (ОКА), вычисленного по формулам 1-3 (приведенным в разделе Методика)

Анализ величин относительных коэффициентов активации гипоталамических структур показал, что внутривенное введение ЛПС индуцирует активацию структур гипоталамуса различной степени выраженности высокая степень активации характерна для PVH и LHA -28, менее выражена активация РН и LHA-28, наиболее низка - в DMH

Введение БСА, приводит к увеличению относительной степени активации большинства исследуемых структур, которое наиболее выражено в PVH, LHA, VMH, РН и сравнительно низко - в AHN и DMH Сравнительный анализ ОКА позволил обнаружить, что степень активации ряда гипоталамических структур (AHN, PVH, LHA-28) при введении ЛПС превосходит интенсивность реакций этих же структур на введение БСА

Таким образом, введение ЛПС и БСА инициирует активацию определенных структур гипоталамуса, степень и паттерн которой характерен для каждого из исследованных антигенов

Необходимо отметить, что паттерн активации клеток, определенный по количеству с-Fos позитивных клеток, и алгоритм относительной активации структур гипоталамуса после введения антигенов (ЛПС или БСА) не идентичен, так как величина ОКА, зависит от количества c-Fos позитивных клеток в данной структуре мозга у контрольной группы животных

После проведения ЭБР степень относительной активации наиболее высока в AHN и РН, несколько менее выражена - в PVH и LHA и наиболее низкая - в VMH и DMH

Анализ изменений ОКА после различных воздействий позволил определить различия паттерна активации гипоталамических структур Введение ЛПС приводит к наиболее выраженной относительной активации PVH и LHA-28 Введение БСА, вызывает минимальную относительную активацию AHN и DMH Наиболее высокая степень относительной активации при применении ЭБР характерна для AHN и РН Необходимо отметать, что при всех видах воздействия наименее интенсивно активируется DMH

Рис ]. Степень относительной аКТИвацЧИ гшюталаммчееких структуру крыс после тектроболевого воздействия, ввелепия ainrrreiioR (Я'лпеподнс^игпрклл , бычьего сывороточного альбумина) Относительные v ":-j>n¡L>^'ib пкт.шлцни после: элекроболевого раздражения { О ); внутривенного ннслсния -ли(Юполисахарида ( О К бычьего сывороточного альбумина ( ■ )

По оси абсцисс: Структуры гипоталамуса, Велшпша относительного коэффициент вычислялась по формуле 1,2.

1 - Р< 0,05; 2- N 0,01 - по сравнению с относительным коэффициентом акпгвации после )лс.кроеuo о разлраження.

Следует так же отмстить наиболее высокую степень активации ряди гилоталамических структур после ЭБР (в AHN, PVH, LHA-25, PEI) по сравнению с реакциями на введение ЛПС или БСА (Рис.1)

3.5. Сравнительный анализ СТШпн от носитель"ой активации структур гипоталамуса крыс после сочетанного применении злекгрпбплевпго раздражения и введении am нгена (лнноиолиеакарнда или бычьего сывороточного альбумина).

Для проведения сравнительного анализа степени относительной активации структур гипоталамуса после соч ста иного воздействия ЭБР и в велении различных антигенов оценивалась величина ОКА, рассчитанного но Формуле 3, Введение jlTTC. после ЭБР велел к выраженной относительной активации ATiN, DMI-1 и Plf, а после сочетания ЭБР и введения БСА - AHN, PVHHPH.

Степсгтъ относительной активации всех, исследуемых пшоталамячеосих структур {AHN, PVH, LHA. ГЗМН, VMH, РП) на введение ЛПС снижается после ЭБР, причем наиболее выраженные изменения характерны для реакций PVH, LHA-28 (Рис. 2).

t

3 3

*s

i 2-1 J

с

I 1

и о

P о ■

ТЙ

2

щ

AHNI

_.3_

f

■I 1

Г

PVH LHA-25 LHA-28 DMH VMH

PH

Рис, 2. Степень относительной активации гипегталамнческих структур I.:после злектроболевого раздражения и последующего введения лпиополисахарида. Г1о оси орлицут- кс.i'1.1;.'.■ í.'i относительного коэффициента ;:ki п:(.поели: - внутривенного введения :еи по полисахарида сочетаннош применение улектроболевого раздражения л вселения лнпополисахарнда [ j fio оси абсцисс: структур]?! 1'И1К-п2--|ЗмуС4

Величина относительного коэффициент вьптслялась по формуле !, 3.

1 - Р-=0,02; 2- Р<0,0[Ь; 3- P^U,00Ü4 - по сравнению с величиной относительного коэффицие^а активации ;шюгаламимсскйХ к крыс поеле внутривенного введения лтюполиеахарида.

Стресс иду цированное снижение степени относительной активации гипоталамнческих Структур на введение БСА было наиболее выражено в PVII., Ll-ÍA. VM11 и менее Выражено в DMI1.PII (Рис.3).

Таким образом, сравнительный анализ паттерна относительной активации структур гипоталамуса при введении антигенов различной природы (ЛПС или БСА} йшволил выявить снижение ее интенсивности при ЭБГ'. (Рис 2, Рис 3).

! 7П-

i 6

■е-

if

ti

íi

1

□

AUN

PVH LHA'25 LHA-28 DMH VMH РИ

Рис. 3. Степень относительной аюивдции гнпоталамических егруктур крыс после злсктроболсвого раздражения и последующего введения оычьего сывороточного альбумина. По оси ординат: величина относительного коэффициента активации

после: внутривенного введения бычьего сывороточного альбумина ( [} ), сочетанного применение электроболевого раздражения и внутривенного введения бычьего сывороточного альбумшш { Ц ). По оси абсцисс: структуры гипоталамуса.

Величина относительного коэффициента вычислялась по формуле 1,3.

1 - Р<0402 ; 2 - Р<0,002 - по сравнен то с относительным коэффициентом активации и гипоталамических структурах крыс после внутривенного введения бычьего сывороточного альбумина;

Сравнительный анализ ОКА гниигтамических структур после сочетал ног о воздействия ЭБР и введения различных антигенов (ЛИС или БСА) позволяет констатировать. что ЭБР вызывает более выраженное снижение степени относительной активации структур гипоталамуса (РУН, \'МН) на введение ЛГТС по сравнению с реакцией па введение БСА (Рис.4)

Г 2.5 г

■ 2 -

1,5 -

5 0,5 -

X

О

0

1 о

f

О

I

AHN

I HA-7S I НА-?Я

ПИН

vmh

РН

Рис. 4. Степени относительной активации пннтшамических структур крыс после эпектробопевоги раздражение и последующего введения антигена (липополисахарида или бычьего сывороточного альбуиина). По оси ординат, величина относительного коэффипиенга активации после: сочеггаппого применения злектробогтевого раздражения и внутривенного введения липопелисахарида ( К сочеганнога применение электроболеного разлажен и н и внутривенного введения бычьего сывороточное альбумина ( Н 1 По оси абсцисс: Структуры гипоталамуса.

Величина относительное коэффициента вычислялась но формуле -V

I - Р<0.05 - по сравнению с рс:цн:исй после злск|роболевого раздражения и последующего внутривенного введения липополисахарида.

Таким образом, сравнительный анализ представленных данных показал, что

применение ЭБР, оочетанное с последующим введением различных антигенов (ЛПС или

БСА), приводит к снижению степени относительной актнвкшт пашгапамическюс структур

на аятнгены различной природы. Паттерн этих изменений зависит ог вида вводимого

антигена и характерен для мозаики относительной активации гипоталамичееких структур

при определенном сочетании воздействий {Рпс 2, Рис 3).

3.6. Интенсивность иммунного ответа крыс после введении антигенов (ли но полисах приза или бычьего сывороточного альбумина) II соч ста нного применения электроболевого раздражения н введения антигенов.

Количество антителобразующих клеток селезенки крыс анализировали через 7 суток после в/п введения антигена (ЛПС или БСА) или сочеганиого применения ЭБР и антигенов (ЛПС или БСА). В качестве контрольных использовали животных, подвергнутых ложному ЭБР, в/в введению агщрогенного физиологического раствора, а так же сочетанному применению этих воздействий.

Анализ количества клеток, образующих антитела, выявил низкий уровень их

15

содержании в селезенке интактных животных (9.33±2.36 на 10' лимфоцитов нагруженных ЛИС и 24±0,82 на Ю6 лимфоцитов нагруженных БСА) (Рис. 5), Введение физиологического раствори не вызывало изменения количества клеток, образующих антитела, в селезенке крыс (Рис.5).

Через 7 суток после введения ЛПС или БСА у экеиври ментальных животных обнаруживаются АОК к соответствующему антигену (ЛПС или БСА) (Рис 5, Рис 6), В среднем после инъекции ЛПС количество АОК возрастало до 87,6 + 0,47, (Р < 0,0007 по сравнению с реакцией на введение физиолоптческого раствора). Введение БСА приводило к увеличению количества АОК лишь до 40 ± 2,83. (Р < 0,002) (Рис 5, Рис 6). Таким образом, введение ЛПС вызывает более интенсивный иммунный ответ, по сравнению с реакцией на БСА, поскольку ЛПС, как известно, обладаем большей степенью иммуногеыносги.

Применение ЭБР приводит к снижению интенсивности нммушюго ответа на введение Л11С или БСА. Количество антителообразующих шюш и селезенке крыс при введении этих антигенов после электроболевого раздражения существенно снижается и соответствует:

- при введен"ч ЛПС - 17,33 + 3,3, (V < 0,0007 но сравнению с и>; количеством у животных, которым вводили только ЛПС) (Рис. 5);

- при введении БСА - 24 + 1,4!, (Р < 0,002 тю сравнению с их количеством у животных, которым вводили только ЬСА) (Рис. 6).

£ |

100,00 -90,00 80,00 ■ 70,00 ■ 60,00

II 50,00 40.00

11 зо.оо

£ 20,00

Й 10,00

§ о,оо

нв

ж

-$а

Сне. 5. Количество антител ообрагующш клеток к лшпталнеаларыду, введенному после электроболсвш-о

р.Ч 1ДрЛЖгН|'и

По ос» абсцисс. Количество аититедообразующих клеток: 1 - у иитактиых jKtTBOTifbix, после: - 2- введения физиологическое раствора. - ложного элс^проболевого раздражения и кведения физиологического раствора,

- 4 - мектро болевого раздражения, - 5 - введение лицоиолкевхарида, - 6- злекгроболевого раздражения и введена* ;1НЕЕ0!ЕОЛнсакурнда

По сравнению с количеством аятителообршугощик клеток: животных:

- # - 0,003 - у нгакпшх; поете:

- * - Р<0,005 - введения физиологического раствора:

- + - Р<0,005 - элекгроболевого раздражения и внутривенного вьеденич физиологического раствора: ■S - Р<0,05 - элеюроболевого раздражения;

-а -Р<0,0007 - введения лшюполнездздвдз.

Таким образом, интенсивность иммунного ответа на введение ЛПС или БСА у животных, подвергнутых ЗБР, снижается на 80,2% и 40% соответственно.

II

та ^г

If

яр ?

100,00

90,00

ао.оо

70,00

бо.оо

50,00 40,00

зо.оо 20,00 10,00 0.00

fk\

^ -'¡Щ??

i ^ i_ISiii

Й!

-ytr

Рнс. & Количество .И" л тс.тобр^п кипи! клеток к бычьему сывороточном)' илъбучнпу, введенному после злекгроболевого раздражении.

По осп абашсс животные: Кол}!чсство агггнтслоо&рлзугоиЕих клеток: I- шггактные, после: 2- введения физиологического раствора. " - ложною элекгроболевого раздражения и введения физиологического раствора, 4- электроболевого раздражения, 5 - ввелеггия бычьего сьпюроготного альбумина, б- злектробшевого раздражения и введения бцчьеЕ-о сыаороточЕюго альбумина. По сравнен иго с кол1ггеством агпителообразуюшнх клеток- у животных:

- # - Р---0.005 - ингакгных, после:

- * - Р<0.005 - введения физиологического раствора;

■ - - Р<0,005 - элсктроболсвого раздражения и внугрнвешюго введения физиологического раегйора; -$ - злеетроболсвого раздражении;

-а -Р<0,0007 - введения введения бычьего сывороточного альбумина.

Таким образом, сравнение степени выраженности реакций мозга и изменения интенсивности иммунного ответа на введение ЛПС или ВС А после ЭБР позволяет констатировать снижение степени активации клеток и струкгур гипоталамуса, а так же интенсивности иммунного ответа на эти антигены при введении их после ЭБР.

4. ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В последние десятилетия большое количество работ в области иммунофизиологии посвящено углубленному изучению механизмов взаимодействия нервной и иммунной систем на клеточном и молекуляр и о-ген этическом уровнях. (Eescdovsky Н.О.. del Key А., 1991; Banks W.A., 1995; Goehler el al„ 2000; 1.aye S., 2000; Denes A.. 2005).

Полученные данные свидетельствуют о илнянни не антигенных и антигенных воздействий на уровень активности клеток иммунной и нервной систем (Корнева Е.А,, Шхинск Э.К.. 1988: Bullitt К., 1990; Hankaniemi Р., 1992; Hosoi et al„ 2002; Li Q.. 2005; Shanin

17

SN et al, 2005) Согласно современным представлениям, интенсивность реакций, происходящих в иммунной системе, в большей степени зависит от уровня функциональной активности определенных структур головного мозга

Хотя в литературе существуют данные о влиянии стрессирующих факторов на изменение интенсивности иммунного ответа (Brenner G J et al, 1997, Meitzer J С et al, 2004, Charmandari E et al, 2005, George P et al, 2005, Li Q, 2005 Kyrou I et al, 2006), вопрос о центральных механизмах стрессиндуцированных дисфункций иммунной системы остается открытым

В данной работе исследован паттерн активации гипоталамичееких структур, определяемый по изменению количества c-Fos позитивных клеток, после введения антигенов различной природы - ЛПС или БСА

Анализ изменений паттерна активации клеток гипоталамичееких структур после внутривенного введения ЛПС или БСА позволил показать, что интенсивность активации клеток определенных гипоталамичееких структур, а именно AHN, PVH, LHA-28, DMH, PH более выражена при введении ЛПС, чем БСА

Сравнительный анализ изменений интенсивности активации исследуемых структур гипоталамуса (определяемой по относительному коэффициенту активации-ОКА) после введения антигенов различной природы позволил выявить более высокую степень относительной активации AHN, PVH, LHA-28 после введения ЛПС, чем БСА, при этом наиболее выраженная активация наблюдалась в PVH и LHA-28

Активацию гипоталамичееких структур после введения различных антигенов в индуктивной фазе иммунного ответа наблюдали и другие исследователи (Клименко В М, 1978, Абдуллаева 3 Д, 1989, Nosov М, 2002), однако сравнительный анализ изменения алгоритма реакций клеток и структур гипоталамуса после введения антигенов различной природы (ЛПС или БСА) проведен впервые Описанные различия, по-видимому, связаны с различной химической структурой использованных антигенов, а так же особенностями динамики в первые часы развития иммунного ответа, инициированного их введением

Изменение степени активации гипоталамичееких структур, так же как и количества антителобразующих клеток (АОК) в селезенке демонстрируют более выраженную реакцию на введение ЛПС, чем на БСА Данные результаты не позволяют утверждать о существовании причинно-следственной связи между изменениями степени активации гипоталамичееких структур и интенсивностью иммунного ответа после введения антигенов, но делают возможным такое допущение

В качестве иммунносупрессирующего стрессорного воздействия было выбрано электроболевое раздражение (модель эмоционально-болевого стресса), эффект которого

проявляется, в частности, снижением аффинности рецепторов NK-клеток селезенки (Li Q et al, 2005) и их цитотоксической активности (Shanin S N et al, 2005), усилением тяжести развития бронхиальной астмы у крыс (Persoons J Н et al, 1995), а так же снижением уровня антител к IgM anti-HSV, повышением уровня инфицированности мышей после заражения вирусом герпес HSV-1 (Brenner G J et al, 1997)

ЭБР приводит к активации клеток и структур гипоталамуса, причем степень относительной активации AHN, PVH, LHA, PH, превышает интенсивность реакций этих структур на введение ЛПС или БСА

Анализ изменений интенсивности иммунного ответа после сочетанного применения ЭБР и введения антигенов различной степени иммуногенности обнаружил снижение интенсивности иммунного ответа (по количеству антителобразующих клеток в селезенке крысы) на введение ЛПС или БСА после электроболевого раздражения Снижение интенсивности иммунного ответа после сочетания ЭБР и введения антигена продемонстрировано и в других исследованиях, так J С Meitzer et al (2004) показали, что ЭБР ведет к супрессии интенсивности ЛПС - индуцированной продукции большинства провоспалительных цитокинов селезенки

Характер изменения паттерна относительной активации гипоталамических структур на введение антигенов после ЭБР зависит от природы вводимого антигена (ЛПС или БСА) Более выраженное снижение интенсивности реакции на введение ЛПС происходит в PVH и VMH, по сравнению с реакцией на введение БСА в этих же условиях

Снижение количества АОК селезенки, на введение ЛПС после ЭБР так же более выражено, чем на введение БСА

Таким образом, интенсивность реакций гипоталамических структур и количества АОК селезенки снижается после сочетанного воздействия ЭБР и введения антигенов (ЛПС или БСА), что дает основание предположить, что наблюдаемые эффекты взаимосвязаны, и хотя не позволяет утверждать существование причинно-следственной связи, но допускает ее высокую вероятность

Полученные результаты демонстрируют ингибирующее влияние ЭБР на интенсивность реакции гипоталамических структур на введение различных антигенов (ЛПС и БСА), которое ассоциируется со снижением количества антителобразующих клеток на те же антигены и отражает характер перестройки реакций мозга на антигены различной природы в этих условиях

выводы

1 Внутривенное введение крысам липополисахарида или бычьего сывороточного альбумина приводит к увеличению количества c-Fos-позитивных клеток в определенных структурах гипоталамуса AHN, PVH, LHA-25, LHA-28, VMH, DMH, PH

2 Степень относительной активации клеток ряда гипоталамических структур крыс (AHN, PVH, LHA-28, DMH, PH) более выражена после введения липополисахарида по сравнению с интенсивностью реакции на введение бычьего сывороточного альбумина, что соответствует степени выраженности иммунного ответа на введение этих антигенов крысам (по количеству АОК в селезенке)

3 Применение электроболевого раздражения ведет к активации определенных структур гипоталамуса крыс - AHN, PVH, LHA, PH, определяемой по величине относительного коэффициента активации, интенсивность которой превышает степень выраженности реакции гипоталамических структур на введение липополисахарида или бычьего сывороточного альбумина

4 Электроболевое раздражение, сочетанное с введением липополисахарида, приводит к снижению степени относительной активации гипоталамических структур крыс (в AHN, PVH, LHA, DMH VMH, PH), инициированной введением липополисахарида

5 Электроболевое раздражение, примененное до введения бычьего сывороточного альбумина, приводит к снижению степени относительной активации гипоталамических структур крыс, характерной для реакции на введение бычьего сывороточного альбумина (в LHA-25, VMH, DMH)

6 Индуцированное элекгроболевым раздражением снижение степени относительной активации реакции гипоталамических структур крыс (PVH и VMH) на введение липополисахарида более выражено, чем на введение бычьего сывороточного альбумина

7 Применение электроболевого раздражения до введения антигенов приводит к снижению количества АОК селезенки крыс на введение липополисахарида (с 17,33 + 3,3, до 87,6 ±0,47, (Р < 0,0007)) и бычьего сывороточного альбумина (с 24 ± 1,41 до 40 ± 2,83, (Р < 0,002))

8 Индуцированное элекгроболевым раздражением снижение степени относительной активации гипоталамических структур на введение липополисахарида или бычьего сывороточного, сочетается со снижением интенсивности иммунного ответа на эти антигены

9 Комплекс проведенных исследований, показавших изменение паттерна и снижение степени относительной активации гипоталамических структур на введение антигенов (липополисахарида или бычьего сывороточного альбумина) после применения электроболевого раздражения, ассоциированное со снижением количества антителобразующих клеток селезенки, дает основания предполагать, что выявленные изменения реакций мозга на вводимые антигены значимы для изучения механизмов развития иммуносупрессии, индуцированной электроболевым раздражением

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1 Gavnlov J V LPS induced expression of c-Fos -like protein in the cells of hypothalamic structures after paihful electrical stimulation// Abstracts of the 6th International Society for NeuroImmunnoModulation Sep 25-28 2005 in Athens, - С 87-88

2 Гаврилов Ю В , Перекрест С В, Новикова H С ЛПС - индуцирована экспрессия C-Fos белка в структурах гипоталамуса при электроболевом раздражении// Материалы научной конференции «Дни иммунологи в СПб» - СПб, 2006, - С 128

3 Перекрест С В, Гаврилов Ю В, Новикова H С Экспрессия C-Fos белка в клетках гипоталамических структур при введении антигенов различной природы «Дни иммунологи в СПб» - СПб, 2006, - С 166

4 Korneva Е А, Gavnîov J V, Perekrest S V Central correlates of adaptatio and the activity of immun system // Abstracts of VIII Congress of International Society for Adaptive Mdicme, June 21-24,2006 in Moscow, - С 115

5 Перекрест С В , Гаврилов Ю В , Абрамова Т В , Новикова H С, Корнева Е А Активация клеток гипоталамических структур при введении антигенов различной природы (по экспрессии c-fos гена)//Медицинская иммунология —2006 —Т 8 - №5-6 - С 631-636

6 Гаврилов Ю В, Перекрест С В, Новикова H С Экспрессия c-Fos белка в клетках различных структур гипоталамичеса при электроболевом раздражении и введении антигенов //Физиологический журнал им И M Сеченова - Т 92 - № 10 - 2006 - С 1195-1203

7 Гаврилов Ю В, Перекрест С В , Новикова H С , Корнева Е А Стресс-индуцированные изменения реакций клеток гипоталамических структур на введение антигена (липополисахарида) (по экспрессии c-Fos белка) // Физиологический журнал им И M Сеченова - Т 92 - № 11 - 2006 - С 1296-1304

8 Гаврилов Ю В , Перекрест С В, Новикова H С , Корнева Е А Эффекты действия электроболевого раздражения на интенсивность активации клеток гипоталамических структур, индуцированной введением различных антигенов // Физиология иммунной системы - 2006 - №7 - С 17-26

9 Gavnlov Y , Prekrest S , Novikova N Antigen-induced expression of c-Fos-like protein in the cells of hypothalamic structures after electrical pamful stimulation // Abstracts of International Symposium Interaction of the nervous and immune systems m health and disease 31 May -2 June, 2007 in Saint-Petersburg, - С 26

Отпечатано в ООО "АРКУШ", Санкт-Петербург, ул Рубинштейна, д 2/45 ИНН 7825442972 / КПП 78501001

уел печат листов 1 О Подписано в печать 11 09 2007 г заказ №1109/1 от 11 09 2007 г, тир 100 экз

ГГНС - гипоталамо-гипофизарно-надпочечниковая система

ГК - глюкокортироидный гомон

ГЭБ - гематоэнцефалический барьер

ИКК - иммунокомпетентные клетки

ИС - иммунная система

ИЛ - интерлейкин

ЛАК - лимфокинактивированная клетка ЛПС - липополисахарид МБР механическое болевое раздражение мРНК - матричная рибонуклеиновая кислота НС - нервная система

ОКА - относительный коэффициент активации

УПП - уровень постоянного потенциала

ФР - физиологический раствор

ФСБ - фосфатно-солевой буфер

ЦНС - центральная нервная система

ЭБР - электроболевое раздражение

AHN - переднее ядро гипоталамуса

АР - заднее поле дна четвертого желудочка

ARH - аркуатное ядро гипоталамуса

AV3V - антериовентральная область 3 желудка CD - кластеры дифференцировки CRF кортикотропин-релизинг фактор DMH- дорзомедиальное ядро гипоталамуса

EGTA - (этилендиокси) диэтилендинитрилотетра-уксусная кислота Ig - иммуноглобулин

LHA - латеральное гипоталамическое поле LC - locuc coeruleus (голубое пятно) ME - медиальное возвышение NE - норадренергические NK - натуральные киллеры NMDA - Ы-метил-Э-аспартат

NF-AT - ядерный фактор активации Т-лимфоцитов

PVH - паравентрикулярное ядро гипоталамуса

РН - заднее гипоталамическое поле

SO - супраоптическое ядро гипоталамуса

Th 1, Th2 - Т-хелперы первого и второго типа

TNF-a - tumor necrosis factor (фактор некроза опухоли)

VMH - вентромедиальное ядро гипоталамуса

СОДЕРЖАНИЕ

1. ВВЕДЕНИЕ.7

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.14

2.1. Взаимодействие нервной и иммунной систем.14

2.1.1. Эффекты действия антигенов при их внутривенном введении на активность клеток и структур головного мозга.29

2.1.2. Влияние стрессорных воздействий на функциональное состояние иммунной систем.33

2.1.2.1. Эффекты действия иммобилизационного стресса на функции иммунной системы.37

2.1.2.2. Эффекты действия психоэмоционального стресса на функции иммунной системы.38

2.1.2.3. Эффекты действия электроболевого раздражения на функции иммунной системы.39

2.2. Ген немедленного ответа c-fos.41

2.2.1. Общие сведения о c-Fos белке, как маркере активации клеток мозга.42

2.2.2. Экспрессия c-fos мРНК и c-Fos белка в клетках мозга.45

2.2.3. Экспрессия c-fos мРНК и c-Fos белка в клетках мозга при антигеном воздействии.47

2.2.4. Экспрессия c-fos мРНК и c-Fos белка в клетках ЦНС при стрессорных воздействиях.51

2.3. Заключение.57

3. МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.59

3.1. Экспериментальные группы животных и схема эксперимента.59

3.2. Получение срезов головного мозга крыс.61

3.3. Иммуногистохимическое выявление c-Fos белка в тканях головного мозга.62

3.4. Выявление антител образующих клеток селезенки крыс методом локального гемолиза (безгелевый).64

3.5. Статистическая обработка результатов.66

4. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.67

4.1. Изменение количества c-Fos позитивных клеток структур гипоталамуса крыс после введения антигенов (липополисахарида или бычьего сывороточного альбумина), электроболевого раздражения и их сочетания.67

4.1.1 Изменение количества c-Fos позитивных клеток в гипоталамических структурах крыс после введения липополисахарида или бычьего сывороточного альбумина.68

4.1.2. Количество c-Fos позитивных клеток в гипоталамических структурах после элекроболебого раздражения.73

4.1.3. Активация клеток гипоталамических структур при введении антигенов (липополисахарида или бычьего сывороточного альбумина) после электроболевого раздражения.74 4.2. Относительные коэффициенты активации структур гипоталамуса крыс после введения антигенов (липополисахарида или бычьего сывороточного альбумина), электроболевого раздражения и их сочетания.77

4.2.1. Относительные коэффициенты активации гипоталамических структур крыс после введения антигенов (липополисахарида или бычьего сывороточного альбумина) и электроболевого раздражения.78

4.2.2. Сравнительный анализ степени активации структур гипоталамуса крыс после сочетанного применения электроболевого раздражения и введения антигена (липополисахарида или бычьего сывороточного альбумина).83

4.3. Интенсивность иммунного ответа крыс после введения антигенов (липополисахарида или бычьего сывороточного альбумина) и сочетанного применения электроболевого раздражения и введения антигенов.88

4.3.1. Количество антителобразующих клеток в селезенке крыс после введения различных антигенов (липополисахарида или бычьего сывороточного альбумина).89

4.3.2. Количество антителобразующих клеток в селезенке крыс после электроболевого раздражения и последующего введения антигена (липополисахарида или бычьего сывороточного альбумина).92

5. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ.96

6. ВЫВОДЫ.112

7.СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ.114

1. ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы.

В процессе жизнедеятельности человек постоянно подвергается воздействию физических, эмоциональных, психологических нагрузок, вызывающих стрессорные реакции, которые могут приводить к снижению активности защитных функций организма, вследствие чего повышается риск развития заболеваний инфекционной, аллергической и опухолевой природы. В практической медицине данные нарушения характеризуются как вторичные иммунодефициты индуцированной или спонтанной формы (Хаитов, 1999).

Экспериментальными и клиническими работами доказано влияние стресса на изменение функции иммунной системы. Так, иммобилизационный стресс у мышей на фоне гриппозной инфекции подавляет клеточный иммунитет (Sheridan et al.,1991). G.J. Brenner and J.A. Moynihan (1997) исследовали эффект электроболевого раздражения (ЭБР) после заражения мышей вирусом герпес HSV-1, и выявили снижение уровня антител к IgM anti-HSV и повышение уровня инфицированности у мышей. S. N. Shanin et al. (2005) показали снижение цитотоксической активности NK клеток при электроболевом раздражении крыс, причем интенсивность этого снижения зависела от силы стрессорного воздействия. Исследования, проведенные R. Glaser (1990) выявили подавление экспрессии гена ИЛ-2 мРНК и ИЛ-2 в Т-лимфоцитах периферической крови человека при психоэмоциональном стрессе (экзамены у студентов).

Впервые влияние мозга на течение инфекционного процесса показано в работах И.Г. Савченко (1891), Е.С. Лондона (1899), а вопрос о возможности участия мозга в регуляции иммунологических реакций впервые поставлен С. Метальниковым (1925). Позже, было установлено влияние разрушения структур головного мозга (Корнева и Хай, 1963) и электростимуляции заднего гипоталамического поля (Корнева и др., 1967, Корнева и др., 1978) на развитие иммунных реакций. Полученные результаты позволили показать, какие структуры гипоталамуса участвуют в процессе центральной регуляции функций иммунной системы.

В настоящее время разработан ряд молекулярно-биологических и биохимических методов исследования, позволяющих выявлять отдельные клетки головного мозга, активирующиеся в ответ на различные воздействия. Одним из таких методов является определение маркерных генов активации клеток нервной системы, в частности протоонкогена c-fos и его производного белка c-Fos (Curran, 1982; Bullitt, 1990). Конститутивный уровень экспрессии c-fos гена в нервных клетках незначителен (Curran, 1988), однако, воздействие внешних стимулов различных видов приводит к быстрому и кратковременному повышению экспрессии гена c-fos в нейронах мозга (Giulia et al., 1986; Bullitt, 1990; Guthrie, 1995; Oladehin, 1995; Muller et al., 1997; Plata et al., 1998; Conde et al., 1999; Girotti et al., 2006; Ueyama et al., 2006).

При анализе структур мозга, отвечающих на введение антигена, часто используется бактериальный липополисахарид (ЛПС), тимус-независимый антиген, который является мощным индуктором синтеза провоспалительных цитокипов. (Elmquist et al., 1993; Rivest et al., 1995; Yokoyama, 1999; Datta et al., 2007), тогда как, бычий сывороточный альбумин (БСА) - тимус-зависимый антиген вызывает менее выраженные неспецифические реакции (Абдуллаева, 1989; Torres, 2001).

Сравнительные исследования особенностей паттерна активации структур головного мозга на введение антигенов различной природы до настоящего времени не проводили.

Стрессиндуцированные изменения реакций мозга на введение различных антигенов так же не исследованы.

Изучение особенностей паттерна активации структур мозга при воздействии антигенов различной природы, а также эффектов стрессорного воздействия, в частности электроболевого, на алгоритм антигениндуцированной активации клеток и структур центральной нервной системы представляет особый интерес, поскольку эти знания являются основой для поиска путей коррекции стрессиндуцированных дисфункций иммунной системы.

Таким образом, работа посвящена изучению стрессиндуцированных изменений реакций мозга на введение антигенов различной природы. Данные изменения являются проявлением нарушения одного из центральных механизмов взаимодействия нервной и иммунной системы в условиях применения иммуносупрессивного стимула (стрессирующего фактора). Результаты исследования создают предпосылки для поиска рациональных способов коррекции стрессиндуцированной супрессии функции иммунной системы, что характеризует актуальность проводимого исследования, важного для фундаментальной науки и клиники.

Цель и задачи исследования

Целью работы явилось изучение реакций головного мозга и иммунной системы на введение антигенов различной природы и их изменений после воздействия электороболевого раздражения. В задачи работы входило:

1. Исследование особенностей паттерна активации клеток и структур гипоталамуса крыс при внутривенном введении антигенов различной природы (липополисахарида или бычьего сывороточного альбумина).

2. Сравнительный анализ алгоритмов активации гипоталамических структур после внутривенного введения антигенов различной природы (липополисахарида или бычьего сывороточного альбумина).

3. Исследование паттерна активации клеток и структур гипоталамуса крыс после электроболевого раздражения.

4. Сравнительный анализ изменения паттерна активации нейронов гипоталамических структур крыс после воздействий антигенной (липополисахарида или бычьего сывороточного альбумина) и не антигенной (электроболевого раздражения) природы.

5. Анализ эффектов действия электроболевого раздражения на инициированный введением различных антигенов (липополисахарида или бычьего сывороточного альбумина) паттерн активации гипоталамических структур крыс.

6. Анализ эффектов действия электроболевого раздражения на интенсивность иммунного ответа крыс, индуцированного внутривенным введением различных антигенов (липополисахарида или бычьего сывороточного альбумина).

7. Сравнительный анализ алгоритма активации гипоталамических структур головного мозга и интенсивности продукции антител после последовательного применения электроболевого раздражения и внутривенного введения антигенов (липополисахарида или бычьего сывороточного альбумина).

Научная новизна работы

Впервые определены различия паттерна проявляющегося изменением характеристики степени интенсивности и соотношения активации клеток и структур гипоталамуса крыс (по количеству c-Fos позитивных клеток) характерных для реакции на введение различных антигенов - липополисахарида или бычьего сывороточного альбумина. Электроболевое раздражение приводит к снижению степени интенсивности иммунного ответа на введение антигенов различных природы (липополисахарида, бычьего сывороточного альбумина), а так же степени и паттерна активации клеток и структур гипоталамуса, характерных для реакций на ведение антигенов.

Полученные результаты позволяют предположить возможность участия выявленных изменений реакций мозга на антигены в механизмах развития реализации стрессиндуцированной иммуносупрессии и создают основы для поиска путей направленной коррекции нарушений, возникающих при приобретенных дисфункциях иммунной системы.

Теоретическая и практическая значимость работы

Работа является необходимым этапом изучения центральных (гипоталамических) механизмов реализации реакции организма на антигенное воздействие и развития стрессиндуцированной иммуносупрессии, что создает основы для поиска способов лечения вторичных (стрессиндуцированных) иммунодефицитов.

Результаты работы могут быть использованы в научной практике, в том числе, при разработке способов терапии приобретенных стрессиндуцированных иммунодефицитов, а так же войти в курс преподавания физиологии, патофизиологии и иммунологии.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Внутривенное введение крысам антигенов (липополисахарида или бычьего сывороточного альбумина) приводит к активации определенных гипоталамических структур, паттерн которой различен.

2. Степень активации гипоталамических структур после внутривенного введения крысам липополисахарида более выражена, чем после инъекции бычьего сывороточного альбумина, что соответствует уровню интенсивности иммунного ответа: количество антителобразующих клеток в селезенке более высоко после внутривенного введения липополисахарида.

3. Электроболевое раздражение приводит к выраженной активации определенных гипоталамических структур.

4. Активация гипоталамических структур крыс после электроболевого раздражения более выражена, чем после введения липополисахарида или бычьего сывороточного альбумина.

5. Применение электроболевого раздражения приводит к снижению степени активации клеток структур гипоталамуса, вызванных внутривенным введением антигенов, причем снижение реакции на введение липополисахарида более выражено, чем на введение бычьего сывороточного альбумина.

6. Электроболевое раздражение приводит к снижению количества антителобразующих клеток в селезенке крыс, образующихся в ответ на внутривенное введение липополисахарида или бычьего сывороточного альбумина, которое более выражено после введения липополисахарида. 7. Снижение степени активации гипоталамических структур на введение липополисахарида или бычьего сывороточного альбумина после электроболевого раздражения сочетается со снижением интенсивности иммунного ответа на эти антигены.

Апробация работы:

Материалы исследования представлены на Российских и Международных научных Форумах: The 6th International Society for NeuroImmunnoModulation (Athens, 2005); VIII Congress of International Society for Adaptive Mdicine (Moscow, 2006); Дни иммунологи в Санкт-Петербуге - 2006; Научная конференция Отдела общей патологии и патологической физиологии ГУ НИИ ЭМ РАМН (Санкт-Петербуг, 2007); Научная конференция молодых ученых, посвященная 115 годовщине со дня основания Института Экспериментальной медицины (Санкт-Петербуг, 2007); International of the nervous and immune systems in health and disease (Saint-Petersburg, 2007).

Структура и объем работы:

Диссертация изложена на 144 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов работы, результатов собственных исследований и их обсуждения, выводов. Библиографический список использованной литературы содержит 287 источника. Работа проиллюстрирована 1 таблицей, 22 рисунками.

ВЫВОДЫ

1. Внутривенное введение крысам липополисахарида или бычьего сывороточного альбумина приводит к увеличению количества c-Fos-позитивных клеток в определенных структурах гипоталамуса: AHN, PVH, LHA-25, LHA-28, VMH, DMH, РН.

2. Степень относительной активации клеток ряда гипоталамических структур крыс (AHN, PVH, LHA-28, DMH, РН) более выражена после введения липополисахарида по сравнению с интенсивностью реакции на введение бычьего сывороточного альбумина, что соответствует степени выраженности иммунного ответа на введение этих антигенов крысам (по количеству АОК в селезенке).

3. Применение электроболевого раздражения ведет к активации определенных структур гипоталамуса крыс - AHN, PVH, LHA, РН, определяемой по величине относительного коэффициента активации, интенсивность которой превышает степень выраженности реакции гипоталамических структур на введение липополисахарида или бычьего сывороточного альбумина.

4. Электроболевое раздражение, сочетанное с введением липополисахарида, приводит к снижению степени относительной активации гипоталамических структур крыс (в AHN, PVH, LHA, DMH VMH, РН), инициированной введением липополисахарида.

5. Электроболевое раздражение, примененное до введения бычьего сывороточного альбумина, приводит к снижению степени относительной активации гипоталамических структур крыс, характерной для реакции на введение бычьего сывороточного альбумина (в LHA-25, VMH, DMH).

6. Индуцированное электроболевым раздражением снижение степени относительной активации реакции гипоталамических структур крыс (PVH и VMH) на введение липополисахарида более выражено, чем на введение бычьего сывороточного альбумина.

7. Применение электроболевого раздражения до введения антигенов приводит к снижению количества АОК селезенки крыс на введение липополисахарида (с 17,33 + 3,3, до 87,6 ±0,47, (Р < 0,0007)) и бычьего сывороточного альбумина (с 24 ± 1,41 до 40 + 2,83, (Р < 0,002)).

8. Индуцированное электроболевым раздражением снижение степени относительной активации гипоталамических структур на введение липополисахарида или бычьего сывороточного, сочетается со снижением интенсивности иммунного ответа на эти антигены.

9. Комплекс проведенных исследований, показавших изменение паттерна и снижение степени относительной активации гипоталамических структур на введение антигенов (липополисахарида или бычьего сывороточного альбумина) после применения электроболевого раздражения, ассоциированное со снижением количества антителобразующих клеток селезенки, дает основания предполагать, что выявленные изменения реакций мозга на вводимые антигены значимы для изучения механизмов развития иммуносупрессии, индуцированной электроболевым раздражением.

2.2. Заключение

Многочисленными исследованиями подтверждена тесная взаимосвязь функционирования нервной и иммунной систем. Показано, что для клеток нейро-эндокринной, и иммунной систем характерно наличие одних и тех же цитокинов, гормонов, нейропептидов, а так же рецепторов к регуляторным белкам (Hazum Е. et al., 1979; Richman et al., 1979; Cunningham J.R. et al., 1992; Quan N. et al., 1994; Besedovsky, del Rey, 1996 и др.). Известно, что биологически активные вещества, вырабатываемые одной из систем, оказывают влияние на функциональноё состояние другой (Blalock, 1984; ; Smith & Blalock, 1986; Elenkov I.J. et al., 2000; Kohm A.P. et al., 2001 и др.).

Показано, что введение антигенов различной природы и разной степени иммуногенности, приводит к активации различных структур головного мозга. (Григорьев, 1982; Корнева и др, 1989; Besedovsky, 1977; Saphier, 1987; Zhang Yi-H. et al., 2000; Goehler et al., 2001 и др.). Накоплен большой объем данных, подтверждающих участие гипоталамических структур в динамике развития иммунных реакций (Корнева и др., 1989; Григорьев, 1982; Перекрест с соавт. 2006; Besedovsky, 1977; Gaykema et al., 1999; Goehler et al., 2001; Cano et al., 2001; Nosov et al., 2002 и др.). Известен временной интервал реакции ЦНС на антигенное воздействие (Rivest & Laflamme al., 1995; Nosov et al., 2002 и др.). С другой стороны по данным многих авторов стрессорные воздействия активируют различные структуры головного мозга, в том числе гипоталамус (Новикова и др., 2002; Rassnick et al., 1998; Bullit, 1990; Chaudhuri, 1997; Kovac's, 1998; Passerin et al., 2000; Chida et al., 2005; Pacheco-Lopez et al., 2005 и др.), a также влияют на интенсивность иммунного ответа (Brenner et al., 1997; Chida 2004; Meltzer et al., 2004; Shanin et al., 2005; и др.).

Хотя существует множество данных, описывающих реакцию различных отделов ЦНС на введение антигена, но не проведен сравнительный анализ паттернов активации структур мозга в ответ на введение антигенов различной природы. Механизмы стрессиндуцированной супрессии функций иммунной системы не ясны, а исследование центральных механизмов этого явления только начинаются. Особый интерес представляет изучение влияния стрессорного воздействия на изменение паттерна активации структур мозга после введения антигенов различной природы и выявление центральных механизмов стрессиндуцированной супрессии функций иммунной системы.

3. МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

3.1. Экспериментальные группы животных и схема эксперимента

Эксперименты выполнены на 88 крысах-самцах Wistar, массой 180220 г. Животных содержали в условиях вивария при комнатной температуре с 12-часовым циклом свет/темнота, свободным доступом к воде и пище, на стандартной диете в соответствии с нормами содержания лабораторных животных. Перед экспериментами, животных в течение 5-и дней приучали к экспериментальной обстановке: каждый день в 10 часов утра крыс помещали в пластмассовые цилиндрические контейнеры, соответствующие размеру крысы, увеличивая время пребывания в них. Крысы считались адаптированными, если в течении часа животные находились в контейнере в спокойном состоянии.

В каждом эксперименте использовали 9 животных: 1. Интактное животное, находящееся в условиях стандартного содержания в клетках вивария - контроль 1

2. Животное, адаптированное к условиям эксперимента помещаемое ежедневно в течении 5 дней в пластмассовый цилиндрический контейнер на 60 минут, с фиксацией электродов на область голеностопных суставов - контроль 2 (ложное электроболевое раздражение).

3. Животное, адаптированное к условиям эксперимента - с последующим, через 60 минут после помещения в контейнер, внутривенным введением физиологического раствора - контроль 3.

4. Животное, адаптированное к условиям эксперимента, которое подвергали электрическому болевому раздражению в течение 60 минут.

5. Животное, адаптированное к условиям эксперимента, подвергаемое электрическому болевому раздражению в течение 60 минут, через час после окончания электроболевого раздражения, животному внутривенно вводили физиологический раствор - контроль 4.

6. Животное, адаптированное к условиям эксперимента, - которому через 60 минут после помещения в контейнер внутривенно вводили липополисахарид.

7. Животное, адаптированное к условиям эксперимента, - которому через 60 минут после помещения в контейнер внутривенно вводили бычий сывороточный альбумин.

8. Животное, адаптированное к условиям эксперимента, которому проводили электрическое болевое раздражение в течение 60 минут и через 1 час после окончания электроболевого раздражения внутривенно вводили липополисахарида.

9. Животное, адаптированное к условиям эксперимента, которому проводили электрическое болевое раздражение в течение 60 минут и через 1 час после окончания электроболевого раздражения внутривенно вводили бычий сывороточный альбумин.

Электроболевое раздражение производили через электроды, представляющие собой стальные спирали (диаметр внутреннего кольца спирали: d=2,0 мм, общая длина спирали: 1=150мм, диаметр стальной проволоки спирали: d"=0,lMM), которые помещали на кожу в область голеностопных суставов. Сила электрического импульса постоянного тока составляла 2,5мА, длительность - 1 сек, 10 ударов/мин в случайном порядке, в течение 60 мин.

В качестве антигена использовали бактериальный липополисахарид E-coli (Sigma, L-2880) в дозе 25 мкг/кт или 25000 мкг/кг бычьего сывороточного альбумина (Sigma А 9543) веса животного в 200 мкл физиологического раствора (0,9% NaCl).

Животных наркотизировали нембуталом (60 мг/кг веса) через 120 минут после внутривенного введения антигена или апирогенного физиологического раствора (в хвостовую вену), а так же после сочетанного введения антигена или апирогенного физиологического раствора с электроболевым раздражением, или через 180 минут, после электроболевого воздействия. После вскрытия грудной клетки животных перфузировали интракардиально теплым физиологическим раствором (50 мл), содержащим 10 ед./мл гепарина, со скоростью протекания 10-15 мл/мин. Затем проводили перфузию 250 мл фиксирующего раствора: 4% парафармальдегида и 0,2% пикриновой кислоты в 0,1 М фосфатном буфере рН 7,4.

3.2. Получение срезов головного мозга крыс

Выделение головного мозга проводили через час после перфузии. Извлеченный мозг дофиксировали в новой порции фиксирующей смеси (без пикриновой кислоты) при +4 °С в течение 12 часов.

Приготавливали срезы толщиной 20 мкм на микротоме (REICHERT, Австрия) с использованием замораживающего столика (Миконта 02, Россия).

3.3. Иммуногистохимическое выявление c-Fos белка в тканях головного мозга

Срезы отмывали от фиксирующего раствора в 0,01 М фосфатно-солевой буфер (ФСБ) (рН 7.4), при комнатной температуре 3 раза по 5 минут и помещали в раствор 3% Н2С>2, после чего снова отмывали в ФСБ 3 раза по 5 минут. Затем их инкубировали в растворе, содержащем 1% БСА на ФСБ и 0,4% тритон Х-100 около 1 часа, для предотвращения неспецифического связывания антител, отмывали в ФСБ 3 раза по 5 минут и инкубировали с антителами кролика к c-Fos белку («Sigma», 1:5000, Lot 079Н 4859) (0,1% БСА; 0,01 М ФСБ; 0,4% тритон) 12 часов при комнатной температуре. Затем, после отмывки (3 раза по 5 мин) в 0,01 М ФСБ, срезы инкубировали с антикроличьми антителами («Sigma», 1:300) (0,01 М ФСБ; 0,4% тритон) 1-2 часа, промывали в 0,01 М ФСБ (2 раза по 5мин) и 1раз 0,01 М Трис-HCl (рН 7,4) и окрашивали в течении 5-15 минут в растворе З'-З'-диаминбензидина 0,02% с Трис-буфером (10 мМ Трис НС1 рН 7,4) с

0,001% н2о2.

Окрашенные срезы монтировали на стекла, и приготавливали препараты, используя канадский бальзам.

Для контроля иммунногистохимической окраски на срезах проводилось выявление эндогенной пероксидазы и специфичности связывания вторичных антител (без добавления первичных антител).

Подсчет клеток производили, используя компьютерную систему Иста-Видио-Тест (Санкт-Петербург). Фронтальные срезы мозга исследовали под световым микроскопом марки Jenamed 2. После иммуногистохимической окраски определяли количество c-Fos позитивных клеток, оптическую плотность окраски клеток и фона для каждого среза и структуры. При анализе количества c-Fos позитивных клеток учитывали только те клетки, оптическая плотность которых превышала окраску фона на 25% и выше. Количество c-Fos позитивных клеток во всех структурах определяли на площади 10000 мкм2.

Поскольку количество c-Fos позитивных клеток в гипоталамических структурах у контрольных животных (после введения физиологического раствора, ложного ЭБР или введения физиологического раствора после ЭБР) различно, для сравнительной оценки степени активации структур гипоталамуса был вычислен относительный коэффициент активации (ОКА) по формулам 1 - 3:

Формула 1.

Относительный коэффициент активации при внутривенном сведении антигена (липополисахарида или бычьего сывороточного альбумина) количество c-Fos-позитивных.клеток после введения антигена (ЛПС или БСА) количество c-Fos-позитиных клеток после введения физиологического раствора

Формула 2.

Относи 1ельный коэффициент активации при электроболевом раздражении количество c-Fos- позитивных клеток после электроболевого раздражения количество c-F'os-позитивных клеток после ложного электроболевого раздражения

Формула 3.

Относительный коэффициент активации при электроболевом раздражении сочетанном с = внутривенным введении антигена (липополисахарида или бычьего сывороточного альбумина) количество c-Fos- позитивных, клеток после электроболевого раздражения сочетанного с введением антигена(ЛПС или БСА) количество c-Fos-позитивных клеток после электроболевого раздражения сочетанного с введением физиологического раствора

3.4. Выявление антителобразующих клеток селезенки крыс методом локального гемолиза (безгелевый)

Через 7 суток, после в/в введения антигена (ЛПС или БСА), или сочетанного применения ЭБР и антигенов различной природы (ЛПС или БСА), а также животных контрольных групп, проводили гельятинную декапитацию крыс с последующим извлечением селезенки.

Селезенку измельчали в гомогенизаторе в среде Игла. Для удаления обломков клеток и грубых агрегатов полученную взвесь пропускали через нейлоновый фильтр и дважды отмывали средой Игла (7 мин в центрифуге 1,5 тыс. об./мин). Осадок ресуспендировали в 0,7 мл дистиллированной воды в течении 20 сек с целью удалить примесь эритроцитов путем осмотического шока. После чего лимфоциты снова отмывали средой Игла и в камере Горяева определяли их количество. Суспензию лимфоцитов готовили из расчета 1 х 106 клеток на 1 мл.

Для проведения реакции использовали следующую смесь: 0,3 мл 20% суспензии человеческих эритроцитов (группа 0, rh~), сенсибилизированных ЛПС (1 мл осадка эритроцитов инкубировали с 1 мг ЛПС при 37°С в течение 1 часа) или БСА (1 мл осадка эритроцитов инкубировали с 10 мг БСА при 37°С в течение 1 часа)

0,1 мл комплемента крысы (сыворотку абсорбировали эритроцитами человека, группа 0, rh", при 37°С в течение 1 часа) 0,5 мл среды Игла

К 0,4 мл данной смеси добавляли 0,2 мл приготовленной взвеси лимфоцитов с известным содержанием клеточных элементов, тщательно перемешивали и вносили по 0,15 мл в заранее заготовленные камеры. Камеры готовили следующим образом: обезжиренные предметные стекла складывали бок о бок и соединяли поперек обоюдоклейкой лентой по краям и по середине. Затем, сняв верхний защитный слой клейкой ленты, складывали оба стекла, чтобы получилось их полное наложение (рис. О

Лимфоциты

Эритроциты комплемент

37° С

2 ч

Парафин

О О в' со , в а о

Зоны гемолиза

Рис. 1. Схема постановки реакции локального гемолиза по методу Cunningham (Фримель Г., 1987).

Заполненные камеры герметизировали парафином и инкубировали при 37°С в течение 2 часов [Фримель Г., 1987]. Подсчет зон гемолиза проводили на световом микроскопе при увеличении хЮО. Учитывались только те зоны гемолиза, в центре которых находились антителообразующие клетки (рис. 2). i l а, и iri i- ** - % I ■ * tf

Г ' . ;> ■> ■ .fffj JI I'.t f* ; T JF fv; ,|ч! ^ T IT*" j

Т'Ца :* -j* ' - ■ . r • • = ■ "A * ; Д ■ - it J-ji-JK в®

•a* 1

L «ESS?* • jrjv^ifjjrftg^ ,л-гя»и» :*-га

60 мкм

Рис. 2. Микрофотография зоны гемолиза в камере Каннингема. Стрелкой указана антителообразующая клетка. (Фото предоставлена Перекрест С.В.)

3.5. Статистическая обработка результатов

Данные представленные в разделе «результаты исследования» являются результатами 4-5 эксперементов, каждое определение проводилось в 3-4 повторах.

Результаты экспериментов обрабатывали с помощью стандартных методов вариационной статистики. Достоверность различий оценивали по t-зависимому критерию Стьюдента. Во всех расчетах за достоверный принимали 95% уровень значимости (Р<0,05).

Графики выполнены на IBM PC при помощи программы Excel, схемы головного мозга с помощью программы Corel Drow 8 с использованием компьютерных программ Rat Brain Maps (Swanson, 1992).