Автореферат и диссертация по медицине (14.00.36) на тему:Влияние аналога гонадотропин-рилизинг гормона сурфагона на регуляторные системы организма

Изучение физиологической роли в организме регуляторных пептидов, и нейропептидов в частности, - одно из приоритетных направлений современной науки. Пептидные молекулы являются важнейшими компонентами в функционировании всех регуляторных систем: нервной, эндокринной и иммунной, и не менее заметная роль принадлежит им в осуществлении их взаимодействия (5, 6, 7, 68, 83, 167). В основе столь значимого положения регуляторных пептидов в организме полифункциональный характер их биологических эффектов (9, 10, 61, 103). Одна из особенностей их регулирующего действия заключается в том, что не только они, но и их производные могут оказывать регулирующее влияние, что создает некий континуум пептидной регуляции. Одни и те же пептиды могут вызывать разные эффекты в зависимости от условий их действия и концентрации. К настоящему времени принято считать, что регуляторные пептиды играют ключевую роль в поддержании гомеостаза, так как именно они в первую очередь определяют основные параметры формирования компенсаторно-приспособительных реакций организма на стрессорное воздействие и нарушения гомеостатического баланса (87, 144).

Подробное выяснение структуры пептидов и механизмов их физиологического действия позволило приступить к созданию высокоактивных синтетических аналогов. Современный период развития биомедицины ознаменован значительными достижениями в области создания лекарственных средств на основе природных эндогенных пептидов, а также в изучении их клинической эффективности и обоснования применения в комплексной терапии различных заболеваний и патологических состояний. В связи с этим разработка новых синтетических пептидных биорегуляторов и изучение механизмов их действия представляются актуальной теоретической и практической задачей (11, 144).

Все вышеизложенное в полной мере относится к гипоталамическому гонадотропин-рилизинг гормону (Гн-РГ) и гипоталамо-гипофизарно-гонадальной системе в целом. За период со времени открытия Гн-РГ в 1969 году были выяснены многие вопросы, касающиеся его синтеза, секреции, рецепторного связывания и влияния на гонадотрофы гипофиза. Однако, несмотря на интенсивные исследования, ряд механизмов в этих процессах остается неясным.

Расшифровка аминокислотной последовательности Гн-РГ и развитие методов пептидного синтеза привело к созданию синтетических аналогов, обладающих свойствами агонистов и антагонистов (23, 24). Агонисты Гн-РГ по биологической активности значительно превосходят эндогенный нейропептид и все чаще применяются в клинической практике. Первоначально агонисты разрабатывались для лечения бесплодия на почве гипогонадотропного гипогонадизма в соответствии с физиологическим значением Гн-РГ. Однако в дальнейшем оказалось, что повышение секреции гонадотропинов происходит только при импульсном применении препарата. Напротив, длительное введение агонистов Гн-РГ приводит к длительной блокаде синтеза ЛГ и ФСГ и понижению уровня половых стероидов. Данные особенности эффектов препаратов значительно расширили показания к их клиническому применению в гинекологии, онкологии, эндокринологии, которые можно объединить по следующим направлениям (98, 107, 133).

Во-первых, угнетение гипофизарно-гонадной функции: физиологический гипогонадизм послеродового периода, задержка полового созревания, крипторхизм, гипогонадотропные состояния. Во-вторых, угнетение гипофи-зарно-гонадальной системы: преждевременное половое созревание, эндомет-риоз, гормонально-зависимые опухоли (в том числе миома матки), рак молочной железы, рак простаты, подавление гиперсекреции андрогенов яичниками (98, 107). Активно разрабатывается использование аналогов Гн-РГ для женской и мужской контрацепции (98) и в программе экстракорпорального оплодотворения и переноса эмбрионов в полость матки (133). Однако опыт клинического использования выявил ряд побочных эффектов препаратов, среди которых головные боли, депрессия, нервозность, изменения либидо, периферические отеки, повышенная потливость.

Широкое клиническое применение аналогов Гн-РГ требует детального исследования всех биологических эффектов, учитывая принадлежность Гн-РГ к семейству регуляторных пептидов. Известно, что кроме эндокринного действия Гн-РГ обладает рядом других эффектов, к которым можно отнести его влияние на нервную (136, 218, 250, 251, 348) и иммунную системы (200, 241, 261, 270, 273). Поэтому в условиях длительного введения высокоактивных пептидов в указанных системах могут развиваться значительные изменения. Однако в данном направлении до настоящего времени отсутствует достаточный объем информации, необходимый для адекватного использования препаратов. В частности, не исследовано влияние Гн-Р1' и его аналогов на эффекторные этапы иммунного ответа и на факторы неспецифической резистентности. Кроме того, невыясненным вопросом является физиологическое значение Гн-РГ во взаимодействии регуляторных систем организма: нервной, эндокринной и иммунной.

Для данной работы был выбран аналог-агонист Гн-РГ сурфагон, синтезированный в Кардиологическом научном центре РАМН и обладающий высокой эндокринной активностью и планируемый для клинического применения.

Таким образом, изучение влияния аналога-агониста Гн-РГ на регуля-торные системы организма представляется весьма актуальным как с позиций дальнейшего исследования физиологической роли Гн-РГ, так и с целью доклинической апробации оригинального препарата.

Диссертационное исследование (№ государственной регистрации 01.20.0301227) выполнено по основному плану научно-исследовательской работы Курского государственного медицинского университета по проблеме 001 «Механизмы системной организации физиологических функций в норме и при патологии».

ЦЕЛЬ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ

Целью настоящего исследования являлось определение биологических свойств и роли аналога гонадотропин-рилизинг гормона сурфагона в ре-гуляторных и адаптивных реакциях нервной, эндокринной и иммунной систем в исходном состоянии и в условиях эмоционально-болевого стресса.

При выполнении работы были поставлены следующие задачи:

- изучить у типологически различных интактных, кастрированных и гипофизэктомированных крыс влияние системного (внутрибрюшинного) и центрального (внутрижелудочкового) введения сурфагона на агрессивно-оборонительное поведение при неизбегаемом электроболевом раздражении и на поведение в открытом поле;

- исследовать влияние системного введения сурфагона на болевую чувствительность у интактных и кастрированных мышей при термическом раздражении;

- выяснить влияние системного введения сурфагона на выработку и сохранение у типологически различных крыс пищедобывательного условного рефлекса в Т-лабиринте;

- изучить действие сурфагона при системном введении у интактных и кастрированных крыс на развитие гуморального и клеточного иммунного ответа в различные его фазы в исходном состоянии и в условиях эмоционально-болевого стресса;

- установить влияние системного введения сурфагона на функциональную и фагоцитарную активность нейтрофилов у мышей в исходном состоянии и в условиях эмоционально-болевого стресса;

- изучить влияние центрального (внутрижелудочкового) введения сурфагона интактным крысам на развитие гуморального иммунного ответа и функциональную и фагоцитарную активность нейтрофилов;

- исследовать содержание тестостерона и продуктов перекисного окисления липидов в сыворотке периферической крови после многократного центрального и системного введения сурфагона;

- выяснить морфологические изменения в органах иммунной и эндокринной систем после многократного системного введения сурфагона.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА В работе впервые проведено исследование нейротропных эффектов сурфагона с использованием поведенческих реакций различного биологического значения. Установлено не опосредованное гонадотропинами и половыми стероидами активирующее влияние пептида на эмоционально-негативную систему мозга при системном введении и ингибирующее - при внутрижелудочковом. Установлена зависимость направленности нейротропных эффектов сурфагона от исходных типологических особенностей животных.

На моделях термического и электрокожного воздействия и с использованием системного и центрального введения показана зависимость действия пептида на болевую чувствительность от вида болевого раздражения и от локализации мест связывания.

Впервые изучено влияние аналога Гн-РГ на поведение в Т-лабиринте при положительном подкреплении и показано модулирующее действие сурфагона на выработку и сохранение пищедобывательного условного рефлекса, а также установлены механизмы этого эффекта: изменение мотивации, исследовательской активности и памяти. Обоснован пептидергический характер влияния сурфагона на обучение.

В работе впервые исследовано влияние аналога Гн-РГ на эффектор-ные звенья иммунитета и факторы неспецифической защиты в норме и в условиях стресса и установлено преимущественное стимулирующее действие сурфагона на гуморальный иммунный ответ и на функциональную и фагоцитарную активность нейтрофилов. Установлено стимулирующее влияние центрального введения аналога Гн-РГ на развитие гуморального иммунного ответа и факторы неспецифической резистентности.

Показана возможность влияния сурфагона на уровень продуктов пе-рекисного окисления в крови при системном и центральном введении, осуществляемого без участия половых стероидов.

Выявлены и изучены морфологические изменения в тимусе, надпочечниках и селезенке после многократного введения аналога Гн-РГ, а также показана их взаимосвязь с функциональными изменениями в организме.

НАУЧНО-ПРАКТИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ

Экспериментальное исследование биологических эффектов сурфагона входит в доклиническое испытание препарата и полученные данные позволяют обосновать рекомендации по его применению при клинической апробации.

Исследованные нейро- и иммунотропные эффекты сурфагона необходимо учитывать при клиническом применении других аналогов-агонистов Гн-РГ на основании наличия общности механизмов действия препаратов данной группы.

Результаты работы будут использованы в Институте экспериментальной кардиологии Российского кардиологического центра РАМН для структурно-функционального анализа пептидных молекул и целенаправленного синтеза препаратов с заданными свойствами.

Установленная зависимость нейротропного действия аналога Гн-РГ от типологических особенностей животных указывает ча необходимость учета данного обстоятельства при изучении эффектов других регуляторных пептидов, а также индивидуальной чувствительности к сурфагону.

Полученные результаты о влиянии аналога Гн-РГ на нервную, эндокринную и иммунную системы расширяют представления об участии гипота-ламо-гипофизарно-гонадальной системы во взаимодействии регуляторных систем организма.

ОСНОВНЫЕ ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ

1. Высокоактивный аналог гонадотропин-рилизинг гормона сурфагон при системном (внутрибрюшинном) введении вызывает у крыс повышение ' ' 11 ' ' болевой чувствительности при электрокожном раздражении и усиление вызванной болью агрессии. Этот эффект воспроизводится после гипофизэкто-мии и кэстрации и, следовательно, не опосредуется гонадотропинами и половыми стероидами, являясь нейротропным.

2. Направленность нейротропного действия сурфагона на формирование боли зависит от вида болевого раздражителя и локализации первично взаимодействующих с пептидом рецепторов мозга, поскольку его эффект является анальгетическим при термическом раздражении и при электрокожном болевом воздействии в случае центрального (внутрижелудочкового) введения.

3. Сурфагон оказывает модулирующее влияние на обучение крыс при положительном (пищевом) подкреплении, ухудшая его у хорошо обучаемых животных. Угнетающий эффект на обучение является стероидозависимым и включает ослабление мотивации, исследовательской активности и памяти. Пептид замедляет формирование пассивного избегания при болевом термическом (отрицательном) раздражении. Данный эффект не зависит от половых стероидов.

4. При увеличении продолжительности действия (внутрибрюшинное введение в течение 4-х дней) сурфагон вызывает у крыс снижение содержания в крови тестостерона, которое при дозе пептида 5 мкг/кг в условиях стресса достигает уровня, обусловленного удалением гонад, что может расцениваться как состояние «химической кастрации».

5. Внутрибрюшинное введение сурфагона стимулирует гуморальный иммунный ответ, а также функциональную и фагоцитарную активность ней-трофилов. Действие пептида на развитие гиперчувствительности замедленного типа супрессирующее и имеет неустойчивый характер. Влияние сурфагона на иммунитет воспроизводится после хирургической и «химической» кастрации и не зависит от половых стероидов.

6. Центральное введение сурфагона стимулирует развитие гуморального иммунного ответа и повышает функциональную и фагоцитарную активность нейтрофилов без участия половых стероидов.

7. Примененная модель повторного болевого раздражения обеспечивает развитие стресса у животных, что сопровождается иммуносупрессией, увеличением массы надпочечников и снижением массы тимуса. Введение сурфагона устраняет вызванную стрессом иммуносупрессию и ослабление функциональной и фагоцитарной активности нейтрофилов. Эффект более выраженный и устойчивый при введении пептида в дозе 0,1 мкг/кг у интакт-ных животных и в дозах 0,1 и 5 мкг/кг - у кастрированных.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ

Результаты исследования доложены и обсуждены на 1-м Международном конгрессе по патофизиологии (Москва, 1991), 3-м Всемирном конгрессе IBRO по нейронаукам (Монреаль, 1991), 1-й конференции Российской Ассоциации по изучению боли (Москва, 1993), XXXII Конгрессе международного союза физиологических наук (Глазго, 1993), 2-м Международном конгрессе по патофизиологии (Киото, 1994), 4-м Всемирном конгрессе IBRO по нейронаукам (Киото, 1995), I конгрессе Европейской федерации по изучению бели «Боль в Европе» (Верона, 1995), I и II Российских конгрессах по патофизиологии (Москва, 1996, 2000), II конгрессе Европейской федерации по изучению боли «Боль в Европе» (Барселона, 1997), 3-м Международном конгрессе по патофизиологии (Лахти, 1998), 9-м Всемирном конгрессе по боли (Вена, 1999), III конгрессе Европейской федерации по изучению боли «Боль в Европе» (Ницца, 2000), Второй Российской научно-практической конференции «Актуальные проблемы экологии, экспериментальной и клинической медицины» (Орел, 2001), 4-м Конгрессе Российской Ассоциации аллергологов и клинических иммунологов (Москва, 2001), 10-м Всемирном конгрессе по боли (Сан-Диего, 2002), итоговых научных конференциях Курского государственного медицинского университета (1991, 1993, 2002).

ПУБЛИКАЦИИ

По материалам диссертации опубликовано 34 работы, в том числе 12 -в центральной печати и 12 - в международной.

СТРУКТУРА И ОБЪЕМ РАБОТЫ

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения собственных результатов исследования (8 глав), заключения выводов, практических рекомендаций и списка литературы, включающего 371 источник, в том числе 156 отечественных и 215 зарубежных.

201 ВЫВОДЫ

1. Сурфагон при системном (внутрибрюшинном) введении вызывает повышение болевой чувствительности при электрокожном раздражении и усиление вызванной болью агрессии. Этот эффект является нейротропным, т.к. воспроизводится после гипофизэктомии и кастрации и, следовательно, не опосредуется гонадотропинами и половыми стероидами.

2. Влияние сурфагона на формирование боли зависит от локализации первично взаимодействующих с ним рецепторов мозга, поскольку при центральном (внутрижелудочковом) введении его эффект при электрокожном раздражении был анальгетическим.

3. Влияние сурфагона на болевую чувствительность при термическом раздражении зависит от исходного состояния гипоталамо-гипофизарно-гонадальной системы: пептид оказывает анальгетическое действие у интакт-ных животных и алгическое - у кастрированных. Кастрация значительно повышает пороги болевых реакций.

4. При введении сурфагона перед сеансом обучения в Т-лабиринте проявляется модулирующее влияние: ухудшение показателей обучения и сохранения пищедобывательного рефлекса у хорошо обучающихся и улучшение - у медленно обучающихся крыс. Действие пеп-тида на обучение и па0 мять является как прямым, так и опосре^ВЬанным. Ингибирующее влияние сурфагона является стероидонезависимым и включает ослабление мотивации, исследовательской активности и памяти.

5. Сурфагон независимо от схемы введения относительно иммунизации в дозе 0,1 мкг/кг стимулирует развитие гуморального иммунного ответа, индуцированного эритроцитами барана. В дозе 5 мкг/кг пептид оказывает иммуносупрессирующий эффект при введении после антигена. После кастрации показатели иммунной реактивности снижаются, а пептид оказывает иммунокорригирующее действие в обеих дозах, что свидетельствует о наличии стероидонезависимых механизмов его иммунотропного эффекта. Развитие реакции гиперчувствительности замедленного типа на эритроциты бара

202 на угнеталось сурфагоном при введении в дозе 0,1 мкг/кг у интактных животных в исходном состоянии и в дозе 5 мкг/кг - у кастрированных в условиях стресса.

6. Функциональная и фагоцитарная активность нейтрофилов повышается при внутрибрюшинном введении сурфагона в дозе 0,1 мкг/кг и снижается при дозе 5 мкг/кг и после кастрации. У кастрированных животных пептид оказывает стимулирующее действие в обеих дозах. Сохранение эффектов пептида после кастрации указывает на возможность их реализации без участия половых стероидов.

7. Эмоционально-болевой стресс снижает показатели иммунного ответа и неспецифической резистентности. Сурфагон в дозе 0,1 мкг/кг устраняет вызванную стрессом иммуносупрессию, а дозе 5 мкг/кг усиливает. После кастрации действие пептида в обеих дозах имеет антистрессорный характер.

8. Внутрижелудочковое введение сурфагона усиливает гуморальный иммунный ответ, функциональную и фагоцитарную активность нейтрофилов и оказывает антиоксидантное действие на фоне неизмененного уровня тестостерона в сыворотке крови.

9. Внутрибрюшинное введение сурфагона (в течение 4-х дней) сопровождается морфологическими изменениями в тимусе, селезенке и надпочечниках, направленность которых зависит от дозы и условий опыта. В исходном состоянии сурфагон снижает массу и ширину коры тимуса, диаметр фолликулов селезенки и увеличивает ширину пучковой и клубочковой зон коры надпочечников. к 10. Многократное внутрибрюшинное введение сурфагона снижает уровень тестостерона в сыворотке крови интактных крыс. В условиях эмоционально-болевого стресса эффект пептида в дозе 5 мкг/кг усиливается и уровень тестостерона достигает его значений у кастрированных животных.

11. Сурфагон не влияет на уровень перекисного окисления липидов в крови в исходных условиях и восстанавливает его снижение после кастрации, выступая в роли прооксиданта. В условиях эмоционально-болевого стресса пептид оказывает антиоксидантное действие. Про- и антиоксидант-ные эффекты препарата не зависят от уровня тестостерона в крови.

12. Аналог Гн-РГ сурфагон обладает высокой биологической активностью, вызывая функциональные и структурные сдвиги в регуляторных системах организма (нервной, эндокринной и иммунной). Полифункциональное действие пептида проявляется как в исходном состоянии, так и в условиях эмоционально-болевого стресса и измененной активности гипотала-мо-гипофизарно-гонадальной системы, вызванной кастрацией. 4

1. В рекомендации по клиническому использованию высокоактивных аналогов-агонистов Гн-РГ должны быть включены сведения об их нейро-тропном действии: усилении отрицательных эмоций и агрессивности, влиянии на процессы обучения и памяти. При назначении препаратов необходимо учитывать типологические особенности организма.

2. С учетом значительного влияния сурфагона на иммунный ответ и факторы неспецифической резистентности необходим контроль иммунного статуса организма при использовании препаратов данной группы.

3. Выбор используемых доз и длительности введения аналогов Гн-РГ должен проводиться не только на основании их эндокринных эффектов, но и нейро- и иммунотропного действия.

4. При создании аналогов регуляторных пептидов с целью практического применения необходимо проведение подробного структурно-функционального анализа для выявления всего спектра их действия на регу-ляторные системы организма.

205

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Выполненный в данной работе комплекс физиологических, иммунологических, биохимических и морфологических исследований показал важную роль Гн-РГ и гипоталамо-гипофизарно-гонадальной системы в целом в регуляции функций организма. Высокая активность аналога Гн-РГ продемонстрирована в отношении всех регуляторных систем: нервной, эндокринной и иммунной.

Исследование действия сурфагона на нервную систему проводилось с использованием поведенческих методик, позволяющих оценивать интегра-тивную деятельность мозга. Более глубокому раскрытию механизмов действия пептида на нервную систему способствовала постановка опытов на типологически различных животных (КС и ДС в условиях этанолового наркоза) с использованием периферического и центрального введения препарата. Проведенные исследования выявили достаточно широкий спектр нейротропной активности сурфагона.

Изучение влияния сурфагона на поведение при неизбегаемом электроболевом раздражении и в открытом поле, а также на температурную болевую чувствительность проводилось с использованием однократного введения пептида внутрибрюшинно или в боковые желудочки мозга. В связи с этим закономерно встает вопрос о возможной активации гипофизарно-гонадальной системы и ее влиянии на выявленные нейротропные эффекты. В экспериментальных исследованиях эндокринной активности препарата было установлено, что у неполовозрелых крыс-самцов однократное' внутрибрю-шинное введение сурфагона в дозах 0,5 и 2,5 мкг/кг вызывает через 3 часа более чем 12-кратное увеличение содержания тестостерона в крови. Уровень гонадотропинов в крови исследован после однократного введения в дозах от 0,02 до 2 мкг/кг. Достоверное увеличение в крови концентрации ЛГ отмечалось через 30 мин после введения крысам сурфагона 0,4 и 2 мкг/кг и не изменялось при меньших (23). Содержание же ФСГ в течение данного времени не отличалось от контрольных значений при применении всего указанного диапазона доз сурфагона. Максимальных значений уровень ЛГ достигает через 2 часа, а ФСГ- через 3 часа (23, 24).

В случае внутрижелудочкового введения сурфагона нами установлено, что даже многократное введение не сопровождается достоверным сдвигом уровня тестостерона в крови, что свидетельствует об отсутствии изменения функционального состояния гипоталамо-гипофизарно-гонадальной системы.

В условиях столь высокой активации гипоталамо-гипофизарно-гонадальной системы после внутрибрюшинного введения препарата большое значение имел правильный выбор времени начала опыта. Этого промежутка времени должно быть достаточно для проявления эффекта пептида и недостаточно для увеличения уровня гонадотропинов в крови.

Как показали полученные результаты, однократное внутрибрюшинное введение сурфагона интактным, кастрированным и гипофизэктомированным крысам в дозах 0,1, 5 и 50 мкг на 1 кг массы тела за 10-15 мин до начала испытания в условиях неизбегаемого электроболевого раздражения вызывает повышение болевой чувствительности и агрессивности и, следовательно, усиление эмоционально-негативной реактивности у крыс обеих групп. Гипо-физэктомия и кастрация вызывают повышение порогов электроболевой чувствительности и ослабление агрессивности.

Поскольку эта форма поведения считается мотивированной страхом (127), можно заключить, что сурфагон усиливает эмоционально-негативное состояние животных. Сохранение активирующего влияния сурфагона на агрессивно-оборонительное поведение при болевом стрессе у кастрированных и гипофизэктомированных крыс свидетельствует о существовании его не опосредованного гонадотропинами и половыми стероидами нейротропного действия. Механизм этого действия может включать изменение активности центральных нейромедиаторных систем, в частности, чувствительности дофаминовых рецепторов, как это установлено для природного люлиберина (117). В пользу существования прямого нейротропного действия сурфагона может свидетельствовать и способ его

174 может свидетельствовать и способ его введения - однократно за 10-15 мин до начала поведенческого тестирования. Данного промежутка времени явно недостаточно, чтобы произошел выброс гонадотропинов гипофиза.

Преобладающими эффектами сурфагона при исследовании поведения в открытом поле были снижение ориентировочной активности и повышение эмоциональности. Следует подчеркнуть, что направленность влияний пептида обнаруживает зависимость от исходной выраженности поведенческой реакции. В частности, отмечается усиление груминга после введения сурфагона интактным и кастрированным ДС крысам, которых отличает меньшая исходная частота этой реакции. Кастрация не изменяет выраженность ориентировочно-исследовательской реакции и груминга в открытом поле у КС крыс, но повышает данные показатели у ДС животных.

Известно, что груминг в этологическом отношении оценивается как "смешанная" форма активности, свидетельствующая о комфортном состоянии животных (117). Однако, в отдельных случаях в условиях высокой активации груминг может являться проявлением фрустрации и отражает повышение эмоционально-негативной возбудимости (31). Возможно, такое объяснение имеет усиление груминга на фоне действия сурфагона у интактных ДС крыс.

В целом, полученные при исследовании поведения крыс в арене результаты могут свидетельствовать о правомочности вывода об усилении под влиянием сурфагона эмоционально-негативной возбудимости, сделанного на основе результатов исследования агрессивно-оборонительного поведения при болевом раздражении.

Однако следует отметить, что активация агрессивно-оборонительного поведения и усиление аффективной агрессивности наблюдались не во всех случаях. Так, сурфагон практически не изменял болевую чувствительность в дозе 0,15 мкг/кг у интактных и гипофизэктомированных ДС крыс, а в дозе 5 мкг/кг у интактных КС и гипофизэктомированных ДС животных отмечалось достоверное повышение порогов болевых реакций. Полное отсутствие сражений имело место у гипофизэктомированных ДС крыс при введении пептида в дозах 0,15 и 5 мкг/кг. Все эти фаты наряду с отмеченным усилением груминга у интактных и кастрированных ДС крыс могут свидетельствовать о возможной активации под влиянием сурфагона системы эмоционально-положительного подкрепления. В таком случае отмеченная активация груминга может служить проявлением комфортного состояния животных.

Таким образом, полученные результаты о влиянии периферического введения сурфагона на исследованные формы поведения показали их достаточно сложный характер и зависимость от типологических особенностей животных. В реализации выявленных эффектов могут принимать участие структуры и медиаторные системы мозга, участвующие в формировании как эмоционально-негативного, так и эмоционально-положительного подкрепления.

Полученные результаты также показали, что кастрация оказывает заметное влияние как на исходные параметры поведения, так и на эффекты сурфагона, оказывая в ряде случаев модулирующее влияние у типологически различных животных. Учитывая тот факт, что кастрированные животные использовались во всех сериях экспериментов данной работы, необходимо отметить основные посткастрационные эндокринные сдвиги в те сроки, в которые проводились эксперименты в данной работе.

У взрослых крыс-самцов непосредственно после кастрации происходит быстрый и поддерживающийся подъем уровня гонадотропинов в сыворотке крови (354), сопровождающийся ультраструктурными изменениями гонадотрофов гипофиза (337). Через 12 дней содержание ФСГ увеличивается в 2 раза, ЛГ - в 5 раз (312). Внутригипофизарный уровень ЛГ достоверно возрастал через 14 дней. Содержание ФСГ в гипофизе имеет двухфазный характер: сначала падает значительно ниже контрольного уровня, а затем достоверно поднимаясь на 21 день. Содержание Гн-РГ в гипоталамусах в период с 14 по 21 день после кастрации значительно падало - до 57 % от контрольного уровня. Данные результаты показывают, что увеличение в сыворотке уровней ФСГ и JIT у крыс-самцов после кастрации во многом не опосредуются на гипоталамическом уровне и зависит от длительности постоперационного периода (354, 360). Подобные же изменения наблюдались и у других видов животных, например, у баранов (178). При этом необходимо отметить, что у краткосрочно (1-е сутки) кастированных баранов как агонисты, так и антагонисты Гн-РГ не повышали секрецию эндогенного оилизинг-гормона (217).

Кроме того, после кастрации у самцов отсутствует корреляционная зависимость между количеством Гн-РГ-рецепторов и чувствительностью клеток гипофиза к Гн-РГ (293).

Таким образом, после кастрации развиваются выраженные эндокринные сдвиги, которые могут оказывать значительное влияние на исходное функциональное состояние регуляторных систем организма, а также существенно видоизменять их реактивность.

Данные экспериментов, полученные при изучении агрессивно-оборонительного поведения в опытах с использованием центрального введения сурфагона в дозах 3 и 30 нг за 10-15 мин до начала исследования поведения, имели противоположный характер по отношению к результатам при периферическом введении. Установлено, что преобладающим эффектом пептида при его введении в боковые желудочки мозга является снижение болевой чувствительности и аффективной агрессивности в ответ на неизбегаемое злектроболевое раздражение. Воспроизведение этого эффекта у кастрированных крыс позволяет заключить, что в его реализации не участвуют половые стероиды. Выявленные различия эффектов центрального и периферического введения сурфагона могут быть обусловлены особенностями достаточно сложного процесса связывания сурфагона с рецепторами в различных' мозговых структурах, зависящего от пути проникновения и распространения пептида в центральной нервной системе. е

Можно полагать, что при системном (внутрибрюшинном) введении препарата основным местом его проникновения в центральную нервную систему являются участки наиболее высокой проницаемости гематоэнцефаличе-ского барьера, в частности гипоталамическая область, и, следовательно, возможна преимущественная значительная активация медиобазального гипоталамуса, имеющего места специфического связывания Гн-РГ (248). Активация же этой области, участвующей, как известно, в формировании реакции ярости и агрессии, должна была привести в условиях неизбегаемого электроболевого раздражения к усилению агрессивно-оборонительного поведения, что и было нами установлено при внутрибрюшинном введении сурфагона. Этот эффект пептида может дополняться алгическим и агрессогенным действием адренокортикотропного гормона (127), увеличенное выделение которого клетками гипофиза под влиянием люлиберина было установлено в опытах in vivo (210). Увеличение выделения гормона при этом возможно и вследствие активации медиобазального гипоталамуса.

При анализе анальгетического и антиагрессогенного эффектов сурфагона при его внутрижелудочковом введении можно полагать, что эти эффекты обусловлены его прямым взаимодействием со специфическими рецепторами в лимбической системе и среднем мозге. Так, с применением радиоавтографии обнаружено специфическое связывание люлиберина с высокой плотностью рецепторов в гиппокампе и миндалевидном комплексе (230, 263, 268, 283), участвующих, как известно, в регуляции поведения. С этими структурами связывают нейромедиаторное действие люлиберина, проявляющееся, в частности, в дозозависимом высвобождении серотонина из си-наптосом гиппокампа под влиянием пептида (232). Этот пептидергический эффект может привести к активации нисходящей серотонинергической системы, обладающей анальгетическим влиянием (4, 28, 70, 138).

Вторым механизмом анальгетического и антиагрессогенного эффектов введенного в желудочки мозга сурфагона может быть его действие на прилежащее к ним центральное серое вещество, в котором обнаружено широкое распространение содержащих Гн-РГ волокон и идентифицированы нейроны, реагирующие на ионофоретическое подведение пептида (268). Поскольку эта область мозга явяляется центральным звеном антиноцицептив-ной системы, ее активация сурфагоном должна привести к снижению болевой чувствительности. Механизм этого эффекта может также включать модулирующее влияние опиоидных пептидов на серотонинергическую систему (342). Принимая во внимание данные о медиации эндогенной опиоидной системой судорожной готовности животных (251, 252), можно полагать, что наблюдавшееся в наших опытах выраженное усиление судорожных реакций при электроболевом раздражении крыс является подтверждением предположения о значительном выделении опиоидов после введения сурфагона в мозговые желудочки. С этим предположением согласуется и наблюдавшееся у крыс усиление груминга, которое на фоне анальгетического и антиагрессо-генного действия пептида служит проявлением комфортного состояния животных. Возможность описанных механизмов подтверждается сходством связывания структурах мозга естественного пептида и его аналогов-агонистов (248).

В связи с этим, важным свидетельством правомочности сделанного предположения об участии в реализации эффектов сурфагона эндогенных опиоидов могут являться результаты исследования нейрофармармакологиче-ского действия аналога-агониста D-Trp-6-Гн-РГ при внутрижелудочковом введении самцам крыс (251), в котором была установлена полная отмена на-локсоном вызванной пептидом аналгезии в тесте отдергивания хвоста. В этом же исследовании было показано угнетение аналогом-агонистом вызванного апоморфином стереотипного поведения, которое полностью отменялось введением налоксона, но антагонист опиатов не влиял на стереотипию, вызванную амфетамином и значительно потенциировал тормозный эффект пептида в отношении ее. Последнее обстоятельство свидетельствует о возможности вовлечения в механизм реализации эффектов Гн-РГ и его ана-логов-агонистов наряду с системой эндогенных опиоидов и дофаминергиче-ской нейротрансмиссии.

Наблюдавшееся в ходе проведенного нами исследования снижение вертикальной активности в арене согласуется с результатами, полученными в тесте открытого поля и в комбинированном тесте каталепсии при внутриже-лудочковом введении Б-Тгр-б-Гн-РГ (251), а также свидетельствует о сходном характере поведенческих эффектов различных аналогов-агонистов Гн-РГ, в основе которой могут находиться одинаковые процессы связывания с рецепторами в структурах мозга и их активации.

Влияние сурфагона на болевую чувствительность также исследовано при термическом болевом воздействии в тесте «горячая пластина» на ин-тактных и кастрированных мышах с использованием широкого диапазона доз препарата (от 0,004 до 450 мкг/кг), который вводился внутрибрюшинно за 12 мин до начала опыта.

У интактных животных во время последних экспозиций сурфагон в большинстве использованных доз оказывал антиноцицептивное влияние, достоверно увеличивая латентный период реакции выпрыгивания. В то же время в начальных экспозициях, где болевая чувствительность оценивалась по величине латентного периода реакции облизывания лап, проявлялись как алгические, так и анальгетические эффекты пептида. Поэтому в ряде опытных групп на протяжении опыта происходило изменение направленности эффектов пептида.

Причиной этому могут быть следующие факторы. В предыдущих исследованиях нами было установлено значительное влияние сурфагона на ориентировочно-исследовательскую активность и груминг в условиях открытого поля, ограниченного стеклянным цилиндром. Подобный цилиндр использовался и в экспериментальной установке "горячая пластина". При этом в начале тестирования (особенно в 1-й экспозиции) у животных отмечалась поведенческая активация, сходная с таковой в открытом поле, что могло оказывать существенное влияние на проявление поведенческой болевой реакции. Другим важным фактором является время введения пептида до начала эксперимента. В наших исследованиях тестирование болевой чувствительности начиналось через 12 минут после внутрибрюшинного введения препарата f - ~ - -—■•■1«'.p mwiji in и nr^ • —

180 г и продолжалось в течение 6-7 минут. За данный промежуток времени сурфа-гон на пути своего распространения в ЦНС мог последовательно активировать нейрохимические механизмы и структуры головного мозга, по-разному влияющие на болевую чувствительность. В частности, при системном введении препарата основным местном его проникновения в ЦНС являются участки наиболее высокой проницаемости гематоэнцефалического барьера, в частности, гипоталамическая область. Поэтому для активации структур анти-ноцицептивной системы (центральное серое вещество среднего мозга), участвующих в реализации анальгетических эффектов аналогов-агонистов Гн-РГ (250, 251, 252, 348), может понадобиться больше времени.

Наряду с этим подробного анализа требуют и другие полученные результаты. Так, использование максимальной в данных опытах дозы пептида 450 мкг/кг сопровождалось повышением болевых порогов на протяжении всего тестирования болевой чувствительности, тогда как изменение достоверных ноцицептивных эффектов сурфагона на антиноцицептивные происходило при использовании достаточно малых доз (от 0,004 до 0,5 мкг/кг). Доза 450 мкг/кг, учитывая высокую устойчивость пептида к протеазам, является достаточно высокой, поэтому при ее введении сурфагон может оказывать нейромедиаторное действие, связываясь со специфическими рецепторами в различных структурах головного мозга и быстро вызывая проявление физиологического эффекта. Использование же доз, которые в 1000 и более раз меньше, может быть недостаточным для подобного действия, но в данном случае возможно проявление нейромодулирующего эффекта пептида и достижение эффекта через изменение активности ряда других медиаторных систем, например, моноаминергической и системы эндогенных опиоидов (250, 348).

Участие половых стероидов и гонадотропинов гипофиза в механизмах изменения порогов исследованных болевых реакций представляется маловероятным из-за малого промежутка времени от момента введения пептида до окончания тестирования. На этом основании можно заключить, что выявленк. Чт. f*\ ные алгические и анальгетические эффекты сурфагона являются результатом его прямого нейротропного действия, не оспосредованного половыми стероидами и гонадотропинами гипофиза.

Преобладающим эффектом сурфагона в опытах с кастрированными животными было повышение болевой чувствительности при термическом раздражении. Наряду с этим при дозе 5 мкг/кг проявлялось анальгетическое действие пептида. Кастрация при этом оказывала выраженное антиноцице-тивное влияние и способствовала изменению направленности эффектов пептида в сравнении с интактными животными. Анальгетический эффект кастрации как при термическом, так и при электрокожном раздражении во многом обусловлен вовлечением серотонинергической системы спинного мозга (288). В то же время известно, ч го центральное серое вещество среднего мозга, являющееся ключевой структурой антиноцицептивной системы, оказывает нисходящее влияние на сегментарные структуры регуляции болевой чувствительности в спинном мозге именно через серотонинергические пути (28).

Таким образом, влияние сурфагона на болевую чувствительность при термическом раздражении у интактных и кастрированных крыс имеет разнонаправленный характер. Данный факт указывает на важное значение исходного функционального состояния гипоталамо-гипофизарно-гонадальной системы, в частности уровня половых стероидов в крови, для реализации эффектов сурфагона, направленных на изменение болевых порогов. Вероятно, тестостерон способен влиять на чувствительность мозговых структур к действию Гн-РГ.

Кроме того, полученные в данной серии результаты показали, что в случае изучения влияния на болевую чувствительность препаратов с высокой нейротропной активностью необходимо учитывать их поведенческие эффекты, которые могут оказывать существенное влияние на проявление поведенческих признаков болевой реакции, особенно в начальной стадии тестирования.

Следует отметить, что все приведенные выше результаты исследова

182 ний получены при однократном введении сурфагона в промежуток времени, недостаточный для изменения функционального состояния гипоталамо-гипофизарно-гонадальной системы. Далее будут проанализированы данные экспериментов, проводившихся при введении сурфагона в дозах 0,1 и 5 мкг/кг на протяжении нескольких дней (от 4-х и более). Подобные схемы введения высокоактивного аналога Гн-РГ не могли не вызывать значительных сдвигов в гипоталамо-гипофизарно-гонадальной системе. Для оценки этих изменений был определен уровень тестостерона в крови после внутри-брюшинного введения препарата крысам в дозах 0,1 и 5 мкг/кг на протяжении 4-х дней.

У интактных животных сурфагон в обеих дозах вызывал близкое по выраженности достоверное снижение уровня тестостерона (на 43 и 50 % соответственно) в сыворотке крови. У кастрированных животных на 20-й день после гонадэктомии уровень тестостерона в крови резко снизился (на 80 %) и введение сурфагона его изменяло. Эмоционально-болевой стресс не влиял на исходный уровень гормона у интактных крыс, но значительно потенции-ровал ингибирующий эффект сурфагона в дозе 5 мкг/кг как у интактных, так и у кастрированных животных. Кроме того, стрессорное воздействие уменьшило содержание тестостерона у кастрированных крыс. Напротиь, в условиях стресса ингибирующее влияние пептида в дозе 0,1 мкг/кг у интактных животных ослабевало, а у кастрированных имело место небольшое повышение уровня гормона.

Наблюдавшееся снижение уровня тестостерона после длительного введения высокоактивного агониста Гн-РГ у интактных крыс, вероятно, происходило по известному механизму, связанному с десенситизацией гипофиза, суть которого заключается в следующем (15). Установлено, что повышение секреции гонадотропинов происходит только при применении Гн-РГ в импульсном режиме (по аналогии с ритмом секреции эндогенного Гн-РГ) (211). При этом происходит связывание только части Гн-РГ-тропных рецепторов в гипофизе, а в интервалах происходит адекватный их ресинтез. Этот механизм поддерживает постоянную готовность клеток аденогипофиза поддерживает постоянную готовность клеток аденогипофиза реагировать на гипоталамическую стимуляцию и модулируется половыми стероидами. При длительном воздействии высокоактивных аналогов Гн-РГ, имеющих повышенное сродство к рецепторам Гн-РГ, сначала происходит связывание большей части рецепторов и пиковый выброс гонадотропинов. В дальнейшем происходит исчезновение Гн-РГ-рецепторов, которые не успевают ресинте-зироваться, что приводит к десенситизации гипофиза и длительной блокаде синтеза гонадотропинов и, соответственно, половых стероидов (15). Эта блокада является обратимой и после отмены аналогов-агонистов полностью восстанавливается чувствительность аденогипофиза к гипоталамической стимуляции.

Необходимо также отметить, что при приблизительно равных уровнях тестостерона в опытных группах интактных крыс после длительного введения пептида динамика их достижения могла быть различной.

Наблюдавшееся отсутствие достоверных изменений уровня тестостерона в условиях эмоционально-болевого стресса в определенной степени согласуется с данными исследований (80), в которых при длительном (от 4 до 10 дней) воздействии различных видов стресса существенного снижения уровня тестостерона не происходило. Напротив, в ряде случаев имело место его достоверное повышение. Достоверное снижение содержания тестостерона отмечалось при однократном стрессорном воздействии электрическим током на модели, близкой к использованной в наших экспериментах (63, 327). Кроме того, в нашем исследовании определенное влияние могла оказать относительная исходная устойчивость к стрессу крыс линии Вистар (134), которая имеет важное значение в нейроэндокринных механизмах формирования адаптивного поведения (106).

В то же время стресс вызвал достоверное снижение уровня тетосте-рона у кастрированных крыс, что могло быть связано с перестройкой в условиях стресса функционирования пучково-сетчатой зоны коры надпочечников, в которой наблюдались существенные изменения при морфологическом

- «¡¡US ц" исследовании.

Значительное усиление в условиях стресса ингибирующего эффекта пептида в дозе 5 мкг/кг у интактных крыс и его проявление у кастрированных свидетельствует о его сложном механизме. Например, учитывая относительно большое количество вводимого препарата, у интактных животных возможно присоединение прямого ингибирующего действия на семенники (152) через связывание со специфическими рецепторами (177). Кроме того, в опытах на приматах показано участие Гн-РГ в активации синтеза тестостерона в надпочечниках из сульфатированных соединений дигидроэпиандрр^ стерона (45, 46, 47). Данный факт позволяет предположить, что в случае применения высокоактивного аналога Гн-РГ нельзя исключать возможности проявления ингибирующего влияния на данный процесс, как это было установлено в наших экспериментах для гонадального синтеза тестостерона у некастрированных крыс. Наряду с этим проявление возрастания эффекта пептида как у интактных, так и у кастрированных крыс может быть и следствием воздействия сурфагона на стресс-реализующие и стресс-лимитирующие механизмы. При этом необходимо учитывать возможность снижения пептидом болевых порогов при электроболевом стрессорном воздействии и активацию эмоционально-негативного подкрепления. Введение меньшей дозы сурфагона также могло реализовавать свои эффекты через указанные механизмы, но с обратной направленностью.

Ежедневное однократное внутрибрюшинное введение сурфагона в дозах 0,1 и 5 мкг/кг за 10 мин до сеанса обучения вызвало ухудшение выработки и сохранения (через 9 дней) пищедобывательного условного рефлекса в Т-лабиринте у КС крыс, исходно отличающихся более высокой способностью к обучению и сохранению условного рефлекса, и улучшение - у ДС животных. Кастрация стимулировала данные процессы у ДС крыс и не изменяла их у КС, а также способствовала однонаправленному проявлению эффектов пептида (преимущественно ингибирующих).

Что касается механизмов эффектов сурфагона на процессы обучения и памяти, то следует считать, что после введения за 10 минут до начала обучения пептид мог оказывать влияние не только на ориентировочно-исследовательскую активность, но и на уровень пищевой мотивации, эмоциональное состояние, а также на выработку временных условных связей и их сохранение. В частности, о влиянии сурфагона на уровень пищевой мотивации свидетельствуют достоверные изменения в некоторых опытных группах длительности латентного периода в 1-й день опыта. Признаком нарушения консолидации временных условных связей может являться значительно сниженный (в 2 раза) уровень сохранности условного рефлекса у КС крыс, получавших сурфагона в дозе 0,1 мкг/кг, в то время как динамика их обучения существенно не отличалась от показателей контрольной группы.

Установленные эффекты сурфагона в условиях положительного и отрицательного подкрепления свидетельствуют о его высокой нейротропной активности. В основе подобного действия пептида модет находиться его прямое влияние на подкрепляющие системы мозга. Известно, что ключевую роль в их функционировании играет мезокортиколимбическая система, основным нейрохимическим звеном которой является система дофамина. Другие нейромедиаторные системы (норадренергическая, серотонинергическая, опиоидная и др.) модулируют ее основное эмоциогенное действие . Особую роль в изменении реактивности мезокортиколимбической системы играют нейропептиды с дофаминзависимыми свойствами (105). Данное обстоятельство в полной мере относится и к аналогам-агонистам Гн-РГ, которые реализуют свои нейротропные эффекты через дофамин- и опиоидергические механизмы (251).

При Анализе эффектов аналога-агониста гипоталамического рилизинг-фактора возникает вопрос о возможном участии гонадотропинов гипофиза и половых гормонов данном процессе. Возможность реализации эффектов пептида без участия половых стероидов была исследована в опытах на кастрированных животных. Наличие достоверных изменений у кастрированных животных указывает на возможность реализации эффектов пептида без

186 включения стероидозависисых механизмов, однако существенное их изменение после кастрации указывает на важное значение для их реализации функционального состояния гипоталамо-гипофизарно-гонадальной системы.

Кроме того, достоверные изменения показателей обучения у интакт-ных крыс в 1-й день опыта также позволяют исключить влияние гонадотро-пинов и половых гормонов, так как время от введения пептида крысам до начала их обучения и продолжительность сеанса недостаточно для существенного изменения их уровня в крови (23, 24). Эти данные позволяют считать наблюдавшиеся в нашем исследовании эффекты сурфагона результатом его нейротропного действия, не опосредованного гонадотропинами и половыми гормонами. Естественно считать, что в последующие дни, т.е. при повторных введениях пептида, обучение происходило на фоне динамичного изменения функционального состояния гипогаламо-гипофизарно-гонада-льной системы, что в свою очередь могло способствовать изменению активности опиоидной и гипоталамо-гипофизарно-надпочечниковой систем (157, 210), оказывающих значительное влияние на исследуемые процессы.

Наряду с выраженным влиянием на нервную и эндокринную систему, пептид проявлял и высокую иммунотропную активность. Так, исследование влияния внутрибрюшинного введения сурфагона в дозах 0,1 и 5 мкг/кг в различные фазы развития гуморального иммунного ответа установило выраженный дозозависимый характер изменения количества АОК и РОК в селезенке. Меньшая доза пептида при всех использованных схемах введения (в индуктивную и продуктивную фазу, а также на протяжении обеих фаз) оказывала иммуностимулирующее действие. Напротив, использование большей дозы препарата в индуктивную фазу вызывало достоверное снижение показателей иммунного ответа, тогда как при остальных схемах введения существенных изменений не происходило. Кастрация вызывала достоверное снижение гуморального иммунного ответа. Эффекты сурфагона у кастрированных животных имели однонаправленный, преимущественно стимулирующий характер. Достоверное снижение иммунного ответа отмечалось только при вве

-¡г! дении сурфагона в большей дозе одновременно на протяжении индуктивной и продуктивной фаз.

При анализе механизмов выявленных иммунотропных эффектов многократного введения сурфагона закономерно встает вопрос об участии в их реализации компонентов гипоталамо-гипофизарно-гонадальной системы. У интактных животных, как было ранее показано, многократное использование обеих доз практически в равной степени вызывает снижение уровня тестостерона в крови, однако изменения показателей гуморального иммунного ответа в опытных группах не имели одинаковой направленности. Полученные результаты указывают на отсутствие видимой взаимосвязи между содержанием тестостерона в крови и характером иммунного ответа, и, следовательно, предполагают наличие стероидонезависимых механизмов.

Данное предположение подтверждается наличием у кастрированных крыс значительного влияния сурфагона на показатели гуморального иммунного ответа. Кроме того, сохранение после кастрации направленности и степени выраженности изменения показателей гуморального иммунного ответа, выявленных у интактных животных, получавших пептид в дозе 0,1 мкг/кг, также свидетельствует об этом.

У интатных же животных участие андрогенов в развитии иммунного ответа могло быть достаточно существенным. При этом следует отметить, что в отношении влияния половых стероидов на иммунный ответ в литературе имеются разноречивые результаты. По одним данным (142, 181, 182, 295, 341, 369) введение тестостерона в организм или внесение его в клеточные культуры снижает гуморальный иммунный ответ, а блокада его рецепторов восстанавливает нарушенный после ожога клеточный иммунитет (352). По другим сведениям (48, 73, 74,), введение гормона приводит к существенному повышению количества АОК в селезенке у крыс, в то время как пролифера-тивная активностьТ-, но не В-клеток существенно снижается. По некоторым данным, тестостерон не изменяет пролиферативный ответ лимфоцитов на митогены (227, 233), но индуцирует Т-супрессоры в культурах лимфоцитов

188 периферической крови человека (233, 347). Активация Т-супрессоров обнаружена и в условиях введения тестостерона in vivo у крыс (Iii). Кроме того, под воздействием гормона отмечено существенное снижение миграции В-клеток из костного мозга в селезенку (74), что связывается с его влиянием на дифференцировку полипотентных стволовых клеток и изменении ее направления в сторону эритропоэза в ущерб лимфопоэзу (148).

Б реализации иммунотропных эффектов сурфагона также представляется вполне реальным участие гонадотропинов гипофиза, способных самостоятельно оказывать влияние на иммунную систему (151, 167, 196). В частности, ЛГ и ФСГ ингибируют секрецию растворимых рецепторов ИЛ-2 мо-нонуклеарными клетками периферической крови (257, 258). Данный механизм может иметь место при отмеченном снижении гуморального иммунного ответа после кастрации вследствие значительного повышения у крыс уровня гонадотропинов в крови. Введение пептида кастрированным животным также может вызывать десенситизацию гипофиза и снижение секреции гонадотропинов, что могло в определенной степени способствовать наблюдавшемуся усилению иммунного ответа в обеих опытных группах.

Кроме того, иммуностимулирующее действие меньшей дозы сурфагона у интактных крыс происходило на (Ьоне сниж*. чия в сыворотке уровня тестостерона и, следовательно, гонадотропинов. Однако в эти представления не укладывается иммуносупрессирующий эффект препарата в дозе 5 мкг/кг в индуктивную фазу у интактных животных, который проявлялся на фоне одинакового с меньшей дозой снижения уровня тестостерона, что указывает на наличие и других механизмов иммунотропного действия аналога Гн-РГ.

Учитывая полифункциональный характер биологической активности Гн-РГ, многократное введение высокоактивного аналога могло вызвать существенные изменения различной модальности в нервной, эндокринной и иммунной системах, которые в своей совокупности определили выраженность и направленность иммунного ответа как интегративного показателя взаимодействия всех регуляторных систем. Свидетельством тому может являться тот факт, что разнонаправленность эффектов при использовании сур-фагона в дозах 0,1 и 5 мкг/кг проявлялась не только при изучении иммунного ответа, но и при исследовании процессов обучения и памяти, болевой чувствительности в тесте «горячая пластина», поведения в открытом поле и при неизбегаемом электроболевом раздражении. Известно, что в поведенческих реакциях, как и в иммунных, отражается функциональное состояние многих систем организма (32, 117, 127) ив исследованиях последних лет все чаще между ними демонстрируется выраженная взаимосвязь (33, 55, 56, 78, 101, 102).

Активация нервных механизмов регуляции иммунного ответа при периферическом введении сурфагона представляется вполне реальной. При этом пептид через участки повышенной проницаемости в гематоэнцефаличе-ском барьере может достигать гипоталамических структур, которые принимают участие в модуляции иммунного ответа. В частности, вентральные ядра при их электрической стимуляции супрессируют иммунные функции спле-ноцитов через активацию симпатического отдела нервной системы (231). Нервные центры заднего гипоталамуса и бугристой зоны оказывают модулирующее влияние на иммунные реакции в зависимости от природы антигена (160).

Исследование иммунотропных эффектов сурфагона при введении в индуктивную фазу гуморального иммунного ответа дозах 0,1 и 5 мкг/кг в условиях эмоционально-болевого стресса показало сохранение их направленности, наблюдавшейся у интактных и кастрированных крыс, не подвергавшихся стрессорному воздействию. Таким образом, стрессовая реакция не оказывала выраженного влияния на проявление иммунотропного действия пептида, что косвенно указывает на различные механизмы их реализации. Использованная модель стресса достоверно снижала гуморальный иммунный ответ, но не изменяла уровень тестостерона в крови и, следовательно, активность всей гипоталамо-гипофизарно-гонадальной системы. Полученные результаты показывают, что в этом случае ингибирующее влияние стресса на иммунный ответ не включало в себя изменения в данной эндокринной оси.

Значительно менее выраженное, чем при исследовании гуморального иммунного ответа, влияние оказывало внутрибрюшинное введение сурфаго-на в тех же дозах на клеточное звено иммунитета в реакции ГЗТ, развитие которой изучали на интактных и кастрированных крысах в норме и в условиях эмоционально-болевого стресса. Пептид оказывал ингибирующее действие, которое проявилось достоверным снижением разности масс регионарных и контрлатеральных лимфоузлов только в двух опытных группах: при введении в дозе 0,1 мкг/кг интактным животным и в дозе 5 мкг/кг - кастрированным, подвергавшимся стрессорному воздействию. Кастрация и эмоционально-болевой стресс не сопровождались существенным изменением данного показателя, но увеличивали в 4 раза разность количества кариоци-тов.

Обращает внимание тот факт, что данное увеличение происходило не вследствие увеличения клеточности в контрлатеральных лимфоузлах, а за счет ее снижения в регионарных. Подобные изменения наблюдались и в опытных группах различных экспериментальных серий. В связи с этим на основании данных литературы можно предположить следующие механизмы развития отмеченных изменений. Установлено, что существует непрерывная рециркуляция лимфоцитов из органов в лимфо- и кровоток и возвращение обратно в лимфоидные органы (феномен хоминга). Т-лимфоциты рециркулируют более интенсивно, чем В-ьалетки. Данный процесс может значительно изменяться под действием ряда факторов, в частности, в условиях стресса

145, 146). Установлено также, что рециркуляция лимфоцитов регулируется 9 нейроэндокринными механизмам и наиболее важным из компонентов при этом является активация центров автономной нервной системы через locus ceruleus и активация КРФ-содержащих нейронов в паравентрикулярных ядрах. Существенную роль в изменении миграционных свойств лимфоцитов играют кортикостероиды и вазоактивный интестинальный пептид (299). В свою очередь, Гн-РГ способен стимулировать секрецию АКТГ в гипофизе о

210). На основании этих данных и, принимая во внимание данные морфологического исследования тимуса и селезенки, можно предполагать участие сурфагона и гипоталамо-гипофизарно-гонадальной системы в целом в регуляции миграции клеток. Участие данной системы в процессах миграции лимфоцитов установлено в исследовании, в котором кастрация вызывала экспансию пре-В-лимфоцитов в костном мозге и усиление их миграции в периферические лимфоидные органы (295, 369). В связи с вышеизложенными фактами можно полагать, что изменение процессов рециркуляции лимфоци-9 тов в виде снижения исходной клеточности в лимфоузлах могло отразиться на развитии ГЗТ.

Прямое действие сурфагона на систему Т-клеток представляется также вполне вероятным с учетом результатов проведенного нами морфологического исследования тимуса, а также данный литературы, согласно которым синтез Гн-РГ обнаружен во многих субпопуляциях Т-лимфоцитов (241, 249, 344). Следует отметить, что в литературы мы не нашли данные о влиянии Гн-РГ и его аналогов на клеточные иммунные реакции.

Таким образом, сурфагон может оказывать ингибирущее влияние на эффекторные этапы клеточного иммунного ответа. Механизмы эффектов пептида могут включать прямое действие на Т-лимфоциты и процессы их рециркуляции.

Полученные при изучении иммунного ответа результаты позволили установить влияние сурфагона как на гуморальное, так и клеточное звено. Кроме того, показана важная роль в этом процессе функционального состояния гипоталамо-гипофизарно-гонадальной системы.

Наряду с выяснением действия пептида на специфическую реактивность организма проведено исследование его влияние на неспецифические факторы защиты, которое выполнено на нейтрофилах из индуцированного перитонеального экссудата у мышей с использованием тех же условий опыта, что при изучении иммунного ответа. Установлено, что у интактных мышей сурфагон оказывал дозозависимое действие на кислородзависимые механизмы и фагоцитарную активность нейтрофилов, стимулируя их при малой дозе и угнетая при большой. У кастрированных животных активность пептида сохранялась, а эффекты в обеих дозах имели стимулирующий характер. В условиях эмоционально-болевого стресса влияние препарата имело ту же направленность, что и у нестрессированных животных.

Полученные результаты позволяют заключить, что сурфагон может осуществлять свое действие на функциональную и фагоцитарную активность нейтрофилов без участия половых стероидов. Нейроэндокринные сдвиги, происходившие при воздействии эмоционально-болевого стресса, не оказали существенного влияния на реализацию эффектов пептида. В связи с этим вероятно наличие иных механизмов, которые требуют дальнейшего подробного выяснения. Необходимо отметить, что в литературе нам не удалось найти работы, в которых исследовалось влияние Гн-РГ или его аналогов на неспецифические факторы защиты.

В результате исследования влияния сурфагона на процессы перекис-ного окисления липидов установлено, что при повторном введении пептида в дозах 0,1 и 5 мкг/кг уровень МДА в сыворотке интактных животных не изменялся на фоне достоверного снижения содержания тестостерона, что в определенной мере указывает на отсутствие взаимосвязи между этими показателями. Подтверждением этому предположению могут быть результаты экспериментов in vitro, в которых показано, что тестостерон, в отличие от эстра-диола, не обладает высокой активностью в отношении ПОЛ в плазме крыс и незначительно подавляет его лишь в высоких концентрациях (150). Однако этими же авторами установлено, что в стенке аорты тестостерон является проксидантом в опытах in vivo и in vitro независимо от концентрации и длительности инкубации (71)

Кастрация достоверно снижала содержание МДА, что согласуется с данными литфатуры (126). У кастрированных крыс снижение уровня продуктов ПОЛ происходит не только в крови, но и в печени (79). Введение сурфагона кастрированным животным в обеих дозах вызывало повышение уровня МДА до контрольных значений у интактных крыс. Механизм данного явления представляется не совсем ясным, в литературе данных о влиянии Гн-РГ и его аналогов на ПОЛ нами не найдено. Однако можно предположить, что снижение уровня МДА в сыворотке крови после кастрации является следствием замедления метаболических процессов в организме, в процессе которых образуются свободные радикалы кислорода. Кроме того, отмеченное нами повышение болевых при электрическом и температурном раздражении у кастрированных животных может свидетельствовать об активации антиноцицептивных механизмов и повышенной продукции опиоидных пептидов, обладающих выраженными антиоксидантными свойствами (96). Подтверждением правомочности данного предположения может являться тот факт, что сурфагон, снижая болевые пороги у кастрированных животных, достоверно повышал у них уровень МДА в крови.

Использованная нами модель эмоционально-болевого стресса вызывала достоверное снижение уровня МДА в сыворотке. Полученные результаты согласуются с данными литературы, в которых подобные результаты в крови были получены при сходном электроболевом стрессорном воздействии на крыс (88). Более интенсивное воздействие эмоционально-болевого стресса (в течение 6 часов) в камере с электрифицированным полом вызывало достоверное повышение уровня МДА в сыворотке крови (41). Механизм полученных нами результатов может заключаться в следующем. В наших опытах стрессорное воздействие достаточно кратковременным (2 минут в 1 раз в сутки), а забор крови производился через 20 часов после последнего сеанса. К этому времени в организме в организме в ответ на активацию стресс-реализующих систем могла значительно повышаться активность стресс-лимитирующих механизмов с последующим выбросом опиоидных пептидов с выраженными антиоксидантными свойствами (96).

Меньшая доза пептида у стрессированных некастрированных животных достоверно снижала содержание МДА, тогда как большая не оказывала эффекта. Следует отметить, что в данной дозе сурфагон оказывал выражен ' .'«ту *

Л а ^ »4 ной противострессорное влияние при изучении его влияния на развитие гуморального иммунного ответа и факторы неспецифической резистентности. У кастрированных крыс в условиях стресса уровень МДА достоверно повышался и не изменялся после введения сурфагона.

Таким образом, разнонаправленное действие стресса у интактных и кастрированных животных может свидетельствовать о важной роли в этом процессе функционального состояния гипоталамо-гипофизарно-гонадальной системы. В пользу этого предположения свидетельствует и неодинаковый характер эффектов пептида у интактных и кастрированных животных. Одновременное определение в сыворотке МДА и тестостерона не выявило взаимосвязи между данными показателями. Что касается механизмов действия препарата на ПОЛ, то сурфагон, обладая широким спектром биологической активности, в том числе нейротропной и эндокринной, может вызывать значительные изменения функций организма, включая метаболические сдвиги. Полученные результаты позволяют предполагать при этом активное влияние пептида на стресс-реализующие и стресс-лимитирующие системы. Поэтому выявленные после многократного введения пептида изменения уровня продуктов ПОЛ в сыворотке крови могут являться интегративным показателем многих процессов, протекающих в органах и тканях.

С целью выяснения возможной роли структур головного мозга в реализации иммунотропных эффектов пептида препарат крысам вводили в боковые желудочки мозга на протяжении индуктивной фазы гуморального иммунного ответа в дозах 3 и 30 нг. В обеих опытных группах отмечалось выраженное повышение количества АОК и РОК в селезенке. Иммуностимулирующая активность сурфагона при этом была существенно выше, чем при внутрибрюшинном введении. Наряду со стимуляцией иммунного отве!а у подопытных крыс возрастали функциональная и макрофагальная активность нейтрофилов периферической крови, индексы массы тимуса и селезенки. В сыворотке крови уровень тестостерона существенно не изменялся, но происходило достоверное снижение содержания МДА. Данный факт, наряду с анальгетическим эффектом внутрижелудочкового введения сурфагона, также может свидетельствовать об участии системы эндогенных опиоидных пептидов в реализации биологических эффектов аналога Гн-РГ.

Использованный способ центрального введения пептида позволил облегчить доступ к структурам мозга, труднодосягаемым при периферическом введении, без сопутствующей активации гипоталамо-гипофизарно-гонадальной оси и без возможности прямого действия на компоненты иммунной системы. В этих условиях сурфагон мог реализовывать свои иммуно-тропные эффекты через нервные и нейроэндокринные механизмы. Нервная система может оказывать модулирующее влияние на иммунный ответ через прямую иннервацию или посредством гормональных влияний (2, 3, 120, 235, 274).

Гн-РГ и его аналог-агонист, имеющий похожую с сурфагоном структуру, при внутрижелудочковом введении обладают высокой нейротропной активностью и вызывают активацию дофаминергической и опиоидной систем (250, 251, 252, 348), являющихся медиаторами эмоционально-положительного подкрепления. Дофаминергическая система играет важную активирующую роль в процессах нейроиммуномодуляции (139, 149). Нейро-тропные эффекты сурфагона при внутрижелудочковом введении были сходны с действием указанного выше аналога и выражались в снижении эмоционально-отрицательной реактивности, отмеченной нами во время исследования поведения при неизбегаемом электроболевом раздражении, в котором пептид оказывал выраженное анальгетическое и антиагрессогенное действие и изменял параметры поведения в открытом поле.

Таким образом, одним из механизмов иммунотропного действия сурфагона при введении в боковые желудочки мозга может быть активация систем медиаторов положительного подкрепления - дофаминергической и опиоидной. Важным фактором является и доступность для воздействия пептида ряда мозговых структур, в частности, гиппокампа, разные области которого могут стимулировать или ингибировать иммунный ответ (262). В связи с этим необходимо отметить, что в гиппокампе имеется высокая плотность специфических Гн-РГ-рецепторов (230). Наблюдавшаяся активация фагоцитарной активности нейтрофилов также могла реализовываться через нервные механизмы. Так, известно, что электрическая стимуляция нервных центров бугристой зоны вызывает усиление фагоцитоза, которое прекращалось после перерезки спинного мозга или под влиянием барбитуратов (160). Активация сурфагоном опиоидной системы, обладающей стресс-лимитирующей активностью (53), могла быть причиной достоверного снижения уровня ПОЛ и содержания МДА в сыворотке крови.

Необходимо также отметить, что результаты, полученные при изучении влияния сурфагона на болевую чувствительность и развитие иммунного ответа, не позволяют установить четкую взаимосвязь между ними, отмеченную в других исследованиях (33, 84), в которых стимуляция иммунного ответа сочеталась со снижением болевых порогов. В то же время высокая поведенческая активность сурфагона, наблюдавшаяся при исследовании его ней-ротропных эффектов, сопровождалась выраженным влиянием на иммунный ответ. Таким образом, полученные нами данные служат еще одним доказательством взаимосвязей между показателями поведения животным и иммунного ответа, отмеченная в ряде исследований (30, 42, 64, 66).

Многократное внутрибрюшинное введение сурфагона в дозах 0,1 и 5 мкг/кг сопровождалось не только вышеописанными функциональными сдвигами, но и морфологическими изменениями в органах иммунной и эндокринной систем, установлеными в экспериментах на интактных и кастрированных мышах в норме и в условиях эмоционально-болевого стресса.

У интактных мышей при меньшей дозе в селезенке наблюдались признаки усиления миграции лимфоцитов из В-зон на фоне умеренного снижения толщины коры тимуса и увеличения активности пучковой зоны надпочечников, тогда как при большей дозе изменения в селезенке касались Т-зон при резком утончении коры тимуса и увеличении ширины клубочковой зоны в надпочечниках. Установленные после введения сурфагона и кастрации существенные морфологические изменения в тимусе согласуются в данными литературы о многосторонних функциональных связях между данным органом и гипоталамо-гипофизарно-гонадальной системой (158, 170, 190, 205, 228, 229)

Выявленные различия в морфологических изменениях органов между подопытными группами согласуются с результатами предыдущих серий, в которых сурфагон при использовании этих же доз оказывал противоположное влияние на болевую чувствительность, иммунный ответ, функциональную и фагоцитарную активность нейтрофилов, что может свидетельствовать взаимосвязи перечисленных явлений. Следовательно, многократное введение сурфагона сопровождается комплексом структурных и функциональных изменений со стороны всех регуляторных систем организма. Оценивая в целом иммунотропное действие пептида можно предположить, что оно имеет им-муномодулирующую направленность (94, 135).

Одним из механизмов столь широкого диапазона биологического действия аналога Гн-РГ может являться образование под его влиянием химических соединений, обладающих полифункциональным физиологическим действием, в частности, оксида азота (N0). Известно, что эндогенным источником для образования N0 является L-аргинин (50, 131), который содержится в структуре Гн-РГ. Установлено, что L-аргинин влияет на количество АОК в селезенке и процесс фагоцитоза (119), индуцирует апоптоз в нервной и лим-фоидной ткани in vitro (147). Пероральное введение L-аргинина тормозит выработку пищедобывательного условного навыка в лабиринте у белых крыс (124) и в этих же дозах снижает болевую чувствительность при термическом раздражении в тесте "tail-flick" (118). В условиях неизбегаемого электроболевого раздражения аргинин-содержащие пептиды при внутрибрюшинном введении повышали болевую чувствительность и агрессивность у крыс (292).

В свою очередь, NO обладает универсальным регуляторным действием на функции нервной, эндокринной и иммунной систем, которое подробно изложено в ряде обзоров (25, 50, 112, 131) и послужило обоснованием для формирования представлений о стресс-лимитирующей системе оксида азота (93). В частности, N0 оказывает влияние на клетки иммунной системы, активность макрофагов и нейтрофилов, процессы обучения и памяти (50, 131). Сравнение установленного нами влияния сурфагона на регуляторные системы с вышеизложенными данными о физиологическом действии Ь-аргинина и N0 позволяет предполагать их участие в реализации эффектов препарата наряду с другими медиаторными системами. В частности, наблюдавшееся про-тивострессорное действие аналога Гн-РГ при внутрижелудочковом введении и при внутрибрюшинном использовании дозы 0,1 мкг/кг. на иммунную систему и факторы неспецифической резистентности может быть обусловлено активацией стресс-лимитирующей системы оксида азота. Напротив, усиление стрессорного действия при системном введении дозы 5 мкг/кг может являться следствием избытка N0. Данные результаты могут служить подтверждением данных литературы о том, что эффекты N0 зависят от концентрации и от места его продукции и могут иметь как защитный, так и повреждающий характер. В связи с этим целесообразным представляется модулирующее воздействие на системы генерации N0 с целью активации его физиологического и устранения патофизиологического действия (131).

На основании полученных результатов с учетом данных литературы обоснованы возможные механизмы нейро- и иммунотропного действия сурфагона (рис. 47). На схеме представлены предполагаемые прямые эффекты пептида на данные регуляторные системы при исключении влияния функционального состояния гипоталамо-гипофизарно-гонадальной системы, компоненты которой способны оказывать значительное влияние на исследованные показатели. Эндокринные эффекты пептида частично или полностью отсутствовали при использовании кастированных и гипофизэктомированных животных, внутрижелудочковом введении пептида, а также в экспериментах с однократным введением препарата, в которых продолжительности опыта было недостаточно для выброса гонадотропинов и тестостерона.

Нейротропные эффекты: Изменение болевой чувствительности, агрессивного поведения, эмоциональности, исследовательской активности, груминга, обучения и памяти

Оксид —► Нейтроазота филы

Изменение неспецифической резистентности

Влияние на пролиферацию и миграцию клеток

Рис. 47. Схема нейротропного и иммунотропного действия сурфагона

Таким образом, синтетический аналог Гн-РГ сурфагон является пептидом с высокой полифункциональной биологической активностью в отношении регуляторных систем организма: нервной, эндокринной и иммунной. Препарат способен оказывать выраженное прямое нейротропное действие, направленность и выраженность которого зависит от типологических особенностей организма и исходного функционального состояния гипоталамо-гипофизарно-гонадальной системы. Влияние сурфагона на иммунологическую реактивность и факторы неспецифической резистентности может реа-лизовываться как опосредованно через изменение активности нервных и эндокринных механизмов, так и, возможно, в результате прямого действия на органы иммунной системы. Наряду с функциональными сдвигами в регуляторных системах, даже кратковременное введение сурфагона вызывает существенные морфологические изменения в органах иммуногенеза и эндокринной системы. Эффекты пептида сохраняются в условиях стрессорной нейро-эндокринной активации и в зависимости от дозы могут иметь как стресс-лимитирующую, так и стресс-реализующую направленность.