Автореферат и диссертация по медицине (14.01.10) на тему:Адоптивная иммунотерапия злокачественных Т-клеточных лимфом кожи на основе экстракорпорального фотофереза



На правах рукописи

ГОРДИЕВСКАЯ МАРИЯ СЕРГЕЕВНА

АДОПТИВНАЯ ИММУНОТЕРАПИЯ ЗЛОКАЧЕСТВЕННЫХ Т-КЛЕТОЧНЫХ ЛИМФОМ КОЖИ НА ОСНОВЕ ЭКСТРАКОРПОРАЛЬНОГО ФОТОФЕРЕЗА

14.01.10 - кожные и венерические болезни 14.01.21 - гематология и переливание крови

АВТОРЕФЕРАТ

ДИССЕРТАЦИИ НА СОИСКАНИЕ УЧЁНОЙ СТЕПЕНИ КАНДИДАТА МЕДИЦИНСКИХ НАУК

2 6 АВГ 2010

МОСКВА 2010

004608796

Работа выполнена в Московском областном научно-исследовательском клиническом институте им. М.Ф. Владимирского

доктор медицинских наук, профессор Молочков Владимир Алексеевич

доктор медицинских наук Квльдюшевский Александр Вадимович

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, профессор

Халдин Алексей Анатольевич

доктор медицинских наук, профессор

Калинин Николай Николаевич

Ведущая организация: Московский государственный медико-

стоматологический университет.

Защита состоится « /^Г » _ часов на заседании

Диссертационного совета Д. 208.040.lt) при Московской медицинской академии им. И.М. Сеченова (119991, Москва, ул. Трубецкая, д.8, стр.2)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Московской медицинской академии им. И.М. Сеченова (117998, Москва, Нахимовский проспект, д.49)

Автореферат разослан «_»_2010 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета

доктор медицинских наук, профессор Светлана Ильинична Эрдес

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Т-клеточные лимфомы кожи (ТКЖ) - представляют собой группу гетерогенных заболеваний, в основе которых лежат лимфопролиферативные процессы, вызванные проникающими в кожу ютональных Т-лимфоцитов. Процесс начинается в коже, с течением времени прогрессирует, вовлекая лимфатические узлы, периферическую кровь и внутренние органы. (Казаков Д.В., и др. 2002). Грибовидный микоз является самым распространённым заболеванием среди ТКЖ и в общей структуре этой группы занимает около 70%. Синдром Сезари, встречается редко и составляет не более 3-4% всех форм ТКЖ (Беяоусова И.Э., Самцов А.В 2006; Howard M.S., Smoller B.R. 2000).

Проблема лечения ТКЖ представляет собой сложную задачу в связи с развитием лекарственной устойчивости в процессе химиотерапии, недостаточной ее эффективностью и тяжелыми осложнениями, обусловленными лекарственной цитопенией. Ни один из применяющихся на сегодняшний день методов лечения (кортикостероидные гормоны, полихимиотерапия, рентгенотерапия) не позволяет добиться полного регресса патологического процесса, а периоды клинической ремиссии редко достигают 1 года. (Галил-Оглы Г.А., Молочков В.А., Сергеев Ю.В 2005).

В связи с этим, разработка высокоспецифичных биотерапевтических методов лечения, базирующихся на естественных механизмах распознавания и удаления чужеродного агента без повреждения здоровых тканей организма, является перспективным и актуальным научным направлением лечения ТКЖ.

В последнее время в лечении ТКЖ произошел существенный прогресс. Это связано в первую очередь с внедрением в клиническую практику иммукотерапевтического метода лечения - экстракорпоральной фотохимиотерапии (ЭФХТ), который зарекомендовал себя во всем мире как наиболее успешный метод лечения ТКЖ. В основе этого метода лежит воздействие на выделенные из кровотока лейкемические Т-клетки ультрафиолетового облучения А (УФО-А) в сочетании с 8 метоксипсораленом (8-МОП).

Berger CL et al. (2001 г) было показано, что в процессе этой процедуры происходит не только индукция запрограммированной гибели опухолевых клеток, но и активация моноцнтов с тансформацией их в агрессивные фагоцитарные незрелые дендритные клетки (ДК). В последующем незрелые ДК вместе с апоптозными опухолевыми клетками возвращаются в организм пациента, где они могут взаимодействовать между собой. Однако это взаимодействие недостаточно эффективно в связи с присутствием значительного количества разнообразных блокирующих факторов и сложностью межклеточного взаимодействия внутри организма.

Данные обстоятельства послужили для нас основанием для проведения научно-исследовательской работы по совершенствованию метода ЭФХТ, который был назван трансиммунизацией (имея в виду перенос опухоль-ассоциированных пептидов и представление их в иммуногенной форме Т-клеточным рецепторам), изучения его клинической эффективности и механизма действия у больных ТКЖ.

Цель исследования.

Повышение эффективности лечения больных Т-клеточными лимфомами кожи на основе адоптивной иммунотерапии методом Трансиммунизации.

Задачи исследования.

1. Изучить особенности имиудядт г^мрргт-т yAonkui.nl I U Ilk' ня пгмпяамш __-экстра, (.ии линеиных дифференцировояных антигенов, селектановой (CD62L) и

интегриновых (CD18 и CDllb) молекул адгезии, молекул, ассоциированных с апоптозом (CD95) и ко-активации (CD86).

2. Разработать метод трансиммунизации (ТИ) на основе совершенствования стандартного метода экстракорпоральной фотохимиотерапии, включив этап 20-часового инкубационного периода мононуклеарных клеток. Изучить индукцию процессов алоптоза опухолевых клеток и трансформацию моноцитов в зрелые дендритные антигенпрезентирующие клетки ex vivo под воздействием УФО-А+8-М0П и инкубационного периода, а также их ко-аетивационную активность.

3. Определить патогенетический механизм противоопухолевого действия ТИ на основании проведения клинико - иммунологических исследований.

4. Обосновать клиническую эффективность ТИ перед другими методами лечения с позиций коррекции иммунологических показателей у больных ТКЛК.

Научная новизна

1. Разработан новый подход в лечении больных ТКЛК на основе ЭФХТ и коррекции адоптивного клеточного иммунитета - ТИ. При этом с целью индукции противоопухолевого эффекта впервые использованы собственные трансформированные из моноцитов дендритные антигенпрезентирутощие клетки.

2. Разработаны оптимальные условия и изучены механизмы индукции апоптоза опухолевых клеток путем воздействия на них УФ облучения в сочетании с фотосенсибилизатором 8-МОП.

3. Изучен механизм трансформации моноцитов в ранние, а затем и в зрелые дендритные антигенпрезентирующие клетки.

4. Изучена функциональная активность дендритных клеток путем анализа экспрессии на них молекул ко-акгивации класса В-7 (CD86) и молекул адгезии.

5. На основании проведенных исследований разработаны критерии и концепция клинической эффективности метода ТИ, прогностические факторы, факторы риска у больных ТКЛК.

Научно-практическая значимость

1. Впервые у нас в стране разработан и внедрен в клиническую практику новый метод адоптивной клеточной иммунотерапии у больных ТКЛК, который можно рассматривать как в качестве альтернативы химиотерапевтическим и гормональным методом лечения, так и в качестве адъювантной терапии, в сочетании с другими методами лечения. При этом разработана программа, тактика и методология

проведения самой процедуры. Продемонстрирована его высокая клиническая эффективность и патогенетическая направленность.

2. Изучена клиническая эффективность метода ТИ, в том числе и в сравнении с традиционными методами лечения. Использование метода дает возможность повысить эффективность лечения, способствует увеличению продолжительности безрецидивного периода в 1,6 раза по сравнению со стандартным методом ЭФХТ и в 2,5 раза по сравнению с общепринятыми методами традиционной терапии. Хорошая переносимость процедур и отсутствие побочных эффектов даёт возможность применять предложенную методику амбулаторно, что позволяет сократить пребывание больного в стационаре, а также рекомендовать метод для широкого внедрения в дерматологических центрах и кожно-венерологических диспансерах.

3. Разработана концепция механизма патогенетического действия ТИ на основе изучения динамики адоптивного клеточного иммунитета и клинического состояния больного. Полученные иммунологические данные модифицированной методики ЭФХТ свидетельствуют о выраженном иммуномодулирующем действии, что подтверждает его патогенетическую направленность.

Положения, выносимые на защиту

1. Предполагается, что у больных различными вариантами ТКЛК отмечается выраженные изменения иммунологического гомеостаза, основными из которых являются нарушение межклеточных механизмов кооперации со стороны иммунорегуляторных Т-лимфоцитов, снижением активности моноцитарно-макрофагальной системы.

2. В процессе проведения процедуры ТИ возможно достичь достоверного роста зрелых антигенпрезентирующих ДК, что позволит повысить эффективность лечения.

3. В лечении больных ТКЛК методом ТИ будет показана высокая клиническая эффективность в сравнении со стандартной процедурой ЭФХТ и традиционными методами терапии.

4. Нормализация иммунологических показателей у больных ТКЛК в процессе проведения процедуры ТИ будет коррелировать с улучшением клинической симптоматики.

Внедрение результатов исследования

Результаты исследования внедрены в практику работы отделения дерматовенерологии и дерматоонкологии МОНИКИ им М.Ф, Владимирского, Московского областного кожно-венерологического диспансера, КВД Московской области. Полученные данные включены в программу лекций и практических занятий кафедры кожных и венерических болезней ФППО ММА им И.М. Сеченова и кафедры дерматовенерологии и дерматоонкологии ФУВ МОНИКИ.

Апробация диссертации

Основные результаты исследования были представлены и обсуждены на заседании Московского областного общества дерматовенерологов (2008, 2009 год), научно-практической конференции ЦФ округа РФ общества детоксикации, диализа и

нефрологии совместно с обществом гемафереза (Москва 2009), заседании городского общества дерматовенерологов (Москва 2008), научно-практической конференции дерматовенерологов ЦФ округа РФ (Москва 2007), совместном заседании отделения дерматовенерологии и дерматоонкологии МОНИКИ, кафедры дерматовенерологии и дерматоонкологии ФУВ МОНИКИ им. МФВлалимирского^гафедры кодмьв^-в-венерическихболезнеДФЩЮВ__ММА ж*-И.М.^Осква,2009года).

Публикации

По материалам диссертации опубликованы 7 научных работ, из них 1 - в журнале, входящих в «Перечень ведущих рецензируемых научных журналов и изданий...», рекомендуемых ВАК Российской Федерации.

Объем и структура диссертации

Работа изложена на 126 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, материала и методов исследования, 3 глав собственных исследований, заключения, выводов. Текст иллюстрирован 29 рисунками и содержит 21 таблицы, 10 фотографий. Указатель литературы включает 32 отечественных и 152 зарубежных источников.

Краткое содержание работы

Работа выполнена в отделении дерматовенерологии и дерматоонкологии МОНИКИ им. М.Ф. Владимирского. Иммунофенотшшческие исследования проводили в иммунологической лаборатории Московского городского центра СПИД Департамента здравоохранения города Москвы (Руководитель центра - д.м.н. А.И. Мазус, руководитель лабораторного отдела - А.Я. Ольшанский).

Диссертационная работа выполнена в соответствии с планом научно-исследовательских работ отделения дерматовенерологии и дерматоонкологии МОНИКИ им. М.Ф. Владимирского: «Разработка и совершенствование медицинских технологий ранней диагностики и лечения больных с системными и онкологическими заболеваниями на основе изучения их патогенетических особенностей» (per. номер 01.2.007 04277 от 03.05.2007). Работа выполнялась также в рамках Гранта президента РФ для Государственной поддержки молодых ученых МД-258.2007.7.

Материалы и методы исследования

Работа выполнена на основании обследования и лечения 65 больных с диагнозом ТКЖ, который устанавливали на основании анамнеза, клинической картины заболевания и подтверждали данными гистологических и иммуногистохимических исследований.

Среди больных мужчин было - 43(66%), женщин - 22(34%), соотношение мужчин и женщин составило 2:1. Возраст пациентов варьировал от 40 до 75 лет, средний возраст 61±7,8 лет. Длительность заболевания у больных была различной. Сведения представлены в Таблице № 1.

Таблица N° 1

Распределение больных по длительности заболевания.___

Длительность заболевания Количество больных

Абсолютное Относительное (%)

До 3 лег 2 3%

От 3 до 10 лет 56 86%

Более 10 лет 7 11%

Всего 65 100%

Как видно из таблицы, наибольшую группу (86 %) составили больные с давностью заболевания более 3 лет, что свидетельствовало о длительном характере течения опухолевого процесса и недостаточной эффективности проводимого ранее лечения.

Сведения о клинических формах и стадиях заболевания у наблюдаемых больных представлены в Таблице №2

Таблица Л"в2

Формы и стадии заболевания__

Форма заболевания Стадия Количество больных абсолютное Относительное число больных (п=65) (%)

число

Классическая форма ГМ 43 66%

а) эритематозно-сквамозная IA ст. 6 14 22%

стадия IB ст. 9

б) инфильтративно-бляшечная IB ст. 7

стадия IIA ст. 13 29 45%

ИВ ст. 9

Эритродермический вариант ГМ IIIA ст. 3 19 28%

IIIB ст. 16

Синдром Сезари ига ст. 3 5%

Всего 65 100%

Большая часть пациентов на момент обследования была представлена классической формой грибовидного микоза (ГМ) инфильтративно-бляшечной стадии. Эритематозно-сквамозпая стадия и эритродермический вариант ГМ определялся приблизительно с одинаковой частотой и в сумме сопоставим с количеством больных в инфильтративно-бляшечной стадии (50% и 45% соответственно). Синдром Сезари был диагностирован у 3 пациентов. Необходимо отметить, что в исследование не были включены больные с опухолевой стадией.

Для проведения исследования эффективности модифицированной методики ЭФХТ - трансиммунизации (ТИ) пациенты были разделены на три группы (основную и две контрольные).

Основную группу (1) составили 20 пациентов ТКЛК, которые получали монотерапию с применением метода ТИ.

Во 2-ю группу (контрольную) были включены 20 больных с диагнозом ТКЛК, получавших терапию в виде стандартной процедуры ЭФХТ в комплексе с другими видами лечения.

Контрольную 5-ю группу составили 25 пациентов с диагнозом ТКЛК, которым проводилась стандартная терапия (химиотерапия, гормональная терапия). Больные контрольных групп были с аналогичными формами заболеваний, сопоставимы по полу и возрасту с основной группой.

:сия - полное разрешение очагов поражения, на месте

которых оставались гиперпигментироваиные или детшгментированные участки кожи без признаков воспаления, отсутствие зуда, значительное уменьшение размеров лимфатических узлов.

Значительное клиническое улучшение - почти полное разрешение очагов поражения, когда в оставшихся элементах наблюдалась четко выраженная тенденция к их разрешению, значительное уменьшение зуда, уменьшение размеров лимфатических узлов.

Клиническое улучшение - очаги поражения бледнели, отмечалось уплощение инфильтративно-бляшечных элементов, уменьшался зуд кожи.

Ухудшение - диссеминация процесса, дальнейший рост элементов, усиление зуда, дальнейшее увеличение лимфатических узлов, несмотря на проводимое лечение.

Оценка клинической эффективности терапии проводилась на основании бальной оценки и показателя SWAT (Severity-weighted assessment tool) (STEVENS Seth R, et al 2002). SWAT - это инструментальная оценка степени поражения кожного покрова, представляющая собой количественный инструмент, который позволяет точно и эффективно отслеживать течение болезни и наглядно демонстрирует динамику изменения состояния пациента. Данную оценку рассчитывали перед началом лечения, а также на 20 сутки после лечения. При использовании ТИ оценку проводили и по окончанию 3 курсов лечения.

Стандартная процедура ЭФХТ

За 1,5 - 2 часа до процедуры пациент принимал оксорален-ультра (8-МОП) в дозе 0,6 мг на 1 кг веса больного. Затем проводили эксфузию 500,0 крови в полимерный контейнер, который подвергали центрифугированию в течение 5 мин при 2600 об/мин. Затем, надосадочную плазму, обогащенную лейкоцитарными клетками переводили в спаренный контейнер и повторно центрифугировали в течение 15 мин при 3000 об/мин. Эритроциты ресуспендировали в физиологическом растворе и переливали больному струйно. Полученную плазму после вторичного центрифугирования переводили во второй спаренный контейнер и реикфузировали. Выделенные лимфоциты взвешивали в 200,0 физиологического раствора, тщательно перемешивали, подвергали УФ облучению в течение 40 минут и реинфузировали больному. Спектральный диапазон излучения - 320 - 400 нм, мощность УФ-излучателя -16 Вт. Процедуру проводили через 1-2 дня, на курс 4 сеанса. При необходимости курс лечения проводили повторно через 1 месяц.

Результаты лечения трактовались нами как клиничеа

ашевиегвтеупявие"Эффекта, ухудшение.

Транснммунизацня За 1,5-2 часа до процедуры больной принимал фотосенсибилизатор оксорален-ультра (8-МОП) в дозе 0,6 мг на 1 кг веса больного. Затем больные подвергались процедуре выделения мононуклеарных клеток в прерывисто - поточном режиме на клеточном сепараторе «HAEMONETICS MCS+» по протоколу выделения мононуклеарных клеток. Клетки выделяли из 2000,0 мл крови, что составляло в среднем 6,2+0,8 х 109 клеток в 100,0 мл плазмы. Добавляли 100,0 мл физиологического раствора NaCl. Гематокрит составлял не более 2%. Клеточную суспензию подвергали облучению ультрафиолетовым светом А (X - 320-400 нм) на облучателе крови «ЮЛИЯ» согласно прилагаемой инструкции со скоростью 10-15 мл/мин из одного полимерного контейнера в другой. Всего проводили 4-5 циклов, общее время облучения составляло 90 мин. После облучения, в клеточную суспензию добавляли 200,0 мл питательного буферного раствора «INTERSOL» фирмы Baxter, предназначенный для длительного хранения тромбоцитов (до 7 суток). При постоянном перемешивании в тромбомиксере выдерживали в течение 18-20 часов при температуре 20-24°С согласно «Инструкции по применению компонентов крови» от 25.11.2002 г. По истечению этого срока клеточную взвесь реинфузировали больному в течение 30 мин. Курс лечения состоял из 4-х процедур, проводимых 2 раза в неделю.

Проточно-цитофлюориметрический анализ

Иммунофенотипические исследования проводили методом проточной цитометрии с использованием проточных цнтометров: Beckman Coulter «Cytomics FC 500» и Epics «XL-MCL». Предподготовка проводилась на автоматической станции TQ-ргер. Общий анализ крови проводили на гематологическом анализаторе Sysmex ICX-21.

Проводили многопарамегровый (5-параметровый) проточно-цитофлюориметрический субпопуляционный анализ поверхностных антигенов с использованием коммерческих моноклональных антител к поверхностным антигенам фирмы Immunotech и Beckman Coulter конъюгированных FITC, РЕ, ECD, РС5, и РС7. В качестве контроля применяли коммерческие сыворотки, содержащие изотипические антимышинные Ig, конъюгированные соответствующим флюорохромом.

Изучали поверхностные антигены, используя следующие моноклональные антитела: CD86- молекула коактивации ДК (В7.2), CD83 - маркер ДК, CD36 -моноциты, CD14- моноциты, CD18 - интегриновая молекула адгезии, CDllb -интегриновая молекула адгезии, CD62L - селективная молекула адгезии, CD3 - пан Т-клетки, CD4- обшая популяция хелперов, CD8 - цитолитические Т-лимфоциты, CD95 -апоптоз, CD16 - естественные киллеры, CD19 - пан В клетки.

Иммунологические исследования проводились в периферической крови и в смешанной культуре мононуклеарных клеток:

1. В периферической крови сразу после ее выделения и спустя 3-4 дня после завершения курса лечения.

2. В смешанной культуре мононуклеарных клеток сразу после выделения клеток и после 20 часового инкубационного периода.

Статистическая обработка результатов проведена по общепринятым методикам, с использованием пакета анализа MS Office ХР и программы Statistica v.6.0.

Результаты исследования и их обсуадение

Изменения в общем состоянии и кожном статусе больных ТКЛК в процессе ТИ представлены в табл. 3.

Таблица 3.

Оценка клинической эффективности трансиммунизации у 20 больных ТКЛК.

Клинические фермы Ю тигопнув-д?-—-----' жкгавность SWAT/баллы

Ремиссия Знач. улучш. Vjivmicmie Без эффекта Ухудше иие До лечения После лечения Измен енияв %

Абс. % Абс, % Абс. % Абс % Абс. %

Э-С.сг.ГМ 2 10% 16,5±0,7 8,740,7 47,5

И-Бсг 3 15% 5 25% 26,4+11, 6 17,449, 5 32,7

Эритр-вариакг Г.М. 3 15% 4 20% 1 5% 14,3*0,9 6,540,7 52,4

Синдром Сезари - - 2 10% - 15,5i0,7 7,540,7 49,3

Всего 5 25% 7 35% 8 40%

*Р <0,05

Наблюдения в процессе проводимой терапии в основной группе уже с первых дней позволило отметить положительную клиническую динамику. Как видно из таблицы №1 максимальный клинический эффект после курса лечения отмечался у больных с эритродермией. Стоит отметить, что клиническая ремиссия была достигнута у 5 пациентов (25%), 2(10%) из которых были в эритематозно-сквамозной стадии, а 3(15%) - имели эритродермический вариант ГМ. У 4 (20%) больных эритродермическим вариантом ГМ отмечалось значительное улучшение, а улучшение у 1(5%) пациента.

У больных с СС улучшение патологического процесса выражалось в разрешении эритродермии и уменьшении количества клеток Сезари.

При бальной оценки площади поражения кожного покрова у пациентов с эритродермией и СС клинический эффект в среднем показал снижение площади поражения в 2 раза (с 14, 3± 0,9 до 7,5 ± 0,7 баллов р <0,05).

У пациентов с инфильтративно-бляшечной стадией ГМ среднее число SWAT было до лечения 26,4± 11,6, после лечения 17,4±9,5, что составило снижение на 32,7%. Значительное клиническое улучшение отмечалось у 3(15%) пациентов, а клиническое улучшение - в 5(25%) случаях.

Процедуру ТИ все больные перенесли удовлетворительно, осложнений и побочных эффектов не отмечалось.

Во 2-ой контрольной группе также был отмечен положительный терапевтический эффект различной степени выраженности у всех больных с эритродермией. При бальной оценки площади поражения кожного покрова у пациентов контрольной группы с эритродермией и СС клинический эффект в среднем показал снижение площади поражения также в 2 раза (с 15,1±0,7 до 8,2±0,7 баллов, р<0,05)

При инфильтративно-бляшечной стадии ГМ терапевтический эффект различной степени выраженности наблюдался у 6 больных (30%): значительное клиническое улучшение отмечалось - у 1 больного (5%), а клиническое улучшение - у 5 больных

(25%). Эффект от проведения ЭФХТ отсутствовал у 4 пациентов (20%). Среднее число SWAT у пациентов этой группы было до лечения 24,8±10,5, после лечения 20,1±9,8, что составило снижение на 19%. 4 пациентам после второго курса ЭФХТ в связи с недостаточной, по нашему мнению, терапевтической эффективностью, были назначены кортшсостероидные препараты в дозе 30-40 мг преднизолона, в том числе двоим пациентам кортикостероидные препараты были назначены в сочетании с цитостатихом проспидином по 100 мг проспидина внутримышечно ежедневно, в суммарной дозе 3000 мг на курс.

При оценке клинического эффекта от проводимой терапии в 3-ей группе контроля обращало на себя внимание, что динамика клинической картины развивалась заметно медленнее, чем в основной группе. Клинической ремиссии достигли 3 пациента (12%) из группы больных с эритематозно-сквамозной стадией ГМ и эритродермическим вариантом Г.М. Значительное клиническое улучшение наблюдалось у 6 больных (24%) во всех стадиях и формах. Клиническое улучшение отмечалось у 11 больных (44%). В этой группе эффекта от проводимого лечения не было у 4 пациентов (16%) ,у 2 в инфильтративно-бляшечной ст. и у 2 больных с эритродермическим вариантом ГМ. Ухудшение со стороны кожного процесса отмечалось у 1 (4%) больного с инфильтративно-бляшечной стадией Г.М.

При бальной оценки площади поражения кожного покрова у больных с эритродермией клинический эффект характеризовался снижение площади поражения в 1,5 раза (с 15,4± 0,75 до 10,5± 0,7 баллов р<0,05). Среднее число SWAT у пациентов в инфильтративно-бляшечной стадии было до лечения 26,5± 11,2 после лечения 22,1±10,5, что составило снижение на 17%.

Из побочных эффектов у 19 больных на фоне проводимой терапии отмечалась слабость, тошнота, диспептические явления. У 13 больных с различными формами и стадиями после курса полихимиотерапии наблюдалась лейко- и лимфопения.

Таким образом, анализ ближайших результатов, основанных на объективных методах клинической оценки с использованием бальной шкалы и критериев SWAT в обследуемых группах, свидетельствует о том, что максимальный клинический эффект был отмечен при использовании модифицированной методики ЭФХТ - ТИ.( Таблица 4)

Таблица 4

Клинические формы SWAT/баллы до лечения SWAT/баллы после лечения

ти Стандарт, метод ЭФХТ Стандартная терапия ТИ Стандарт, метод ЭФХТ Стандартная терапия

Эритематозно-сквамозная ст. ГМ 16,5±0,7 16,5±0,7 15,3± 0,75 8,7*±0,7 8,7*±0,6 10,1 »±0,7

Инфильтративно-бляшечная ст. ГМ 26,4±11,6 24,8±10,5 26,5± 11,2 17,4±9,5 20,1±9,8 22,1±10,5

ЭритродермическнЯ вариант Г.М. 14,3±0,9 14,2±0,8 14,9±0,9 6,5*±0,7 7,8*±0,8 9,9*±0,75

Синдром Сезари 15,5±0,7 15,6±0,6 7,5*±0,7 9,6*±0,7

*Р <0,05 <0,05

Как видно из таблицы 4, клинический эффект при лечении методом ТИ был достигнут при всех формах ТКЛК. У больных с эритродермией и СС лечение методом ТИ и стандартным методом ЭФХТ дало практически одинаковый эффект (снижение площади поражения в 2 раза), в то время как при лечении стандартной терапией площадь поражения снизилась всего в 1,5 раза. У больных в инфильтрятииип-^^яп.рпнпй-с^и^«^—метод 1И показал наилучший клинический эффект: снижение площади поражения кожного покрова в 1,5 раза, (на 20% эффективнее чем при стандартной методике ЭФХТ и на 25% эффективнее стандартного метода лечения).

При оценке отдаленных результатов лечения учитывали длительность безрецидивного периода. Из 65 больных ТКЛК отдаленные результаты лечения были прослежены у 20 пациентов основной группы, у 18 пациентов 1-ой контрольной группы и 20 пациентов 2-ой контрольной группы. Сроки наблюдений составили от 1 месяца до 3-х лет.

При отсутствии у больных рецидивов, контроль проводился в течение первого года каждые 3 месяца; в последующем в течение трех лет - каждый год. Данные о продолжительности безрецидивного периода представлены в таблице 5

Таблице 5

Продолжительность безрецидивного периода у больных ТКЛК, получавших лечение методом ТИ, стандартной процедурой ЭФХТ и традиционной терапии

Группы больных Метод лечения Безрецидивный период

1-3 мес. 3-6 мес. бмес. - 1год 1-3 года

1 Трансиммунизация п =20 3(15%) 11(55%) 6(30%)

2 ЭФХТ п= 18 2(11%) 5(28%) 9(50%) 2(11%)

3 Традиционная терапия N(20) 4(20%) 9(45%) 6(30%) 1(5%)

Как видно из таблицы 5, наибольший процент больных с длительностью безрецидивного периода от 6 месяцев и до 1 года отмечался в основной и 1-ой контрольной группы 11 (55%) и 9 (50%) соответственно. Наиболее продолжительный безрецидивный период - до 3 лет наблюдался у 6(30%) больных основной группы. В контрольных группах безрецидивный период более 1 года отмечался только в 2(11%) случаях у больных 1-ой группы и в 1 (5%) - во 2-ой группе.

Необходимо отметить, что клинические проявления при очередном обострении у больных основной группы были менее выраженными, чем до лечения, последующие процедуры ТИ приводили к более быстрому купированию кожных проявлений, что способствовало сокращению длительности обострения.

Таким образом, 85% пациентам 1-ой группы достаточно проведения одного курса ТИ с периодичностью в 6 мес., тогда как пациентам 2 и 3 группы необходима терапия не менее 1раза в 3 месяца или чаще.

При оценке отдалённых результатов лечения, использование метода ТИ позволяет увеличить продолжительность безрецидивного периода в среднем в 1,6 раза по сравнению со стандартной методикой ЭФХТ и в 2,5 раза по сравнению с традиционными методами лечения.

Особенности иммуной системы и межклеточного взаимодействия у больных Т-клеточной лимфомой кожи

Иммунологические исследования были проведены у 18 больных ТКЛК основной группы и у 16 практически здоровых людей, доноров крови (референсные значения).

В результате статистического, регрессионного и корреляционного анализов состояния иммунной системы больных ТКЛК был установлен ряд аномалий фенотипа Т- лимфоцитов и выявлены определенные изменения, касающиеся нарушения межклеточных взаимодействий. (Таблица 6)

Таблица 6

Экспрессия линейных дифференцировочных лнмфоцитарных и моиоцитарных

антигенов у больных ТКЛК в сравнении с референсными значениями (М+т)

Экспрессия линейных лимфоцитарных и моноцитарных антигенов Обследуемые группы р

Референсные значения (п=16)(%) Больные ТКЛК (п=18)(%)

CD3 72,20 + 4,47 65,53±12,70 <0,05

cd4 46,66+ 7,16 49,60±10,09 >0,05

cd8 23,33+ 5,27 20,0б±9,41 >0,05

cdvcdeiw.) 2,12 + 0,76 2,95 ±1,23 <0,05

cd,6 13,53+3,12 13,69± 7,90 >0,05

cd14 17,06+4,26 8,8±9,9 <0,05

cd36 49,4+5,9« 32,06±14,10 <0,05

Как видно из представленной таблицы, общее количество Т-лимфоцитов у больных ТКЛК было достоверно снижено по сравнению с нормой и отличалось значительной вариабельностью. Иммунорегуляторный индекс (СО^СОв) у больных был достоверно выше референсных значений, что свидетельствовало о нарушении механизмов межклеточного взаимодействия со стороны иммунорегуляторных хелперных (С04+) и цитолитических (С08+) Т-лимфоцитов и указывало на функциональную недостаточность специфических механизмов иммунологической защиты.

Количество естественных киллерных лимфоцитов (С016+) у больных ТКЛК не отличалось от референсных значений, что косвенно свидетельствовало о том, что неспецифические механизмы адоптивного иммунного ответа не достаточно задействованы при данном заболевании или заблокированы продуктами опухолевой пролиферации.

Экспрессии моноцитарных антигенов СБ14+ и С036+ были достоверно снижены у больных ТКЛК (таб.6., рис.1,2).

Рис.1. Сравнительные показатели экспрессии моноцитарного антигена СШ4 у больных ТКЛК и моровых лицей (М+ш)

Рис. 2. Сравительные показатели мопоиитарного антигена СШб у больных ТКЛК и здоровых люден (М+ш)

Данное обстоятельство указывает на нарушение защитной функции со стороны макрофагально-моноцитарной системы и недостаточности механизмов иммунотолерантности к чужеродным антигенам и аномальным клеткам у больных ТКЛК. Большой разброс данных свидетельствует о том, что больные находились на разных этапах опухолевого процесса. Учитывая, что моноциты осуществляют антигенпрезентирукяцую функцию в результате трансформации в дендритные клетки, можно сделать предположение о том, что уменьшение количества моноцитарных клеток у больных ТКЛК является предпосылкой для формирования опухолевого процесса.

Основываясь на данных, указывающих на значение и роль ДК в формировании протективного иммунного ответа при опухолевых заболеваниях (Тттегтап Щ, е1 а1. 1999), нами были изучены экспрессия молекулы СЭ83, ассоциированная с этими клетками и экспрессия молекулы ко-актнващш С086 на моноцитах у больных ТКЛК в контексте с референсными показателями здоровых людей. Молекулы ко-активации обеспечивают второй сигнальный путь активации Т-клеточного рецептора на наивных Т-лимфоцитах. При недостаточной их экспрессии или блокаде, развиваются процессы анергии к представляемым антигенным эпитопам. В этой связи изучение экспрессии молекул ко-активации представляется весьма важным в изучении процессов формирования опухолевой пролиферации. Эти данные представлены в таблице 7

Таблиц 7.

Экспрессия молекул С083 и С086 на моноцитах периферической крови у _больных ТКЛК и здоровы» людей (М+ш)__

Изучаемые антигены Обследуемые группы (%) Р

Здоровые доноры (п=16) Больные ТКЛК (п=18)

С014+С083+ 0 47±2б,39 <0,05

С014+С086+ 17,8+4,19 11,66±б,62 <0,05

Как следует из данных, представленных в таблице 2 в норме у здоровых людей антиген С083, ассоциированный с ДК практически не представлен на моноцитах. Это

согласуется с данными литературы, свидетельствующие, о том, что количество дендритных клеток в периферической крови здоровых людей составляет менее 1 %. В то же время, экспрессия этого маркера на моноцитах у больных ТКЛК составляет 47±26,39%, что может свидетельствовать о присутствии в периферической крови больных ТКЛК достаточно большого количества ДК. Однако экспрессия коактивационного антигена СС86+ на этих клетках была достоверно ниже референсных показателей (таб. 7, рис. 3).

у 1S

S

8 "

I,

s

ЁелышаТЛХДоТИ

Рис. 3. Сравнительные показатели экспрессии CD14+ CD86+ у больных ТКЛК и здоровых людей (М+ш)

Полученные данные дают нам основание охарактеризовать иммунофенотип ДК больных ТКЛК как CD 14+CD8.3 fCD86" и сделать предположение о механизме формирования иммунологической толерантности к опухолевым антигенам при этом заболевании. Высокий уровень апоптоза опухолевых клеток в эпидермисе у больных ТКЛК и чрезмерно высокая концентрация при этом антигена способствует поглощению его незрелыми ДК, что приводит к перегрузке их антигенными пептидами. Известно, что природа и принадлежность злокачественных Т-лимфоцитов соответствует Th2 клеткам (Rook АН, et al., 1995). Известно также, что Th2 опухолевые лимфоциты продуцируют 1L-10, трансформирующий фактор роста бета (TGF-P) (Berger CL et al., 2002,) и цитотоксический Т-лимфоцитарный антиген-4 (CTLA-4) (Kamarashev J et al., 1998,), которые угнетают экспрессию костимуляторных молекул на макрофагах и ингибируют созревание ДК. В результате, вместо развития эффективного иммунного ответа имеет место негативный исход Т-клеточной активации в виде индукции анергии и апоптоза реактивных Т-клеток.

Таким образом, на основании полученных результатов можно утверждать, что одним из механизмов, посредством которого опухолевые клетки при ТКЛК подавляют иммунитет - это выделение ими растворимых факторов, которые могут работать через интерференцию эффекторных Т-клеток, получив доступ к костимулирующим молекулам класса В7 (CD86), заблокировав их активацию, спровоцировав тем самым анергию к опухолевым антигенам и пролиферацию опухолевого клона.

С целью изучения механизмов, повлекших за собой нарушение функциональных особенностей иммунокомпетентных клеток, был проведен количественный и

корреляционный анализ экспрессии интегриновых и селектиновой (CD62L) молекул адгезии на лимфоцитах периферической крови у больных ТКЖ в сравнении с референсными показателями.

Необходимость в изучении экспрессии молекул адгезии при ТКЖ была также обусловлена положением о том, что при взаимодействии молекул адгезии опухолевых

клеток со СВОИМИ лигандами В Ртрпщя лршыяя-ттшшип- гигндтпл йткигируимпир

шшшоз, что приводит к накоплению опухолевых клеток с развитием соответствующей клинической симптоматики.

В нашем исследовании была изучена экспрессия интегриновых молекул адгезии: МАС-1 (CDllb/CD18) и LFA-1 (CD18), а также лимфоцитарной селектиновой молекулы адгезии CD62L. Бьш проведен анализ их коэкспрессии на общей популяции Т-лимфоцитов и естественных киллерных клетках Результаты представлены в таблице 8.

Таблица 8

Экспрессия молекул адгезии на Т-лимфоцитах и киллерных клетках (М+).

Изучаемые маркеры Обследуемые группы Р

Референсные значения (п=16)(%) Больные ТЖ(п=18) (%)

CD62L 60Д85+4ДЗ 48,07±18,5 <0,05

CD3+CD62L+ 51,85+4,53 44,57+19,01 >0,05

CD16+CD62L+ 1,46+0.62 14,07*18,2 <0,05

LFA-1 (CD18) 42,93+19,44 64,8±23,10 <0,05

СШ+СШ8+ 233 + 4.98 59,4±28,18 <0,05

CD16+CD18+ 9,84+134 57,0±41,67 <0,05

МАС-1 (CDllb/CD18) 22.12 +1.7 26,53±14,70 <0,05

CD3+CDllb+ 7.18+ 1.42 13,5+11,11 >0,05

CD16+CDUb+ 10,76+ 0,83 5338+41,66 <0,05

В результате иммунофенотипического анализа было установлено, что интегриновая молекула адгезии LFA-1 (CD18) в норме присутствует только на 23,3+4,95% всех лимфоцитах, а у больных ТКЖ -на 59,4+28,18%, р<0,05 (табл. 8, рис. 4).

Вольны* ТЛКдеТИ

Рис. 4. Сравнительные показатели коэкспрессии молекулы адгезии CD18+ (LFA-1) на Т-лимфоцитах (CD3+) у здоровых людей и больных ТЯК (М+га)

» Сред

SlCi owl

■ Cf*a

СЗлСтвпр

БойМ1Ш?ЛКАвТМ

Рис. 5. Сравнительные показатели коэкспрессии молекулы адгезии CD18+ (LFA-1) аа естественных киллерных клетках (CD16+) у здоровых людей и больных ТЛК (М+ш)

Повышение экспрессии интегриновых молекул адгезии на Т-лимфоцитах и естественных киллерных клетках способствует перемоделированию морфологии этих клеток, повышению их функциональной активности для распознавания патоген-ассоциированных молекулярных структур и может свидетельствовать о высокой степени злокачественности опухолевого процесса у изучаемых больных, а также служить косвенным доказательством повышения продукции клетками провоспалительных цито-и хемокинов (рис.5). Это также служит доказательством нарушения механизмов кооперации врожденной неспецифической защиты и специфического иммунного ответа направленного на локализацию, киллинг и элиминацию чужеродных агентов.

Дальнейшее изучение, основанное на анализе корреляционной зависимости хелперных Т-лимфоцитов от экспрессии молекул адгезии, подтвердили данные литературы о том, что селекгиновая молекула адгезии CD62L в норме присутствует на хелперных Т-лимфоцитах, о чем свидетельствует высокая степень корреляционной зависимости (рис. 6). Присутствие селектиновой молекулы адгезии на хелперных Т-лимфоцитах в норме у здоровых людей обеспечивает их адгезию к активированному сосудистому эндотелию в начальной фазе воспаления и хоминг их из кровотока в периферические лимфоузлы. С их помощью осуществляется антиген-опосредованная активация Т-клеточного рецептора CD28, молекул коактивации класса B7(CD80, CD86), а также взаимодействие с В-лимфоцитами.

Достоверное и значительное снижение экспрессии лимфоцитарной селектиновой молекулы адгезии (С062Ц у больных ТКЛК, а также отсутствие корреляционной зависимости между хелперными Т-лимфоцитами, выявленное в нашем исследовании, свидетельствовало об отсутствии этой молекулы на мембране СШ-Т-лимфоцитов (таб. 8, рис. 7). Потеря адгезионных молекул с поверхности хелперных клеток может послужить одной из причин негативной регуляции воспаления и расстройства клеточной кооперации при ТКЛК. Возможно, что в результате опухолевой трансформации хелперных лимфоцитов, Ь-селектины слущиваются (подвергаются шеддигау) с клеточной поверхности и переходят в растворимую форму. Растворимые

адгезионные молекулы могут выполнять функции цитокинов, связываясь со своими лигандами, блокируя, таким образом, процессы межклеточной интеграции. Отсутствие L-селектинов на клеточной поверхности лимфоцитов может также послужить причиной недостаточной активации Т-клеточного рцептора и молекул ко-активации класса В7 (CD86) на антиген-презентирующих клетках.

В связи с этим, полученные данные позволяют рассматривать модификацию иммунной системы у больных ТКЛК уаг рпуш.ш. nfiyt штигнныи не тпттько количественными изменениями со стороны популяций иммунокомпетентных клеток, но и связанный с нарушением их взаимодействия через молекулы клеточной адгезии и ко-активации.

Обнаруженные иммунные нарушения у больных, ТКЛК, явились патогенетическим обоснованием для усовершенствования стандартной методики ЭФХТ и введения дополнительного этапа 20 часового инкубационного периода мононуклеарных клеток с целью модуляции антиген специфического адоптивного иммунного ответа у больных ТКЛК.

Динамика иммунологических изменений в смешанной культуре лимфоцитов под воздействием процедуры ТИ

С целью изучения воздействия на лейкоциты крови УФО-А в сочетании с 8-МОП и инкубации были проведены морфологические и иммунологические исследования культивированных клеток сразу после их выделения и перед реинфузией больному (ex vivo).

В результате было установлено, что после УФО-А+8-МОП и 20-часовой инкубации, появилось большое количество клеток, морфология и фенотип которых соответствовал активированным моноцитам. Это были большие клетки с многочисленными амебовидными цитоплазматическими выростами, и появлением значительного количества вакуолей в цитоплазме моноцита. Это дало основание предположить, что в результате данного воздействия происходит выраженная активация моноцитов.

При изучении экспрессии основных клеточных популяций в смешанной культуре мононуклеарных клеток до и после проведения процедуры ТИ нами не было выявлено существенных изменений. Результаты экспрессии акцессорных молекул на активизированных моноцитах и антигена апоптоза на хелперных Т-лимфоцитах представлены в таблице 9.

Таблица 9

Экспрессия молекул коактивации на моноцитах и антигена апоптоза на хелперных

Т-клегках в смешанной культуре мононуклеарных клеток в процессе ТИ (М+ш)

Изучаемый маркер Обследуемые группы Р

Больные ТЛК до ТИ (п=18) (%) Больные ТЛК после ТИ (п=18)(%)

CD36+ 38,0+12,3 36,0+9,8 >0,05

CD14+ 7,8±5,4 3,1±2,5 <0,05

CD83+CD14+ 44,3+39,6 44,9+40,8 >0,05

CD86+CD36+ 9,7±8,6 46,5+20,9 <0,05

CD86+CD14+ 12,2+10,8 28,5+30,7 <0,05

CD95+CD4+ 6,7+3,5 22,4+6,2 <0,05

Обращает на себя внимания тот факт, что в процессе данной процедуры значительно уменьшилось относительное количество клеток, экспрессирующих моноцитарный антиген С014+ с 7,8+5,4% до 3,1±2,5%, р<0,05. При этом экспрессия другого моноцитарного антигена - С036+ не уменьшилась. Это обстоятельство объясняется трансформацией моноцитов в денритные клетки с потерей ими (в результате шеддинга) молекулы СОИ и сохранением молекулы С036. Дендритные клетки используют СЭЗб для того, чтобы распознать и фагоцитировать апоптотические опухолевые фрагменты.

Установлено, что под воздействием данной процедуры происходит усиление экспрессии антигена РАБ/АРО-1 (СВ95), ассоциированного с апоптозом на СБ4+ Т-лимфоцитах в среднем с 6,7+3,5% до 22,4+6,2%, р<0,001. Принимая во внимание, что апоптоз направлен на элиминацию в первую очередь клоновой экспансии, можно предположить, что таким образом он реализуется преимущественно на опухолевых клетках.

Выраженные изменения в процессе ТИ были вьивлены со стороны экспрессии ко-активационной молекулы СТ>86 на моноцитах. Так, если перед процедурой экспрессия СБ86 на С036+ клеток в смешанной культуре мононуклеаров была крайне незначительна и составляла 9,7+8,6%, то после процедуры - 46,5+20,9%, р<0,05, (табл. 9, рис.8). Усиление экспрессии коактивационной молекулы СБ86 были обнаружены и в ассоциации с другим моноцитарным антигеном СБ14 (табл.9, рис.8). Так, если до процедуры экспрессия С086+ на СВ14+ клетках в смешанной культуре лимфоцитов составляла 12,2+10,8%, то после процедуры - 28,5+30,7%, р<0,05.

« поел, УФО

Этап обошдаяимя

Рис. 8 Динамика коэкспрессии СЭ86+ на СБ36+ и СП 14+ клетках в смешанной культуре мононуклеаров сразу после их выделения и спустя 20 часов после УФО-А+8-МОП._|

Эти данные указывают на то, что после 20-часовой инкубации в смешанной культуре мононуклеаров, моноциты, подвергаясь экзогенным факторам активации, переходят на путь трансформации в ранние ДК, характеризующиеся активным фагоцитозом апоптозных опухолевых клеток, а затем и в зрелые антиген презентирующие ДК. Индукция зрелых ДК подтверждена высокой экспрессией на моноцитах С083 и коактивационного антигена СО 86 являющегося обязательным для активации второго сигнального пути.

Динамика иммунологических изменений в периферической крови у больных ТКЛК под воздействием курса ТИ

Иммунологические исследования у больных ТКЛК проводили через 3-4 дня после завершения курса ТИ. Как видно из рисунка 9, у больных в процессе проведения курса ТИ произошли существенные изменения со стороны основных субпопуляций Т-лимфоцитов.

100-

80-

60-

40-

20-

гЬ

□ Норма

□ Больные ТКПК ДО ТИ

□ Больные ТКЛК после ТИ

СОЗ+ С04+ С08+

Рисунок 9. Динамика изменения субпопуляций Т-лимфоцитов у больных ТКЛК в процессе ТИ

Полученные данные отражают выраженную закономерность к индукции структурно-функциональных изменений со стороны мембранных антигенных маркеров лимфоцитов во всем объеме циркулирующей крови, носящих регулирующий (нормализующий) характер.

После проведения ТИ происходила нормализация иммунорегуляторного индекса (до ТИ - 2,95±1,23%, после ТИ -1,8±0,5%, р<0,05). Нормализация была обусловлена как за счет снижения хелперной субпопуляции (с 49,60± 10,09% до 44,4± 12,78%, р<0,05), так и за счет повышения относительного количества цитолитических Т-лимфоцитов в периферической крови (с 20,06±9,41% до 26,0±8,43%, р<0,05) (рис. 9.). Необходимо отметить, что общее количество Т-лимфоцитов (СОЗ+) в периферической крови после курса лечения достоверно возрастало с 65,53±12,70% до 76,6±10,42%, р<0,05 и приближалось к нормальным показателям.

Таблица 10.

Экспрессия молекул ко-астивации на моноцитах у больных ПСЛК в процессе ТИ (М+т)

Экспрессия Обследуемые группы Р

Больные ТЛК до ТИ Больные ТЛК после

антигенов (п=18)(%) ТИ (11=18) (%)

СБ86+СШ4+ 11,66±6,62 29,73±22,15 <0,05

С083+СЭ14+ 47±26,39 17,28±13,30 <0,05

Как видно из представленной таблицы 10, в процессе курса ТИ происходит значительное снижение количества неиммуногенных ДК, имеющих фенотип CD14+CD83+CD86', перегруженных антигенными пептидами с 47±26,39% до 17,3+14,5%, р <0,05. Важно отметить, что количество зрелых, функционально активных ДК в результате проведения курса лечения, существенно возрастало. Так, если до лечения только 11,66±6,62% моноцитов имели фенотип CD14+CD83"CD86+, то после курса иммунотерапии - 29,73±22,15% р<0,05.

Таким образом, трансформация новых ДК из моноцитов in vitro, как было показано ранее, способствует индукции на них маркера коактивации Т-клеточного рецептора CD86+. Перенос в последующем этих клеток в организм больного, приводит к нарастанию зрелых иммуногенных ДК и снижению уровня нефункциональных неиммуногенных ДК. Учитывая, что при этом происходит снижение относительного количества CD4+ Т-лимфоцитов и повышение цитотоксических CD8+ клеток, можно предположить, что под влиянием данной процедуры происходит стимуляция наивных, неармированных CD8 Т-лимфоцитов с дифференцирорвкой их в специфические цитолитические Т-лимфоциты. Снижение в периферической крови CD4+ Т-лимфоцитов подтверждает данное предположение и может свидетельствовать о формировании специфического протективного иммунного ответа, направленного против опухолевых клеток. Динамика клинического улучшения опухолевого процесса в результате ТИ убедительно доказывает данное положение.

Таким образом, модифицированная процедура ЭФХТ - трансиммунизация с включением 20-часового инкубационного периода позволяет наиболее полноценно взаимодействовать незрелым ДК с опухолевыми лимфоцитами ex vivo. Процессы индуцированного апоптоза в злокачественных Т-клетках служат сигналом для поглощения их ДК и перехода иммуногенных пептидов из опухолевых в ДК, которые, таким образом трансформируются в профессиональные АПК с полным комплектом ко-стимуляторных и акцессорных молекул. Дальнейшее введение в организм больного дендритных АПК способствует формированию специфического противоопухолевого иммунного ответа путем производства клона цитолитических CD8 Т- клеток, способных вызвать цитолиз опухолевой клетки в результате воздействия TNF-a в/или секреции гранул перфорина и гранзимов, индуцировав тем самым гранзим-зависимый апоптоз опухолевых клеток.

Результаты полученных иммунологических и клинических исследований применения метода ТИ в лечении ТКЛК, отличающийся от ЭФХТ дополнительным введением инкубационного периода после УФО опухолевых и моноцитарных клеток, убедительно демонстрируют явное преимущество предлагаемого метода с точки зрения формирования протективного иммунного ответа у данных больных.

В основе дисбаланса иммунного гомеостаза у больных Т-клеточными лимфомами кожи лежат нарушения механизмов межклеточного взаимодействия, обусловленные повышением экспрессии интегриновых молекул (LFA-1) на Т-лимфоцитах (59,4+28,18%, р<0,05) и естественных киллерных клетках (CD16), (57,0±41,67 р<0,05) а также отсутствие экспрессии лимфоцитарной селектиновой молекулы адгезии (CD62L) на хелперных Т-лимфоцитах. Иммунологическая толерантность к опухолевым антигенам обусловлена избытком неиммуногенных дендритных антигенпрезентирующих клеток, которые характеризуются отсутствием экспрессии коактивационных молекул (CD86), имеющих фенотип CD36+CD83+CD86'.

Разработан метод трансиммунизации на основе стандартного метода экстракорпоральной фотохимиотерапии в лечении больных Т-клеточными лимфомами кожи. Показана его высокая клиническая эффективность. Применение этого метода позволило достичь выраженного клинического эффекта в 60% случаях у 12 больных с различными формами Т-клеточной лимфомой кожи.

Показано, что в процессе процедуры трансиммунизации индуцируется экспрессия антигена CD95, ассоциированного с алоптозом на опухолевых CD4 Т-лимфоцитах в смешанной культуре мононуклеарных клеток (с 6,7+3,5 до 22,4+6,2 р<0,05). Моноциты, во время инкубационного периода, трансформируются в ранние, а затем и в зрелые антигенпрезентирующие дендритные клетки, с высокой экспрессией коактивационной молекулы CD86+ (46,5+20,9%, р<0,05) обладающие иммуногенным потенциалом.

Клиническая эффективность предложенного метода была максимальной у больных с эритродермической формой Т-клеточной лимфомой кожи. Клинической ремиссия была достигнута у 5 (25%) больных со снижением площади поражения в 2 раза (SWAT /балы до лечения 14, 3=ь 0,9 после 7,5 ± 0,7 баллов р <0,05), у пациентов с инфильтративно - бляшечной стадией заболевания в 1,5 раз (SWAT до лечения 26,4 ±11,6,, после лечении 17,4 ± 9,5), что эффективнее, стандартной методики экстракорпоральной фотохимиотерапии на 20% и на 25% эффективнее традиционных методов лечения. При этом продолжительность клинической ремиссии после трансиммунизации увеличилась в 1,6 раза по сравнению со стандартной процедурой экстракорпоральной фотохимиотерапии и в 2,5 раза в сравнении с традиционными методами лечения с применением гормональных и химиотерапевтических препаратов, в сроки наблюдения от 1 года до 3-х лет.

После проведения процедуры трансиммунизации происходила коррекция иммунологических показателей с достоверным увеличение в периферической крови CD8+ Т-лимфоцитов (с 20,06±9,41% до 26,0±8,43%, р<0,05), уменьшением количества CD4 Т-клеток (с 49,60±10,09% до 44,4±12,78%, р<0,05) и, как следствие этого, нормализация иммунорегуляторного индекса (до трансиммунизации - 2,95±1,23%, после - 1,8±0,5%, р<0,05), коррелирующая с улучшением клинической симптоматики, а также продолжительность

безрецидивного периода, свидетельствует о достижении стойкого протективного противоопухолевого иммунного ответа у больных Т-клеточной лимфомой кожи после проведения трансиммунизации.

Практические рекомендации

1. Курс модифицированной методики ЭФХТ - Трансиммунизации включает в себя 4 сеанса, проводимых 2 раза в неделю. Повторный курс лечения назначается через 4 недели, затем через 3 месяца, через 6 месяцев и далее по показаниям.

2. Процедура ТИ показана больным с эритематозно-сквамозной стадией ГМ, эритродермическим вариантом ГМ, синдромом Сезари, инфильтративно-бляшечной стадией ГМ, а также при неэффективности предыдущей терапии.

3. Противопоказанием для проведения ТИ служит индивидуальная непереносимость к препаратам, содержащим метоксипсорален, сопутсвующая тяжёлая сердечно-сосудистая патология: сердечно-сосудистая недостаточность, нарушение сердечного ритма, нарушение со стороны мозгового кровообращения, тяжёлые психические расстройства.

4. Процедуры ТИ необходимо проводить под контролем гемодинамических показателей, с учётом возраста больного, сопутствующей патологии и лабораторных данных.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Кильдюшевский A.B., Карзанов О.В., Ермилова А.И., Гостева И.В., Гордиевская М.С. и др. - Экстракорпоральная фотохимиотерапия в лечении аутоиммунных и лимфопролиферативных заболеваний кожи.// Альманах клинической медицины T.XV-M 2007 - Актуальные вопросы дерматовенерологии и дерматоонкологии, стр. 168-172

2. Молочков A.B., Молочков A.B., Кильдюшевский A.B., Молочков В.А., Ольшанский А.Я., Гордиевская М.С. и др. - Совершенствование методов экстракорпоральной фотохимиотерапии в лечении Т-клеточных злокачественных лимфом кожи.// Актуальные вопросы дерматовенерологии и дерматоонкологии - материалы конференции, 2008, стр. 135-138.

3. Кильдюшевский A.B., Ольшанский А.Я., Молочков В.А., Молочков A.B., Гордиевская М.С. и др. - Трансиммунизация - новый тренд иммунотерапии Т-клеточных лимфом кожи.// Новые медицинские технологии - 2008, - №10 - с. 1724.

4. Молочков A.B., Овсянникова Г.В., Гордиевская М.С. - К вопросу о диагностике Т-клеточной лимфомы кожи.// НПК Памяти профессора А.Л.Машкилейсона -М.2008, стр. 57-58

5. Овсянникова Г.В., Гордиевская М.С., Федоровская A.B. - Опыт лечения больных ранней стадией Т-клеточной лимфомой кожи.// Материалы конференции «Герпес и инфекции передаваемые половым путём» - 2009 г., стр. 110-113

6. Кильдюшевский A.B., Молочков A.B., Ольшанский А.Я., Фомин А.М., Гордиевская М.С., Аникина Ю.А. - Трансляционная иммунотерапия Т-клеточных лимфом кожи.// Материалы конференции «Актуальные вопросы гемафереза, хирургической гемокоррекции и диализа.

7. Кильдюшевский A.B., Молочков В.А., Ольшанский А.Я., Фомин A.M., Гордиевская М.С. - Адоптивная иммунотерапия Т-клеточной лимфомы кожи на основе экстракорпорального фотофереза.// Российский журнал кожных и венерических болезней - 2010г. Ks 1, стр.4-10.

8. Заявка на патент на изобретение (per. № 2009108739). Кильдюшевский A.B., Молочков В.А., Молочков A.B., Ольшанский А.Я, Гордиевская М.С., Карташова М.Г.

Заказ № 259. Объем 1п.л. Тираж 100 экз. Отпечатано в ООО «Петроруш». г.Москва, ул.Палиха 2а.тел.250-92-06 www.postator.ru