Адаптационная защита мозга от оксидативного повреждения при экспериментальной модели болезни Альцгеймера

Хоменко, Инна Петровна

Диссертации по медицине → Патологическая физиология

Автореферат и диссертация по медицине (14.00.16) на тему:Адаптационная защита мозга от оксидативного повреждения при экспериментальной модели болезни Альцгеймера

ДИССЕРТАЦИЯ

АВТОРЕФЕРАТ

Хоменко, Инна Петровна Москва 2006 г.

Ученая степень: кандидата биологических наук

ВАК РФ: 14.00.16

Автореферат диссертации по медицине на тему Адаптационная защита мозга от оксидативного повреждения при экспериментальной модели болезни Альцгеймера

На правах рукописи

ХОМЕНКО ИННА ПЕТРОВНА

АДАПТАЦИОННАЯ ЗАЩИТА МОЗГА ОТ ОКСИДАТИВНОГО ПОВРЕЖДЕНИЯ ПРИ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ МОДЕЛИ БОЛЕЗНИ АЛЬЦГЕЙМЕРА

14.00.16 - патологическая физиология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва-2006

Работа выполнена в лаборатории стресса и

адаптации Государственного учреждения Научно-исследовательского института общей патологии и патофизиологии Российской АМН

Научные руководители:

доктор медицинских наук, профессор И.Ю. Малышев доктор биологических наук, профессор Е.Б. Манухина

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор В.Б. Кошелев доктор биологических наук В.Г. Башкатова

Ведущее учреждение:

Российский Университет Дружбы Народов

Автореферат разослан _2006 года

Защита диссертации состоится ^ЮНЛ 2006 года в на заседании Диссертационного совета Д 001.003.01 при Научно-исследовательском институте общей патологии и патофизиологии РАМН по адресу: 125315, Москва, Балтийская улица, дом 8.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института

Ученый секретарь Диссертационного совета, кандидат медицинских наук

Л.Н. Скуратовская

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследования.

Старение является главным фактором риска нейродегенеративных нарушений, таких как болезнь Альцгеймера (БА), Паркинсона, старческая деменция и число людей с этими тяжелыми состояниями быстро увеличивается. БА представляет собой главную причину слабоумия и поражает некоторых людей уже в сорока- и пятидесятилетнем возрасте со всем специфическим сочетанием клинических и патологических признаков. Это заболевание "убивает" сотни тысяч человек в год (Вуртман, 1985; Яетап е! а1., 2004). По приблизительным оценкам демографического прогноза Организации Объединенных Наций, число людей старше 80 лет в 2050 году приблизится к 370 млн (8иЬ, СЬес1ег, 2002). В настоящее время известно, что 50% людей старше 85 лет страдают БА. Следовательно, если данная статистика верна, то менее чем через 50 лет свыше!00 миллионов человек во всем мире будут поражены слабоумием и потребуют огромных затрат на лечение и уход (БиИ, СЬес1ег, 2002; О) е1 а1., 2005).

Это заболевание, впервые описанное немецким невропатологом Алоисом Альцгеймером в 1906 г. и названное его именем, по-прежнему является неразгаданной загадкой, поскольку до сих пор неизвестны средства, способные остановить безжалостное течение этой болезни. Различные фармацевтические препараты, применяемые для профилактики и лечения БА, как правило, обладают весьма ограниченными возможностями и большим количеством побочных эффектов. Поэтому серьезное внимание в настоящее время уделяется средствам, которые могли бы повысить адаптивный потенциал и мобилизовать защитные системы организма. Вместе с тем сейчас становится все более очевидным, что долгое время после начала БА ее развитие сдерживается эндогенными системами защиты мозга, которые включают антиоксидантную систему, систему белков теплового шока (НвРв), оксида азота (N0) и другие стресс-лимитирующие системы (Меегвоп, 1984; Ма^Ьеу, МапикЫпа, 1999; Манухина, Малышев, 2000).

Таким образом, факторы, активирующие эндогенные защитные системы, могут оказывать нейропротекторное действие. Эффективным альтернативным способом стимулирования эндогенной защиты организма является адаптация организма к умеренному, дозированному воздействию факторов окружающей среды, таких как гипоксия, стресс, тепло, физическая нагрузка и т.д. (Меерсон и др. 1993а). Известно, что ключевая роль в формировании адаптационной защиты принадлежит активации синтеза стресс-белков (НБРэ), которые в настоящее время считаются важным компонентом внутриклеточной протекторной системы, обладающей адаптогенными, антиоксидантными, цитопротекторными и антиапоптотическими свойствами (Манухина, Малышев, 2000; Ма1узЬеу, МапикЫпа, 1999; Меегеоп & а1., 1992).

РОС. НАЦИОНАЛЬНАЯ БИБЛИОТЕКА С.-Петербург ОЭ 200^икт

Цель и задачи исследования.

Цель настоящего исследования состояла в изучении возможности нефармакологической адаптационной защиты мозга и определении роли HSPs в эндогенных нейропротекторных механизмах, формирующихся на уровне клеток и целого организма.

В рамках поставленной цели решались следующие основные задачи:

1. Оценить возможность предупреждения нарушений когнитивных функций у животных (крыс линии Вистар) с помощью адаптации к гипоксии на экспериментальной модели болезни Альцгеймера.

2. Оценить возможность ограничения индукции оксидативного стресса в гиппокампе крыс линии Вистар с помощью адаптации к гипоксии.

3. Сопоставить устойчивость к нейродегенеративному повреждению мозга у крыс линий Август и Вистар, обладающих различной врожденной устойчивостью к острому стрессу.

4. Оценить возможность адаптационной защиты нервных клеток гиппокампа мыши НТ22 в культуре от гибели, вызванной оксидативным стрессом.

5. Изучить возможную роль HSPs в нейропротекторном эффекте адаптации in vitro.

Научная новизна исследования определяется следующими основными результатами.

Впервые продемонстрирована возможность предупреждения и/или ограничения нейродегенеративного повреждения нейронов мозга и сопутствующих поведенческих нарушений у крыс Вистар с помощью предварительной адаптации к гипоксии.

В экспериментах in vivo впервые установлено, что один из механизмов защитного действия адаптации к гипоксии на когнитивную функцию может быть связан с ограничением оксидативного стресса в гиппокампе.

Впервые показано, что крысы линий Август и Вистар, обладающие разной врожденной устойчивостью к острому стрессу (Пшенникова и др., 1999; Пшенникова и др., 1996), различаются также по устойчивости к нейродегенеративному процессу по показателям поведенческих реакций и по уровню интенсивности свободнорадикального окисления в структурах мозга.

Разработана модель дозированной адаптации культуры нейронов гиппокампа к неповреждающему оксидативному стрессу, обладающая защитным эффектом. Таким образом, впервые показано, что адаптационная защита может формироваться на уровне изолированных нервных клеток в отсутствие нейрогуморальных факторов.

Впервые установлено, что один из механизмов адаптации культуры нейронов гиппокампа к неповреждающему оксидативному стрессу связан с увеличением синтеза HSP70.

Теоретическое значение работы определяется тем, что в ней доказана возможность адаптационной защиты мозга и ограничения поведенческих нарушений у крыс при экспериментальной болезни Альцгеймера; показано, что устойчивость к нейродегенеративным повреждениям мозга в значительной степени определяется врожденной активностью защитных стресс-лимитирующих систем; доказана возможность формирования адаптации на клеточном уровне в отсутствие нейрогуморальных факторов; раскрыта роль HSPs в защитных эффектах адаптации на клеточном уровне.

Практическое значение работы состоит в том, что результаты работы позволяют обосновать новые подходы для немедикаментозного предупреждения болезни Альцгеймера и нейродегенеративных расстройств. Это в перспективе может обеспечить существенный прогресс в клинике болезни Альцгеймера и других тяжелых заболеваний человека, связанных с нейродегенеративными повреждениями головного мозга.

Положения, выносимые на защиту:

1. Адаптация организма к гипоксии предупреждает нарушение когнитивных функций у крыс Вистар, вызванное введением Ар, и ограничивает оксидативный стресс, индуцированный в гиппокампе.

2. Крысы линии Август, обладающие повышенной врожденной устойчивостью к острому стрессу, по сравнению с крысами линии Вистар, более устойчивы к развитию нейродегенеративного процесса, вызванного введением Ар.

3. Адаптационная защита от оксидативного стресса может формироваться на клеточном уровне в отсутствие нейрогуморальных влияний.

4. Стресс-белки HSP70 вовлечены в формирование адаптационной защиты на клеточном уровне.

Апробация работы

Основные результаты работы доложены на Международной конференции по болезни Альцгеймера (Cold Spring Harbor Laboratory, США, 2002), V международной конференции "Hypoxia in Medicine" (Инсбрук, Австрия, 2003), Международной конференции "Активные формы кислорода, оксид азота, антиоксиданты и здоровье человека" (Смоленск, 2003), XIX съезде физиологического общества им. И.П. Павлова (Екатеринбург, 2004), III Российском конгрессе по патофизиологии (Москва, 2004), научной конференции "Нейрохимия: фундаментальные и прикладные аспекты" (Москва, 2005), 4-ой Национальной научно-практической конференции с международным участием "Активные формы кислорода, оксид азота, антиоксиданты и здоровье человека" (Смоленск, 2005), 4-ой Российской конференции с международным участием "Гипоксия: механизмы, адаптация, коррекция" (Москва, 2005), конгрессе по экспериментальной биологии (Сан-Франциско, США, 2006).

Объем и структура диссертации.

Диссертация изложена на 141 странице и состоит из введения, обзора литературы, собственных результатов и их обсуждения, заключения и выводов. Список литературы содержит 235 источников. Диссертация иллюстрирована 8 таблицами и 25 рисунками.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Исследование включало 4 этапа.

На первом этапе были проведены эксперименты in vivo на уровне целого организма. Была изучена возможность защиты или предупреждения нарушения когнитивных функций у животных (крыс линии Вистар), вызванного введением Aß, с помощью адаптации к периодической гипобарической гипоксии.

На втором этапе были проведены эксперименты in vivo по сопоставлению устойчивости к экспериментальному нейродегенеративному повреждению мозга у крыс линий Август и Вистар, обладающих различной врожденной устойчивостью к острому эмоциональному стрессу (Пшенникова и др., 1999; Пшенникова и др., 1996), который играет важную роль в патогенезе БА (Small, 2002; Radecki et al., 2005).

На третьем этапе были проведены эксперименты in vitro на клеточном уровне. Выбор линии клеток гиппокампа мыши НТ22 был обусловлен тем, что: а), гиппокамп - структура головного мозга, повреждающаяся первой при БА на уровне целого организма; б), клетки НТ22 часто используется для изучения заболеваний, связанных с гибелью нервных клеток, вызванной оксидативным стрессом (Sagara et al., 1999), который играет важную роль в патогенезе БА (Markesbery, 1997; Klein, Ackerman, 2003; Migliore et al., 2005). Кроме того, фундаментальный для понимания механизмов адаптации вопрос - может ли адаптационный эффект формироваться только благодаря непосредственному действию фактора среды на клетки, или для этого необходимо обязательное участие центральной нейрогуморальной системы, до сих пор остается открытым. Для ответа на данный вопрос была разработана оптимальная модель адаптации культуры клеток к неповреждающим воздействиям оксидативного стресса. Выбор модели для использования в дальнейшей работе проводился по эффективности адаптационной защиты клеток при повреждении Н2О2. Степень повреждения и защиты оценивали по изменению метаболической активности клеток.

На четвертом этапе с помощью современных биохимических и молекулярно-биологических методов исследования были изучены изменения функционирования эндогенных нейропротекторных механизмов, включая синтез HSPs, формирующиеся на уровне изолированных клеток в ходе адаптации.

Использование блокатора синтеза HSPs, кверцетина, позволило сопоставить вклад данных белков в развитие защитного эффекта адаптации

на клеточном уровне в отсутствие нейрогуморальных влияний при воздействии тяжелым оксидативным повреждением.

Эксперименты были выполнены на 307 самцах крыс линий Вистар массой 320±50 г и Август массой 250±30 г., культуре нервных клеток гиппокампа мыши НТ22.

Эксперименты на животных

Адаптацию животных к периодической гипобарической гипоксии проводили в барокамере при разряжении воздуха, соответствующем высоте 4000 метров над уровнем моря, ежедневно по 4 часа в сутки в течение 14 суток. Режим адаптации: 1-ый день - 1000 м / 30 мин, 2-ой день 2000 м / 60 мин, 3-ий день - 3000 м / 90 мин, 4-ый день -4000 м / 2 часа, 5-ый день - 4000 м / 3 часа, 6-ой - 14-ый дни - 4000 м / 4 часа. Животных для последующих экспериментов брали через 24 часа после последнего сеанса адаптации.

После последнего адаптирующего воздействия через 24 часа моделировали нейродегенеративный процесс. Для этого вводили нейротоксичный фрагмент Ар (см. далее). В соответствии с данными литературы (Harkany et al., 1998) проводили тестирование УРПИ через 14 дней после введения Ар, затем через 14 дней - тест экстраполяционного избавления (ТЭИ), а через 1 -2 дня после ТЭИ животных декапитировали и извлекали мозг для последующих биохимических исследований.

При проведении экспериментов по сопоставлению устойчивости к нейродегенеративному повреждению мозга у крыс линий Август и Вистар изменение когнитивных функций оценивали с помощью тестов УРПИ и "открытое поле". Через 14 дней после введения АР проводили тестирование УРПИ, затем через 14 дней после завершения тестирования УРПИ оценивали поведение животного в тесте "открытое поле", а через 2 дня после последнего тестирования животных декапитировали и извлекали мозг для последующих биохимических исследований.

Моделирование нейродегенеративного процесса у экспериментальных животных проводили с помощью стереотаксического введения крысам нейротоксичного соединения. В качестве такого соединения использовали нейротоксичный фрагмент Ар, содержащий 11 аминокислотных остатков, соответствующих последовательности 25-35 нативного пептида. Животным под хлоралгидратным наркозом (300 мг/кг) стереотаксически билатерально вводили Ар (25-35) в п. basalis magnocellularis по следующим координатам (по атласу G. Paxinos, С. Watson, 1998): АР - 1,5 мм, DL - 2,7 мм, Н - 8,7 мм. Введение проводили в соответствии с методикой Harkany и соавторов (1998) под наркозом, в стереотаксической установке с помощью внутричерепной канюли и шприца Гамильтона. Экспериментальным животным вводили по 2 мкл 0,4x10"9 М раствора Ар (25-35) (Sigma). Ар (25-35) растворяли в физиологическом растворе - 1 мг/ 4,7мл.

В экспериментах по сопоставлению устойчивости к нейродегенеративному повреждению мозга у крыс линий Август и Вистар, вызванному моделированием БА, крыс случайным образом распределяли на три группы: контроль, введение АР (25-35) и ложная операция. В группе крыс обеих популяций ложная операция проводилась с введением физиологического раствора вместо А(3. Животных декапитировали через 30 дней после операции.

Обучение крыс условному рефлексу пассивного избегания (УРПИ) проводили по методике (van der Zee et. al., 1994) на установке "Lafayette Instruments" (США). Крысу сажали на ярко освещенную платформу (250x70 мм) спиной к квадратному отверстию (60x60 мм), ведущему в камеру (400x400x400 мм) с электродным полом. Вследствие норкового рефлекса после обнаружения входа в темный отсек камеры крыса переходила в него и стремилась большую часть времени находиться в нем. С момента помещения животного в экспериментальную камеру в течение 180 секунд регистрировали латентный период первого захода в затемненное отделение. По истечении этого времени в момент, когда крыса оказывалась в затемненном отделении, отверстие закрывали и наносили животному неизбегаемое электроболевое раздражение через пол. При тестировании сохранности УРПИ (через 24 часа после обучения) крысу сажали на платформу спиной к отверстию и регистрировали латентный период захода животного в темное отделение.

Тест экстраполяционного избавления (ТЭИ) характеризует быстроту решения поставленной задачи в стрессорной ситуации (Rayevsky et al., 1990). Экспериментальная установка представляет собой сосуд цилиндрической формы диаметром 35 см, высотой 45 см, наполненный водой (температура 22°С). В центре сосуда закреплен прозрачный стеклянный цилиндр диаметром 10 см и высотой 22 см. Нижний конец цилиндра погружен в воду на 2,5 см. Крысу опускали хвостом вниз во внутренний цилиндр, помещенный в центре сосуда, и на протяжении 2-ух минут регистрировали латентный период двигательных реакций (время до первого движения - X, сек), число прыжков (безуспешных попыток избегания - У) и латентный период подныривания (Z, сек).

Тестирование животных в "открытом поле" проводили в течение 2-ух минут; при этом животное помещали в центр поля и регистрировали горизонтальную (движения по полу открытого поля) и вертикальную ("стойки" на задних лапах с опорой и без опоры на стенки открытого поля) двигательную активность.

Забор и хранение тканей отделов мозга

После декапитации животных мозг быстро извлекали, охлаждали в изотоническом растворе хлорида натрия и на льду выделяли фронтальную и теменную кору больших полушарий, мозжечок и гиппокамп. Данные структуры мозга затем хранили при -86° С. Позже определяли в них содержание ТБК-реактивных продуктов спектрофотометрическим методом.

Содержание вторичных продуктов перекисного окисления липидов (ПОЛ), реагирующих с тиобарбитуровой кислотой (ТБКРП), определяли спектрофотометрическим методом (Ohkawa et. al., 1979). Поглощение (оптическую плотность) экстрактов определяли при длинах волн 535 нм (максимум поглощения малонового диальдегида - МДА), 515 нм и 550 нм (для учета неспецифического поглощения) на фотометре КФК-3 (Россия).

Эксперименты на культуре клеток

Повреждение нервных клеток вызывали введением в среду культивирования высоких концентраций Н202 (30%, Sigma), 600 мкМ и 1,5 мМ, отобранных в ходе предварительных экспериментов. Общее повреждение клеток оценивали по тесту МТТ (см. далее). Специфическое повреждение, вызванное оксидативным стрессом, оценивали по HSP32 в качестве маркера методом Вестерн-блот анализа.

Для измерения метаболической активности (тест МТТ) клеток был использован метод определения МТТ-редуктазной активности (Gomez et al., 1997). Клетки в 6-ячеечных чашках инкубировали с 500 мкл раствора МТТ-реагента (MP Biomedicals, Inc.) концентрацией 0,5 мг/мл при 37°С в течение 30 минут, после чего образовавшиеся фиолетовые кристаллы растворяли 10% Тритон Х-100 и 0,1 M HCl в изопропаноле. Оптическую плотность раствора, пропорциональную метаболической активности клеток, измеряли на фотометре КФК-3 (Россия) при 570 нм. Результаты представляли в % от оптической плотности контрольной группы клеток.

Адаптация клеток к неповреждающим воздействиям оксидативного стресса. Поскольку в ходе отработки данной модели мы получили эффекты как прекондиционирования, так и адаптации, были выбраны следующие экспериментальные условия именно для адаптации клеток к неповреждающим воздействиям Н202: плотность клеток - 30000 клеток на лунку, адаптирующая концентрация Н202 - 3 мкМ, повреждающие концентрации Н202 - 600 мкМ и 1,5 мМ. В качестве конечной рабочей модели была выбрана модель трехдневной адаптации. Клетки адаптировали к 3 мкМ Н202 ежедневно, в течение трех дней. Через 24 часа после последнего сеанса адаптации клетки повреждали оксидативным стрессом, вызванным добавлением в среду культивирования клеток концентраций Н202 - 600 мкМ и 1,5 мМ. Затем экспериментальные 6-ячеечные чашки с клетками инкубировали при 37°С в атмосфере 10% С02 в течение 2-ух часов для оценки выживаемости клеток методом измерения МТТ-редуктазной активности, в течение 6-8 часов - для определения синтеза HSP32 и 18 часов - для определения индукции HSP70 методом Вестерн-блот анализа.

Определение содержания HSPs проводили методом Вестерн-блот анализа с использованием оборудования и реактивов BioRad. Клетки лизировали в фосфатном буфере с добавлением 0,1% Тритона Х-100 и коктейля ингибиторов протеаз. В полученных образцах измеряли белок по методу Бредфорда. Затем образцы смешивали с буфером для образцов

(SB4X) в соотношении - 3 части образца : 1 часть SB4X и прогревали при 96"С в течение 7 мин. Электрофорез проводили в 12% полиакриламидном геле по Laemmli (1970). Для последующего Вестерн-блоттинга белки переносили с геля на нитроцеллюлозную мембрану путем электроэлюции. Для выявления содержания исследуемых белков использовали иммуноферментную хемилюминесценцию с использованием первых моноклональных антител против индуцибельной формы HSP70 и HSP32 (мышиные моноклональные антитела к HSP70, мышиные моноклональные антитела к гемоксигеназе-1, фирмы StressGen Biotechnologies) и вторых антител, конъюгированных с пероксидазой хрена (Amersham). Для визуализации содержания исследуемого антигена использовали набор ECL (Amersham). Экспонирование осуществляли на пленку Hyperfilm ECL (Amersham). О содержании белков судили по ширине и интенсивности окрашивания полосы связывания антител, соответствующей молекулярной массе белка. Количественную обработку сканированных иммуноблотов проводили с помощью компьютерной программы Photoshop.

В качестве ингибитора синтеза HSPs был использован кверцетин (Sigma) в концентрации 50 мкМ (Wu, Yu, 2000). Преинкубацию с кверцетином в растворе диметилсульфоксида (MP Biomedicals, Inc.) начинали за 1,5 часа до начала каждого сеанса адаптации. По окончании эксперимента измеряли метаболическую активность клеток.

Статистическую обработку результатов проводили с использованием t-критерия Стьюдента. Различия считали достоверными при р<0,05. Результаты представляли в виде М+т. Также использовали непараметрические методы анализа - критерий Т (парный критерий Вилкоксона) для определения значимости изучаемого параметра внутри каждой группы животных и критерий U (Вилкоксона - Манна - Уитни) для оценки достоверности различий между группами. Для оценки достоверности различий по степени запоминания животных использовали точный метод Фишера.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Адаптация к гипоксии предупреждает нарушение когнитивных функций, вызванное введением р-амилоида, у крыс линии Вистар

После введения Ар изменение латентного периода захода в темную камеру в тесте УРПИ было на 41,68% меньше, чем в контроле (рис.1). Этот факт отражает ухудшение памяти, которое является признаком БА. Предварительная адаптация к гипоксии привела к увеличению изменения второго латентного периода на 78,82% по сравнению с группой животных, которым вводили Ар, а также полностью предупредила нарушение когнитивных функций, вызванное Ар (рис.1). Следует отметить, что у

200 -I

180

160 Н^Н

|||| |

контроль ложная бета -операция амилоид

адаптация адаптация + бета -амилоид

Рис. 1. Влияние введения и адаптации к гипоксии на способность к запоминанию у крыс линии Вистар.

* - Р < 0,05 по сравнению с контролем; ** - Р < 0,05 по сравнению с группой животных "бета-амилоид".

животных с ложной операцией латентный период захода в темную камеру не отличался от контроля. Таким образом, оперативное вмешательство и последующее введение вещества в мозг не является причиной наблюдаемых изменений: они вызваны именно данным пептидом.

Рис.2. Влияние адаптации к гипоксии на вызванные Ар изменения латентного периода начала двигательной реакции (параметра X) в тесте экстраполяционного избавления (ТЭИ).

* - Р < 0,05 по сравнению с контролем; ** - Р < 0,05 по сравнению с группой животных "бета-амилоид".

контроль бета - амилоид адаптация адаптация +

бета - амилоид

Было показано, что Ар достоверно почти в два раза увеличивает латентный период двигательной реакции и время до принятия правильного решения в тесте ТЭИ (рис.2), что свидетельствует об ухудшении когнитивной функции, необходимой для успешного поиска выхода из острой стрессорной ситуации. Адаптация сама по себе достоверно уменьшала латентный период двигательной реакции и предупреждала вызванное Ар увеличение этого показателя. Это означает, что адаптация к гипоксии увеличила быстроту начала поиска решения в стрессорной ситуации и предупредила нарушение этой функции у животных, получивших инъекцию Ар, на 36,52% (рис.2).

Таким образом, предварительная адаптация к гипоксии полностью предупреждает нарушение когнитивных функций у крыс линии Вистар, вызванное введением токсичного фрагмента Ар.

Адаптация к гипоксии ограничивает оксидативный стресс в гиппокампе, вызванный введением ¡¡-амилоида, у крыс линии Вистар

В наших экспериментах уровень оксидативного стресса оценивался у крыс, которым вводили Ар, по содержанию ТБК-реактивных продуктов в структурах мозга, включая кору, мозжечок и гиппокамп. Представленные в таблице 1 данные показывают, что Ар избирательно индуцирует оксидативный стресс в гиппокампе. Адаптация к гипоксии сама по себе не повлияла на уровень ТБК-реактивных продуктов, но в то же время ограничила его повышение, вызванное введением Ар. Как уже упоминалось выше, адаптация к гипоксии эффективно предупреждала у крыс вызванные

Таблица 1.

Влияние адаптации к гипоксии на вызванный Ар оксидативный стресс в структурах мозга крыс линии Вистар (М±т).

Серия Вещества, реагирующие с тиобарбитуровой кислотой (малоновый диальдегид), нмоль/г ткани

кора мозжечок гиппокамп

Контроль 57,6 ± 4,6 56,8 ± 5,4 53,8 ± 2,2

Бета-амилоид (АР) 56,7 ±4,7 52,7 ± 2,8 63,1 ±2,7*

Адаптация 55,3 ± 7,2 57,7 ± 4,5 54,7 ±3,5

Адаптация + 61,2 ±4,9 54,6 ± 2,8 56,1 ±2,1

бета-амилоид (АР)

* -Р <0,05 по сравнению с контролем.

Ар нарушения когнитивной функции.

Таким образом, наши эксперименты впервые показали, что один из механизмов защитного действия адаптации к гипоксии на когнитивную функцию может быть связан с ограничением оксидативного стресса в гиппокампе.

Различия в устойчивости крыс Вистар и Август к нейродегенеративному повреждению мозга

Как показало тестирование УРПИ (таблица 2), в контроле 90% крыс линии Август и 90% крыс Вистар "запомнили" электрошок. При этом степень запоминания (А ЛП) у крыс Вистар была выше, чем у крыс Август. Введение Ар существенно нарушало процессы памяти у крыс Вистар: в этой группе крыс различие между ЛП| и ЛП2 в соответствии с парным Т критерием Вилкоксона было не достоверно (Р>0,05), то есть большинство крыс "не запомнили" электрошок, а доля запомнивших составила всего 37% против 90% в контроле. У крыс Август, в отличие от крыс Вистар, введение Ар не вызывало достоверного нарушения процессов памяти, по сравнению

Таблица 2.

Влияние введения Ар на поведенческие реакции крыс линий Август и Вистар в тестах УРПИ и "открытое поле".

Серии опытов Линии крыс Показатели теста УРПИ (средние значения) Показатели теста "открытое поле" (средние значения)

АЛП, сек крысы, запомнившие электрошок, % горизонтальная активность (число пересеченных квадратов) вертикальная активность (суммарное число стоек)

Контроль Август 100,6 Рт<0,01 90 25,2 11,4

Вистар 142,7* Рт< 0,01 90 25,6 8,6'

Бета-амилоид Август 89,9 Рт < 0,05 89 36,2 + 15,2 +

Вистар 36,1++■ Рт> 0,05 37 ++' 26,8" 5,1

Ложная операция Август 96,2 100 26,4 11,6

Вистар 103 89 44,2 8,Г

* р<0,01 по сравнению с крысами Август, * р<0,05, ++ р<0,01 по сравнению с контролем (и критерий Вилкоксона-Манна-Уитни); Рт означает величину достоверности разности ЛП2 и ЛП/, то есть степени запоминания (парный Т критерий Вилкоксона).

с контролем, как по количеству запомнивших крыс, так и по степени запоминания (А ЛП).

Таким образом, у крыс Август повышенная устойчивость к острому стрессу (Пшенникова и др., 1999; Пшенникова и др., 1996; Пшенникова, 2003) сопровождается более высокой устойчивостью к нейродегенеративному повреждению по показателям нарушений процесса запоминания.

Горизонтальная двигательная активность в открытом поле в контроле у крыс Август и Вистар была одинаковой, а уровень вертикальной двигательной активности у крыс Август выше, чем у Вистар (таблица 2). Следовательно, ориентировочно-исследовательская активность крыс Август выше, что согласуется с ранее полученными данными (Пшенникова и др., 1999). Под влиянием А(3 у крыс Август увеличилась как горизонтальная двигательная активность (локомоция), так и вертикальная. У крыс Вистар, напротив, вертикальная двигательная активность снизилась на 41% и стала в 3 раза меньше, чем у крыс Август, а горизонтальная активность не изменилась. Следовательно, моделирование БА привело у крыс Вистар к угнетению такого элемента когнитивной функции мозга как ориентировочно-исследовательская активность животного и, напротив, активировало этот элемент у крыс Август. Следует отметить, что у всех животных с ложной операцией показатели поведенческих реакций не отличались от контроля. Таким образом, оперативное вмешательство и последующее введение вещества в мозг не является причиной наблюдаемых изменений: они вызваны именно данным пептидом.

При сопоставлении интенсивности свободнорадикального окисления в структурах мозга в коре больших полушарий не было обнаружено достоверных различий по содержанию МДА между сериями опытов как у крыс Вистар, так и у крыс Август, то есть не выявлено влияние введения АР на уровень ПОЛ в данной структуре мозга (таблица 3). Вместе с тем, у крыс Вистар во всех сериях опытов уровень ПОЛ в данной структуре мозга оказался достоверно выше, чем у крыс Август. В гиппокампе наблюдалась иная картина: у крыс Вистар, но не у крыс Август, после введения Ар наблюдалась достоверная тенденция повышения содержания МДА (на 9%) по сравнению с контролем. Однако во всех сериях опытов уровень содержания МДА в этой структуре у крыс Вистар и Август существенно не отличался (таблица 3).

Таким образом, более низкая устойчивость к моделированному нейродегенеративному процессу, выявляемая по изменению поведенческих реакций, у крыс Вистар сочеталась с несколько большей активацией свободнорадикального окисления в гиппокампе по сравнению с крысами Август.

Таблица 3.

Влияние введения Ар на содержание малонового диальдегида (МДА), нмоль/г ткани, в структурах головного мозга у крыс линий Август и Вистар (М±т).

Серии опытов Линии крыс Структуры мозга

Гиппокамп Кора

Контроль Август 70,15 ±3,4 (16) 64,4 ±3,9 (16)

Вистар 71,2 ± 1,84 (10) 79,26 ±4,2 (8) *

Бета-амилоид Август 72,6 ±4,4 (16) 64,5 ± 3,6 (16)

Вистар 77,8 ±2,51 (10) + 77,0 ± 3,26 (9) *

Ложная операция Август 73,65 ± 13,5 (8) 65,68 ±4,52 (8)

Вистар 71,25 ±2,0 (8) 84,41 ±8,4 (9) *

* - Р < 0,05 - по сравнению с крысами Август; ' - Р < 0,05 - по сравнению с контролем; цифры в скобках - количество животных в серии.

Прекондиционирование и адаптация к Н202 защищают изолированные нейроны от гибели, вызванной последующим воздействием оксидативного стресса

Для разработки модели адаптации к оксидативному стрессу клеток в культуре была использована 30% Н202 (Sigma). Время каждого сеанса инкубации клеток с Н202 составило 2 часа. Сеансы прекондиционирования и адаптации проводились в течение 1, 2 и 3 дней для выбора наиболее эффективной модели для дальнейшего использования в нашей работе. Также в предварительных экспериментах был исследован широкий диапазон концентраций Н202 (30%, Sigma), используемых как для прекондиционирования и адаптации культуры клеток (3, 6, 12,5, 25, 50, 100 мкМ), так и для их повреждения (100, 200, 300, 400, 600 мкМ и 1,5 мМ). На рис.3 представлено влияние 2-ух часовой инкубации клеток НТ22 с Н202 на их метаболическую активность, то есть выживаемость по тесту МТТ. Видно, что концентрации Н202 от 3 до 100 мкМ могут использоваться для проведения экспериментов по прекондиционированию и адаптации, так как они практически не вызывают гибели клеток. Также из представленных данных видно, что концентрации Н202 200, 400, 600 мкМ и 1,5 мМ, вызывают 29,9%, 37,25%, 42,8% и 52% достоверное повреждение клеток НТ22 соответственно. Следовательно, эти концентрации могут

Рис.3. Влияние 2-ух часовой инкубации клеток НТ22 с Н202 (30%, Sigma) на их выокиваемость (МТТ-тест).

Диаграмма показывает МТТ-редуктазную активность клеток НТ22 (% от контроля). * р < 0,05 по сравнению с контролем; ** р < 0,02 по сравнению с контролем (t-mecm Стьюдента).

использоваться в дальнейших экспериментах для индукции гибели нейронов в культуре от воздействия тяжелого оксидативного стресса.

При разработке модели адаптации к неповреждающим воздействиям Н202 культуры нервных клеток гиппокампа мыши НТ22 были использованы два основных критерия: 1) каждое адаптационное воздействие и полный курс адаптации не вызывают нарушений метаболизма клеток; 2) однократное воздействие не вызывает защитного эффекта, а курс адаптации эффективно защищает культуру клеток от воздействия оксидативного стресса, вызванного 600 мкМ и 1,5 мМ Н202. Этим требованиям отвечала трехдневная модель адаптации культуры клеток к 3 мкМ Н202 в течение 2-ух часов.

На рис.4 и 5 представлены данные по влиянию трехдневной адаптации к неповреждающим воздействиям Н202 (3 мкМ) на снижение метаболической активности, вызванное оксидативным стрессом в клетках линии НТ22. На рисунке 4 видно, что инкубация клеток с 600 мкМ Н202 снижала их метаболическую активность на 38,6313,1% от контроля, а предварительная адаптация к 3 мкМ Н202 ограничивала падение этого показателя на 36,3±2,1%, то есть адаптация достоверно защищала клетки НТ22 от повреждения, вызванного оксидативным стрессом. Также следует

120 1

контроль повреждение -фехцневная трехдневная

адаптация адаптация +

повреждение

Рис.4. Влияние трехдневной адаптации к ЗмкМ Н202 на снижение метаболической активности, вызванное оксидативным стрессом (600 мкМ Н2О2) в клетках линии НТ22.

* - Р < 0,001 по сравнению с контролем; ** - Р < 0,001 по сравнению с повреждением, вызванным 600 мкМ Н202.

120 т

контроль повреждение трехдневная трехдневная

адаптация адаптация + повреждение

Рис. 5. Влияние трехдневной адаптации к 3 мкМ Н202 на снижение метаболической активности, вызванное оксидативным стрессом (1,5 мМ Н202) в клетках линии НТ22.

* - Р < 0,001 по сравнению с контролем; **-/>< 0,001 по сравнению с повреждением, вызванным 1,5 мМ Н202.

отметить, что сама по себе адаптация практически не влияла на выживаемость клеток, то есть данный показатель был близок к контролю.

Рассмотрим воздействие более сильного по своей повреждающей силе стрессорного фактора на выживаемость нервных клеток и способность предварительной адаптации защитить клетки от данного стрессора. На рисунке 5 видно, что инкубация клеток с 1,5 мМ Н202 приводила к снижению их метаболической активности на 51,55±1,7% от контроля. Но, несмотря на такую массивную гибель клеток, предварительная адаптация к 3 мкМ Н202 ограничивала падение этого показателя на 27,8±2,2%. Следовательно, предварительная адаптация к Н202 достоверно защищала нервные клетки НТ22 от оксидативного повреждения.

Таким образом, трехдневная адаптация к 3 мкМ Н202 эффективно ограничивала повреждение нервных клеток гигаюкампа мыши НТ22, вызванное оксидативным стрессом (600 мкМ и 1,5 мМ Н202), что подтверждает возможность непосредственного воздействия адаптирующего фактора на клетку в отсутствие нейрогуморальных влияний и активации соответствующих внутриклеточных защитных механизмов. Кроме того, наблюдался переход от развития феномена прекондиционирования к развитию адаптации по мере уменьшения концентрации Н202, используемой в этих моделях.

Белки теплового шока вовлечены в адаптационную защиту нейронов от оксидативного повреждения

Так как синтез НБРв играет существенную роль в реализации защитных эффектов адаптации в условиях целого организма (Ма1узЬеу е1 а1., 2000), было изучено накопление НБРв в ходе адаптации клеток к неповреждающим воздействиям Н202. На рисунке 6 представлены результаты Вестерн-блот анализа синтеза НБР32 в клетках линии НТ22. Сама по себе адаптация достоверно повышала содержание этого белка в клетках практически в 2 раза. Однократное воздействие 3 мкМ Н202 также приводило к небольшому увеличению содержания НБР32 в клетках. А воздействие оксидативного стресса, вызванного 1,5 мМ Н202 на нервные клетки, приводило к повышенной индукции НБР32 в них. При данном воздействии уровень НБР32 достоверно увеличивался в 16,27 раза по сравнению с контролем, то есть с интактными клетками. НБР32 является маркером оксидативного стресса, поэтому можно заключить, что в ходе адаптации клеток происходила умеренная активация оксидативного стресса, тогда как при действии больших доз перекиси водорода наблюдался выраженный оксидативный стресс, сопровождающийся повреждением клеток. В свою очередь, предварительная адаптация клеток НТ22 к неповреждающим воздействиям Н202 приводила к снижению уровня маркера оксидативного стресса НБР32 при последующем воздействии повреждающего оксидативного стресса на 37,33 ±13,5%.

а).

в» "■ ЧЬ h ч V * > *

б).

250,00 200,00 150,00100,00 50,00 ■ 0,00

"Л a ft ^

r-1 . г*1 .

Рис б. Влияние адаптации к неповреждающим воздействиям Н202 на синтез HSP32 в клетках линии НТ22.

а). Репрезентативная электрофореграмма накопления HSP32 в клетках линии НТ22. 4 - маркер HSP32; 5,6- контроли; 7,8 - однократное воздействие 3 мкМ Н2О2; 9,10 - трехдневная адаптация к 3 мкМ Н2О2; 11,12 - трехдневная адаптация к 3 мкМ Н2О2 + оксидативный стресс, вызванный 1,5 мМ Н202; 13,14 - оксидативный стресс, вызванный 1,5 мМ Н202.

б). Диаграмма, показывающая уровень HSP32 в клетках линии НТ22 (данные представлены в виде относительных денситометрических единиц, представляющих произведение площади сигнала на интенсивность). 1 -контроль; 2 - однократное воздействие 3 мкМ Н2О2; 3 - трехдневная адаптация к 3 мкМ Н202; 4 - оксидативный стресс, вызванный 1,5 мМ Н2О2; 5 - трехдневная адаптация к 3 мкМ Н2О2 + оксидативный стресс, вызванный 1,5 мМ Н202. * - Р < 0,02, Р< 0,05, Р < 0,01 по сравнению с контролем, соответственно представлению на графике; **-/>< 0,02 по сравнению с оксидативным стрессом, вызванным 1,5 мМ Н202.

Таким образом, НБР32 является пропорциональным маркером оксидативного стресса, а предварительная адаптация клеток НТ22 к неповреждающим воздействиям Н202 ограничивает этот стресс.

Анализ синтеза Н8Р70 в клетках НТ22 показал, что клетки этой линии обладают достаточно высоким базальным уровнем экспрессии данного белка в контроле (рис.7). При этом адаптация сама по себе также приводила к достоверному увеличению уровня индукции этого белка по сравнению с контролем. Однократное же воздействие 3 мкМ Н202 приводило к снижению уровня содержания Н8Р70 в клетках НТ22 в 2,32+0,26% раза относительно клеток в контроле. В то же время воздействие оксидативного стресса на нервные клетки, вызванного 1,5 мМ Н202, достоверно подавляло индукцию НБР70 в них в 28,66±0,07% раза относительно контрольных клеток. Предварительная трехдневная адаптация клеток НТ22 к неповреждающим воздействиям Н202 достоверно защитила их от сильного оксидативного стресса повышением индукции Н8Р70 в 15,21 ±0,18% по сравнению с клетками, которые подвергались воздействию только оксидативного стресса без предварительной адаптации. Однако, несмотря на наличие защитного эффекта адаптации, видно, что уровень индукции ШР70 в клетках, которые были предварительно адаптированы, а затем подвергнуты действию сильного оксидативного стресса, ниже, чем в контроле. Тем не менее, эти результаты могут свидетельствовать о роли Н8Р70 в защитном эффекте адаптации к Н202 и объяснять выживаемость клеток при воздействии мощного оксидативного стрессора.

Таким образом, активация синтеза ШР70 является важным механизмом адаптационной защиты нейронов на клеточном уровне.

а).

Т •! ТГЛТП а лл^

б).

8,00 7,006,00. 5,004,00 ■ 3,002,001,000,00--

Рис. 7. Влияние адаптации к неповреждающим воздействиям Н2О2 на синтез НБР70 в клетках линии НТ22.

а). Репрезентативная электрофореграмма накопления ШР70 в клетках линии НТ22. 3 - маркер НБР70; 4 - маркер МБР32; 5,6- контроли; 7,8 - однократное воздействие 3 мкМ Н202; 9,10 - трехдневная адаптация к 3 мкМ Н2О2; 11,12 - трехдневная адаптация к 3 мкМ Н202 + оксидативный стресс, вызванный 1,5 мМ Н202; 13,14 - оксидативный стресс, вызванный 1,5 мМ Н202.

б). Диаграмма, показывающая уровень НБР70 в клетках линии НТ22 (данные представлены в виде относительных денситометрических единиц, представляющих произведение площади сигнала на интенсивность). 1 -контроль; 2 - однократное воздействие 3 мкМ Н202; 3 - трехдневная адаптация к 3 мкМ Н2О2; 4 - оксидативный стресс, вызванный 1,5 мМ Н2О2; 5 - трехдневная адаптация к 3 мкМ Н202 + оксидативный стресс, вызванный 1,5 мМ Н2С>2. * - Р < 0,01 по сравнению с контролем, соответственно представлению на графике от контроля; ** - Р < 0,01 по сравнению с оксидатшным стрессом.

Ингибитор синтеза белков теплового шока, кверцетин, устраняет защитный эффект адаптации нейронов к Н202

Для оценки возможного вклада НЭРб в развитие защитного эффекта адаптации к Н202 был использован блокатор синтеза НБРэ, кверцетин (НоБока\уа е1 а1., 1992; Уи, 2000; Хи ^ а]., 2004), в дозе 50 мкМ. На рисунке 8 представлены данные по влиянию кверцетина на защитный эффект адаптации к Н202 по тесту МТТ-редуктазной активности, то есть на выживаемость клеток. Видно, что трехдневное введение кверцетина в указанной дозе не повлияло на МТТ-редуктазную активность неадаптированных клеток, то есть клеток в контроле. Из рисунка 8 следует, что доза кверцетина 50 мкМ полностью отменяла защитный эффект адаптации и, таким образом, способствовала увеличению гибели клеток. Если оксидативное повреждение, вызванное воздействием 600 мкМ Н202,

□ без кверцетина ■ с кверцетином

120

Рис.8. Влияние кверцетина на защитный эффект адаптации к Н202 при повреждении оксидативным стрессом в клетках линии НТ22.

1 - контроль, 2 - трехдневная адаптация к 3 мкМ Н202, 3 -оксидативный стресс, вызванный 600 мкМ Н202, 4 - трехдневная адаптация к 3 мкМ Н202 + оксидативный стресс, вызванный 600 мкМ Н202. * - Р < 0,001 по сравнению с контролем; **-/>< 0,001 по сравнению с оксидативным стрессом; ' - Р < 0,02 по сравнению с контролем; " - Р < 0,001 и Р < 0,01 по сравнению с контролем и оксидативным стрессом, соответственно.

приводило к снижению выживаемости клеток на 20±1,78% от контроля, то в серии с предварительной адаптацией перед воздействием оксидативного стресса выживаемость клеток достоверно была более низкой и уменьшалась на 42,3±0,99% относительно контрольных клеток. В то же время, данные экспериментов, проведенных без участия кверцетина, демонстрируют ярко выраженный защитный эффект адаптации к Н202 клеток НТ22 на их выживаемость (рис. 4, 5 и 8).

Таким образом, полученные данные подтверждают роль НБРб в развитии защитного эффекта адаптации к Н202 на уровне изолированных клеток вне нейрогуморальных влияний.

В целом, адаптационная защита от оксидативного стресса подтверждает существование прямых защитных эффектов адаптации клеток. В частности, на нервных клетках гиппокампа мыши НТ22 адаптационная защита от оксидативного стресса, вызванного 600 мкМ и 1,5 мМ Н202, составила практически 100 и 50%, соответственно. Это согласуется с представлениями о прямых эффектах адаптации организма (Меерсон, 1993а) и свидетельствует о возможности формирования адаптации на уровне клеток без участия нейроэндокринных факторов.

Данные об участии ШР70 в защите от воздействий тяжелого оксидативного стресса на клеточном уровне согласуются с данными литературы относительно роли ГОР70 в защите от оксидативного стресса, сопровождающего нейродегенеративные нарушения на уровне целого организма (НоэБкг е1 а1., 2004; Уепап е1 а1., 2005).

выводы

1. Предварительная адаптация к гипобарической гипоксии предупреждает нарушение когнитивных функций у крыс линии Вистар, вызванное введением токсичного фрагмента Ар.

2. Один из механизмов защитного действия адаптации к гипоксии на когнитивную функцию у крыс линии Вистар при экспериментальном моделировании болезни Альцгеймера может быть связан с ограничением оксидативного стресса в гиппокампе.

3. Крысы линии Август, обладающие более высокой устойчивостью к острому эмоциональному стрессу, по сравнению с крысами линии Вистар, также более устойчивы к развитию нейродегенеративного процесса, вызванного введением Ар, по показателям поведенческих реакций в тестах "условный рефлекс пассивного избегания" и "открытое поле" и по уровню интенсивности свободнорадикального окисления в структурах мозга.

4. В культуре клеток гиппокампа мыши НТ22 по мере снижения действующей на клетки концентрации Н202 и увеличения количества воздействий происходит переход клеточного ответа с феномена прекондиционирования в феномен адаптации.

5. Предварительная адаптация культуры нервных клеток гиппокампа мыши НТ22 к умеренным воздействиям Н202 приводит к повышению их устойчивости к последующему оксидативному стрессу. Такая адаптационная защита проявляется в ограничении падения метаболической активности клеток и снижении уровня маркера оксидативного стресса, Н8Р32.

6. Активация синтеза Н8Р70 является важным механизмом адаптационной защиты нейронов на уровне культуры клеток от повреждающих воздействий, вызванных оксидативным стрессом.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1 .Malyshev I.Yu., Goryacheva A.V., Khomenko I.P., Kruglov S.V., Mashina S.Yu., Pokidyshev D.A., Popkova E.V., Pshennikova M.G., Vlasova M.A., Zelenina O.M., Manukhina E.B. Prospects for using adaptation to hypoxia in Alzheimer's disease. // Proceeding of the fifth international conference "Hypoxia in medicine". - Hypoxia Medical J. - 2003 - No. 3. - P. 15.

2.Хоменко И.П., Горячева A.B., Попкова E.B., Пшенникова М.Г., Покидышев Д.А., Машина С.Ю., Манухина Е.Б., Малышев И.Ю. Адаптация к гипоксии ограничивает снижение продукции NO и оксидативный стресс при экспериментальной болезни Альцгеймера. // XIX съезд физиологического общества им. И.П. Павлова. Российский физиологический журнал имени И.М. Сеченова. - 2004. - Т.90. - №8.-С.247.

3.Манухина Е.Б., Машина С.Ю., Покидышев Д.А., Горячева А.В., Хоменко И.П., Малышев И.Ю. Роль нарушений продукции оксида азота в развитии болезни Альцгеймера: возможность немедикаментозной профилактики. // XIX съезд физиологического общества им. И.П. Павлова. Российский физиологический журнал имени И.М. Сеченова. - 2004. - Т.90. - №8.- С.487.

4.Манухина Е.Б., Виегант Ф., Торшин В.И., Горячева А.В., Хоменко И.П., Круглое С.В., Машина С.Ю., Покидышев Д.А., Попкова Е.В., Пшенникова М.Г., Власова М.А., Зеленина О.М., Малышев И.Ю. Перспективы применения немедикаментозных подходов при болезни Альцгеймера. // Известия АН. Серия биологическая. - 2004. - №4. -С.465-480.

5.Манухина Е.Б., Машина С.Ю., Покидышев Д.А., Горячева А.В., Хоменко И.П., Малышев И.Ю. Роль гиперпродукции и дефицита оксида азота в болезни Альцгеймера. // Дисфункция эндотелия: экспериментальные и клинические исследования. - Витебск, ВГМУ. -2004.-С. 15-25.

6.Manukhina Е.В., Wiegant F.A.C., Goryacheva A.V., Khomenko I.P., Kruglov S.V., Mashina S.Yu., Pokidyshev D.A., Popkova E.V., Pshennikova M.G., Vlasova M.A., Zelenina O.M. Malyshev I.Yu. Prospects for using methods of adaptive medicine in Alzheimer's disease. // Adaptation Biology and Medicine. V.4. / Current Concepts. Eds., P.K. Singal, N. Takeda. Narosa Publishing House. - New Delhi. -2004. - P.204-226.

7.Manukhina E.B., Mashina S.Yu., Torshin V.I., Goryacheva A.V., Khomenko I.P. , Kruglov S.V., Pokidyshev D.A. , Popkova E.V., Pshennikova M.G., Vlasova V.F., Zelenina O.M., Malyshev I.Yu. Can adaptation to hypoxia help combating Alzheimer's disease? // Hypoxia Medical J. - 2004 - V.12 (1-2). - P.2-14.

8.Пшенникова М.Г., Попкова E.B., Хоменко И.П., Манухина Е.Б., Горячева А.В., Машина С.Ю., Покидышев Д.А., Малышев И.Ю. Сопоставление устойчивости к нейродегенеративному повреждению

мозга у крыс линии Август и популяции Вистар. // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. - 2005. - Т. 139. - №5. -С.491-494.

9.Пшенникова М.Г., Попкова Е.В., Хоменко И.П., Покидышев Д.А., Манухина Е.Б., Горячева A.B., Машина С.Ю., Малышев И.Ю. Перекисное окисление липидов и нарушение когнитивных функций при нейродегенеративном повреждении мозга у крыс линии Август и Вистар, обладающих разной устойчивостью к стрессорным повреждениям. // Сборник трудов 4-ой национальной научно-практической конференции с международным участием "Активные формы кислорода, оксид азота, антиоксиданты и здоровье человека". -Смоленск, 2005. - С.292-294.

Ю.Пшенникова М.Г., Попкова Е.В., Хоменко И.П., Покидышев Д.А., Зеленина О.М., Манухина Е.Б., Круглов C.B., Горячева A.B., Малышев И.Ю. Влияние адаптации к гипоксии на устойчивость к нейродегенеративному повреждению мозга у крыс линии Август и Вистар. // Материалы Четвертой Российской конференции "Гипоксия: механизмы, адаптация, коррекция". - М., 2005. - С.94-95.

ll.Malyshev I.Yu., Wiegant F.A.C., Mashina S.Yu., Torshin V.l., Goryacheva A.V., Khomenko I.P., Kruglov S.V., Pokidyshev D.A., Popkova E.V., Pshennikova M.G., Vlasova M.A., Zelenina O.M., Manukhina E.B. Possible use of adaptation to hypoxia in Alzheimer's disease: a hypothesis. // Med. Sei. Monit. -2005. - V.l 1. -N.8: HY31-38.

Заказ № 192/03/06 Подписано в печать 27.03.2006 Тираж 120 экз. Усл. пл. 1

ООО "Цифровичок", тел. (495) 797-75-76; (495) 778-22-20 www.cfr.ru; е-тай:т/о@с/г.ги

/effyf

№116 2 5

Оглавление диссертации Хоменко, Инна Петровна :: 2006 :: Москва

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Болезнь Альцгеймера и медикаментозная терапия.

1.2. Нейротоксические механизмы действия Р-амилоидного пептида: накопление свободных радикалов, изменение кальциевого гомеостаза и воспалительный ответ.

1.2.1. Накопление свободных радикалов.

1.2.2. Изменение кальциевого гомеостаза.

1.2.3. Воспалительный ответ.

1.2.4. Активация сигнальных путей.

1.3. Белки теплового шока и их роль в защите мозга от нейродегенерации.

1.4. Адаптация к факторам среды и перспективы немедикаментозной терапии и профилактика БА.

1.4.1. Адаптация к гипоксии.

1.4.2. Прекондиционирование и адаптация к оксидативному стрессу.

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

2.1. Эксперименты на животных.

2.1.1. Адаптация к периодической гипобарической гипоксии.

2.1.2. Моделирование нейродегенеративного процесса.

2.1.3. Поведенческие тесты.

2.1.3.1.Условный рефлекс пассивного избегания (УРПИ).

2.1.3.2. Тест экстраполяционного избавления (ТЭИ).

2.1.3.3. Тест "открытое поле".

2.1.4. Забор и хранение тканей отделов мозга.

2.1.5.Определение содержания вторичных продуктов перекисного окисления липидов в гомогенатах структур головного мозга крыс.

2.2. Эксперименты на культуре клеток.

2.2.1. Процедура выращивания и пересадки клеток.

2.2.2.Повреждение клеток оксидативным стрессом и измерение их метаболической активности (МТТ-тест).

2.2.3. Адаптация клеток к неповреждающим воздействиям оксидативного стресса.

2.2.4.Оценка содержания белков теплового шока (Вестерн-блот анализ).

2.2.5. Ингибирование синтеза белков теплового шока.

2.3. Статистическая обработка данных.

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

3.1. Адаптация к гипоксии предупреждает нарушение когнитивных функций, вызванное введением Р-амилоида, у крыс линии Вистар.

3.2. Адаптация к гипоксии ограничивает оксидативный стресс в гиппокампе, вызванный введением Р-амилоида, у крыс линии Вистар.

3.3. Различия в устойчивости крыс Вистар и Август к нейродегенеративному повреждению мозга.

3.4. Прекондиционирование и адаптация к Н2О2 защищают изолированные нейроны от гибели, вызванной последующим воздействием оксидативного стресса.

3.5. Белки теплового шока вовлечены в адаптационную защиту нейронов от оксидативного повреждения.

3.6. Ингибитор синтеза белков теплового шока, кверцетин, устраняет защитный эффект адаптации нейронов к Н2О2.

3.7. Обсуждение результатов.

ВЫВОДЫ.

Введение диссертации по теме "Патологическая физиология", Хоменко, Инна Петровна, автореферат

Актуальность исследования

Старение является главным фактором риска нейродегенеративных нарушений, таких как болезнь Альцгеймера (БА), Паркинсона, и число людей с этими тяжелыми состояниями быстро увеличивается. БА представляет собой главную причину слабоумия и поражает некоторых людей уже в сорока- и пятидесятилетнем возрасте со всем специфическим сочетанием клинических и патологических признаков. Это заболевание убивает сотни тысяч человек в год (Вуртман, 1985; Reiman et al., 2004). По приблизительным оценкам демографического прогноза Организации Объединенных Наций, число людей старше 80 лет в 2050 году приблизится к 370 млн (Suh, Checler, 2002). В настоящее время известно, что 50% людей старше 85 лет страдают болезнью Альцгеймера. Следовательно, если данная статистика верна, то менее чем через 50 лет свыше 100 миллионов человек во всем мире будут поражены слабоумием и потребуют огромных затрат на лечение и уход (Suh, Checler, 2002; Di et al., 2005).

Это заболевание, впервые описанное немецким невропатологом Алоисом Альцгеймером в 1906 г. и названное его именем, по-прежнему является неразгаданной загадкой, поскольку до сих пор неизвестны средства, способные остановить безжалостное течение этой болезни. Различные фармацевтические препараты, применяемые для профилактики и лечения БА, как правило, обладают весьма ограниченными возможностями и большим количеством побочных эффектов. Поэтому серьезное внимание в настоящее время уделяется средствам, которые могли бы повысить адаптивный потенциал и мобилизовать защитные системы организма. Вместе с тем сейчас становится все более очевидным, что долгое время после начала БА ее развитие сдерживается эндогенными системами защиты мозга, которые включают антиоксидантную систему, систему белков теплового шока (HSPs), оксида азота (NO) и другие так называемые стресс-лимитирующие системы (Meerson, 1984; Malyshev, Manukhina, 1999; Манухина, Малышев, 2000).

Таким образом, факторы, активирующие эндогенные защитные системы, могут оказывать нейропротекторное действие. Эффективным альтернативным способом стимулирования эндогенной защиты организма, которое может составить альтернативу медикаментозной терапии, является адаптация организма к умеренному, дозированному воздействию факторов окружающей среды, таких как гипоксия, стресс, тепло, физическая нагрузка и т.д. (Меерсон и др. 1993а). Известно, что ключевая роль в формировании адаптационной защиты принадлежит активации синтеза стресс-белков (HSPs), которые в настоящее время считаются важным компонентом внутриклеточной протекторной системы, обладающей адаптогенными, антиоксидантными, цитопротекторными и антиапоптотическими свойствами (Манухина, Малышев, 2000; Malyshev, Manukhina, 1999; Meerson et al., 1992).

В соответствии с вышеизложенным, цель настоящего исследования состояла в изучении возможности нефармакологической адаптационной защиты мозга и определении роли HSPs в эндогенных нейропротекторных механизмах, формирующихся на уровне клеток и целого организма.

В рамках поставленной цели решались следующие основные задачи:

5. Изучить возможную роль HSPs в нейропротекторном эффекте адаптации in vitro.

Научная новизна исследования определяется следующими основными результатами.

Разработана модель дозированной адаптации культуры нейронов гиппокампа к неповреждающему оксидативному стрессу, обладающая защитным эффектом. Таким образом, впервые установлено, что адаптационная защита может формироваться на уровне изолированных нервных клеток в отсутствие нейрогуморальных факторов.

Впервые установлено, что один из механизмов адаптации нейронов гиппокампа к неповреждающему оксидативному стрессу связан с увеличением синтеза HSP70.

Положения, выносимые на защиту:

4. Стресс-белки HSP70 вовлечены в формирование адаптационной защиты на клеточном уровне.

Апробация работы

Международной конференции "Активные формы кислорода, оксид азота, антиоксиданты и здоровье человека" (Смоленск, 2003), XIX съезде физиологического общества им. И.П. Павлова (Екатеринбург, 2004), III Российском конгрессе по патофизиологии (Москва, 2004), научной конференции "Нейрохимия: фундаментальные и прикладные аспекты" (Москва, 2005), 4-ой Национальной научно-практической конференции с международным участием "Активные формы кислорода, оксид азота, антиоксиданты и здоровье человека" (Смоленск, 2005), 4-ой Российской конференции с международным участием "Гипоксия: механизмы, адаптация, коррекция" (Москва, 2005). На III Российском конгрессе по патофизиологии (Москва, 2004) был получен диплом за лучшую научную работу "Конкурса молодых ученых".

Заключение диссертационного исследования на тему "Адаптационная защита мозга от оксидативного повреждения при экспериментальной модели болезни Альцгеймера"

выводы

4. В культуре клеток гиппокампа мыши НТ22 по мере снижения действующей на клетки концентрации Н202 и увеличению количества воздействий происходит переход клеточного ответа с феномена прекондиционирования в феномен адаптации.

5. Предварительная адаптация культуры нервных клеток гиппокампа мыши НТ22 к умеренным воздействиям Н2Ог приводит к повышению их устойчивости к последующему оксидативному стрессу. Такая адаптационная защита проявляется в ограничении падения метаболической активности клеток и снижении уровня маркера оксидативного стресса, HSP32.

6. Активация синтеза HSP70 является важным механизмом адаптационной защиты нейронов на уровне культуры клеток от повреждающих воздействий, вызванных оксидативным стрессом.

Список использованной литературы по медицине, диссертация 2006 года, Хоменко, Инна Петровна

1. Белкина Л.М., Салтыкова В.А., Пшенникова М.Г. Генетически обусловленные различия в устойчивости к инфаркту миокарда у крыс Вистар и линии Август. // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. 2001. - Т. 131. - №6. - С. 624-628.

2. Белых А.Г., Гукасов В.М., Чукаев С.А. Состояние системы свободнорадикального окисления при нормобарической гипоксии. // Физиологический журнал. 1992. - Т.38. - С. 73-76.

3. Болдырев А.А. Роль активных форм кислорода в жизнедеятельности нейрона. // Успехи физиологических наук. 2003. - Т.34. - № 3. — С. 2134.

4. Буреш Я., Бурешова О., Хьюстон Д.П. Методики и основные эксперименты по изучению мозга и поведения. // М.: Высшая школа. Пер. с англ. Живописцевой Е. Н.; под ред. (и с предисл.) Батуева А. С. 1991. — 399 С.

5. Вуртман Р. Дж. Болезнь Альцгеймера. // В мире науки. 1985. - № 3. - С. 20-29.

6. Гаврилова С.И. Болезнь Альцгеймера (деменция альцгеймеровского типа). // Нейродегенеративные болезни и старение. / Ред. Завалишин И.А., Яхно Н.Н., Гаврилова С.И. М. 2001. - С. 10-122.

7. Ельчанинова С. А., Кореняк Н.А., Смагина И.В., Пинегин JT.E., Варшавский Б.Я. Прерывистая гипоксия в лечении дисциркуляторной энцефалопатии. // Журнал неврологии и психиатрии им. С.С. Корсакова.- 2002. Т.102. - С. 29-32.

8. Круглов С.В. Влияние адаптации к теплу на апоптоз в тимусе. // Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук. М. 2005. - 24С.

9. Лямина Н.П., Сенчихин В.Н., Покидышев Д. А., Манухина Е.Б. Нарушение продукции NO у мужчин молодого возраста с артериальной гипертензией и немедикаментозный метод ее коррекции. // Кардиология.- 2001. № 9. - С. 17-21.

10. Манухина Е.Б., Малышев И.Ю. Роль оксида азота в сердечно-сосудистой системе: взгляд патофизиолога. // Российский кардиологический журнал. -2000.-№ 5-С. 55-63.

11. Манухина Е.Б., Малышев И.Ю. Стресс-лимитирующая система оксида азота // Российский физиологический журнал им. И.М. Сеченова. 2000. -Т.86.-№ 10.-С. 1283-1292.

12. Меерсон Ф.З. Адаптационная медицина: механизмы и защитные эффекты адаптации. М.: Hypoxia Medical LTD 1993а.

13. Меерсон Ф.З. Концепция долговременной адаптации. // М. Дело. -19936,- 138 С.

14. Меерсон Ф.З. Патогенез и предупреждение стрессорных и ишемических повреждений сердца. // М.: Медицина. 1984.

15. Меерсон Ф.З., Архипенко Ю.В., Рожицкая И.И., Диденко В.В., Сазонтова Т.Г. Противоположное действие на антиоксидантные ферменты адаптации к непрерывной и периодической гипоксии. // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. 1992.-Т.114.-С. 14-15.

16. Монастырская Е.А. Механизмы защитных эффектов адаптации к теплу при различных типах гибели клеток. // Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук. М. 2003. - 23 С.

17. Монастырская Е.А., Дучен М.Р., Андреева Л.В., Виегант Ф., Манухина Е.Б., Малышев И.Ю. Антиапоптотический эффект адаптации к теплу в культуре клеток. // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. 2003. - Т.135. - №2. - С. 143-146.

18. Пшенникова М.Г. Врожденная эффективность стресс-лимитирующих систем, как фактор устойчивости к стрессорным повреждениям. // Успехи физиологических наук. 2003. - Т.34. - №3. - С. 55-67.

19. Яхно Н.Н., Преображенская И.С. Болезнь Альцгеймера: патогенез, клиника, лечение. // Русский медицинский журнал. 2002. - Т. 10. - № 25. -С. 1143-1148.

20. Abramov AY, Canevari L, and Duchen MR. Amyloid peptides induce mitochondrial dysfunction and oxidative stress in astrocytes and death of neurons through activation of NADPH oxidase. // J. Neuroscience. 2004. -V. 24.-No. 2.-P. 565-575.

21. Abramov AY, Canevari L, Duchen MR. Changes in Ca2+.c and glutathione in astrocytes as the primary mechanism of amyloid neurotoxicity. // J. Neuroscience. 2003. - V.23. - P. 5088-5095.

22. Abravaya K., Myers M.P., Murphy S.P. and Morimoto R.I. The human heat shock protein hsp70 interacts with HSF, the transcription factor that regulates heat shock gene expression. // Genes Dev. 1992. — No.6. — P. 1153-1164.

23. Addae J.I., Youssef F.F., Stone T.W. Neuroprotective role of learning in dementia: a biological explanation. // J. Alzheimer's Dis. 2003. - V.5. - P. 91-104.

24. Ahlemeyer В., Krieglstein J. Pharmacological studies supporting the therapeutic use of Ginkgo biloba extract for Alzheimer's disease. // Pharmacopsychiatry. 2003. - V.36. Suppl. 1. - P. S8-S14.

25. Ashkenazi A., Dixit V.M. Death receptor: signaling and modulation. // Science.- 1998.-V.281.-P. 1305-1308.

26. Ashley-Koch A.E, Shao Y, Rimmler J.B, Gaskell P.C, Welsh-Bohmer K.A, Jackson C.E, Scott W.K, Haines J.L, Pericak-Vance M.A. An autosomal genomic screen for dementia in an extended Amish family. // Neuroscience Letters. 2005. - V.379. - P. 199-204.

27. Atwood C, Moir R, Huang X, et al. Dramatic aggregation of Alzheimer abeta by Cu(II) is induced by conditions representing physiological acidosis. // J. Biol. Chem.- 1998.-V.273.-P. 12817-12826.

28. Auwera van der I., Wera S., Leuven van F., and Henderson ST. A ketogenic diet reduces amyloid beta 40 and 42 in a mouse model of Alzheimer's disease. // Nutr Metab (Lond). 2005. - V.2:28.

29. Bartolomeo AC., Morris H., and Boast CA. Arecoline via miniosmotic pump improves AF64A-impaired radial maze performance in rats: a possible model of Alzheimer's disease. // Neurobiology of Learning and Memory. 1997. -V.68. - Issue 3. - P. 333-342.

30. Behl C, Davis J, Cole GM, and Schubert D. Vitamin E protects nerve cells from amyloid beta protein toxicity. // Biochem. Biophys. Res. Commun. -1992. V.186. - P.944-950.

31. Behl C, Davis J.B, Lesley R, and Schubert D. Hydrogen peroxide mediates amyloid p protein toxicity. // Cell. 1994. - V.77. - P.817-827.

32. Behl C, Widmann M, Trapp T, Holsboer F. 17-Beta estradiol protects neurons from oxidative stress-induced cell death in vitro. // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1995. - V.216. - P. 473-782.

33. Bence NF., Sampat RM., Kopito RR. Impairment of the ubiquitin-proteasome system by protein aggregation. // Science. 2001. - V.292. -P. 1552-1555.

34. Benjamin IJ, and McMillan DR. Stress (heat shock) proteins: molecular chaperones in cardiovascular biology and disease. // Circ. Res. 1998. - V. 83. -P. 117-132.

35. Berg L., McKee D.W., Miller J.P. et al. Neuropathological indices of Alzheimer's disease in demented and nondemented persons aged 80 years and older//Arch. Neurol. 1993.-Vol. 50. - P. 34-358.

36. Berghmans R.L. Anti-Alzheimer drugs: ethical aspects of research and practice. // Tijdschr. Gerontol. Geriatr. 2000. - V.31. - P. 100-106.

37. Bi H., Sze CI. N-methyl-D-aspartate receptor subunit NR2A and NR2B messenger RNA levels are altered in the hippocampus and entorhinal cortex in Alzheimer's disease. // J. Neurol. Sci. 2002. - V. 200. - No. 1-2. - P.l 1-8.

38. Bitan G, Kirkitadze MD, Lomakin A, Vollers SS, Benedek GB, Teplow DB. Amyloid р-protein (Ap) assembly: Ap40 and Ap42 oligomerize through distinct pathways. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2003. - V.100. - No. 1. - P. 330-335.

39. Blacker D, Wilcox MA, Laird NM, Rodes L, Horvath SM, Go RC, Perry R, Watson BJr, Bassett SS, Mclnnis MG et al. Alpha-2 macroglobulin is genetically associated with Alzheimer disease. // Nat. Genet. 1998. - V. 19. -P. 357-360.

40. Blennow K. Cerebrospinal fluid protein biomarkers for Alzheimer's disease. // NeuroRx. -2004. V.l. -No.2. - P. 213-225.

41. Blond-Elguindi S, Cwirla, S.E, Dower W.J, Lipshutz, R.J, Sprang S.R, Sambrook J.F, and Gething M.J. Affinity panning of a library of peptides displayed on bacteriophages reveals the binding specificity of BiP. // Cell. -1993.-No.75.-P. 717-728.

42. Bolli R. The late phase of preconditioning. // Circ. Res. 2000. - V.87. - P. 972-983.

43. Braak H., Braak E. Evolution of the neuropathology of Alzheimer's disease // Acta Neurol. Scand. (Suppl.) 1996. - Vol. 165. - P. 3-12.

44. Bradford M.M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein using the principle of protein binding. // Analyt. Biochem. 1976. - V.72. - P. 248-254.

45. Calabrese V, Bates ТЕ, Stella AM. NO synthase and NO-dependent signal pathways in brain aging and neurodegenerative disorders: the role of oxidant/antioxidant balance. // Neurochem. Res. 2000. - V.25. - No.9-10. -P. 1315-1341.

46. Cande C., Cohen I., Daugas E., Ravagnan L., Larochette N., Zamzami N., Kroemer G. Apoptosis-inducing factor (AIF): a novel caspase-independent death effector released from mitochondria. // Biochimie. 2002. - V.84. - P. 215-222.

47. Cardinali D.P., Brusco L.I., Liberczuk C., Furio A.M. The use of melatonin in Alzheimer's disease. // Neuroendocrinol. Lett. 2002. - Suppl. 1. - P. 20-23.

48. Chen Z-H, Yoshida Y, Saito Y, and Niki E. Adaptation to hydrogen peroxide enhances PC 12 cell tolerance against oxidative damage. // Neuroscience Letters. 2005. - V.383. - No.3. - P. 256-259.

49. Chiang H.L., Terlecky S.R., Plant C.P., Dice J.F. A role for a 70-kilodalton heat shock protein in lysosomal degradation of intracellular proteins. // Science. 1989. - V.20. - No.246 (4928). - P.382-385.

50. Chodzko-Zajko WJ, Moore KA. Physical fitness and cognitive functioning in aging. // Exerc. Sport Sci. Rev. 1994. -V. 22. - P. 195-220.

51. Choi J, Liu R-M and Forman HJ. Adaptation to oxidative stress: Quinone-mediated protection of signaling in rat lung epithelial L2 cells. // Biochemical Pharmacology. 1997.-V.53.-No.7.-P. 987-993.

52. Chopp M, Chen H, Ho KL, Dereski MO, Brown E, Hetzel FW, Welch KM. Transient hyperthermia protects against subsequent forebrain ischemic cell damage in the rat.//Neurology. 1989. - V.39. - P. 1396-1398.

53. D'Alessio J, Ashley R. Highly sensitive enhanced chemiluminescence immunodetection method for herpes simplex virus type 2 Western immunoblot. //J. Clin. Microbiol. 1992. -V.30. -No.4. - P. 1005-1007.

54. D'Andrea M.R., Nagele R.G., Wang H.Y., Peterson P.A., Lee D.H. Evidence that neurons accumulating amyloid can undergo lysis to form amyloid plaques in Alzheimer's disease. // Histopathology. 2001. - V.38. - P. 120-134.

55. Dodd P.R. Excited to death: different ways to lose your neurons. // Biogerontology. 2002. - V.3. - P. 51-56.

56. Dou F, Netzer WJ, Takashima A, and Xu H. Heat shock proteins reduce aggregation and facilitate degradation of tau protein. // International Congress Series. 2003a. - V.1252. - P. 383-393.

57. Dou F, Netzer WJ, Tanemura K, Li F, Hartl FU, Takashima A, Gouras GK, Greengard P, Xu H. Chaperones increase association of tau protein withmicrotubules. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 20036. - V.100. - No.2. - P. 721-726.

58. Duering M, Grimm M.O.W, Grimm HS, Schroder J, Hartmann T. Mean age of onset in familial Alzheimer's disease is determined by amyloid beta 42. // Neurobiology of Aging. 2005. - V.26. - P. 785-788.

59. Enz A, Amstutz R, Boddeke H, Gmelin G, and Malanowski J. Brain selective inhibition of acetylcholinesterase: a novel approach to therapy for Alzheimer's disease. // Prog. Brain Res. 1993. - V.98. - P. 431-438.

60. Etcheberrigaray R, and Bhagavan S. Ionic and signal Transduction alterations in Alzheimer's disease. // Molecular Neurobiology. 1999. - V.20. - P. 93109.

61. Fan R. and Tenner AJ. Differential regulation of Ap42-induced neuronal Clq synthesis and microglial activation. // J. Neuroinflammation. 2005. - 2:1.

62. Fonte V, Kapulkin V, Taft A, Fluet A, Friedman D, Link CD. Interaction of intracellular beta amyloid peptide with chaperone proteins. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2002. - V.99. - No. 14. - P. 9439-9444.

63. Gabai V.L., Meriin A.B., Yaglom J.A., Volloch V.Z., Sherman M.Y. Role of Hsp70 in regulation of stress-kinase JNK: implications in apoptosis and aging. // FEBS Lett. 1998. - V.438. - P. 1-4.

64. Gearing M., Mirra S.S., Hedreen J.C. et al. The Consortium to Establish a Registry of Alzheimer's Disease (CERAD). Pt. X. Neuropathology confirmation of the clinical diagnosis of Alzheimer's disease // Neurology, -1995.-Vol. 45.-P. 461-466.

65. Getchell T.V., Krishna N.S., Dhooper N., Sparks D.L., Getchell M.L. Human olfactory receptor neurons express heat shock protein 70: age-related trends. // Ann. Otol. Rhinol. Laryngol. 1995. - V. 104. - P.47-50.

66. Glenner GG. and Wong CW. Alzheimer's disease and Down's syndrome: sharing of a unique cerebrovascular amyloid fibril protein. // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1984. - V.122. - P. 1131-1135.

67. Halverson K, Fraser P, Kirschner D, and Lansbury PT Jr. Molecular determinants of amyloid deposition in Alzheimer's disease: conformational studies of synthetic beta-protein fragments. // Biochemistry. 1990. - V.29. -P. 2639-2644.

68. Ham D., Schipper H.M. Heme oxygenase-1 induction and mitochondrial iron sequestration in astroglia exposed to amyloid peptides. // Cell. Mol. Biol. — 2000.- V.46.-P. 587-596.

69. Heilbronn E. Inhibition of cholinesterases by tetrahydroaminacrine. // Acta Chem. Scand.- 1961.-V.13.-P. 1386-1390.

70. Heininger K. A unifying hypothesis of Alzheimer's disease. IV. Causation and sequence of events. // Rev. Neuroscience. 2000. - V.l 1. - P. 213-328.

71. Hensley K, Hall N, Subramaniam R, Cole P, Harris M, Aksenov M, Markesbery WR, and Butterfield DA. Brain regional correspondence between Alzheimer's disease histopathology and biomarkers of protein oxidation. // J. Neurochem.- 1995.-V.65.-P. 2146-2156.

72. Hightower L.E. Heat shock, stress proteins, chaperones, and proteotoxicity. // Cell. 1991. - V.66. - P. 191-197.

73. Hosokawa N., Hirayoshi K., Kudo H., Takechi H., Aoike A., Kawai K., and Nagata K. Inhibition of the activation of heat shock factor in vivo and in vitro by flavonoids. //Mol. Cell. Biol. 1992. - V.12. -P.3490-3498.

74. Hosokawa N., Hirayoshi K., Nakai K., Hosckawa Y., Marui N., Yoshida M., Sakai Т., Nishiro H., Aoike A., Kawai K., and Nagata K. Flavonoids inhibit the expression of heat shock proteins. // Cell Struct. Funct. 1990. - V.15. -P.393-401.

75. Howes M-J.R. and Houghton P.J. Plants used in Chinese and Indian traditional medicine for improvement of memory and cognitive function. // Pharmacology, Biochemistry and Behavior. 2003. - V.75. - P. 513-527.

76. Huang H-M, Zhang H, Ou H-C, Chen H-L, and Gibson GE. a-Keto-p-methyl-n-valeric acid diminishes reactive oxygen species and alters endoplasmic1. Л Ireticulum Ca stores. // Free Radical Biology & Medicine. 2004. - V.37. -No.ll.-P. 1779-1789.

77. Ishikawa K, Navab M, Leitinger N, Fogelman A.M. and Lusis A.J. Induction of heme oxygenase-1 inhibits the monocyte transmigration induced by mildly oxidized LDL. // J. Clin. Invest. 1997. - V.100. -No.5. - P. 1209-1216.

78. Jarrett SG. and Boulton ME. Antioxidant up-regulation and increased nuclear DNA protection play key roles in adaptation to oxidative stress in epithelial cells. // Free Radical Biology and Medicine. 2005. - V.38. - No. 10. - P. 1382-1391.

79. Johnson G., Refolo L.M., Wallace W. Heat-shocked neuronal PC 12 cells reveal Alzheimer's disease-associated alterations in amyloid precursor protein and tau. // Ann. N.Y. Acad. Sci. 1993. - V.695. - P. 194-197.

80. Kametani F. Secretion of long Ар-related peptides processed at e-cleavage site is dependent on the a-secretase pre-cutting. // FEBS Letters. 2004. - V.570 - Issues 1-3. - P. 73-76.

81. Kar S, Slowikowski SP, Westaway D, Mount HT. Interactions between amyloid and central cholinergic neurons: implications for Alzheimer's disease. // J. Psychiatry Neuroscience. 2004. - V.29. - No.6. - P. 427-441.

82. Kim DK, Cho ES, Lee BR, and Um H-D. NF-кВ mediates the adaptation of human U937 cells to hydrogen peroxide. // Free Radical Biology and Medicine.-2001.-V.30.-No.5.-P. 563-571.

83. Kirby BA, Merril CR, Ghanbari H, Wallace WC. Heat shock proteins protect against stress-related phosphorylation of tau in neuronal PC 12 cells that have acquired thermotolerance. //J. Neuroscience. 1994. - V.14. - P. 5687-5693.

84. Klein JA, and Ackerman SL. Oxidative stress, cell cycle, and neurodegeneration. //J. Clin. Invest. 2003. - V.l 11. - No.6. - P. 785-793.

85. Klein SD and Brune B. Heat-shock protein 70 attenuates nitric oxide-induced apoptosis in RAW macrophages by preventing cytochrome с release. // J. Biochem. 2002. - V.362. - No.(Pt 3). - P. 635-641.

86. Kluck R.M., Bossy-Wetzel E., Green D.R., Newmeyer D.D. Mitochondrial control of apoptosis: the role of cytochrome c. // Science. — 1997. — V.275. — P. 1132-1143.

87. Kontush A. Amyloid-beta: an antioxidant that becomes a prooxidant and critically contributes to Alzheimer's disease. // Free Radic. Biol. Med. 2001. -V.31.-P. 1120-1131.

88. Kudva YC, Hiddinga HJ, Butler PC, Mueske CS, Eberhardt NL. Small heat shock proteins inhibit in vitro A beta(l-42) amyloidogenesis. // FEBS Lett. -1997. V.416. - No. 1. - P. 117-121.

89. Kurapati R., Passananti HB., Rose MR., Tower J. Increased hsp72 RNA levels in Drosophila lines genetically selected for increased longevity. // J. Gerontol. A. Biol. Sci. Med. Sci. 2000. - V.55. - P. 552-559.

90. Laemmli U.K. Cleavage of structural protein during the assembly of the head of bacteriophage T4. //Nature. 1970. - V.227. - P.680-686.

91. Lau A, He QY, Chiu JF. A proteome analysis of the arsenite response in cultured lung cells: evidence for in vitro oxidative stress-induced apoptosis. // Biochem. J. 2004 - V.382 (Pt 2). - P. 641-650.

92. Laurin D., Verreault R., Lindsay J., MacPherson K., Rockwood K. Physical activity and risk of cognitive impairment and dementia in elderly persons. // Arch. Neurol. 2001. - V.58. - P. 498-504.

93. Law A, Gauthier S, and Quirion R. Say NO to Alzheimer's disease: the putative links between nitric oxide and dementia of the Alzheimer's type. // Brain Res. Brain Res. Rev. -2001. V.35. -P. 73-96.

94. Lee MS, Kwon YT, Li M, Peng J, Friedlander RM, and Tsai LH. Neuroroxicity induces cleavage of p35 to p25 by calpain. // Nature (Lond.). -2000. V.405. - P. 360-364.

95. Lehmann DJ, Johnston C, and Smith AD. Synergy between the genes for butyrylcholinesterase К variant and apolipoprotein E4 in late-onset confirmed Alzheimer's disease. //Hum. Mol. Genet. 1997. - V.6. - P. 1933-1936.

96. Lennon SV, Martin SJ, Cotter TG. Dose-dependent induction of apoptosis in human tumor cell lines by widely diverging stimuli. // Cell Prolif. 1991. -V.24. - No.2. -P. 203-214.

97. Li D-P., Calzi SL., and Sanchez ER. Inhibition of heat shock factor activity prevents heat shock potentiation of glucocorticoid receptor-mediated gene expression. // Cell Stress Chaperones. 1999. - V.4. - No.4. - P. 223-234.

98. Loeffler DA. Using animal models to determine the significance of complement activation in Alzheimer's disease. // J. Neuroinflammation. -2004. 1:18.

99. Lu TS, Chen HW, Huang MH, Wang SJ, and Yang RC. Heat shock treatment protects osmotic stress-induced dysfunction of the blood-brain barrier through preservation of tight junction. // Cell Stress & Chaperones. 2004. - V.9. -No.4. - P. 369-377.

100. Lue LF, Rydel R, Brigham EF, Yang LB, Hampel H, Murphy GM Jr, Brachova L, Yan SD, Walker DG, Shen Y, et al. Inflammatory repertoire of Alzheimer's disease and nondemented elderly microglia in vitro. // Glia. -2001.-V.35.-P. 72-79.

101. Luximon-Ramma A, Bahorun T, Crozier A, Zbarsky V, Datla KP, Dexter DT, Aruoma OI. Characterization of the antioxidant functions of flavonoids and proanthocyanidins in Mauritian black teas. // Food Research International. -2005.-V.38.-P. 357-367.

102. Ma SL., Tang NL., Lam LC., Chiu HF. The association between promoter polymorphism of the interleukin-10 gene and Alzheimer's disease. // Neurobiology of Aging. 2005. - V.26. - P. 1005-1010.

103. Mahendra N., Arkin S. Effects of four years of exercise, language, and social interventions on Alzheimer discourse. // J. Commun. Disord. 2003. - V.36. -P. 395-422.

104. Maher P, and Davis J.B. The role of monoamine metabolism in oxidative glutamate toxicity. //J. Neuroscience. 1996. -V. 16. - P. 6394-6401.

105. Maines M.D. The heme oxygenase system and its functions in the brain. // Cellular and Molecular Biology. 2000. - V.46. - No.3. - P. 573-585.

106. Malyshev I.Yu., Bayda L.A., Trifonov A.I., Larionov N.P., Kubrina L.D., Mikoyan V.D., Vanin A.F., Manukhina E.B. Cross-talk between nitric oxide and HSP70 in the antihypotensive effect of adaptation to heat. // Physiol. Res. -2000.-V.49.-P. 99-105.

107. Malyshev I.Yu., Manukhina E.B. Stress, adaptation and nitric oxide // Adaptation Biology and Medicine (V.2) / Eds Pandolf B.B., Takeda N. Singal P.K. New Delhi: Narosa Publ. House. 1999. - P. 375-392.

108. Manukhina E.B., Mashina S.Yu., Smirin B.V., Lyamina NP, Senchikhin VN, Vanin AF, Malyshev IYu. Role of nitric oxide in adaptation to hypoxia and adaptive defense. // Physiol. Res. 2000. - V.49. - P.89-97.

109. Mark RJ, Hensley K, Butterfield DA, and Mattson MP. Amyloid p-peptide impairs ion-motive ATPase activities: evidence for a role in loss of neuronal Ca2+ homeostasis and cell death. // J. Neuroscience. 1995. - V. 15. - P. 62396249.

110. Markesbery WR. Oxidative stress hypothesis in Alzheimer's disease. // Free Radic. Biol. Med. 1997. - V.23. - P. 134-147.

111. Masliah E. Mechanisms of synaptic dysfunction in Alzheimer's disease // Hystol, Hystopathol. 1995. - V. 10. - P. 505-519.

112. Masliah E., Mallory M., Hensen L. Synaptic and neuritic alterations during the progression of Alzheimer's disease //Neuroscience. Lett. 1994. - P. 67-72.

113. Mattson M.P. Neuroprotective signaling and the aging brain: take away my food and let me run. // Brain Res. 2000. - V.886. - P.47-53.

114. Mattson MP and Chan SL. Dysregulation of cellular calcium homeostasis in Alzheimer's disease: bad genes and bad habits. // J. Mol. Neuroscience. -2001.-V. 17.-P. 205-224.

115. Mattson MP., Duan W., Wan R., and Guo Z. Prophylactic activation of neuroprotective stress response pathways by dietary and behavioral manipulations. // J. NeuroRx. 2004. - V.1.-P.111-116.

116. Mayer RJ, Arnold J, Laszlo L, Landon M, Lowe J. Ubiquitin in health and disease. // Biochim. Biophys. Acta. 1991. - V. 1089. - No.2. - P. 141 -157.

117. McLean CA, Cherny RA, Fraser FW, Fuller SJ, Smith MJ, Beyreuther K, Bush Al, and Masters CL. Soluble pool of Abeta amyloid as a determinant of severity of neurodegeneration in Alzheimer's disease. // Ann. Neurol. 1999. -V.46.-P. 860-866.

118. Meerson F.Z. Adaptation, stress and prophylaxis. Berlin: Springer-Verlag.1984.

119. Meriin AB., Yaglom JA., Gabai VL., Mosser DD., Zon L., Sherman MY. Protein damaging stresses activate JNK via inhibition of its phosphatase: anovel pathway controlled by Hsp72. // Mol. Cell Biol. 1999. - V.19. -P.2547-2555.

120. Michikawa M, Gong JS, Fan QW, Sawamura N, and Yanagisawa K. A novel action of Alzheimer's amyloid beta-protein (Abeta): oligomeric Abeta promotes lipid release. // J. Neuroscience. 2001. - V.21. - P. 7226-7235.

121. Migliore L, Fontana I, Trippi F, Colognato R, Coppede F, Tognoni G, Nucciarone B, Siciliano G. Oxidative DNA damage in peripheral leukocytes of mild cognitive impairment and AD patients. // Neurobiology of Aging. 2005. - V.26.-P. 567-573.

122. Morimoto B.H., and Koshland D.E. Induction and expression of long- and short-term neurosecretory potentiation in a neural cell line. // Neuron. 1989. -V.5.-P. 875-880.

123. Morimoto T.R, Tissieres A, Georgopoulos G. The biology of heat-stress proteins and molecular chaperones. // Plainview, Cold Spring Harbor Laboratory Press: New York. 1994.

124. Mouat M.F., Kolli K., Orlando R., Hargrove JL. and Grider A. The effects of quercetin on SW480 human colon carcinoma cells: a proteomic study. // Nutr. J. — 2005. — V.4: 11.

125. Mueller X.M., Tevaearai H., Chaubert P., Genton C.Y., Sergesser L. Mechanism of action of transmyocardial revascularization. // Schweiz. Med. Wochenschr. 1999. - V. 129. - P. 1889-1892.

126. Nagai N., Nakai A., Nagata K. Quercetin suppresses heat shock response by down regulation of HSF1. // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1995. -V.208. - P.1099-1105.

127. Nakanishi Y., Yasumoto K. Induction after administering paraquat of heme oxygenase-1 and heat shock protein in the liver of senescence-accelerated mice.//Biosci. Biotechnol. Biochem. 1997. - V.61. - 1302-1306.

128. Neubauer J.A. Physiological and pathophysiological responses to intermittent hypoxia. // J. Appl. Physiol. 2001. - V.90. - P. 1593-1599.

129. Ohkawa H., Ohishi N., Yagi K. Assay for lipid peroxides in animal tissues by thiobarbituric acid reaction. //Anal. Biochem. -1979. V.95. - No.2. - P. 351358.

130. Ohtsuka K, and Suzuki T. Roles of molecular chaperones in the nervous system. // Brain Res. Bull. 2000. - V.53. - P. 141-146.

131. Pappolla MA, Sos M, Omar RA, Sambamurti K. The heat shock/oxidative stress connection. Relevance to Alzheimer disease. // Mol. Chem. Neuropathol. 1996.-V.28.-No.l-3.-P. 21-34.

132. Park L, Anrather J, Forster C, Kazama K, Carlson GA, Iadecola C. Ap-induced vascular oxidative stress and attenuation of functional hyperemia in mouse somatosensory cortex. // J. Cerebral Blood Flow & Metabolism. 2004. -V.24.-P. 334-342.

133. Paxinos G., Watson C. Rat brain in stereotaxis coordinates. // Acad. Press. 1998.

134. Pelham H.R.B. Speculations on the functions of the major heat shock and glucose-regulated proteins. // Cell. 1986. - V.46. - P. 959-961.

135. Perry N.S.L, Bollen C, Perry E.K, Ballard C. Salvia for dementia therapy: review of pharmacological activity and pilot tolerability clinical trial. // Pharmacology, Biochemistry and Behavior. 2003. - V.75. - P. 651-659.

136. Perry G., Cash AD., and Smith M.A Alzheimer disease and oxidative stress. // Journal of Biomedicine and Biotechnology. 2002. - V.2:3. - P. 120-123.

137. Pinot F., Yaagoubi A.EI., Christie P., Dinh-Xuan AT., and Polla BS. Induction of stress proteins by tobacco smoke in human monocytes: modulation by antioxidants. // Cell Stress Chaperones. 1997. - V.2. - No.3. - P. 156-161.

138. Radecki D.T., Brown L.M., Martinez J. and Teyler T.J. BDNF Protects Against Stress-Induced Impairments in Spatial Learning and Memory and LTP. // Hippocampus. 2005. - V.15. -No.2. - P. 246-253.

139. Raeburn C.D., Cleveland J.C.Jr., Zimmerman M.A., Harken A.H. Organ preconditioning.//Arch. Surg.-2001.-V.136.-P. 1263-1266.

140. Rapoport M and Ferreira A. PD98059 prevents neurite degeneration induced by fibrillar beta-amyloid in mature hippocampal neurons. // J. Neurochem. -2000.-V.74.-P. 125-133.

141. Ravagnan L, Gurbuxani S, Susin SA, Maisse C, Daugas E, Zamzami N, Мак T, Jaattela M, Penninger JM, Garrido C, Kroemer G. Heat-shock protein 70 antagonizes apoptosis-inducing factor. // Nat. Cell Biol. 2001. - V.3. -No.9. -P. 839-843.

142. Rayevsky K.S., Bondarenko N.A., Kudrin V.S., Miroshnichenko I.I. Cognitive deficiency induced by the acute stress in rats: a possible role of brain catecholaminergic systems // Ann. 1st. Super Sanita. 1990. - V.26. - P. 25-29.

143. ReimanEM, ChenK, Alexander GE, CaselliRJ, Bandy D, Osborne D, Saunders AM, and Hardy J. Functional brain abnormalities in young adults at genetic risk for late-onset Alzheimer's dementia. // PNAS. 2004. - V.101. -No.l.-P. 284-289.

144. Renkawek K., Bosman G.J., Gaestel M. Increased expression of heat-shock protein 27 kDa in Alzheimer disease: a preliminary study. // Neuroreport. -1993. V.5. - P. 14-16.

145. Ritossa F. A new puffing pattern induced by temperature shock and DNP in Drosophila. // Experientia. 1962. -V. 18. - P. 571-573.

146. Rogers J, Cooper N.R, Webster S, Schultz J, McGeer P.L, Stryren S.D, Civin W.H, Brachova L, Bradt B, Ward P, Lieberburg I. Complement activation by P-amyloid in Alzheimer's disease. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1992. -V.89. -No.21. - P. 10016-10020.

147. Ryter S.W., Tyrrell R. The heme synthesis and degradation pathways: role in oxidant sensitivity. // Free Rad. Biol. Med. 2000. - V.28. - No.2. - P. 298309.

148. Sagara Y., Hendler S., Khoh-Reiter S., Gillenwater G., Carlo D., Schubert D., Chang J. Propofol hemisuccinate protects neuronal cells from oxidative injury. // J. Neurochem. 1999. - V.73. - P. 2524-2530.

149. Satoh H. Comparative Electropharmacological Actions of Some Constituents from Ginkgo biloba Extract in Guinea-pig Ventricular Cardiomyocytes. // Evid. Based. Complement. Alternat. Med. 2004. - V.l. - No.3. - P. 277284.

150. Schafer M, Goodenough S, Moosmann B, Behl C. Inhibition of glycogen synthase kinase 3p is involved in the resistance to oxidative stress in neuronal HT22 cells. // Brain Research. 2004. - V. 1005. - P. 84-89.

151. Schipper H.M. Heme oxygenase-1: role in brain aging and neurodegeneration. // Experimental Gerontology. 2000. -V.35. -P.821-830.

152. Schulze-Osthoff K., Ferrari D., Los M., Wesselborg S., Peter M.E. // Apoptosis signaling by death receptors. // Eur. J. Biochem. 1998. - V.254. -P. 439-459.

153. Selkoe DJ. Alzheimer's disease: genes, proteins, and therapy. // Physiol. Rev. -2001.-V.81.-No.2.-P. 741-766.

154. Selkoe DJ. Alzheimer's disease: a central role for amyloid. // J. Neuropathol. Exp. Neurol. 1994. - V.53. - P. 438-447.

155. Shanavas A., Papasozomenos S.Ch. т kinases in the rat heart shock model: Possible implications for Alzheimer disease. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. -2000.-V.97.-P. 14139-14144.

156. Slebos DJ, Ryter SW, Choi AM. Heme oxygenase-1 and carbon monoxide in pulmonary medicine. // Respir. Res. 2003 - V.4 (1):7.

157. Small GW. What we need to know about age related memory loss. // BMJ. -2002.-V.324 (7352): 1502-1505.

158. Soucek Т., Cumming R., Dargusch R., Maher P., Schubert D. The regulation of glucose metabolism by HIF-1 mediates a neuroprotective response to amyloid beta peptide. // Neuron. 2003. - V.39. - P. 43-56.

159. Soti C. and Csermely P. Chaperones come of age. // Cell Stress & Chaperones. -2002.-V.7.-No.2.-P. 186-190.

160. Strandberg ТЕ, Pitkala K, Eerola J, Til vis R, Tienari PJ. Interaction of herpesviridae, APOE gene, and education in cognitive impairment. // Neurobiology of Aging. -2005. V.26. - Issue 7. - P. 1001-1004.

161. Suh YH and Checler F. Amyloid precursor protein, presenilins, and a-synuclein: molecular pathogenesis and pharmacological applications in Alzheimer's disease. // Pharmacol. Rev. 2002. - V.54. - No.3. - P. 469 -525.

162. Swaab D.F., Dubelaar E.J., Scherder E.J., Van Someren E.J., Verwer R.W. Therapeutic strategies for Alzheimer disease: focus on neuronal reactivation of metabolically impaired neurons. // Alzheimer Dis. Assoc. Disord. — 2003. -V.17.-P. SI 14-S122.

163. Sykova E, Vorisek I, Antonova T, Mazel T, Meyer-Luehmann M, Jucker M, Hajek M, Or M, Bures J. Changes in extracellular space size and geometry in

164. АРР23 transgenic mice: A model of Alzheimer's disease. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2005. - V. 102. - No.2. - P. 479-484.

165. Tabaton M. Soluble amyloid P protein is a marker of Alzheimer amyloid in brain but not in cerebrospinal fluid. // Biochem. Biophys. Res. Commun. -1994.-V.200.-P. 1598-1603.

166. Takeda A., Perry G., Abraham N.G., Dwyer B.E., Kutty R.K., Laitinen J.T., Petersen R.B., Smith M.A. Overexpression of heme oxygenase in neuronal cells, the possible interactions with Tau. // J. Biol. Chem. 2000. - V. 275. -P. 5395-5399.

167. Tidwell JL, Houenou LJ, and Tytell M. Administration of Hsp70 in vivo inhibits motor and sensory neuron degeneration. // Cell Stress & Chaperones. — 2003. V.9. -No.l. - P. 88-98.

168. Todd M.J, Viitanen P.V, Lorimer G.H. Dynamics of the chaperonin ATPase cycle: implications for facilitated protein folding. // Science. 1994. — V.265. -P. 659-666.

169. Towbin H, Staehelin T, Gordon J. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.- 1979. V.76. -No.9. - P.4350-4354.

170. Town Т., Nikolic V., and Tan J. The microglial "activation" continuum: from innate to adaptive responses. // J. Neuroinflammation. 2005. - V.2: 24.

171. Tsunumi Y., Takeshita S., Chen D., Keaney M., Rossow S. Direct intramuscular gene transfer of naked DNA encoding vascular endothelial growth factor augments collateral development and tissue perfusion. // Circulation. 1996. - V.94. - P. 3281 -3290.

172. Urbane В, Cruz L, Yun S, Buldyrev SV, Bitan G, Teplow DB, and Stanley HE. In silico study of amyloid P-protein folding and oligomerization. // PNAS. -2004.-V.101.-P. 17345-17350.

173. Varadarajan S, Yatin S, Aksenova M, and Butterfield AD. Alzheimer's amyloid beta peptide-associated free radical oxidative stress and neurotoxicity. //J. Struct. Biol. 2000. - V.130. - P. 184-208.

174. Wakutani Y., Urakami K., Shimomura Т., Takahashi K. Heat shock protein 70 mRNA levels in mononuclear blood cells from patients with dementia of the Alzheimer type. // Dementia. 1995. - V.6. - P. 301-305.

175. Wolozin B. and Behl C. Mechanisms of neurodegenerative disorders (parts 1 and 2). // Arch. Neurol. 2000. - V.57. - P. 793-807.

176. Wu A, Derrico С A, Hatem L, and Colvin RA. Alzheimer's amyloid-beta peptide inhibits sodium/calcium exchange measured in rat and human brain plasma membrane vesicles. // Neuroscience. 1997. - V.80. - Issue 3. - P. 675-684.

177. Wu B.Y., Yu A.C. Quercetin inhibits c-fos, heat shock protein, and glial fibrillary acidic protein expression in injured astrocytes. // J. Neuroscience. Res. 2000. - V.62. - P.730-736.

178. Yamaguchi Y., Kawashima S. Effect of P-amyloid-(25-35) on passive avoidance, radial-arm maze learning and choline acetyltransferase activity in the rat. // Eur. J. Pharmacol. 2001. - V.412. - P. 265-272.

179. Yan S, Chen X, Fu J, et al. RAGE and amyloid-p peptide neurotoxicity in Alzheimer's disease. // Nature. 1996. - V.382. - P. 685-691.

180. Yang A.J., Chandswangbhuvana D., Margol L., Glabe C.G. Loss of endosomal / lysosomal membrane impermeability is an early event in amyloid Abeta 1-42 pathogenesis. // J. Neuroscience. Res. 1998. - V.52. - P. 691698.

181. Yankner BA. Mechanisms of neuronal degeneration in Alzheimer's disease. // Neuron. 1996.-V. 16.-P. 921-932.

182. Yee WM, Frim DM, Isacson O. Relationships between stress protein induction and NMDA-mediated neuronal death in the entorhinal cortex. // Exp. Brain. Res. 1993. - V.94. — No.2. - P. 193-202.

183. Yenari MA., Liu J., Zheng Z., Vexler ZS., Lee JE., and Giffard RG. Antiapoptotic and anti-inflammatory mechanisms of heat-shock protein protection. // Ann. N.Y. Acad. Sci. 2005. - V. 1053. - P. 74-83.

184. Younkin SG. Evidence that A beta 42 is the real culprit in Alzheimer's disease. // Ann. Neurol. 1995. - V.37. - P. 287-288.

185. Zhang S-Z., Gao Q, Cao C-M, Bruce I.C. and Xia Q. Involvement of the mitochondrial calcium uniporter in cardioprotection by ischemic preconditioning.// Life Sciences. 2006. - V.78. -No.7. - P. 738-745.

186. Zheng YL, Kesavapany S, Gravell M, Hamilton RS, Schubert M, Amin N, Albers W, Grant P, Pant HC. A Cdk5 inhibitory peptide reduces tau hyperphosphorylation and apoptosis in neurons. // EMBO J. 2005. - V.24. -No.l.-P. 209-220.

187. Zimmermann M, Borroni B, Cattabeni F, Padovani A, and Di Luca M. Cholinesterase inhibitors influence APP metabolism in Alzheimer disease patients. //Neurobiology of Disease. 2005. - V.19. - P. 237-242.