Автореферат и диссертация по фармакологии (15.00.02) на тему:Выделение и изучение фосфолипидов масла семян амаранта

На правах рукописи

САФОНОВА Елена Федоровна

ВЫДЕЛЕНИЕ И ИЗУЧЕНИЕ ФОСФОЛИПИДОВ МАСЛА СЕМЯН АМАРАНТА

15.00.02 - фармацевтическая химия, фармакогнозия

АВТОРЕФЕРАТ

на соискание ученой степени кандидата химических наук

Москва 2004

Работа выполнена на кафедрах аналитической химии (зав. кафедрой д.х.н., проф. Селеменев В.Ф.) и фармацевтической химии и фармацевтических технологий (зав. кафедрой д.ф.н., проф. Сливкин А.И ) Воронежского государственного университета.

Научный руководитель:

Доктор фармацевтических наук, профессор Сливкин А.И.

Официальные оппоненты:

Доктор фармацевтических наук, профессор Нестерова О.В.

Доктор биологических наук, профессор Сяткин С.П,

Ведущая организация:

Институт стандартизации научного центра экспертизы и контроля качества лекарственных средств

Защита диссертации состоится «17» сентября 2004 г. в 14 час. на заседании диссертационного совета Д. 212. 203. 13 в Российском Университете Дружбы Народов по адресу: 117198, Москва, ул. Миклухо-Маклая, д. 8.

С диссертацией можно ознакомиться в Научной библиотеке РУДН по адресу: 117198, Москва, ул. Миклухо-Маклая, д. 6.

Автореферат разослан « ^/ъаЛь^ГСТ¿6—2004 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета

Кандидат фармацевтических наук, доцент Лагуткина

Т.П.

АКТУАЛЬНОСТЬ РАБОТЫ

Масла большинства дикорастущих растений и культурных сортов принадлежат к числу весьма ценных лекарственных средств, давно используемых в лечебной практике. Они применяются как самостоятельные лекарственные препараты для лечения ожогов и ран, так и в качестве вспомогательных веществ для приготовления инъекционных растворов, мазевых и суппозиторных основ. Кроме того, растительные масла и отходы их производства могут служить источником получения новых лекарственных средств, обладающих уникальным комплексом фармакологических свойств. Лечебный эффект жирных растительных масел обусловлен наличием целого комплекса биологически активных соединений, таких как, токоферолы, эссенциальные фосфолипиды, полиненасыщенные жирные кислоты, фитостерины и др.

В последние годы наблюдается тенденция расширения сырьевой базы для получения растительных масел за счет внедрения новых нетрадиционных растений и отходов пищевой промышленности. В Воронежском госуниверситете разработана и запатентована методика получения масла из семян амаранта гибридного (Oleum Amaranthacea). Новый способ экстракции и очистки позволяют получить масло с максимально возможным содержанием биологически активных веществ. В настоящее время в России организовано опытно-промышленное производство масла семян амаранта, которое активно продвигается на фармацевтический рынок в качестве биологически активной добавки.

Одним из основных компонентов липидной фракции масла являются фосфолипиды, которые обладают гепатопротекторным,

иммуномоделирующим, антиоксидантным и регенерирующим действием. Содержание фосфолипидов в растительных маслах в соответствии с требованиями нормативной документации приводится в суммарном виде. Однако не все фосфолипиды обладают одинаковым

фармакотерапевтическим эффектом. Поэтому весьма актуальным представляется изучение фосфолипидного состава масел, используемых в фармации, а также разработка современных методов разделения и анализа этой группы веществ.

ЦЕЛИ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ

Целью диссертационной работы явились исследования по разработке унифицированных методик разделения, идентификации и количественной оценки фосфолипидов масла семян амаранта с последующей стандартизацией изучаемого объекта по всем параметрам качества лекарственных средств. - , , . ..

РОС НАЦИОНАЛЬНАЯ БИБЛИОТЕКА

Для реализации поставленной цели необходимо решить следующие задачи:

- исследовать и оценить физико-химические показатели качества масла семян амаранта;

- установить жирнокислотный состав липидной фракции масла семян амаранта;

- изучить возможности сорбционного выделения фосфолипидов из липидного комплекса масла семян амаранта сорбентами различной природы;

- выбрать оптимальные параметры для фракционирования и идентификации фосфолипидов методом зонального высоковольтного электрофореза на бумаге;

- выбрать и обосновать условия разделения и анализа фосфолипидов методом хроматографии в тонком слое сорбента;

- разработать методику количественного определения фосфолипидов в изучаемых объектах;

- предложить способ стандартизации масла семян амаранта.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА

Проведена оценка качества масла из семян амаранта по физико-химическим показателям, регламентируемым нормативной документацией.

Методом газожидкостной хроматографии установлен

жирнокислотный состав липидной фракции масла семян амаранта. Полученные данные позволяют сделать вывод о том, что изучаемое масло идентично растительным маслам линолевой группы с высокой долей пальмитиновой и олеиновой кислот.

Изучен состав липидной фракции масла семян амаранта и установлено наличие следующих компонентов: сквален, стерины, токоферолы, фитостерины, фосфолипиды, свободные жирные кислоты и глицериды жирных кислот.

Изучена сорбционная активность фосфолипидов по отношению к аниониту АВ-17-2П, катиониту КРС, неионогенному сорбенту Стиросорб и высказано предположение о механизме сорбции. Результаты исследования положены в основу выделения и фракционирования фосфолипидов из масла семян амаранта. Приоритетность данного исследования подтверждена патентом на изобретение № 2169734 РФ по заявке №99125174 от 30.11.1999.

Разработаны методики количественного определения фосфолипидов, в основе которых лежат современные физико-химические методы анализа, такие как хроматография в тонком слое сорбенте, высоковольтный электрофорез, спктрофотометрия в УФ-области. По разработанным

методикам в масле, полученном из семян амаранта, впервые установлен качественный и количественный состав фосфолипидного комплекса.

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ

Найден новый перспективный источник получения ценных биологически активных веществ, обладающих гепатопротекторным, иммуномоделирующим и противоожоговым действием.

Определены физико-химические показатели качества масла семян амаранта.

Показана- возможность использования- сорбционных методов для выделения и фракционирования фосфолипидов с помощью сорбентов различной природы. Изучен механизм сорбции фосфолипидов ионогенными и неионогенными сорбентами. Результаты исследования позволили усовершенствовать метод выделения и фракционирования фосфолипидов из масла семян амаранта

Разработаны новые методики идентификации и количественного определения биологически активных компонентов масла семян амаранта -фосфолипидов современными физико-химическими методами.

Проведена сравнительная оценка хроматографических, спектральных и электрохимических методов, позволяющих вести контроль за содержанием фосфолипидов в различных растительных объектах.

Разработанные способы выделения и методики анализа фосфолипидов могут быть использованы на фармацевтических и пищевых предприятиях для получения лечебно-профилактических препаратов и их стандартизации.

ВНЕДРЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЯ В ПРАКТИКУ

Проведено внедрение разработанных методик выделения, идентификации и количественного определения фосфолипидов в растительных маслах в ЗАО «Инновационные системы ОКБМ» г Воронежа (акт о внедрении от 25.05.2004), при проведении учебных и научно-исследовательских работ на кафедре органической химии и в «Лаборатории инструментальных методов пищевой химии» Воронежской Государственной Технологической Академии (Акт о внедрении от 24.03.2003 г.), на фармацевтическом факультете Воронежского Госуниверситета (Акт № 5 от 17. 0.1.2002).

ОСНОВНЫЕ ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫДВИГАЕМЫЕ НА ЗАЩИТУ

- данные по составу высших жирных кислот в липидной фракции масла семян амаранта;

- методики сорбционного выделения фосфолипидов из фосфолипидного комплекса;

- методика разделения и идентификации фосфолипидов методом зонального высоковольтного электрофореза;

- выбор оптимальных параметров для разделения фосфолипидов в тонком слое сорбента и разработанная на основе этих данных методика количественного определения фосфолипидов;

- изучение качественного и количественного состава фосфолипидов масла семян амаранта.

АПРОБАЦИЯ РАБОТ

Основные результаты исследования доложены на:

- Всероссийской конференции «Химический анализ веществ и материалов» (г. Москва, 2000 г);

- IV Международном симпозиуме "Новые нетрадиционные растения и перспективы их использования" (г. Москва, 2001 г);

- IX и X Российском национальном конгрессах "Человек и лекарство" (г. Москва, 2002, 2003,2004 гг);

- IX Международной конференции по теоретическим вопросам адсорбции и адсорбционной хроматографии (г. Москва, 2002 г );

- Всероссийском симпозиуме «Современные проблемы хроматографии» (г. Москва, 2002 г);

- Всероссийской конференции «Фагран-2002» (г. Воронеж).

ПУБЛИКАЦИИ. По материалам диссертации опубликовано 18 работ, в том числе 7 статей, 10 тезисов, 1 патент.

Диссертация изложена на 149 страницах машинописного текста, содержит 22 рисунка, 27 таблиц и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, 3 глав собственных исследований, общих выводов, библиографического указателя, включающего 186 источников и Приложений.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Объектами исследования явились образцы масла семян амаранта гибридного (Amaranthus hybridicus), полученные экстракционным способом в 2001 (образец 1) и 2002 (образец 2) годах.

В качестве стандартов использовали хлороформные растворы фосфолипидов фирмы «ICN Biomedical»: фосфатидилхолин (ФХ),

фосфатидилинозит (ФИ), фосфатидилэтаноламин (ФЭА), фосфатидилсерин (ФС), фосфатидная кислота (ФК), лизофосфатидилхолин (ЛФХ).

Получение Фосфолипидного комплекса (ФЛК). Экстракцию фосфолипидов из масла семян амаранта проводили по методике Блая и Дайэра, которая является упрощенным вариантом метода Фолча. Осаждение ФЛК из хлороформного экстракта осуществляли холодным ацетоном.

Разделение ФЛК на индивидуальные фосфолипиды проводили тремя методами:

- колоночной хроматографией на сорбентах АВ-17-2П, КРС-2П, МХДЭхЮО (Стиросорб);

- методом ТСХ на пластинках Сорбфил («Сорбполимер», Краснодар) в системе растворителей хлороформ-метанол-вода (65:25:4);

- высоковольтным электрофорезом на приборе LFGB (Венгрия) с горизонтальной камерой при 600 В.

Идентификацию фосфолипидов методом ИКС осуществляли на спектрофотометре «Инфралюм ФТ-02» («Люмекс», Россия) в области 4000-400 см"1 методом тонкой пленки на дисках из КВг. ИК-спектры растворов фосфолипидов снимали в кюветах из КВг толщиной 0,3 мм.

Физико-химические показателели качества масла семян амаранта определяли по методикам ГФ XI и Межгосударственным стандартам, регламентирующим качество пищевых растительных масел. Определение запаха, цвета и прозрачности проводилось по ГОСТ 5472-50; определение золы - ГОСТ 5474-66; кислотное число - ГФ XI и ГОСТ 5476-80; неомыляемые вещества - ГОСТ 5479-64; цветное число (ЦЧ) - ГОСТ 547793; содержание влаги и летучих веществ - ГФ XI и ГОСТ 11812-66; показатель преломления (п ) - ГОСТ 5482-90; перекисное число (ПЧ) -ГОСТ 26593-85; иодное число (ИЧ) - ГФ XI и ГОСТ Р 51.487-99; число омыления (ЧО) - ГФ XI и ГОСТ 5478-90; содержание фосфора - ГОСТ 7824-80.

Определение состава жирных кислот липидной фракции масла семян амаранта проводили методом ГЖХ по ГОСТ Р 51483-99 на хроматографе «Cгom-5» (Чехословакия).

Определение а-токоферола осуществлялось методом ВЭЖХ по ФС 42-2442-99 на хроматографе «Милихром» (Россия) методом абсолютной калибровки.

Количественное определение фосфолипидов методом ТСХ проводили денситометрическим сканированием на сканере фирмы Shimadzy (Япония) и компьютерным сканированием на ПК с использованием программы «8огЬШ \ideodensitometr».

Статистическую обработку результатов проводили по программе «^гаИйгса 6.0» и ГФ XI.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1. Выделение фосфолипидов из растительных масел.

Сорбционное выделение и фракционирование фосфолипидов. Фосфолипиды (ФЛ) имеют в своем составе отрицательно заряженную фосфатную и положительно заряженную аминогруппу и поэтому могут существовать в различных ионных формах. Для выбора сорбентов, позволяющих разделить фосфолипиды, методом переменных концентраций были установлены сорбционные емкости некоторых ионогенных и неионогенных сорбентов по отношению к фосфатидилхолину (ФХ). Результаты представлены в табл. 1.

Таблица 1.

Физико-химические характеристики и емкость некоторых сорбентов

Сорбент Основа Функциональные группы Емкость сорбента, мг/г

Стиросорб (МХДЭхЮО) Полистирольнь1е сетки сверхсшитой структуры Не содержит 39,0

Анионит АН-25 Гексаметилендиамин с хлорметиллированным сополимером стирола с ДВБ =№Н 26,5

Анионит АН-1ОП Фенол, формальдегид и аммонийные соли =>Ш; -ОН; N 26,4

Анионит АВ-17-2П Сополимер стирола с ДВБ -^(СНз), 38,7

Катионит КРС Продукт сульфирования сополимера стирола с ДВБ -БОзН 38,5

Амфолит АНКФ-1 Гелевая сруктура, содержащая кислотные ионогенные и основные (пиридиновый азот) группы "-тр-сн,—" о [Г 27,0

Силикагель Диоксид кремния -БЮН <1

Данные табл. 1 показывают, что наибольшей сорбционной емкостью обладают сорбенты КРС, АВ-17-2П и Стиросорб. Тот факт, что емкостные характеристики ФХ на ионогенных и неионогенных сорбентах являются величинами одного порядка, может свидетельствовать о необменном механизме сорбции. Для исследования процессов, происходящих при взаимодействии ФХ с сорбентами были построены изотермы сорбции в

пределах концентраций от 10 до 90 мг/мл при 293 К (рис. 1, 2,3) и сняты ИК-спектры сорбентов после сорбции ФХ в области 4000-400 см'1 (рис. 4).

Рис.1. Изотерма сорбции ФХ на неионогенном сорбенте Стиросорб.

Рис.2. Изотерма сорбции ФХ на анионите АВ-17-2П.

Рис.3. Изотерма сорбции ФХ на катионите КРС.

|| АВ-17-2П.

ВЮ 1000 4600 3000 3900 ЗООО 3900

«0 1000 1600 3000 3930 ЭОСО 3500

Рис. 4. ИК-спектры сорбентов после сорбции фосфатидилхолина.

Как видно на рисунках 2 и 3, максимум на изотермах сорбции наблюдается при 70 мг/мл для катионита КРС-2П и при 50 мг/мл для анионита АВ-17-2П. Такой вид изотерм характерен для ПАВ, а фосфолипиды как известно, вследствие наличия полярного и гидрофобного фрагментов обладают поверхностно-активными свойствами. Таким образом, в области концентраций, которые соответствуют линейным участкам на изотермах (область Генри), процесс сорбции

протекает за счет электростатического взаимодействия полярных фрагментов ФХ с функциональными группами сорбента на его поверхности. Причем, молекулы ФХ ориентируются положительно заряженной аминогруппой к противоионам ОН ~ (анионит) и отрицательно заряженной фосфатной группой к противоионам Н* (катеонит) с образованием соответствующей ионной пары «цвитерион-противоион». На ИК-спектрах этих ионитов наблюдается наличие полос поглощения в области 3200-3500 см"1,что соответствует колебаниям ассоциированных с цвиттер -ионом свободных функциональных групп сорбента. Появление отдельных полос поглощения при 1200-1600 см'1 характеризует колебания, вызванные ионной связью между полярными группами ФХ и ионитами. При более высоких концентрациях молекулы ФХ образут ассоциаты, что приводит к невозможности их сорбции на поверхности сорбента вследствие конкуренции процессов перераспределения биполярных ионов ФЛ между поверхностью сорбента и ассоциатами в равновесном растворе. Сорбция ФХ на неионогенном сорбенте Стиросорб имеет вид изотермы Ленгмюра (рис. 1), что подтверждает адсорбционный механизм взаимодействия. Наличие полос поглощения в ИК-спгктрах при 1056-1086 см*1 и их смещение в сторону больших частот является следствием возрастающей сорбции ФХ за счет гидрофобного взаимодействия неполярных фрагментов липида с фазой сорбента, а максимумы при 29252927 см'1 характерны для валентных колебаний ассоциированных групп Р-ОН. Следовательно, при сорбции ФХ на неионогенном сорбенте Стиросорб доминирующим является гидрофобное взаимодействие. Таким образом, процесс сорбции ФХ сорбентами различного типа является следствием полифункционального взаимодействия.

С учетом полученных данных было проведено разделение фосфолипидного комплекса масла семян амаранта (ФЛК).

Для разделения ФЛК на отдельные классы фосфолипидов применяли колоночный вариант хроматографии с использованием в качестве сорбентов катеонита КРС-2П, анионита АВ-17-2П и неионогенного сорбента Стиросорб. Хроматографирование проводили в следующих условиях: колонки стеклянные 15x0,9 см; длина сорбционного слоя 10 см; температура 20 °С; хлороформно-этанольный (1:10) раствор ФЛК с концентрацией 3 г/л объемом 0,1 л; скорость пропускания 0,5 мл/мин. Процесс сорбции и десорбции контролировали методами спектрофотометрии в УФ-области. Определение относительной оптической плотности растворов проводили на спектрофотометре СФ-56 в кварцевой кювете толщиной 10 мм в диапазоне длин волн 190-340 нм. Для компенсации фонового поглощения в кюветы сравнения помещали исходный элюент.

Контроль за составом фосфолипидов в каждой фракции проводили методами ТСХ и ИК-спектроскопии. Результаты анализа представлены в табл. 2.

Сопоставление максимумов поглощения с характеристическими частотами колебаний стандартных растворов фосфолипидов подтвердило данные, полученные методом ТСХ (табл. 2).

Таблица 2

Результаты ТСХ и ИКС анализов фосфолипидов, полученных после разделения ФЛК на сорбентах

Из представленных данных следует, что лучшее разделение фосфолипидов достигается при использовании неионогенного сорбента Стиросорб. На анионите и катионите разделить фосфолипиды на отдельные фракции не представляется возможным. Кроме того, фосфатидилхолин и фосфатидилинозит, обладающие фармакологической активностью и имеющие в связи с этим наибольшее значение, на ионитах не разделяются, а выходят в одних и тех же фракциях.

Проведенные исследования показали несомненную перспективность использования макропористого неионогенного сорбента Стиросорб для сорбционного выделения фосфолипидов из растительных материалов. Установлено, что сорбент обладает достаточно высокой сорбционной емкостью и разделительной способностью по отношению к исследуемым веществам.

Разделение фосфолипидов методом зонального высоковольтного электрофореза на бумаге. Наличие в молекулах фосфолипидов заряженных групп позволило сделать предположение о возможности их фракционирования и идентификации методом электрофореза. Разделение проводили на приборе марки LFG с горизонтальной камерой и электродами из платиновой проволоки. В качестве проводящей жидкости применяли 3 буферных раствора: цитратный (рН=3,79); фосфатный (рН=7,91) и аммиачный (рН= 12,05). В работе была использована хроматографическая бумага (ГОСТ № 10395-63) форматом 25x65, плотностью 85. ФЛК, полученный из исследуемых объектов сушили в чашке Петри под вакуумом при 30-35 °С, затем растворяли до 1% в хлороформе и проводили разделение. Оптимальное время экспонирования, установленное экспериментально, составило 60 мин для фосфатного и цитратного буферов, 30 мин для аммиачного буфера. Электрофорез проводили при 600 В (градиент потенциала 9 В/см). Фиксирование электрофоретических зон после разделения осуществлялось в термостате при 105-110 °С в течение 20-30 мин. Для обнаружения фосфолипидов использовали следующие реагенты: 5 % спиртовый раствор ФМК, 0,25 % раствор нингидрина в ацетоне, 0,0012 % раствор Родамина 6Ж. Полученные результаты представлены в табл. 3.

Следует отметить, что лучшее разделение ФЛК и качество электрофоретических зон было достигнуто в цитратном буфере. В соответствии с данными таблицы 3, в цитратной и фосфатной буферных системах ФХ и ФЭА существуют в виде положительно заряженных частиц, т.к. под действием электрического тока они движутся в катодную область. Следовательно, в кислой и нейтральной средах ФХ и ФЭА существуют в виде катионов. ФС, ФК, ФГ и ФИ в цитратном буфере обнаруживаются в анодной области, т.е. они имеют отрицательный суммарный заряд и являются анионными ФЛ. В аммиачном буфере (щелочная среда) ФИ, ФС и ФЭА существуют в виде анионов, а ФХ остается на линии старта. Это можно объяснить тем, что вблизи величины рН=12,05 находится изоэлектрическая точка ФХ. Обнаружить ФК, ФС и ФИ при использовании фосфатного буфера не удалось. Проверка отдельных электрофоретических зон на наличие золы показала отсутствие минеральных компонентов (менее 0,001%), что свидетельствует о разрушении комплекса металл-ФЛ при использовании этого метода. В фосфатном и цитратном буферных растворах электрофореграмма ФХ имеет специфический вид «свечей» (рис. 5), причем установлено, что высота таких свечей линейно зависит от концентрации ФХ в области от 30 до 80 мг/мл. Этот факт был использован для построения градуировочной зависимости содержания ФХ от высоты электрофоретической зоны в цитратном буфере (рис. 6).

Таблица 3

Рис.5. Электрофореграмма стандартных растворов ФХ (цитратный буфер) с концентрациями:! - 39,38 мг/мл; 2 - 58,08 мг/мл; 3 - 78,76 мг/мл; 4 - 98,72 мг/мл.

Н,мм 65

55 -45 -35 -25 -15 -■

35 55 75 95 115

с, мг/мл

Рис.6. Градуировочный график для определения ФХ в цитратном буфере (Н-высота электрофоретической зоны).

Такой прием определения ФХ позволяет значительно сократить время анализа и уменьшить ошибку определения вследствие сокращения целого ряда операций предподготовки пробы для дальнейшего количественного обнаружения. Данные по содержанию ФХ в ФЛК масла семян амаранта представлены в табл. 4.

Таблица 4

Содержание ФХ в ФЛК семян амаранта (ФЛК 1) и амарантовом масле

(ФЛК 2)

Объект исследования Массовая доля ФХ в ФЛК, % Метрологические характеристики

ФЛК 1 53,0 8х=1,3; Дх=3,5; Еа=6,7 %

ФЖ2 51,0 5х=1,5; Дх= 2,7;е«=5,2 %

На основе вышеизложенного можно сделать вывод о том, что при разделении ФЛ для аналитических целей предпочтительнее использовать метод ВЭФ на бумаге как наиболее экспрессный и информативный. Кроме того, предлагаемая методика позволяет параллельно разделению проводить идентификацию ФЛ и количественное определение основного компонента ФЛК - фосфатидилхолина. Для препаративного выделения ФЛ целесообразно применять метод колоночной хроматографии на неионогенном сорбенте Стиросорб.

2. Изучение химического состава масла семян амаранта.

Физико-химические характеристики качества масла. Определение физико-химических характеристик проводили для двух образцов масла семян амаранта. В табл. 5 представлены результаты проведенных исследований и аналогичные данные для миндального масла (серия невысыхающих масел) и кукурузного масла (серия полувысыхающих масел). Установлено, что испытуемые образцы масла имеют оранжево-красный цвет, характерный запах и специфический привкус без горечи.

Таблица 5.

Показатели качества масла семян амаранта и некоторых других растительных масел

Показатели Амарантовое Миндальное Кукурузное

1 2

Массовая доля золы, % 0,37 0,39 0,03-0,05 0,06-0,07

КЧ, мг КОН/г 2,5 3,2 ¿2,5 ¿5

ЧО, мг КОН/г 200 160 190-195 180-210

ИЧ, г У 100 г 110 90 93-102 111-133

ПЧ, ммоль/кг С>2 1,2 1,6 - 1,0-1,5

ЦЧ, мг12 30 50 - 30-70

Массовая доля влаги и летучих вществ, % 0,31 0,36 ¿0,2 <0,2

Показатель преломления 1,450 1,452 1,470-1,472 1,471

Плотность, г/см3 0,921 0,932 0,913-0,918 0,921-0,924

Содержание Р в пересчете наР205 0,5 0,8 - 0,362-0,442

Показатель «массовая доля общей золы, характеризующий содержание неорганических примесей, на порядок выше, чем в кукурузном и миндальном маслах. Показатель «кислотное число», по которому контролируется процесс прогоркания масла под действием факторов окружающей среды (свет, влага и т.д.), соответствует другим жирным растительным маслам. Важнейшая константа, характеризующая степень ненасыщенности растительного масла - «йодное число», позволяет отнести исследуемый объект к серии полувысыхающих масел (тип линолевой кислоты). Наличие токсичных продуктов окисления (перекисей и гидроперекисей), контролируемое показателем «перекисное число», для масла семян амаранта не превышает аналогичные параметры других растительных масел.

Таким образом, установлено, что по основным физико-химическим показателям масло семян амаранта соответствует требованиям ГФ X и другим нормативным документам, регламентирующим качество растительных масел.

Жирнокислотный состав. Определение состава жирных кислот липидов масла семян амаранта проводили методом ГЖХ. Хроматограмма метиловых эфиров жирных кислот приведена на рис. 7.

Идентификационные характеристики и массовые доли жирных кислот в изучаемых объектах представлены в табл. 6.

Таблица 6.

Жирнокислотный состав липидов масла семян амаранта_

Кислота Время удерживания,с Содержание жирных кислот, %

1 2

Лауриновая (С)4 0) 1490,7 0,5±0,02 0,4±0,02

Миристиновая (Си о) 1756,1 0,5±0,02 0,4±0,02

Пальмитиновая (Cíeо) 2070,7 22,0+1,21 21,8±1,01

Пальмитолеиновая (Cíe i) 2317,9 - 0,6+0,03

Маргариновая (С|7 0) 2692,9 0,5±0,02 -

Стеариновая (Cía о) 2958,4 3,0±0,21 2,7±0,11

Олеиновая (Ctg i) 3117,6 24,0±1,31 21,3±1,03

Линолевая (Cjs^) 3460,9 51,1±2,5 51,7±2,5

Линоленовая (Сиз) 3949,7 0,9±0,07 0,8±0,06

Состав жирных кислот, приведенных в табл. 6 показывает идентичность масла семян амаранта растительным маслам линолевой серии (группа 7), но с высокой долей пальмитиновой и олеиновой кислот. Кроме того, преобладание линолевой кислоты позволяет отнести данное масло к серии полувысыхающих растительных масел, что хорошо согласуется с величиной йодного числа (табл. 5). Значительно увеличен по сравнению с нормативными данными уровень насыщенных жирных кислот.

3

9

Рис. 7. Хроматограмма метиловых эфиров жирных кислот липидов масла семян амаранта (1 - лауриновая; 2 - миристиновая; 3 -пальмитиновая; 4 — пальмитолеиновая; 5 - маргариновая; 6 -

стеариновая; 7 - олеиновая; 8 - линолевая; 9 - линоленовая).

В результате установлено, что в масле семян амаранта в большем количестве (около 75 %) содержатся ненасыщенные жирные кислоты, в том числе незаменимые (эссенциальные) — линолевая и линоленовая.

Изучение фосфолипидного состава масла семян амаранта. ФЛ входят в состав всех жирных масел, однако их содержание приводится обычно в суммарном виде. Тем не менее, не все фосфолипиды обладают фармакологической активностью, а у некоторых она пока не выявлена. Поэтому представляется интересным изучение фосфолипидного состава масел и определение количественного содержания тех фосфолипидов, которые дают наибольший фармакологический эффект. С этой целью разработана экспресс методика идентификации и количественной оценки ФЛ методом ТСХ с применением компьютерного сканирования.

Было проведено исследование пяти типов элюирующих систем, причем соотношение растворителей подбиралось таким образом, чтобы полярность системы приблизительно равнялась оптимальной величине - 5 (табл. 7).

Таблица 7

Полярность различных элюирующих систем используемых для _разделения ФЛ._

N Состав системы Соотношение растворителей Полярность

I Хлороформ-метанол 19,5:7,5 5,02

И Хлороформ-этанол 19,5:7,5 4,62

III Бутанол-уксусная кислота-вода 4:1:5 5,8

IV Ацетонитрил-этанол 4:1 5,01

V Хлороформ-ацетон-метанол-уксусная кислота-вода 5:2:1:1:0,5 5,23

Разделение ФЛ проводилось на трех типах пластин для ТСХ с закрепленным слоем силикагеля Силуфол, Сорбфил и Армсорб при одномерном элюировании. Лучшее разделение и качество зон было получено на пластинах Сорбфил. Следует отметить, что пластины марки Силуфол с УФ-добавкой пригодны только для обнаружения ФЛ реагентом Родамин 6Ж в УФ-свете. Остальные реагенты, используемые для обнаружения ФЛ, на этом типе пластин не работают. Во избежание «эффекта нагрузки», при котором величина становится зависимой от количества вещества, нанесенного на пластину, был установлен

оптимальный объем наносимой пробы, который составил 10 мкл. В качестве реагентов для обнаружений зон ФЛ были использованы: 0,0012-процентный раствор Родамина-бЖ; 5% спиртовой раствор фосфорномолибденовой кислоты (ФМК); реагент, Драгендорфа (смесь растворов основного нитрата висмута в 20 % уксусной кислоте и 40% раствор йодистого калия) и 1% раствор нингидрина в ацетоне. В описанных выше условиях были проанализированы стандартные растворы ФХ и ФИ. По полученным хроматограммам для каждой элюирующей системы рассчитаны величины Яр коэффициент распределения (К), высота, эквивалентная теоретической тарелке (Н) и число теоретических тарелок (К) (табл. 8).

Таблица 8

Величины Яс, К, Н и N для ФЛ по данным ТСХ._

N Вещество Яг н, N К

Мкм ю-3

I ФХ 0,15+0,01 2,1 3,8 5,6

ФИ 0,08±0,002 0,4 19,5 И,5

II ФХ 0,07±0,002 2,0 3,8 13,3

ФИ 0,16±0,008 4,0 1,9 5,2

III ФХ 0,34+0,02 0,9 7,1 1,9

ФИ 0,89+0,02 0,04 15,7 0,12

IV ФХ 0,05±0,002 0,9 8,7 19,0

ФИ 0,65±0,02 0,1 7,8 0,54

V ФХ 0,39±0,01 1,1 7,8 1,6

ФИ 0,64±0,02 0,9 9,5 0,56

Из данных табл. 8 следует, что самые высокие величины ЧТТ, а, следовательно, наибольшая эффективность разделения наблюдается в системах III, IV и V для ФХ и I, III и V для ФИ. Лучшее качество хроматографических зон было получено в системах I, II и V. Таким образом, установлено, что наиболее приемлемыми для разделения ФЛ и последующей количественной обработки данных являются системы I и V.

Компоненты сложных смесей могут влиять друг на друга и создавать условия взаимной перегрузки. Степень этих взаимодействий зависит от природы вещества, его концентрации и величины Яг Как правило такое взаимодействие приводит к занижению величины К. В частности, такое утверждение справедливо для веществ с очень малыми значениями Яг и для тех веществ, которые разделены не полностью. В табл. 9 представлены данные по влиянию эффектов локализации растворителя для различных элюирующих систем при разделении фосфатидилхолина (ФХ) и фосфатидилинозита (ФИ).

Таблица 9

Изменение селективности за счет эффектов локализации.

Элюирующая Ki к2 К,/К2

Система (ФХ) (ФИ)

I 5,62 11,50 0,48

II 13,31 5,21 2,50

III 1,98 0,12 12,66

IV 19,01 0,54 3,66

V 1,65 .0,56 2,84

Как видно из данных табл. 9, ФХ лучше удерживается в системах I, II, и IV. Трудно осуществимое разделение ФХ и ФИ в системе растворителей I (K,/K2<1) становится реальным в системах II, III, IV и V. ФИ обладает большим сродством к сорбенту в элюирующей системе I и П. Однако, в системе I ФИ не может быть отделен от ФХ (Kj/K2<1). Лучшим элюентом для разделения этого вещества является система III. Таким образом, по совокупности всех параметров, характеризующих эффективность, селективность и качество хроматографического разделения мы остановили свой выбор на пятикомпонентной элюирующей системе

В результате проведенного исследования были выбраны и обоснованы условия хроматографического анализа фосфолипидов в тонком слое сорбента. Разделение ФЛК на индивидуальные липиды можно проводить в элюирующих системах I, II и V. Для количественной обработки хроматограмм методом компьютерного сканирования целесообразно применять систему V. Замена метанола на этанол в элюенте I, который наиболее часто используется для анализа фосфолипидов, существенно не влияет на эффективность разделения и качество хроматографических зон.

С целью количественного определения ФЛ методом ТСХ была проведена апробация возможности использования персонального компьютера для интерпретации полученных данных. После проявления хроматограмм пластины сканировали на планшетном сканере Genius Color Page -SP2, а полученные изображения обрабатывали компьютерной программой Sorbfil Videodensitometr.

Принцип работы программы состоит в построении аналоговой кривой хроматограммы по отклонению яркости пятен от яркости фона с последующим нахождением пиков на этой кривой и расчетом их площади. Анализ полученных данных позволил установить линейную зависимость между концентрацией вещества и площадью пика, соответствующего этому веществу на аналоговой кривой в области концентраций от 1 до 13 мг/мл.

На рис. 8 приведена аналоговая кривая (трек) хроматограммы стандартного хлороформного раствора ФХ с концентрацией 1,2 мг/м.л

Рис. 8. Аналоговая кривая хроматограммы стандартного раствора ФХ в хлороформе (1,2 мг/мл).

Для проверки разработанной нами методики пластину с серией стандартных растворов ФХ проанализировали специальным сканирующим денситометром С8-9000 фирмы Shimadzy при а =600 нм. Градуировочные графики для ФХ, полученные описанными способами, представлены на рис. 9.

Рис. 9. Градуировочные графики для определения содержания ФХ методом ТСХ, полученные с помощью сканирующего устройства Shimadzy (1) и персонального компьютера (2).

Как видно из рис. 9, оба графика имеют линейную зависимость площади пятна S от концентрации ФХ в диапазоне 1,0-13,0 мг/мл. Градуировочная зависимость, полученная с использованием

персонального компьютера (8=13,08+4,94С; К.2=0,988) близка к полученной на типовом сканере (8=9,54+6,76С; К.г=0,988).

Таким образом, разработана экономичная и экспрессная методика количественной интерпретации данных ТСХ на офисном компьютере. Метод применим также для количественной обработки электрофореграмм в бумажном электрофорезе фосфолипидов.

По описанной выше методике были проанализированы стандартные растворы фосфатидилинозита (ФИ), фосфатидилглицерина (ФГ)» лизофосфатидилхолина (ЛФХ) и фосфатидных кислот (ФК) в элюирующей системе V и построены градуировочные зависимости по методу наименьших квадратов (табл. 10).

Таблица 10.

Данные для построения градуировочных графиков некоторых фосфолипидов ^ методом ТСХ с применением компьютерного сканирования

Название ФЛ Уравнение градуировочного графика (И. =0,988) Область линейности мг/мл Предел обнаружения, мг/мл

ФХ 8=4,94С+13,08 1-10 0,5

ЛФХ 8=19,15С+1б,96 1-6 1,5

ФИ 8=304С+126 1-5 1,0

ФГ 8=501С+357 1-3 1,0

ФК 8=67,1С+79,0 1,5-5 1,0

Существенным достоинством данной методики является возможность определения ЛФХ, содержание которого должно контролироваться, поскольку этот ФЛ обладает гемолитическим действием.

Разработка методик контроля качества и стандартизации амарантового масла.

Стандартизация масла семян амаранта проводилась по следующим параметрам: описание; определение физических констант; определение химических показателей качества масла; установление состава жирных кислот; определение степени чистоты; количественное определение биологически активных веществ.

Описание. Масло семян амаранта является прозрачной маслянистой жидкостью оранжево-красного цвета с характерным, свойственным амарантовому маслу, запахом, специфическим привкусом без горечи.

Определение физических констант (плотности и показателя преломления) проводили по методике ГФ XI. Плотность исследуемого масла находилась в пределах 0,920-0,930 г/см3, показатель преломления — 1,447-1,452. Определение спектральных характеристик осуществляли методом УФ-спектрофотометрии. Для этого около 0,05 г масла (точная навеска) растворяли в 50 мл этилового спирта и снимали спектр

поглощения в области 200-340 нм. УФ-спектр имеет три максимума при 220±2, 264±2 и 315+2 нм. Отношение значений оптических плотностей при первом и втором максимумах равно 3,5-3,7. Индекс окисленности, рассчитанный по УФ-спектру раствора масла в этаноле составляет 1,7.

Определение химических показателей качества масла проводили по ГФ X, XI и ГОСТам, регламентирующим качество пищевых растительных масел. Нормы допустимых отклонений составили: кислотное число - не более 5 мг КОН/г; число омыления - 160-200 мг КОН/г, иодное число - 90110%; цветное число не должно превышать 50 %.

Определение жирнокислотного состава липидной фракции масла проводили методом ГЖХ. На хроматограмме метиловых эфиров жирных кислот наблюдается 9 пиков, которые выходят в следующей последовательности: лауриновая кислота, миристиновая кислота, пальмитиновая кислота, пальмитолеиновая кислота, маргариновая кислота, стеариновая кислота, олеиновая кислота, линолевая кислота, линоленовая кислота. Следует отметить, что содержание жирных кислот в масле может меняться в зависимости от условий хранения семян, способов получения масла и др.

Определение степени чистоты проводили по показателям: массовая доля общей золы, определение влаги и летучих веществ, определение остаточных органических растворителей. Определение массовой доли общей золы проводили по методике ГОСТа. Эта величина не должна превышать 0,4 %. Определение массовой доли влаги и летучих веществ проводили по методике ГФ XI. Величина массовой доли влаги и летучих веществ не должна превышать 0,35 %.

Определение остаточных органических растворителей. Для получения масла из семян амаранта и дальнейшей очистки используются такие органические растворители как гексан, этанол, хлороформ и поэтому нельзя исключать вероятность того, что они могут присутствовать в конечном продукте. Все растворители относятся к 3 классу токсичности и подлежат нормированию правилами надлежащей производственной практики (GMP). Содержание подобных растворителей в концентрациях менее 0,5 % допустимо и не требует подтверждения. Определение остаточных органических растворителей проводили методом ГЖХ равновесно паровой фазы (РПФ) на газовом хроматографе "Chшm-5" с пламенно-ионизационным детектором. В качестве неподвижной фазы использовали ПЭГА на хроматоне N-AW. Метод заключается в переводе анализируемых веществ из исследуемого материала (масла семян амаранта) в контактирующий с ним воздух в закрытом объеме и анализе пробы воздуха на газовом хроматографе. Пределы обнаружения составили для гексана 106 %; для ацетона - 105 %; для этанола - 105 %.

На рис. 10 представлены хроматограмма стандартного раствора, содержащего определяемые органические растворители в допустимых концентрациях (0,5 % от массы образца) и хроматограммы РПФ над растворами двух исследуемых образцов амарантсзого масла.

Как видно на рис. 10, ни один из исследуемых растворителей не обнаруживается даже в пределах определяемого минимума данного метода. Кроме того, показатель «потеря в массе при высушивании», включающий в себя наличие летучих веществ, в том числе и органических растворителей соответствует нормам НД (табл. 5). Таким образом, амарантовое масло не содержит примесей органических растворителей.

Время удерживания, мин Рис. 10. Хроматограммы РПФ образцов масла семян амаранта (а-б) и стандартного раствора органических растворителей (в) 1-гептан; 2-ацетон; 3-этанол.

Кроме стандартизации масла семян амаранта по физико-химическим показателям, нами предлагается проводить определение содержания биологически активных веществ, поскольку они являются важнейшими показателями качества растительного масла, используемого в фармации.

Для доказательства подлинности а-токоферола (витамин Е) использовали реакцию с концентрированной азотной кислотой. Появление красного окрашивания свидетельствует об образовании о-токоферилхинона.

Кроме того, подлинность -токоферола устанавливали на хроматограммах, полученных при количественном определении методом ВЭЖХ с использованием абсолютной калибровки. Времена удерживания компонентов масла семян амаранта сравнивались с временами удерживания стандартных образцов а-токоферола ацетата (ГСО) на хроматограмме одного из калибровочных растворов. Оно составляет 2,8 мин (Х=284 нм). Содержание токоферола составило 8,1 (образей 1) и 7,5 % (образец 2).

Определение фосфолипидного состава проводили по разработанной нами ТСХ методике с последующей компьютерной обработкой полученных данных. Результаты для двух образцов масла представлены в табл. 10.

Таблица 11

Содержание фосфолипидов в образцах масла семян амаранта

Фосфолипиы Содержание ФЛ в ФЛК Метрологические характеристики

Образец 1 Образец 2

ФХ 45,0 40,0 Бх=0,7; Дх=1,9;е»=4,1 %

ЛФХ 13,6 16,3 8Х=0,2; Дх=0,6;8а=4,4 %

ФИ 15,8 17,7 8Х=0,3; Дх=0,8; ^=5,1 %

ФЭА 22,0 20,0 Бх=0,5; Дх=0,9; е„=4,3 %

Анализ полученных данных показал, что содержание эссенциальных фосфолипидов (ФХ, ФИ и ФЭА) в фосфолипидном комплексе масла семян амаранта составляет в среднем 75 % от массы ФЛК. Содержание незаменимых жирных кислот, таких как линолевая и линоленовая, может достигать 75 % от суммы всех жирных кислот. Содержание а-токоферола (витамина Е) составляет примерно 8 %. Клинические исследования, проведенные в стационарах г.Воронежа, и полученные нами результаты доказывают несомненную перспективность использования амарантового масла в качестве лечебного средства.

Общие выводы

1.Исследованы физико-химические характеристики масла семян амаранта. Установлено, что исследуемое масло по основным физико-химическим параметрам отвечает требованиям ГОСТов, регламентирующих качество растительных масел.

2.Методом ГЖХ установлен жирнокислотный состав масла семян амаранта. Полученные результаты позволяют отнести его к группе полувысыхающих растительных масел линолевой серии. Содержание полиненасыщенных жирных кислот составляет в среднем 75 % от суммы всех жирных кислот.

3.Изучена возможность разделения и фракционирования фосфолипидов с применением сорбентов различной природы. Установлено, что оптимальное разделение фосфолипидов для препаративных целей достигается при использовании неионогенного макропористого сорбента Стиросорб.

4.Проведено разделение и идентификация фосфолипидов методом высоковольтного электрофореза на бумаге. Установлены оптимальные параметры процесса разделения. Разработана методика количественной оценки фосфатидилхолина данным методом. Массовая доля ФХ в ФЛК масла семян амаранта по данным ВЭФ составляет в среднем 52 %.

5.Изучены особенности хроматографического разделения фосфолипидов в тонком слое сорбента. Выбраны и обоснованы условия процесса разделения и анализа фосфолипидов. Впервые разработана

унифицированная методика количественной оценки данных ТСХ фосфолипидов с использованием персонального компьютера. Установлено, что содержание эссенциальных фосфолипидов в ФЛК масла семян амаранта составляет 75 % от массы ФЛК.

6.Сформулированы требования установлены нормы допустимых отклонений по показателям, характеризующим качество растительных масел.

7.Проведена стандартизация масла семян амаранта гибридного по всем параметрам качества, регламентируемым НД. Полученные данные, в частности, высокое содержание эссенциальных фосфолипидов, полиненасыщенных жирных кислот и витамина Е доказывают перспективность использования этого вещества в качестве лекарственного средства.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕДИССЕРТАЦИИ

1. Патент РФ на изобретение №2169734 по заявке № 99125174 от 30.11.1999. Способ разделения фосфолипидов/Селеменев В.Ф., Орос Г.Ю., Железной С.А., Рудаков О.Б., Шестаков А.С., Сафонова Е.Ф., Мануковская А.И., Сливкин А. И.

2. Селеменев В.Ф., Орос Г.Ю., Железной С.А., Шестаков А.С., Железная Т.А., Сафонова Е.Ф., Болотов В.Н., Рудаков О.Б. Энергетические и спектральные характеристики Н-связей в фосфолипидах //Журн. Физич. Химии.-2001. -Т.75, №4. -с. 735-741.

3. Сафонова Е.Ф., Назарова А.А., Селеменев В.Ф., Брежнева Т.А., Сливкин А.И. Выбор оптимальных параметров разделения фосфолипидов в тонком слое сорбента//Хим.-фармац. журн. - 2002. — Т.36, №4. -с. 41-43.

4. Сафонова Е.Ф., Селеменев В.Ф., Ермошевич О.Н., Гречкосей А.В., Макеев А.М. Физико-химические основы хроматографического выделения фосфолипидов из растительных объектов//Сорбционные и хроматографические процессы. -Воронеж, 2001. —Т.1. -Вып. 3.

5. Селеменев В.Ф., Рудаков О.Б., Болотов В.М., Железной С.А., Коновалов В.В., Сафонова Е.Ф. Физико-химические основы фракционирования и идентификации фосфолипидов семян подсолнечника//Хранение и переработка сельхозсырья. -2000. -№12. -с.66-70.

6. Рудаков О.Б., Хрипушин В.В., Сафонова Е.Ф., Железная Т.А. Количественная тонкослойная хроматография фосфолипидов// Сорбционные и хроматографические процессы. -Воронеж, 2002. -Т.2. -Вып. 2.-с. 209-212.

7. Рудаков О.Б., Селеменев В.Ф., Железная Т.А., Орос Г.Ю., Сафонова Е.Ф. Препаративная жидкостная хроматография фосфолипидов// Сорбционные и хроматографические процессы. -Воронеж, 2002. -т.2. -вып. 2. -с.203-208.

8. Назарова А.А., Корнева Т.А., Ковалева Е.В., Рожков П.Н., Сафонова Е.Ф., Рудаков О.Б. Количественная оценка фосфолипидов методом

ВЭТСХ с использованием компьютерного сканирования// Сорбционные и хроматографические процессы. -Воронеж, 2003. -ТЗ. -вып. 2. -с.213-216.

9. Сафонова Е.Ф., Селеменев В.Ф., Макеев А.М., Брежнева ТА, Сливкин А.И.. Корейская И.М. Изучение фосфолипидного состава отходов амарантового масла// Новые и нетрадиционные растения и перспективы их использования: Тр. IV Международного симпозиума. 20-24 июня 2001 г. -М.: Изд-во Российского ун-та Дружбы народов, 2001. -т. 1. -с. 180-182.

Ю.Сафонова Е.Ф., Сливкин А.И., Селеменев В.Ф., Макеев А.М. Выделение и анализ фосфолипидов из амарантового масла//Человек и лекарство: Тез. Докл. Российск. Нац. Конгресса 16-20 апр. 2002. -М.,

2002.-с. ,692.

П.Сафонова Е.Ф., Сливкин А.И., Селеменев В.Ф., Рудаков О.Б., Шевцова Е.М. Количественная оценка фосфолипидов методом ТСХ// Человек и лекарство: Тез. Докл. Российск. Нац. Конгресса апр. 2003. -М.,

2003.-с. ,751.

12.Сафонова Е.Ф., Жигулина О.В.. Селеменев В.Ф.. Сливкин А.И. Определение фосфолипидов методом зонального высоковольтного электрофореза//Современные проблемы хроматографии: Тез. Докл. Всероссийск. Симпозиума. 18-22 марта 2002 г. -М. -2002. -с. 107.

13. Селеменев В.Ф., Сафонова Е.Ф., Брежнева ТА, Бабенко Н.К., Рудаков О.Б., Зяблов А.Н. Изучение фосфолипидов семян амаранта// Химический анализ веществ и материалов: Тез. Докл. Всероссийск. Конф. 16-21 апреля 2000 г. -М. 2000. -с. 137.

14.Селеменев В.Ф., Рудаков О.Б., Коновалов В.В., Сафонова Е.Ф. Физико-химические основы сорбционного выделения и разделения фосфолипидов //Теоретические вопросы адсорбции и адсорбционной хроматографии: Тез. Докл. IX Междуннародной конф. Москва, 2001 г, с. 37.

15.Сафонова Е.Ф.,Селеменев В.Ф., Макеев A.M., Сливкин А.И., Брежнева ТА, Рудаков О.Б. Выделение и анализ фосфолипидов из отходов амарантового масла//Проблемы химии и химической технологии: Tp.DC регион. Конф. -Тамбов, 2001.

16.Сафонова Е.Ф., Порядная Е.Н., Селеменев В.Ф.. Рудаков О.Б. Изучение сорбции фосфолипидов на сорбентах различного типа//'Фагран-2002": тез. Докл. 1 Всероссийск. Конф. "Физико-химические процессы в конденсированном состоянии и на межфазных границах" 11-14 ноября 2002. -Воронеж, 2002.

17. Рудаков О.Б., Селеменев В.Ф., Железная Т.А., Сафонова Е.Ф. Разделение фосфолипидов на неионогенном сорбенте//Хранение и переработка сельхозсырья.- 2002.- № 7.

Сафонова Елена Федоровна (Россия) II U - 1 45 80

Выделение и изучение фосфолипидов масла семян амаранта.

В настоящее время в России организовано опытно-промышленное производство амарантового масла, которое активно продвигается на фармацевтический рынок в качестве биологически активной добавки.

В настоящей работе проведены исследования по оценке качества масла семян амаранта, усовершенствованы методы выделения и фракционирования фосфолипидов (ФЛ) и изучен состав фосфолипидного комплекса масла (ФЛК). Показано, что по основным физико-химическим показателям масло семян амаранта отвечает требованиям ГФ. Методом ГЖХ установлено, что содержание полиненасыщенных жирных кислот составляет в среднем 75 %, причем состав жирных кислот позволяет отнести исследуемый объект к серии полувысыхающих масел линолевой группы. Изучена возможность разделения ФЛК сорбентами различной природы. Установлено, что оптимальное разделение ФЛ для препаративных целей достигается при использовании макропористого неионогенного сорбента МХДЭх100. Разработана методика разделения и идентификации ФЛ методом высоковольтного зонального электрофореза на бумаге. Выбраны и обоснованы условия разделения ФЛ в тонком слое сорбента. Предложена методика количественной оценки данных ТСХ с применением компьютерного сканирования. Установлено, что содержание эссенциальных фосфолипидов в амарантовом масле составляет в среднем 75 % от массы ФЛК. Safonova F. Elena (Russia)

Recovery and study of amaranth seeds oil's phospholipids.

Nowadays the experimental industrial manufacturing of amaranth oil has been organized in Russia. Amaranth oil as a biological additive has been promoted to the pharmaceutical marcet.

The estimation of amaranth seeds oil's quality has been done in this work, the methods of recovery and fractionation of phospholipids (PL) have been improved, the structure of oils' phospholipid complex (PLC) has been studied. It has been shown that the main physico-chemical characteristics of amaranth oil are in accordance with the requirements of normative documentation for fatty plant oils. Using the method of GLC it has been found that the content of olefin fatty acids is approximately 75 % and this content of fatty acids allows to refer the studied object to the serious of semi dried oils of linolic group. The possibility of oils' PLC separation using sorbents of various nature has been studied. The method of separation and identification of PL by zone electrophoresis at high voltage on paper has been suggested. The conditions of PLs separation in the thin layer of sorbent have been chosen and explained. The method of quantitative estimation of TLC data applying computational scanning has been suggested. It has been faund that the content of essential PL in amaranth oil is approximately 75 % of PLC weight.

Заказ № 465 от б 07.2004. Тир 100 экз Лаборатория оперативной полиграфии ВГУ

АКТУАЛЬНОСТЬ РАБОТЫ

Масла большинства дикорастущих растений и культурных сортов принадлежат к числу весьма ценных лекарственных средств, давно используемых в лечебной практике. Они применяются как самостоятельные лекарственные препараты для лечения ожогов и ран, так и в качестве вспомогательных веществ для приготовления инъекционных растворов, мазевых и суппозиторных основ. Кроме того, растительные масла и отходы их производства могут служить источником получения новых лекарственных средств, обладающих уникальным комплексом фармакологических свойств. Лечебный эффект жирных растительных масел обусловлен наличием целого комплекса биологически активных соединений, таких как, токоферолы, эссенциальные фосфолипиды, полиненасыщенные жирные кислоты, фитостерины и др.

В последние годы наблюдается тенденция расширения сырьевой базы за счет внедрения новых нетрадиционных растений и отходов пищевой промышленности. В Воронежском госуниверситете разработана и запатентована методика получения масла из семян амаранта гибридного (Oleum Amaranthacta). Новый способ экстракции и очистки позволяют получить масло с максимально возможным содержанием биологически активных веществ. В настоящее время в России организовано промышленное производство масла семян амаранта, которое активно внедряется на фармацевтический рынок в качестве биологически активной добавки.

В связи с этим возникает необходимость подробного изучения химического состава, совершенствования способов извлечения биологически активных веществ и методов стандартизации жирных растительных масел.

Одним из основных компонентов липидной фракции масла являются фосфолипиды, которые обладают гепатопротекторным, иммуномоделирующим, антиоксидантным и регенерирующим действием. Содержание фосфолипидов в растительных маслах в соответствии с требованиями нормативной документации приводится в суммарном виде. Однако, не все фосфолипиды обладают одинаковым фармакотерапевтическим эффектом. Поэтому весьма актуальным представляется изучение фосфолипидного состава масел, используемых в фармации, а также разработка современных методов разделения и анализа этой группы веществ.

ЦЕЛИ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ

Целью диссертационной работы явились исследования по разработке унифицированных методик разделения, идентификации и количественной оценки фосфолипидов масла семян амаранта с последующей стандартизацией изучаемого объекта по всем параметрам качества.

Для реализации поставленной цели необходимо решить следующие задачи:

- исследовать и оценить физико-химические показатели качества масла семян амаранта;

- установить жирнокислотный состав липидной фракции масла семян амаранта;

- изучить возможности сорбционного выделения фосфолипидов из липидного комплекса масла семян амаранта сорбентами различной природы;

- выбрать оптимальные параметры для фракционирования и идентификации фосфолипидов методом зонального высоковольтного электрофореза на бумаге;

- разработать методику количественного определения фосфолипидов в изучаемых объектах;

- предложить способ стандартизации масла семян амаранта.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА

Проведена оценка качества масла из семян амаранта по физико-химическим показателям, регламентируемым нормативной документацией.

Методом газожидкостной хроматографии установлен жирнокислотный состав липидной фракции масла семян амаранта. Полученные данные позволяют сделать вывод о том, что изучаемое масло идентично растительным маслам линолевой группы с высокой долей пальмитиновой и олеиновой кислот.

Изучен состав липидной фракции масла семян амаранта и установлено наличие следующих компонентов: сквален, стерины, токоферолы, фитостерины, фосфолипиды, свободные жирные кислоты и глицериды жирных кислот.

Изучена сорбционная активность фосфолипидов по отношению к аниониту АВ-17-2П, катиониту КРС, неионогенному сорбенту Стиросорб и высказано предположение о механизме сорбции. Результаты исследования^ положены в основу выделения и фракционирования фосфолипидов из масла семян амаранта. Приоритетность данного исследования подтверждена патентом на изобретение № 2169734 РФ по заявке № 99125174 от 30.11.1999.

Разработаны методики количественного определения фосфолипидов, в основе которых лежат современные физико-химические методы анализа, такие как хроматография в тонком слое сорбенте, высоковольтный электрофорез, спектрофотометрия в УФ-области. По разработанным методикам в масле, полученном из семян амаранта, впервые установлен качественный и количественный состав фосфолипидного комплекса.

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ

Найден новый перспективный источник получения ценных биологически-активных веществ, обладающих гепатопротекторным, иммуномоделирующим и противоожоговым действием.

Определены физико-химические показатели качества масла семян амаранта.

Показана возможность использования сорбционных методов для выделения и фракционирования фосфолипидов с помощью сорбентов различной природы. Изучен механизм сорбции фосфолипидов ионогенными и неионогенными сорбентами. Результаты исследования позволили усовершенствовать метод выделения и фракционирования фосфолипидов из масла семян амаранта

Разработаны новые методики идентификации и количественного определения биологически-активных компонентов масла семян амаранта -фосфолипидов с помощью современных физико-химических методов.

Проведена сравнительная оценка хроматографических, спектральных и электрохимических методов анализа, позволяющих вести контроль за содержанием фосфолипидов в различных растительных объектах.

Разработанные способы фракционирования и методики анализа фосфолипидов могут быть использованы на фармацевтических и пищевых предприятиях для получения лечебно-профилактических препаратов и их стандартизации.

ВНЕДРЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЯ В ПРАКТИКУ

Проведено внедрение разработанных методик выделения, идентификации и количественного определения фосфолипидов в растительных маслах в ЗАО «Инновационные системы ОКБМ» г.Воронежа (акт о внедрении от 25.05.2004); при проведении учебных и научно-исследовательских работ на кафедре органической химии и в «Лаборатории инструментальных методов пищевой химии» Воронежской Государственной Технологической Академии (Акт о внедрении от 24.03.2003 г.), а также на Фармацевтическом факультете Воронежского Госуниверситета (Акт № 5 от 17. 0.1.2002).

ОСНОВНЫЕ ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫДВИГАЕМЫЕ НА ЗАЩИТУ

- результаты определения основных физико-химических показателей качества амарантового масла;

- данные по составу высших жирных кислот в липидной фракции масла семян амаранта;

- методики сорбционного выделения фосфолипидов из фосфолипидного комплекса;

- методика разделения и идентификации фосфолипидов методом зонального высоковольтного электрофореза;

- выбор оптимальных параметров для разделения фосфолипидов в тонком слое сорбента и разработанная на основе этих данных методика количественного определения фосфолипидов;

- изучение качественного и количественного состава фосфолипидов масла семян амаранта.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ

Основные результаты исследования доложены на:

- Всероссийской конференции «Химический анализ веществ и материалов» (г. Москва, 2000 г);

- IV Международном симпозиуме "Новые нетрадиционные растения и перспективы их использования" (г. Москва, 2001 г);

- IX и X Российском национальном конгрессах "Человек и лекарство" (г. Москва, 2002, 2003 гг);

- IX Международной конференции по теоретическим вопросам адсорбции и адсорбционной хроматографии (г. Москва, 2002 г );

- Всероссийском симпозиуме «Современные проблемы хроматографии» (г. Москва, 2002 г);

- Всероссийской конференции «Фагран-2002» (г. Воронеж).

1ТУБЛИКАЦИИ. По материалам диссертации опубликовано 18 работ, в том числе 7 статей, 10 тезисов, 1 патент.

Диссертация изложена на 149 страницах машинописного текста, содержит 22 рисунка, 27 таблиц и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, 3 глав собственных исследований, общих выводов, библиографического указателя, включающего 186 источников и Приложений.

Общие выводы

1. Исследованы физико-химические характеристики масла семян амаранта. Установлено, что исследуемое масло по основным физико-химическим параметрам отвечает требованиям ГОСТов, регламентирующих качество растительных масел.

2. Методом ГЖХ установлен жирнокислотный состав масла семян амаранта. Полученные результаты позволяют отнести его к группе полувысыхающих растительных масел линолевой серии. Содержание полиненасыщенных жирных кислот составляет в среднем 75 % от суммы всех жирных кислот.

2. Изучена возможность разделения и фракционирования фосфолипидов с применением сорбентов различной природы. Установлено, что оптимальное разделение фосфолипидов для препаративных целей достигается при использовании неионогенного макропористого сорбента Стиросорб.

4. Проведено разделение и идентификация фосфолипидов методом высоковольтного электрофореза на бумаге. Установлены оптимальные параметры процесса разделения. Разработана методика количественной оценки фосфатидилхолина данным методом. Массовая доля ФХ в ФЛК масла семян амаранта по данным ВЭФ составляет в среднем 52 %.

5. Изучены особенности хроматографического разделения фосфолипидов в тонком слое сорбента. Выбраны и обоснованы условия процесса разделения и анализа фосфолипидов. Впервые разработана унифицированная методика количественной оценки данных ТСХ фосфолипидов с использованием персонального компьютера. Установлено, что содержание эссенциальных фосфолипидов в ФЛК масла семян амаранта составляет 75 % от массы ФЛК.

6. Сформулированы требования установлены нормы допустимых отклонений по показателям, характеризующим качество растительных масел.

7. Проведена стандартизация масла семян амаранта гибридного по всем параметрам качества,. регламентируемым НД. Полученные данные», в частности, высокое содержание эссенциальных фосфолипидов, полиненасыщенных жирных кислот и витамина Е доказывают перспективность использования этого вещества в качестве лекарственного средства.