Автореферат и диссертация по фармакологии (15.00.02) на тему:Усовершенствование технологии получения глауцина и методов его стандартизации

Серёжечкин Андрей Геннадьевич

Усовершенствование технологии получения глауцина и методов его стандартизации.

15.00.02 - Фармацевтическая химия, фармакогнозия

АВТОРЕФЕРАТ

Диссертации на соискание учёной степени кандидата фармацевтических наук

Серёжечкнн Андрей Геннадьевич

Усовершенствование технологии получения глауцина и методов его стандартизации.

15.00.02 - Фармацевтическая химия, фармакогнозия

АВТОРЕФЕРАТ

Диссертации на соискание учёной степени кандидата фармацевтических наук

Работа выполнена во Всероссийском научно-исследовательском институте лекарственных и

ароматических растений

Научный руководитель:

Доктор химических наук, профессор

Толкачев Олег Никифорович

Официальные оппоненты:

Доктор фармацевтических наук, профессор

Дементьева Наталья Николаевна

Кандидат фармацевтических наук

Лякина Марина Николаевна

Ведущая организация: Институт государственного контроля лекарственных средств ФГУ «НЦЭСМП» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Защита состоится «11» октября 2004 г. в 14 часов на заседании диссертационного совета Д 006.070.01 при Всероссийском научно-исследовательском институте лекарственных и ароматических растений (ВИЛАР) РАСХН по адресу. 117216 г. Москва, ул. Грина, 7.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ВИЛАР по адресу: 117216 г.Москва, ул. Грина, 7.

Автореферат разослан «_»_• 2004 г.

Учёный секретарь диссертационного совета Д 006.070.01 к. с.-х. н.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы Одними из важных задач, стоящих перед современной химико-фармацевтической промышленностью, являются разработка новых препаратов, а также улучшение качества уже известных лекарственных средств.

В начале 60-х годов уже прошлого века Всемирная организация здравоохранения (ВОЗ) разработала требования к современным лекарственным препаратам. Среди таких критериев были безопасность, доступность населению, приемлемость для пациента и эффективность

Заболевания бронхолегочной системы сопровождаются кашлем, представляющим собой хорошо известный, но сложный рефлекс. Лечение кашля заключается, главным образом, в устранении его причины Именно в таких случаях и назначают противокашлевые средства К препаратам, относящимся к этой группе, предъявляется ряд требований. Кроме специфического свойства длительно подавлять кашлевой рефлекс, они не должны угнетать дыхание, оказывать сильное седативное или снотворное действие, не должны вызывать привыкания и пристрастия, уменьшать эффект при длительном применении, повышать артериальное давление, а также не вызывать запор, не раздражать желудочно-кишечный тракт и обладать большой терапевтической широтой.-

Препарат, идеально отвечающий- современным требованиям противокашлевой терапии, подходящий для лечения как детей, так и.взрослых, обладающий доказанной в эксперименте и клинике эффективностью и безопасностью, это глауцина гидрохлорид. Подобно кодеину глауцин подавляет кашлевой цетр, но в отличие от него не угнетает дыхания Препарат не вызывает привыкания и лекарственной зависимости, не замедляет моторику кишечника С первых дней лечения воздействует на выраженность, частоту и характер кашля, облегчает дыхание, снимает ощущение удушья. Кроме противокашлевого действия глауцин обладает еще рядом полезных свойств: анальгетическим, противовоспалительным, спазмолитическим и гипотензивным действием Все эти свойства подтверждены экспериментальными и клиническими данными.

Немаловажное влияние сегодня уделяется экологической стороне технологических процессов, лежащих в основе производства лекарственных препаратов В производстве препаратов на основе растительного сырья часто используют органические растворители В связи с тем, что эти вещества несут огромную опасность для людей, занятых в производстве, все более актуальной становится проблема замены органических растворителей на

неорганические, либо замены одного растворителя на другой, обладающей меньшей токсичностью

Согласно нормативной документации (ИД) определение глауцина в растительном сырье и промежуточных продуктах производства проводят титриметрическими и хроматоспектрофотометрическими методами Им свойственны тайне недостатки, как многостадийность, длительность операций очистки и разделения, недостаточная точность В современном производстве все большее практическое применение находят методы высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) и ЯМР благодаря высокой чувствительности, точности и селективности, а также малой продолжительности анализа Цели работы

изучение пространственного строения и свойств субстанции глауцина гидрохлорида в твердом состоянии и в растворах,

разработка метода количественного определения содержания глауцина в траве мачка желтого с использованием высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ). разработка метода кочичественного определения содержания глауцина в траве мачка желтого с использованием ядерно-магнитного резонанса (ЯМР).

разработка новой эффективной технологии получения глауцина гидрохлорида с заменой экстрагента на головной стадии на экологически безопасный, применением неагрессивных реагентов в отношении используемой аппаратуры.

изучение и оптимизация экстракции алкалоидов мачка желтого из лекарственного растительного сырья. совершенствование способа получения глауцина гидрохлорида. Основные задачи работы

Для достижения поставленной цели необходимо

выбрать достоверные аналитические методы качественного и количественного Определения алкалоидов апорфиновой группы.

изучить хроматографическое поведение глауцина при использовании методов ТСХ и ВЭЖХ, подобрать условия разделения и методы детекцпи глауцина при анализе методом ТСХ.

изучить спектральные характеристики глауцина методами УФ, ЯМР спектроскопии и подобрать условия анализа,

изучить физико-химические свойства глауцина гидрохлорида.

выбрать соответствующие методы экстракции глауцина из травы мачка желтого,

- разработать методику разделения общей суммы алкалоидов травы мачка желтого на

разных стадиях экстракции,

- разработать метод кристаллизации глауцина гидрохлорида. Научная новизна

Методами ТСХ и 'Н-ЯМР спектрометрии показано, что глауцина гидрохлорид представляет собой диастереомерную смесь солей алкалоида.

Разработаны новые методы определения глауцина в траве мачка желтого с использованием ВЭЖХ и ' Н-ЯМР спектрометрии,

Разработан способ получения и очистки глауцина гидрохлорида. Изучены физико-химические свойства глауцина гидрохлорида Практическая значимость работы

Разработана технология получения глауцина гидрохлорида из травы мачка желтого с использованием этанол-фосфатного экстрагента на головной стадии в нескольких вариантах с последующей нейтрализацией кислоты карбонатом кальция, либо смеси последнего с хлоридами кальция или алюминия, обогащением смеси алкалоидов глауцином методом селективной экстракции, получения глауцина гидрохлорида и его очистка методом кристаллизации Предложенный способ получения оформлен в виде заявки на патент

Разработана НД на глауцина гидрохлорид, внесены изменения в действующий регламент на получение глауцина гидрохлорида Апробация работы

Основные результаты работы изложены в трудах ВИЛАР и материалах международной конференции Публикации

По материалам диссертации опубликовано 3 работы и оформлена заявка на патент На защиту выносятся следующие положения

_ результаты разработки методик количественного определения содержания глауцина в

траве мачка желтого с использованием методов ЯМР и ВЭЖХ, I результаты разработки новой технологии получения глауцина гидрохлорида из травы мачка желтого,

~ результаты разработки новой методики кристаллизации глауцина гидрохлорида.

результаты исследований по изучению и оптимизации экстракции алкалоидов мачка желтого из лекарственного растительного сырья.

- результаты спектральных исследований стереохимии и компьютерное моделирование молекулы глауцина гидрохлорида и его фосфата. Объем и структура диссертации

Диссертационная работа изложена на 118 страницах машинописного текста, содержит 13 схем, 15 рисунков, 13 таблиц и 4 диаграммы. Работа состоит из введения, обзора литературы, глав экспериментальных исследований, выводов, списка литературы. Список цитированной литературы включает 102 источника. Из них 32 на иностранных языках. .

Во введении сформулированы актуальность, цели и задачи исследования, научная новизна и практическая значимость работы, положения, выносимые на защиту.

В первой главе на основании краткого обзора данных литературы рассмотрены фармакологические и физико-химические свойства глауцина гидрохлорида Изучены методы его идентификации и количественного определения. Также рассмотрены известные методы получения данного алкачоида

Во второй главе представлена экспериментальная часть, в которую входят результаты по разработке методик количественного определения глауцина гидрохлорида методом ЯМР и ВЭЖХ результаты исследования субстанции глауцина гидрохлорида и изучения экстракции глауцина из травы мачка желтого. Также приведены результаты разработки методики способа получения глауцина гидрохлорида из лекарственного сырья травы мачка желтого и разработки нового способа кристаллизации глауцина гидрохлорида. Изучена пространственная структура молекулы глауцина гидрохлорида. Приведены компьютерные расчеты минимальной потенциальной энергии для наиболее вероятных конформаций единичных молекул основания ачкалоида.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ 2.4. Разработка метола количественного определения глауцина в траве мачка желтого с использованием ВЭЖХ

Подбор условий хроматографического разделения

Для определения содержания глауцина в субстанции нами была разработана методика ВЭЖХ, адаптированная для применения на ПЭЗ ВИЛАР. Выбор оптимальных режимов проведения анализа проводились экспериментально.

Учитывая, что экстракты помимо. глаущша содержат фенольные соединения и таликмидин, обладающий криптофенольными свойствами, а также то, что фосфаты глауцина хорошо растворимы в воде и спирте, мы. предложили проводить экстракцию растения смесью спирта и I % фосфорной кислоты. В этих условиях экстракт содержит существенно меньше фенольных алкалоидов, что хорошо видно на ТСХ, и глауцин более полно извлекается из сырья.

На диаграмме 1 показано влияние концентрации спирта в экстрагенте на.данные содержания глауцина в процентах на сухое сырье.

Диаграмма 1

Оптимизация экстракции глауцина из травы мачка желтого

20. 40 60 80

% спирта в 1% фосфорной кислоте

Аналитическую пробу сырья измельчают, экстрагируют раствором 1 % фосфорной кислоты и спирта этилового в соотношении 4:6 по объему. Полученный экстракт фильтруют и хроматографируют. Влажность сырья определяют в соответствии с Государственной фармакопеей 11-го издания (ГФ XI).

Хроматографию проводят на колонке 15х0,40 см с сорбентом «Кромасил» (Kromasil ™ (AIzo Nobel)) 100 С-18.6 мкм (производства фирмы «Элсико», Россия)

Подвижную фазу для хроматографии готовят из ацетонитрила для хроматографии и 0,03 М раствора дигидрофосфата калия (рН=4,8±0,1) в соотношении 74 26 по объему

Оборудование, хроматограф Gilson (Франция, США) с детекторами Gilson UV 115 при длине волны 280 нм или на хроматограф LCD (Чехословакия) с детектором LCD ГМ 2241, аналого-цифровым преобразователем и программным обеспечением «Юнихром» для Windows 95 («Новые аналитические системы» Минск, Белоруссия) при длине волны 290 нм Для двухволновой детекции используют детектор Gilson UV 116 Приборы оборудованы инжекторами типа «Reodine-2175» с петлей 20 мкл

В качестве раствора стандартного образца использовуют глаушша гидрохлорид ГСО, который растворяют в том же экстрагенте, что и при экстракции травы мачка желтого -смеси 1 % фосфорной кислоты и спирта этилового в соотношении 4 6

Раствор изокориднна готовят из 1 мг изокоридина гидрохлорида и 7 мл смеси фосфорной кислоты и спирта Раствор, содержащий около 140 мкг/мл изокоридина гидрохлорида, смешивают с раствором ГСО глауцина гидрохлорида в соотношении 1:1 и хроматографируют.

Хроматографическая система считается пригодной, если коэффициент разрешения (R,) между пиками изокоридина и глауцина будет не менее 1,1.

Раствор стандарта и исследуемого образца хроматографируют по три раза при скорости потока 1 мл/мин. Средний результат используется для расчетов Расчет ведется по следующей формуле:

X - содержание глауцина основания в сырье в %.

Sx - среднее значение площади под пиком глауцина в хроматограммах экстракта, Ss, - среднее значение площади под пиком глауцина в хроматограммах раствора стандарта, Ша - навеска стандарта глауцина гидрохлорида в мг; ПК - навеска сырья мачка желтого в мг; потеря в массе при высушивании, %

Представленный метод отличается хорошей воспроизводимостью. Нами установлен открываемый минимум глауцина основания в траве мачка желтого - 5 мкг/мл. Линейность зависимости между концентрацией и площадью под хроматографическим пиком глауцина соблюдается во всем диапазоне предполагаемых к использованию концентраций от 12 мг/мл до 0,006 мг/мл.

Рис. 1. Хроматограмма экстракта мачка желтого, где пики 3 и 4 соответствуют времени выхода коридина и нзокоридина, пик 5 - времени выхода таликм клина, а пик 7 - времени выхода глауцина.

Из анализа типичной хроматограммы, представленной на рисунке 1, видно, что «о взятом на анализ экстракте сырья мачка желтого присутствуют вещества, поглощающие в УФ области при 280 нм, которые хорошо отделимы от основного пика. Соотношение площадей пиков в хроматограммах, снятых при длине волны 280 нм и 304 нм, у стандарта глауцина гидрохлорида и у пика глауцина в экстракте совпадают, что доказывает полноту и правильность разделения.

Было найдено, что тест на «пригодность хроматографической системы» удобно проводить, разделяя два нативных алкалоида мачка желтого изокоридина и глауцина. Эти вещества со сходными физико-химическими свойствами содержатся в достаточных количествах в сырье и являются достаточно доступными. Анализ в предлагаемых нами условиях, будет считаться правильным, если коэффициент селективности будет не менее 1,3. На рисунке 1 приводится хроматограмма экстракта, в которой положение изокоридина

указано на . основании. добавки - стандартного; образца • изокоридина, полученного в лаборатории алкалоидов ВИЛАРа. В экстракте может содержаться коридин, который при рН ниже 6,0 плохо разделяется с изокоридином. Но оба алкалоида полностью отделяются от глауцина, что видно на рисунке 1.

Таблица 1

Метрологические характеристики методики количественного определения глауцина в сырье травы мачка желтого

Минимальное количество глауцина определяемое этим методом в сырье было менее 5

мкг/мл.

Таким образом, разработанная нами методика количественного анализа содержания глауцина в траве мачка желтого методом ВЭЖХ, является более точной и быстрой по сравнению с предложенными ранее методами. По существовавшей методике содержание глауцина в траве мачка желтого урожая 2000 г (Северо-Кавказская ЗОС) равно 1,04 ± 0,11 %, а по предлагаемой 1,4 ± 0.04 %.

2.4.3. Разработка метола количественного определения глауцина в траве мачка желтого с использованием ЯМР спектрометрии

При разработке метода количественного определения содержания глауцина в сырье мачка желтого нами проведено изучение влияния различных экстрагентов на полноту извлечения апорфиновых алкалоидов на первой стадии процесса. На этой стадии использовался водно-спиртовый экстрагент, содержащий фосфорную кислоту различной концентрации.

Точную навеску тразы мачка желтого измельчают и экстрагируют кислым 60 % этиловым спиртом. Полученный экстракт, фильтруют, упаривают и экстрагируют хлороформом до полного извлечения глауцина. Хлороформный экстракт фильтруют и упаривают. Полученный экстракт взвешивают и отбирают пробу для анализа.

Количественное содержание глауцина в навеске определют методом *Н ЯМР на спектрометре GEMINI 200 (VARIAN, США) с использованием внутреннего стандарта.

В качестве образца сравнения (внутреннего стандарта) использовался ксантотоксин -стандарт (М. м. 216). Использованный способ извлечения глауцина дает образец с высоким, содержанием глауцина в навеске. Поскольку при измерении ошибка наименьшая при

равенстве площадей анализируемого образца и стандарта, навеску ксантотоксина брали приблизительно в 1,7 раз меньшую, чем анализируемая навеска, что приблизительно соответствует отношению молекулярных масс глауцина и ксантотоксина Проводилось измерение интегральной интенсивности сигналов протона Н-3 глауцина в ^ ЯМР спектре (синглет в области 6,57 м.д.) и протона Н-3 ксантотоксина (дублет при 6,35 м.д.) (рис. 2).

При определении содержания глауцина проводилось измерение интегральной интенсивности сигналов характеристичных ароматических протонов изохинолиновой части молекулы.

Содержание глауцина определяют по следующей формуле:

Гае

X ГЛ *:/• - содержание измеряемого вещества (глауцина) в образце,

™ ст.~ масса стандарта -ксантотоксина, 10 мг;

I гл. — интегральная интенсивность Нз протона глауцина;

I „. — интегральная интенсивность протона Нз стандарта - кентотоксина;

Мгл^ молекулярная масса глауцина (355,16),

М ст.~ молекулярная масса стандарта - ксантотоксина (216);

К— постоянный коэффициент, равный отношению молекулярных весов М гл / М п. - навеска анализируемого образца;

Рис.2. Фрагмент 'Н-ЯМР спектр анализируемого образца глауцина с добавлением ксантотоксина (200МГц, СОСЬ, ТМС=0)

2.5.1. Разработка технологии получения S(+)-nnaymma

Нами предложена новая схема получения глауцина, в которой использованы водные растворы спирта, содержащие фосфорную кислоту. Доказано, что присутствие воды в гидрофильных растворителях значительно увеличивает эффективность извлечения гидрофильных органических соединений. Это обусловлено образованием смеишшых водно-этанольных коньюгатов фосфатов глауцина.

Сравнительные результаты вышеописанных экспериментов приведены в таблице 2.

Из таблицы видно, что наибольший выход готового продукта (70-85 %) и содержания в нем глауцина (97,5-99,5 %) достигается при использовании смеси этилового 60 % водного спирта, подкисленного I % фосфорной кислотой.

Сравнительные данные результатов по выходу конечного продукта и содержанию действующего вещества в зависимости от использования различных экстрагентов на головной стадии процесса, полученные с помощью метода ЯМР.

Л> п/п Экстрагент, применяемый на головкой стадии экстракции Количество извлекаемого глауцина из сырья, % Выход готового продукта, % Содержание глауцина в готовом продукте, %

1. 60 % водный этанол 0,66 37,43.. . . , ?7,0

2. 20 % кислый этанол (1%Н3Ю+) 0,57 17,73 98,0

3. 40 % кислый этанол (1%Н3Р04) 0,86 34,6' 98,0

4. 60 % кислый этанол (1 % Н3РО4) 1,27-1,35 78,4-84,6 98,5-99

5. 60 % кислый этанол (10 % Н3РО4) 1,25-1,34 70-81 97,5-99,5

6 80 % кислый этанол (1 % Н3РО4) 0,82-1,0 50 ' 99,5

Положительный эффект достигается за счет использования смеси трехосновной минеральной (фосфорной) кислоты и водного органического растворителя (спирта, предпочтительное содержание которого в смеси 60 %), полного удаления фосфат-ионов из среды при нейтрализации, предпочтительно в виде труднорастворимых фосфатов кальция, а также использования селективного экстрагента - ароматического растворителя (бензола или толуола) на стадии очистки, а также внесения изменений на заключительной стадии очистки препарата - кристаллизации глауцина гидрохлорида.

Предлагаемый способ позволяет исключить использование агрессивной соляной кислоты, а также токсичных растворителей (дихлорэтана, метанола) на головной стадии процесса, сократить время экстракции на головной стадии до 2-4 часов и обшее время

проведения процесса, исключить процесс набухания сырья на головной стадии и образование эмульсий в процессе экстракции алкалоидов после нейтрализации водно-кислотных экстракций, уменьшить объем используемых растворителей на стадии жидкость-жидкостной экстракции, исключить стадию разделения алкалоидов методом колоночной хроматографии, требующим больших количеств растворителей и окиси алюминия, а также исключить образование побочного фенольного алкалоида таликмидина. который влияет на качество препарата в процессе хранения, увеличивая его чувствительность к свету

2.5.2. Изучение стадии экстракции суммы алкалоидов, содержащей глауцин, из растительного сырья травы мачка желтого

При проведении работ, подтверждающих правильность выбора параметров технологического процесса, были проведены опыты по подбору экстрагента, соотношения сырья и экстрагента, кратности и времени экстракции

1 Влияние природы растворителя на выход суммы аткалоидов и условия опытов

Сырье экстрагировали однократно в течение четырех часов при комнатной

температуре, при перемешивании различными растворителями в соотношении 1 10 соответственно Результаты приведены в таблице 3

Нами было доказано, что использование водно-спиртовых смесей, содержащих 1 % и 10 % фосфорную кисюту, дают одинаковые результаты Данные, приведенные в таблице 3 , показывают, что оптимальным экстрагентом является смесь этиловый спирт, разбавленный 1 % фосфорной кислотой до 60 %

На диаграмме 7 показано, что добавление к водно-спиртовому раствору I % фосфорной кислоты дает увеличение выхода более чем в 2 раза

2 Влияние времени экстракции на выход суммы растворителей

Данные экспериментов по подбору времени экстракции 60 % кислым спиртом приведены в таблице 4 Соотношение сырья и растворителя - I 10 Экстракцию проводили при комнатной температуре Для установления оптимального времени диффузии было проведено три варианта экстракции алкалоидов из сырья Выход суммы алкалоидов . определяли весовым методом

Влияние природы растворителя на выход глауцина.

Растворитель Концентрация спирта, % Выход глауцина, %

Водно-спиртовая смесь 20 0,33

40 0,41

60 0,66

80 0,51

Водно-спиртовая смесь, содержащая 1% Н3РО4 20 0,57

30 0,70

40 0,86

60 1,35

80 0,82

Водко-сгшртовая смесь, содержащая 10 % Н1РО4 60 1,32

1% Н3РО4 - 0,36

Диаграмма 2.

Влияние фосфорной кислоты иа выход глауцина гидрохлорида

□Водно-спиртовая смесь

■Водно-спиртовая смесь с добавлением 1% фосфорной кислоты

Влияние времени экстракции на выход суммы алкалоидов

Время экстракции, ч Выход суммы алкалоидов в первом сливе, %

2 1,08

4 1,62

6 1,60

Из данных, приведенных в таблице 4, можно сделать вывод, что оптимальное время экстракции составляет 4 часа.

3. Влияние кратности экстракций на выход суммы алкалоидов.

В экспериментах по извлечению суммы ачкалоидов по сливам было установлено. что для полного извлечения из сырья достаточно провести четырехкратную экстракцию травы мачка желтого 60 % кислым спиртом при комнатной температуре в течение четырех часов. При этом coat ношение сырья и экстрагента должно быть 1:10.

Таблица 5

Выход суммы алкалоидов в зависимости от количества экстракций

Количество экстракций Выход суммы алкалоидов, г

1 1.41

2 0.51

3 0,33

4 0,15

5 0,12

Остаток в шроте 0,04

Из данных, приведенных в табл. S следует, что основная масса алкалоидов переходит в 1,2,3 и 4-й экстракты. 2.6.1. Описание способа получения глауцина-

Нами проведена экстракция глауцина из надземной части сырья мачка желтого разными экстрагентами на головной стадии. экстракции с последующим получением глауцинсодержащих фракций как в виде соли, так и в виде основания, которая изображена на схеме 1.

Траву мачка желтого экстрагируют смесью 60 % кислого спирта и 1 % фосфорной кислоты четырехкратно.

2.53. Технологическая схема получения глауцина гидрохлорида

Схема 1. Технологическая схема получения глауцина гидрохлорида

Экстракты. концентрируют в вакууме до кислого кубового остатка, который обрабатывают хлористым кальцием и затем углекислым кальцием. Выпавший осадок фосфатов кальция отделяют, подщелачивают гидратом окиси аммония и экстрагируют бензолом или толуолом. При первой обработке водной фазы органическим растворителем из раствора выпадает осадок фосфатов аммония, который фильтруют, а фильтрат экстрагируют бензолом. Из органической фазы после обычной обработки и упаривания в вакууме получают глауцин, который превращают в гидрохлорид в растворе метанола действием концентрированной соляной кислоты согласно известному способу.

2.6.2.Усовершенствования способа кристаллизации глауцина гидрохлорида

Предложен способ получения глауцина гидрохлорида из основания, которое заключается в следующем.

Очищенное основание - алкалоида, полученное вышеописанным способом, растворяют в горячем спирте (70 "С), добавляют избыток спиртового раствора соляной кислоты, сразу же начинается кристаллизация. В горячий раствор добавляют ацетон, перемешивают, к творожисто-образной реакционной массе прибавляют петролейный эфир и оставляют стоять при комнатной температуре. Перемешивают, фильтруют под вакуумом, тщательно отжимают и промывают ацетоном. Полученный продукт сушат сначала на воздухе при комнатной температуре, а затем в вакуум-сушильном шкафу, измельчают и просеивают. Получают белый аморфный порошок со слегка розоватым, желтоватым или сиреневатым оттенком. Выход готового продукта 86,29 %. Из маточных растворов аналогичным образом получают дополнительно еще 12,90 % вещества. Общий выход 99,19 % (в прототипе выход целевого продукта достигает 70-80%).

При использовании для очистки технического глауцина гидрохлорида по этой методике происходит очистка алкалоида без применения колоночной хроматографии.

2.7. Характеристика готового продукта

Глауцин (^Щ^^) относится к группе апорфиновых алкалоидов и имеет структурную формулу (I).

Состав глауцина гидрохлорида отвечает формуле C21H25O4N*HC1, т.пл. 228-230 °С (разл.), Мм. 391,5. Угол оптического вращения [а]о18 +111° (с 2,08; хлф.).

I

Приведенный на рис. 3 УФ-спектр полученного глауциыа гидрохлорида характеризуется максимумами поглощения при 218, 280 и 300 нм, что соответствует максимумам поглощения глауцина-стандарта.

• <»» 4ММ

Х.Ш -—--;—-—;----------;------——;-

<»• ЯМ »* 1»|

Рис. 3. УФ спектр глауинна гидрохлорида (спирт 0,0005 % раствор)

Глауцина гидрохлорид представляет собой порошок без запаха, слегка желтоватого или розоватого оттенка: хорошо растворим в воде, спирте, хлороформе; нерастворим в бензоле, серном и петролейном эфирах. Объемный вес - 580 г/л.

В 'Н-ЯМР спектре глауцина гидрохлорида (рис. 4) наблюдается дублеты в области 13 нм, относящиеся к группе, три дублета при 6,68; 6,76; 6,82 нм, которые относятся к протонам Н-11, Н-8 и Н-3 соответственно. Дублеты при 4 и 3,9 нм имеют относятся к метоксильным группам во 2, 10 и И положении, а дублет при 3,8 к метоксилу в положении 1. Дублет при 3,1 нм относится к N-Me группе.

Наличие сигналов в виде дублетов при 3,1 и 2,8 нм свидетельствуют о том, что молекулы алкалоида в виде основания отсутствуют. Присутствие молекул алкалоида в виде основания приводит к обмену между состоянием основание - соль, в результате чего сигнал N-Me группы превращается в уширенный синглет. Присутствие небольшого количества основания уменьшает стабильность соли, что резко ухудшает качество продукта и срок его хранения.

На рис. 5 приведена хроматограмма ВЭЖХ полученного нами глауцина гидрохлорида. Пик 4 соответствует времени выхода глауцина гидрохлорида. Чистота продукта - 99,5 %.

в

10

05

00

Рис. 5 ВЭЖХ - хроматограмма глауцина гидрохлорила

Рис. 4. 1Н-ЯМР спектр молекулы глаушша гидрохлорида (200МГц, СОСЬ, ,ТМС=0)

2 8 0 стереохимии реакции протонирования молекулы глауцина

В процессе изучения качества производственных партий субстанции глауцина гидрохлорида нами использовались методы 'Н ЯМР спектроскопии и ТСХ на силикагеле (SilufЫ, ЧССР, система хлороформ - этанол, 10 1), которыми было показано, что субстанция препарата представляет собой смесь двух изомерных солей (диагтереомеров) в соотношении около 1 3

В Н ЯМР спектрах гидрохлорида, в отличие от основания алкалоида, наблюдались удвоенные сигналы трех протонов ароматических протонов (все синглеты), N метилиммониевых групп, а также метиленовых и метанового протонов колец В и С При этом обращает на себя внимание небольшое различие химических сдвигов протонов соответствующих изомерных метилиммониевых групп (Д6 = окою 0,08 мд) Протонированный атом азота является новым центром хиральности в алкалоиде, который может обусловливать различия в физико-химических свойствах солей Таким образом, речь идет об асимметрической индукции процесса солеобразования атома азота центром асимметрии С6а Компьютерный расчет наиболее вероятных конформаций единичных молекул основания алкалоида и ее ионизированных форм методом молекулярной

механики (расчет минимальной потенциальной энергии по программе ММ2) показал, что тетрагидроизохинолиновое кольцо (В) алкалоида находится в предпочтительной конформации искаженного кресла. Барьер инверсии N-метильной группы в глауцине N,Me <-► NcMe (29,338 - 28,628 = 0,710 ккал/моль) при 300" К, причем обе конформации, как видно из расчетов, практически равновероятны. Минимальная потенциальная энергия протежированных форм глауцина соответственно равна для форм 27,32 и

26,51 ккал/моль, что соответствует разнице 0,81 ккал/моль. Из этого следует, что Сб>-Н атом практически; не влияет на стереохимию протонирования глауцина при условиях близких к экспериментальным. Таким образом, геометрия исходной молекулы основания алкалоида не позволяет однозначно интерпретировать подобную стереоспецифичность реакции протонирования алкалоида глауцина Компьютерные расчеты показали также, что молекулы солей глауцина склонны образовывать димерные супрамолекулярные гидратнрованные ассоциаты в растворах, в которых молекулы алкалоида связаны попарно между собой водородной связью, а также гидрофобными, Ван-Дер-Ваальсовыми и другими взаимодействиями При этом ассоциаты представляют собой равновесную смесь двух молекул солей во взаимно инвертированной форме (инвертомеров) тетрагидроизохинолинового фрагмента С1 «-► 1С (А-А' и В-В"). Это сопровождается значительным выигрышем суммарных потенциальных энергий (£ Е = -80 и -70 ккал/моль соответственно для негидратированных молекул). Геометрия N-Me групп в них близки, что может объяснить близость сигналов протонов в 'Н ЯМР-спектрах. В результате было показано, что образование обоих димерных ассоциатов (На) (NH-Нба-цис) (2Е -116,8 ккал/мол для гидрата) и (lib) (NH-Нба-транс) (2Е -120,8 ккал/мол для гидрата) энергетически равновероятно. Таким образом, ассоциация глауцина гидрохлорида, по всей вероятности, стабилизирует конформацию молекул в ассоциатах, может быть объяснением причины подобного поведения и свойств препарата.

HjCO

Н3С

Н3СО"

Н3С(

Н3СО'

H3CI

la

lb

ВЫВОДЫ:

1) Проведен системный анализ литературных источников по методам анализа и методам получения глауцина гидрохлорида

2) Разработан оптимальный вариант экстракции на первой стадии процесса в результате изучения режимов экстракции различными растворителями.

3) Разработаны методики количественного определения глауцина с использованием ЯМР, ВЭЖХ, предложен новый проект ФС на глауцина гидрохлорид.

4) Разработана технология получения глауцина гидрохлорида из травы мачка желтого, которая позволила исключить токсичные растворители (дитхлорэтан, метанол) на головной стадии процесса, сократить время экстракции и общее время проведения процесса, уменьшить объем используемых растворителей.

5) Разработана новая методика кристаллизации глауцина гидрохлорида из маточных растворов, которая позволила заменить токсичный метанол на более безопасный в этом отношении этиловый спирт.

6) Предложен способ получения препарата, который оформлен в виде заявки на патент (Заявка РФ №2003103083 от 04.02.2003).

7) Проведен компьютерный расчет предпочтительных конформаций основания глауцина, мономеров изомерных гидрохлоридов и их димеров, а также фосфатов глауцина. Показано, что физико-химические свойства субстанции препарата обусловлены их пространственным строением.

8) Показано методами тонкослойной хроматографии и ЯМР спектрометрии, что гидрохлорид глауцина в кристаллическом состоянии представляет собой смесь диастереомерных солей в соотношении 1:3.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Шейченко О.П., Шейченко В.И., Сережечыш А.Г., Толкачев ОН., Быков В.А. О получении и очистке глауцина гидрохлорида. // Материалы международной научной конференции, посвященной памяти профессора Алексея Ивановича Шретера. - Москва- ВИЛАР, 2004. - Т. 1. - С. 340-341

2. Сережечкин А Г., Толкачев ОН.. Мачек желтый - методы аналитического контроля (обзор). // Химия, технология, медицина. - Москва: ВИЛАР, 2003. - Т. XVI. - С. 90-98.

3. Шейченко О.П., Сережечкин А.Г., Шейченко В.И., Лапа Г.Б, Толкачев О.Н., Быков В.А., Сокольская ТА. Способ получения (+)-глауцина. // Заявка РФ №2003103083 от 04.02.2003.

4. Сережечкин А.Г., Лапа Г.Б., Шейченко В.И., Толкачев О.Н. О стереохимии N протонирования глауцина. // Химия, технология, медицина. Сборник научных трудов, посвященный 70-летию ВИЛАР. - Москва: ВИЛАР, 2000. - С. 63-64.

Подписано к печати 06/09/2004 г. Формат А5. Бум. тип. печать ризогр. Тираж 100 экз. Научно-исследовательский и учебно-методический Центр биомедицинских технологий ВИЛАР, 123056, Москва, ул. Красина, 2

111620*

Подписано к печати 06/09/2004 г. Формат А5. Бум. тип. печать ризогр. Тираж 100 экз. Научно-исследовательский и учебно-методический Центр биомедицинских технологий ВИЛАР, 123086, Москва, ул. Красина, 2

Актуальность темы. Одними из важных задач, стоящих перед современной химико-фармацевтической промышленностью, являются разработка новых препаратов, а также улучшение качества уже известных лекарственных средств.

В начале 60-х годов уже прошлого века Всемирная организация здравоохранения (ВОЗ) разработала требования к современным лекарственным препаратам. Среди таких критериев были безопасность, доступность населению, приемлемость для пациента и эффективность.

Заболевания бронхолегочной системы сопровождаются кашлем, представляющим собой хорошо известный,- но сложный рефлекс. Лечение кашля заключается, главным образом, в устранении его причины., Именно в таких случаях и назначают противокашлевые средства. К препаратам, относящимся к этой группе, предъявляется ряд требований. Кроме специфического свойства длительно подавлять кашлевой рефлекс, они не должны угнетать дыхание, оказывать сильное седативное или снотворное действие, не должны вызывать привыкания и пристрастия, уменьшать эффект при длительном применении, повышать артериальное давление, а также не вызывать запор, не раздражать желудочно-кишечный тракт и обладать большой терапевтической широтой.

Препарат, идеально отвечающий современным требованиям противокашлевой терапии, подходящий для лечения как детей, так и взрослых, обладающий доказанной в эксперименте и клинике эффективностью и безопасностью, это глауцина гидрохлорид. Подобно кодеину глауцин подавляет кашлевой центр, но в отличие от него не угнетает дыхания. Препарат не вызывает привыкания и лекарственной зависимости, не замедляет моторику кишечника. С первых дней лечения воздействует на выраженность, частоту и характер кашля, облегчает дыхание, снимает ощущение удушья. Кроме противокашлевого действия глауцин обладает еще рядом полезных свойств: анальгетическим, противовоспалительным, спазмолитическим и гипотензивным действием. Все эти свойства подтверждены экспериментальными и клиническими данными.

Немаловажное внимание сегодня уделяется экологической стороне технологических процессов, лежащих в основе производства лекарственных препаратов. В производстве препаратов на основе растительного сырья часто используют органические растворители. В связи с тем, что эти вещества несут опасность для людей, занятых в производстве, все более актуальной становится проблема замены органических, растворителей, на, неорганические,- либо замены, одного растворителя на другой, обладающей меньшей токсичностью.

Согласно нормативной документации (НД) определение глауцина в растительном сырье и промежуточных продуктах производства проводят титриметрическими и хроматоспектрофотометрическими методами. Им свойственны такие недостатки, как многостадийность, длительность операций очистки и разделения, недостаточная точность. В современном производстве все большее практическое применение находят методы высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) и ЯМР благодаря высокой чувствительности, точности и селективности, а также малой продолжительности анализа.

Цели работы

- изучение пространственного строения и свойств субстанции глауцина гидрохлорида в твердом состоянии и в растворах;

- разработка метода количественного определения содержания глауцина в траве мачка желтого с использованием высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ);

- разработка метода количественного определения содержания глауцина в траве мачка желтого с использованием ядерно-магнитного резонанса (ЯМР);

- разработка новой эффективной технологии получения глауцина гидрохлорида с заменой экстрагента на головной стадии на экологически безопасный, применением неагрессивных реагентов в отношении используемой аппаратуры;

- изучение и оптимизация экстракции алкалоидов мачка желтого из лекарственного растительного сырья.

- усовершенствование способа получения глауцина гидрохлорида.

Основные задачи работы

Для достижения поставленной цели необходимо:

- выбрать достоверные аналитические методы качественного и количественного определения алкалоидов апорфиновой группы;

- изучить хроматографическое поведение глауцина при использовании методов ТСХ и ВЭЖХ, подобрать условия разделения и методы детекции глауцина при анализе методом ТСХ;

- изучить спектральные характеристики глауцина методами УФ, ЯМР спектроскопии и подобрать условия анализа;

- изучить физико-химические свойства глауцина гидрохлорида;

- выбрать соответствующие методы экстракции глауцина из травы мачка желтого;

- разработать методику разделения общей суммы алкалоидов травы мачка желтого на разных стадиях экстракции;

- разработать метод кристаллизации глауцина гидрохлорида.

Научная новизна

Методами ТСХ и 'Н-ЯМР спектрометрии показано, что глауцина гидрохлорид представляет собой диастереомерную смесь солей алкалоида;

Разработаны новые методы определения глауцина в траве мачка желтого с использованием ВЭЖХ и !Н-ЯМР спектрометрии;

Разработан способ получения и очистки глауцина гидрохлорида; Изучены физико-химические свойства глауцина гидрохлорида.

Практическая значимость работы

Пересмотрена технология получения глауцина гидрохлорида из травы мачка желтого с использованием этанол-фосфатного экстрагента на головной стадии в нескольких вариантах с последующей нейтрализацией кислоты карбонатом кальция, либо смеси последнего с хлоридами кальция или алюминия, обогащением смеси алкалоидов глауцином методом селективной экстракции, получения глауцина гидрохлорида и его очистка методом кристаллизации. Предложенный способ получения оформлен в виде заявки на патент.

Разработана НД на глауцина гидрохлорид, внесены изменения в действующий регламент на получение глауцина гидрохлорида.

Апробация работы

Основные результаты работы изложены в трудах ВИЛАР и материалах международной конференции.

Публикации

По материалам диссертации опубликовано 3 работы и оформлена заявка на патент.

На защиту выносятся следующие положения

- результаты разработки методик количественного определения содержания глауцина в траве мачка желтого с использованием методов ЯМР и ВЭЖХ;

- результаты разработки новой технологии получения глауцина гидрохлорида из травы мачка желтого;

- результаты разработки новой методики кристаллизации глауцина гидрохлорида;

- результаты исследований по изучению и оптимизации экстракции алкалоидов мачка желтого из лекарственного растительного сырья;

- результаты спектральных исследований стереохимии и компьютерное моделирование молекулы глауцина гидрохлорида и его фосфата.

Объем и структура диссертации

Диссертационная работа изложена на 118 страницах машинописного текста, содержит 13 схем, 15 рисунков, 13 таблиц и 4 диаграммы. Работа состоит из введения, обзора литературы, глав экспериментальных исследований, выводов, списка литературы. Список цитированной литературы включает 102 источника. Из них 32 на иностранных языках.

ОБЩИЕ ВЫВОДЫ:

1) Проведен системный анализ литературных источников по методам анализа и методам получения глауцина гидрохлорида.

2) Разработан оптимальный вариант экстракции на первой стадии процесса в результате изучения режимов экстракции различными растворителями.

3) Разработаны методики количественного определения глауцина с использованием ЯМР, ВЭЖХ, предложен новый проект ФС на глауцина гидрохлорид.

4) Разработана технология получения глауцина гидрохлорида из травы мачка желтого, которая позволила исключить токсичные растворители (дитхлорэтан, метанол) на головной стадии процесса, сократить время экстракции и общее время проведения процесса, уменьшить объем используемых растворителей.

5) Разработана новая методика кристаллизации глауцина гидрохлорида из маточных растворов, которая позволила заменить токсичный метанол на более безопасный в этом отношении этиловый спирт.

6) Предложен способ получения препарата, который оформлен в виде заявки на патент (Заявка РФ №2003103083 от 04.02.2003).

7) Проведен компьютерный расчет предпочтительных конформаций основания глауцина, мономеров изомерных гидрохлоридов и их димеров, а также фосфатов глауцина. Показано, что физико-химические свойства субстанции препарата обусловлены их пространственным строением.

8) Показано методами тонкослойной хроматографии и ЯМР спектрометрии, что гидрохлорид глауцина в кристаллическом состоянии представляет собой смесь диастереомерных солей в соотношении 1:3.