Автореферат и диссертация по фармакологии (15.00.02) на тему:Унификация методов стандартизации флавоноидов в процессе производства препаратов боярышника, зверобоя и календулы

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ И МЕДИЦИНСКОЙ

ПРОМЫШЛЕННОСТИ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ ФАРМАЦИИ

на правах рукописи

РГ Б ОД

; • • • ''ХАКИМОВА ДШОРОМ РАХМАТУЛЛОЕВНА

УНИФИКАЦИЯ МЕТОДОВ СТАНДАРТИЗАЦИИ ФЛАВОНОЦЦОВ 3 ПРОЦЕССЕ ПРОИЗВОДСТВА ПРЕПАРАТОВ БОЯРЫШНИКА, ЗВЕРОБОЯ И КАЛЕНДУЛЫ

Специальности 15.00.02 - фармацевтическая химия и

фармакогнозия

15.00.01 - технология лекарств и организация фармацевтического дела

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата фармацевтических наук

Москва - 1994

Работа выполнена в Научно-исследовательском институте фармации Министерства здравоохранения и медицинской промышленности Российской Федерации

Научный руководитель:

доктор фармацевтических наук, старший научный сотрудник Д.М.Попов

Официальные оппоненты:

доктор фармацевтических наук, старший научный сотрудник Н.Н.Дементьева

кандидат фармацевтических наук, доцент

Н.Г.Селезенев

Ведущая организация - Московская медицинская академия им. И.М.Сеченова

Защита состоится " 15" " 931995 г. в 4Ц ^часов на заседании специализированного Совета Д 074.28.01 при Научно-исследовательском институте фармации по адресу: П7418, Москва, ул. Красикова, 34.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке института Автореферат разослан " •// " ¿И-сЬд^Л- 1994~г.

Ученый секретарь специализированного Совета Д 074.28.01, кандидат фармацевтических наук, страший научный сотрудник

Л.М.Боброва

ОЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОШ

Актуальность темы. В настоящее время лекарственные растения пользуются большим спросом. Лечебные препараты, приготовленные из растительного сырья, составляют около 50 % от обшего объема выпускаемых препаратов. Разработ/ ка специфических методик определения биологически активных веществ является необходимым условием изучения лекарственных растений.

Среди всего многообразия методов анализа лекарственных препаратов выделяются и приобретают все большее значение физико-химические методы. Это объясняется тем, что их использование ведет к значительному сокращению времени и веществ, затрачиваемых на анализ, кроме того, физико-химические методы характеризуются большей точностью и надежностью. В последние годы в фармакопеи разных стран включены такие физико-химические методы как: фотоколориметрия, экстракционная фотометрия, спек-трофотометрия в УФ-области, полярография, рефрактометрия, хроматография на бумаге и в тонком слое сорбента,газовая, газожидкостная, ВЗЗХ и др.

При знакомстве с литературой, где широко публикуются работы по применению современных методов количественного определения лекарственных веществ, выявляется крайняя неравномерность в разработке методик анализа: существует большое количество препаратов, для которых разработаны методики с применением практически всех методов анализа; для других же препаратов физико-химические методы анализа не разработаны совсем. К их числу можно отнести и растительное сырье и препараты из него.

В качесгве объектов исследования были выбраны боясышник, зверобоя и календула, широко применяемые в современной медицинской практике. Основными действующими веществами этих растений являются флавоноиды, но методы их анализа в препаратах и сырье боярышника, зверобоя и календулы разработаны недостаточно.

В последние годы разработаны фотометрические методы количественного определения флавоноидов после проведения окрашенных реакций. Но наибольшее распространение получили спектральные методы анализа. УФ-спектрофотометрический метод, ВЗХХ и ТСХ-денситометрия имеют большие потенциальные возможности при стандартизации флавоноидов в лекарственном сырье и препаратах. Это соответствует современным требованиям, предъявляемым к фармацевтическому анализу.

Вследствие этого, выбор оптимального метода и разработка методик количественного определения флавоноидов в указанных • объектах является актуальной проблемой.

Цель исследования. Выбор оптимального метода количественного определения флавоноидов, подбор условий и разработка унифицированной методики количественного определения флавоноидов в сырье, препаратах и шроте боярышника, зверобоя и календулы, усовершенствование технологий настоек, экстрактов, а также водных извлечений из исследуемого сырья.

Задачи исследования:

I. Изучить литературу по следующим направлениям: сведения о химическом составе, биологической активности и методах анализа боярышника, зверобоя и календулы, технология приготовления препаратов из сырья исследуемых растений.

2. Провести сравнительную оценку доступных методов анализа флавоноидов с целью выбора оптимального.

3. Подобрать условия и разработать унифицированную методику количественного определения флавоноидов в сырье, псепаратах и шроте боярышника, зверобоя и календулы с использованием выбранного метода.

4. Использовать разработанную методику в процессе производства препаратов боярышника, зверобоя и календулы.

5. Разработать нормативно-техническую документацию на жидкий экстракт и настойку боярышника, с включением разработанных методик.

Научная новизна. Подобраны условия проведения реакции комплексообразования флавоноидов с алюминия хлоридом в уксусно-уротропиновом буферном растворе (количество реагентов, взятых для анализа, температура и время проведения реакции, рН-среда), определены основные факторы, влияющие на максимальную экстракцию флавоноидов из сырья (величина частиц сырья, природа экстрагента, соотношение сысья и экстрагента, время и температура экстракции), которые положены в основу разработки унифицированных методик определения флавоноидов на всех стадиях производства препаратов, го есть в сырье, готовом продукте и шроте боярышника, зверобоя и календулы.

Комплексом методов (спектрофогомегрическим и ТСХ) выявлено, что основным фактором, влияшим на полноту экстракции флавоноидов при изготовлении водных извлечений и настоек из боярышника, зверобоя и календулы, а также жидкого экстракта из боярышника, является измельченность сырья, при этом величина час-

год сырья 0,5 мм дает значительную экономию сырья: для боярышника - в 6 раз, для зверобоя - в 4 раза, для календулы -в 2 раза. Для использования мелкоизыельченного сырья разработана одноразовая упаковка, которая лает возможность качественного приготовления зодных извлечений з домашних условиях. Определены условия хранения одноразовой упаковки и сроки их годности

Учитывая го, что трава зверобоя имеет плотную структуру и содержит значительное количество дубильных веществ, в процессе экстракции под действием капиллярных сил вода пропитывает растительное сырье, заполняет межклеточное пространство и проникает внутрь клеток интенсивнее при увеличении времени нагревания, вследствие чего влияние времени нагревания оказывается более значительным, чем время, настаивания, в этой связи максимальное извлечение действующих'^йз травы зверобоя осуществляется при нагревании водного извлечения в течение 30 минут и последующем настаивании в течение 10 минут, а при изготовлении водных извлечений из плодов боярышника - нагревание в течение 30 минут и последующее настаивание в течение 45 мин.

В процессе исследования были разработаны пути усовершенствования технологии настоек, экстрактов и водных извлечений из боярышника, зверобоя и календулы, заключающиеся в уменьшении величины частиц сырья, увеличении концентрации экстрагента (спирта), изменения температуры и времени экстракции и перемешивании экстрагента во время процесса экстрагирования.

Практическая значимость, работы. На основании проведенных исследований разработаны и внедрены:

- методики качественного и количественного анализа флаво-

ноияов в экстракте боярышника жидком (проект £С на "Экстракт боярышника жидкий" направлен в Фармакопейный комитет. Письмо № 7-12/812 от 16.03.94 г.).

- методики качественного и количественного анализа флазо-ноицов в настойке боярышника (Проект ФС направлен на Ярославскую фармацевтическую фабрику для согласования. Письмо № 7-6/ 560 от 27.04.93 г.)

Публикации. По теме диссертации опубликовано 5 печатных работ.

Апробация работы. Основные положения диссертации доложены на Республиканской научной конференции по фармации и фармакологии (Пятигорск, 1993), в материалах Республиканской научно-практической конференции (проблемы фармацевтов Таджикистана, 20-21 декабря 1991).

Связь задач исследования с проблемным планом фармацевтической науки. Диссертационная работа выполнена в соотсет-ствии с тематикой и планом научно-исследовательских работ На-учно-исслеповательского института фармации (номер государственной регистрации 0192.017260) и Межведомственным советом по фармации $ 47 АМН РФ.

На защиту выносятся:

- сезультатн исследования по выбору оптимального метопа количественного определения флавоноидов;

- унифицисозанняя методика количественного определения флавоноидов в сырье, препаратах и шроте боярышника;

- унифицированная методика количественного определения Флавоноидов в сырье, препаратах и шроте зверобоя:

- унифицированная методика количественного определения флавоноидов в сырье, препаратах и шроте календулы;

- результаты по усовершенствованию технологии настоев, настоек и экстрактов боярышника, зверобоя и календулы.

Объем и структура диссертации. Работа изложена на 128 страницах машинописного текста, содержит 25 таблиц и 8 рисунков. Работа состоит из введения, обзора литературы, трех экспериментальных глав, общих выводов, списка литературы 185 наименований, из них 37 на иностранных языках.

Во введении раскрыта актуальность темы, определены цели й задачи исследования, сформулированы научная новизна и практическая значимость работы.

В первой главе рассмотрены сведения о химическом составе исследуемых объектов, биологическом действии, выделении, идентификации и количественном определении флавоноидов, а также технология производства лекарственных препаратов из растительного сырья.

Во второй главе изучается сравнительная оценка методов анализа флавоноидов с целью выбора оптимального.

Третья глава посвящена разработке унифицированных методик количественного определения-флавоноидов в сырье, препаратах и шроте боярышника, зверобоя и календулы с использованием выбранных методов.

В четвертой главе изучается применение разработанных унифицированных методик определения флавоноидов в процессе производства препаратов боярышника, зверобоя и календулы.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

СРАВНИТЕЛЬНАЯ ОЦЕНКА МЕТОДОВ АНАЛИЗА ФЛАВОНОИДОВ С ЦЕЛЬЮ ВЫБОРА ОПТИМАЛЬНОГО

Несмотря на то, что для количественного определения флавоноидов предложены различные методы: титриметрические, фотоколориметрические, спектральные в УФ- и ИК-областях спектра, хроматографические, ВЭНХ и т.д., однако, в вышеописанных методиках дана воспроизводимость и точность методов, сравнительных данных по результатам, полученным различными методами в работах не представлено, а также не проведено исследований по выбору оптимального метода количественного определения флавоноидов.

Для подбора оптимального метода исследования флавоноидов использовались 0,02 % растворы рутина на 50 % этаноле, разлитые в ампулы и подвергшиеся воздействию температуры, кислоты и щелочи. Образцы растворов рутина после 30 и 60 суток хранения в вышеуказанных условиях были проанализированы с использованием фотоколориметрического метода по реакции диазотирования, У5-спектрофотометрического метода, спектрофотометрического метода по реакции комплексообразования с алюминия хлоридом и уротропином, спектрофотометрического метода по реакции комплексообразования с алюминия хлоридом без уксусно-уротропинового буферного раствора и хроматографического метода.

В качестве контрольного нами был выбран метод высокоэффективной жидкостной хроматографии. ВЭНХ проводили на приборе "Вес^ппеШ" модель 344 с УФ-детектороы с переменной длиной волны. Колонка 25 см с внутренним диаметром 4,6 мм, заполненная

адсорбентом "Ультрасфер"ODS с величиной частиц 5 мкм; элю-ент вода-изопропанол-уксусная кислота (13:6:1). Детектирование проводили при длине волны 257 ни; скорость потока элюента 0,5 мл в минуту; площадь пиков на хроматограммах измеряли с помощью интегратора.

Результаты анализов после 30 и 60 суток хранения растворов показали, что рутин при температуре 60° С разрушается в зависимости от времени хранения. Методом ВЭ1Х определено снижение содержания рутина в растворах на 21 % после 30 суток хранения и на 34 % после 60 суток хранения.(рис.1).

Хроматограммы растворов рутина

i

О 5 10 О 5 10 О 5 ^ОмиН,

1 - после приготовления;

2 - после 30 суток хранения при температуре 60° С;

3 - после 60 суток хранения при температуре 60° С

Рис. I

• Однако, разными методами были получены различные результаты (табл. I).

- у - Таблица I

Результаты анализа растворов рутина послеп 30 и 60 суток хранения при температуре 60 С

№ ! Наименование метопа [Содержание рутина, % __!___________________________________!аи суток 1 оО суток

1. УФ-спектрофотометрический 102 105

2. Спектрофотометрический с алюминия

хлоридом и уротропином 80 64

3. Спектрофотометрический с алюминия

хлоридом без уротропина 59 59

4. фотоколориметрический 100 100

5. Хроматоспекгрофотомегрический 81 63

Как видно из табл. I, спектрофотометрическим методом по реакции с алюминия хлоридом и уротропином через 30 суток хранения показано снижение содержания рутина в растворах на 20 %, а через 60 суток - на 36 % по сравнению с контрольными. Хромато-спектрофотометрическим методом установлено снижение содержания рутина через 30 суток на 19 %, а через 60 суток - на 37 %. УФ-спеятрофотометрический метод показал не уменьшение концентрации, а его увеличение через 30 суток хранения на 2 %, а через 60 суток - на 5 56. Спектрофотометрическим методом по реакции с алюминия хлоридом без уротропина определено снижение концентрации рутина через 30 суток на 41 %, в последующие 30 суток хранения дальнейшего снижения содержания рутина в растворе не произошло. фотоколориметрический метод по реакции диазотирования практически не показал изменения концентрации рутина в растворах после 30 и 60 суток хранения.

В процессе хранения препаратов, содержащих флавоноиды, отрицательное влияние оказывает рН среды, которая зависит от кислотных или основных свойств растворителя и стекла, в котором хранится препарат.

В ходе исследований установлено, что при комнатной темпера-

- ю -

туре в щелочной среде (рН*12,0) и в кислой среде (рН=2,0) происходит деструкция флавоноидов. Результаты анализов растворов рутина после 15 и 30 суток воздействия кислоты и щелочи

представлены в табл. 2. Таблица 2

Результаты анализа растворов рутина после .

15 и 30 суток воздействия кислоты и щелочи

........ _

№№ ! Наименование метода п/п! ! рн« 2,0 ! рН = 12,0

! 115 с^т. . !30 суг. !15сут.!30сут.

I. Уф-спектрофотометрический 112,0 120,0 38,0 18,0

2. Спектрофотометрический с алюминия хлоридом и уротропином 110,0 118,0 36,0 12,0

3. Спектрофотометрический с алюминия хлоридом без уротропина 105,0 87,0 17,0 11,0

4. Фотоколориметрический 100,0 96,0 81,0 61,0

5. В32Х 16,0 10,0 34,0 14,0

Как видно из табл. 2 методом ВЭХХ показано снижение концентрации рутина при воздействии на него кислоты хлористоводородной через 15 суток - на 84 %, через 30 суток - на 90 а также установлено, что при воздействии кислоты хлористоводородной на растворы рутина происходит его гидролиз с образованием кверцетина. Образовавшийся кверцетин оставался в анализируемом растворе и увеличивал оптическую плотность этих растворов при использовании УФ-спектрофотометрического метода (на 12 % через 15 суток и на 20 % через 30 суток) и спектрофотометрии по реакции с алюминия хлоридом и уротропином (на 10 % через 15 суток и на 18 % через 30 суток). Спектрофотометрический метод по реакции с алюминия хлоридом без уротропина не показал достоверных результатов в связи с тем, что в процессе воздействия изменялась концентрация водородных ионов вследствие чего метод показал увеличение концентрации через 15 суток на 50 % и умень-

шение ее через 30 суток на 13 %. Фотоколориметрический метод практически не показал изменения концентрации ( через 30 суток концентрация рутина уменьшилась на 4 Й в связи с тем, что эту реакцию дают как рутин так и кверцетин.

При воздействии щелочи на растворы рутина методом ВЭЖХ показано снижение содержания рутина в растворе через 15 суток на 66 % и через 60 суток на 65 %. При воздействии на растворы рутина щелочи происходит деструкция рутина. Всеми методами показано практически одинаковое снижение концентрации рутина в растворах, свидетельствующее о том, что при разрушении рутина щелочью, образующиеся продукты не мешают проведению анализа, за исключением фотоколориметрического метода, где продукты реакции мешают проведению анализа.

При сравнении результатов, полученных исследуемыми методами с данными метода ВЭЖХ, взятым как контрольный, показано, что спектрофотометрический метод по реакции с алюминия хлоридом в уксусно-уротропиновом буфере давал стабильные результаты близкие к данным, полученным методом ВЭЗХ. Следовательно данный метод является оптимальным для анализа флавоноипов и использования его для разработки унифицированных методик.

РАЗРАБОТКА УНИФИЦИРОВАННЫХ МЕТОДИК КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ ШВ0Н0ЦЦ0В В СЫРЬЕ,И ПРЕПАРАТАХ БОЯРЫШНИКА,ЗВЕРОБОЯ И КАЛЕНДУЛЫ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ВЫБРАННОГО МЕТОДА

При разработке унифицированных методик количественного определения флавоноидов в сырье и препаратах исследуемых объектов был использован выбсанный нами спектрофотометрический метод по реакции комплексообразования с алюминия хлоридом и уротропином.

- 12 -

В качестве стандартного вещества был выбран рутин, дифференциальный спектр поглощения которого с алюминия хлоридом в предлагаемых условиях совпадает с дифференциальным спектром поглощения флавоноидов исследуемых объектов с алюминия хлоридом. При построении калибровочного графика было установлено, что поцчиняемость закону Бугера-Ламберта-Бера соблюдается в пределах концентраций 0,0002-0,0020 %. Наименьшее определяемое количество рутина - 0,002 мг/мл. Реакция рутина и флавоноидов с алюминия хлоридом протекает практически полностью в течение 30 минут.

Экспериментально установлено, что оптимальное извлечение флавоноидов идет при измельчении плодов боярышника до частиц величиной 2 мм, для зверобоя - 3 мм, для календулы - I мм. Наилучшим экстрагентом является 70 % этанол, которым экстрагируют действующие вещества на кипящей водяной бане в течение I часа; соотношение сырья и экстрагента для боярышника составляет 1:20, для зверобоя 1:30, для календулы 1:30. Полученные результаты были использованы при разработке методик определения флавоноидов в сырье, настойке, жидком экстракте и отходах производства боярышника, зверобоя и календулы.

Разработанная унифицированная методика была апробирована на образцах сырья и препаратов боярышника. Полученные результаты представлены в табл. 3, из которой видно, что относительная ошибка определения при доверительной вероятности 0,95 не превышает + 5 %.

Аналогичные результаты были получены при анализе сырья и препаратов зверобоя и календулы. Относительная ошибка определения при доверительной вероя*ности 0,95 для зверобоя от + 3,07 до + 4,9 %, для календулы - не превышает + 5 %.

Таблица 3

Результаты количественного определения флавоноидов в сырье и препаратах боярышника с использованием метода добавок рутина

№ ¡Найдено !Введено (Найдено [Метрологические характерис-

обра-!Флавонои-!рутина, ¡флавонои-! тики___

ца !дов, мг ! мг !дов и ру-!найдено! ; • ! / !

! ! !тин8, мг !рутина,! х ! —х ! + А,%

! ! ! ! мг ! ! ! '

Плоды боярышника

I. 141,90 35,00 176,7 34,8 0,420 1,079 3,10

2. 82,00 20,00 101,8 19,9 0,300 0,771 3,87

3. 86,10 25,00 110,8 24,8 0,360 0,925 3,73

Настойка боярышника

4. 5,00 2,50 7,49 2,29 0,032 0,080 3,21

5. 7,20 3,00 10,23 3,03 0,039 0,101 3,33

6. 8,80 5,00 13,82 5,10 0,078 0,199 3,98

Жидкий экстракт боярышника

7. 41,70 25,00 65,73 24,00 0,360 0,920 3,84

8. 52,00 25,00 77,43 24,90 0,416 1,070 4,30

9. 62,90 25,00 87.73 24,80 0,340 0,873 3,52

С помощью разработанных нами методик было определено содержание флавоноидов в сырье, препаратах и шроте боярышника: в сырье найдено от 0,0820 до 0,1419 % (по Гф XI д.б. не менее 0,06% действующих веществ); в настойке - от 0,0050 до 0,0080 %, в жидком экстракте - от 0,0417 до 0,0629 %. Содержание флавоноидов в зверобое следующее: в сырье найдено от 0,2356 до 6,81 % (ГФ XI д.б. не менее 1,5 %), в настойке - от 0,2356 до 0,6058 %. Результаты определения флавоноидов в календуле показали: в цветках обнаружено от 1,687 до 2,238 % (по ГФ XI д.б. не менее 1,500 %), в настойке - от 0,148 до 0,179 % (по НТД д.б. не менее 0,125 %).

ПРИМЕНЕНИЕ РАЗРАБОТАННЫХ УНИФИЦИРОВАННЫХ МЕТОДИК

ОПРЕДЕЛЕНИЯ ФЛАВОНОИДОВ В ПРОЦЕССЕ ПРОИЗВОДСТВА ПРЕПАРАТОВ БОЯРЫШНИКА, ЗВЕРОБОЯ И КАЛЕНДУЛЫ

Разработанные нами унифицированные методики определения

флавоноидов боярышника, зверобоя и календулы позволяют определять содержание флавоноидов не только в сырье и препаратах, но и в отходах производства (т.е. шроте) этих лекарственных растений. С их помощью нами определено, что в препараты, приготовленные по существующей технологии, из сырья переходит в среднем от 35 до 40 % действующих веществ, т.е. в шроте остается 60-65$ ценных биологически активных соединений, в связи с чем ставится вопрос о разработке безотходных технологий получения лекарственных препаратов из исследуемого сырья. Для решения этого вопроса нами была поставлена цель: изучить действие основных факторов, влияющих на процесс экстракции и предложить пути усовершенствования существующих в настоящее время в нормативно-технической документации технологий получения препаратов боярышника, зверобоя и календулы.

Для этого было исследовано влияние на степень извлечения флавоноидов степени измельчения сырья, температуры экстрагента и времени экстракции. Полученные результаты представлены в табл. 4.

Таблица 4.

Результаты количественного определения флавоноидов в зависимости от условий экстракции

Условия экстракции ¡Содержание флавоноидов ■ 1 Степень !чения, извле-% -¡Содержание фла-1воноидов в шроте,!

1 I ! 2 ! I ! ! 2 ! I ! 2

I ! 2 ! 3 ! 4 : ! 5 ! 6 ! 7

Степень измельче ния, мм -

0,5 1,0 2,0 3,0 0,0117 0,0081 0,0054 0,0051 0,5893 0,7500 0,5536 0,2071 82,45 57,08 38,06 35,91 58,12 73,96 54,59 24,71 17,55 42,92 61,94 64,09 41,88 26,04 48,41 75,29

5,0 0,0031 0,2083 21,85 24,86 78,15 75,14

Время настаивания, сут. 3 0,0089 62,72 37,28

Продолжение таблицы 4.

I

2 ! 3

4 ! 5

! 6

7

3

4 4

0,0089 0,0091 0,0094

35^87

Температура экстракции,

0 С

20

50 70

20 0,0083 0,2356 58,49 57,18 41,51 42,82

50 0,0069 0,4087 62,72 67,54 37,28 32,46

70 0,0091 0,3288 64,13 54,43 35,87 45,57

Примечание: I - данные для боярышника

2 - данные для зверобоя

Результаты табл. 4 показывают, что наибольшее влияние на выход флавоноидов оказывает степень измельчения сырья: уменьшение величины частиц плодов боярышника в 10 раз приводит к увеличению содержания флавоноидов в настойке более чем в 4 раза, а в настойке зверобоя - в 2,5 раза. Время и температура экстракции оказывают значигельно меньшее зкияние на извлечение флавоноидов. Технология производства настойки из цветков календулы не тсебует усовершенствования, поскольку при получении настойки было установлено, что выход флавоноидов в извлечение составляет 75-80 %у что соответствует требованиям по приготовлению лекарственных препаратов из растительного сырья.

В последние годы особое внимание привлекают такие лекарственные формы из исследуемых объектов, которые можно готовить в аптеках ¿х/гтро/м, в фитобарах и в домашних условиях - это настои и отвары, однако методы контроля их качества и технологии разработаны недостаточно.

В связи с этим встает вопрос о разработке современных методик количественного определения флавоноидов этих растений в настоях и отварах и усовершенствовании их технологий.

По мнению некоторых авторов из плодов боярышника следует готовить настой, т.е. 15 мин. нагревать на кипящей водяной бане

и 45 мин. охлаждать при комнатной температуре. Другие авторы считают, что следует готовить отвары. Результаты проведенных нами исследований показывают, что в случае приготовления настоя в водное извлечение переходит очень мало (10-11 %) флаво-ноидов, а большинство их остается в шроте. Также ранее нами было выяснено, что нагревать водное извлечение из плодов боярышника следует не менее 30 мин., т.е. как отвар, поэтому нам представлялось интересным изучить влияние времени настаивания на степень извлечения флавоноидов в отвар из плодов боярышника. Полученные данные представлены в табл. 5.

Таблица 5.

Влияние времени настаивания при приготовлении отваров боярышника на степень извлечения флавоноидов (время нагревания 30 мин)

№№ !Время настаива-!Содержание флавонои-!Степень извлече-п^п _|ниял___мин..____]____дова____г________]___ния2____%___________

1. 20 0,00131 7,3

2. 30 0,00158 8,8

3. 45 0,00160 9,0

4. 45 0,00164 9,1

5. 60 0,00187 10,4

Из табл. 5 видно, что время настаивания не оказывает значительного влияния на степень извлечения флавоноидов в отвар из плодов боярышника. Так, если настаивать отвар в течение 20 мин. флавоноидов извлекается 7,3 % а если настаивать I час, то степень извлечения составляет 10,4 %. Мы рекомендуем настаивать отвар плодов боярышника 45 мин.

Далее нами изучено влияние степени измельчения сырья на полноту экстракции флавоноидов в водное извлечение. Результаты исследования представлены в табл. 6.

Таблица 6.

Влияние степени измельчения сырья на выход флавоноидов в отвар из плодов боярышника

Степень изме-(Содержание фла!Степень из-(Остаточное количество льченияА_мм_!воноидовА__г__|влечения1_|]_^лавоноилов_в_шсоте1_%

0,5 0,00524 35,9 64,1

1,0 0,00576 39,5 60,5

2,0 0,00395 27,0 73,0

3,0 0,00292 20,0 80,0

5,0 0,00267 18,3 81,7

7,0 0,00164 11,3 88,7

цельное 0,00123 8,4 91,6

Результаты табл. 6 показывают, что наибольший еыход флавоноидов наблюдается при использовании сырья, проходящего сквозь сито с диаметром отверстий I мм, в данном случае их извлекается почти 40 %. При использовании более измельченного сырья выход флавоноидов немного снижается, что связано с наличием пектиновых веществ, в результате чего масса склеивается и плохо смачивается, а это создает препятствия для проникновения извлекателя в клетку. Чем более крупное заваривается сырье, тем меньшее количество флавоноидов извлекается. Так, при приготовлении отвара из цельного сырья выход флавоноидов составляет лишь 8,4 %.

На качество водных извлечений большое влияние оказывает количественное соотношение между сырьем и извлекающей жидкостью. С целью поиска оптимального соотношения плодов боярышника и воды нами были приготовлены различные водные извлечения из плодов боярышника. Полученные результаты представлены в табл. 7.

Результаты табл. 7 показывают, что использование сырья, проходящего сквозь сито с диаметром отверстий 0,5 мм в соотношении 2,5:200 и неизмельченного сырья в соотношении 16:200 пает

Таблица 7.

Влияние соотношения сырья и экстрагента на выход флавоноидов в отвар из плодов боярышника

Степень измельчения, мм ■¡Соотношение сы-!рья и экстра! гента •¡Содержание фла-!Степень извле-?воноидов, г !чения, % ! !

1,0 1:200 0,00092 31,7

2:200 0,00154 34,1

2,5:200 0,00257 35,2

3:200 0,00288 32,8

4:200 0,00401 34,3

5:200 0,00524 35,9

цельное 16:200 0,00232 4,9

одинаковое содержание флавоноидов в отваре, но при использовании мелкоизмельченных плодов степень извлечения флавоноидов из сырья больше чем при использовании целых плодов в 7 раз.

Для изучения влияния времени нагревания и настаивания на полноту экстракции флавоноидов были приготовлены водные извлечения из травы зверобоя с использованием различных комбинаций: вначале изменялось время нагревания от 5 до 30 минут при одинаковом времени настаивания, затем менялось время настаивания от 15 до 60 мин. при одинаковом времени нагревания. Полученные результаты представлены в табл. 8.

Таблица 8.

Влияние времени нагревания и времени настаивания на эффективность экстракции флавоноидов в водные извлечения из травы зверобоя

Ш> ¡Время на-!Вреыя нас-¡Содержание(Степень из-10статочное коли-п/п!гревания,¡таивания, ¡Флавонои- ¡влечения, ¡чество флавонои-___]___мин..___]____мин..___I____г_____{____%______1522_в_ш20теА_|__

1 5 45 0,0511 57,6 42,4

2 10 45 0,0539 60,8 39,2

3 15 45 0,0562 63,4 36,6

4 20 45 0,0588 66,0 39,0

5 25 45 0,0718 81,0 19,0

Продолжение таблицы 8.

I ! 2 ! 3 ! 4 ! 5 ! 6

6 30 45 0,0730 82,3 17,7

7 15 15 0,0580 65,8 34,2

8 15 25 0,0602 67,9 32,1

9 15 35 0,0610 68,8 31,2

10 15 45 0,0611 68,9 31,1

II 15 55 0,0590 66,5 33,5

12 15 60 0,0500 66,5 33,5

13 30 10 0.0709 67,8 32.2

14 15 45 0,0591 55,5 44,5

15 заливают до охлаж-

кипятком дения 0,0415 46,8 53,2

16 заливают сразу

кипятком процежи- 0,0456

и 45 мин. вают 51,4 48,6

кипятят

Результаты табл. 8 показывают, что на полноту экстракции флавоноидов в водные извлечения из травы зверобоя оказывает заметное влияние время нагревания и меньшее влияние время настаивания: так, при нагревании в течение 10 мин. извлекается 60 % флавоноидов, а при нагревании в течение 30 мин. - выход составляет 82 % (время настаивания одинаковое); при настаивании в течение 15 мин. извлекается 65 % флавоноидов, а при настаивании 35-45 мин. - 68 % (время нагревания одинаковое). При более длительном настаивании (60 мин.) процентное содержание флавоноидов в водном извлечении снижается до 66 %. По-видимому, это связано с частичным разрушением флавоноидов.

В связи с тем, что даже при изготовлении отвара 20-30 % флавоноидов остается в шроте далее было изучено влияние степени измельчения сырья. Полученные результаты представлены в табл.9.

Данные табл. 9 показывают, что лучший переход флавоноидов из сырья е воду (92 %) происходит при измельчении сырья до частиц величиной 0,5 мм, а по рекомендации Гф XI изд. для приготовления настоя применяют траву, проходящую сквозь сито с диамет-

Таблица 9

Зависимость экстракции флавоноидов в отвар из травы зверобоя от степени измельчения сырья

Степень ! Содержание ! Степень !Остаточное количест-измельчения,!флавоноицов, ! извлечения, !во флавоноидов в _____мм_____I_____г________|______%______1ЕЕ21Ё1______I_________

0,5 0,1651 92,8 7,2

1,0 0,1440 81,2 18,8

2,0 0,0842 47,8 52,2

3,0 0,0374 21,2 78,8

5,0 0,0210 II.8 88,2

7,0 0,0191 10,7 89,3

ром отверстий 7 мм, при этом выход флавоноидов составляет Есе-го 10 %.

Для более рационального использования сырья далее было изучено влияние соотношения сырья и экстрагента. Полученные результаты представлены в табл. 10.

Таблица 10.

Влияние соотношения сырья и экстрагента на выход флавоноидов из травы зверобоя в отвар

Степень измельчения, [Соотношение сы-!Содержание!Степень извле-мм !рья и экстра- !флавонои- !чения, %

! гента !дов, г ! 10

Сырье, проходящее 1:200 0,0334 94,5

сквозь сито с диамет- 2:200 0,0645 94,0

ром отверстий 0,5 мм 2,5:200 0,0838 93,3

3:200 0,1000 92,0

5:200 0,1650 90,6

Сырье, проходящее 10:200 0,0667 19,1

сквозь сито с диамет- 10:200 0,0812 23,2

ром отверстий 7 мм 10:200 0,0709 20,3

Результаты, представленные в табл. 10 аоказывают, что при

использовании сырья, проходящего через сито с диаметром 0,5 мм количество его может быть уменьшено в 4 раза, поскольку соотно-

шение 2,5:200 лает такой же выход флавоноидов, что и соотношение 10:200 с использованием сырья, проходящего сквозь сито с диаметром отверстий 7 мм.

Исследования, подобные проведенным с сырьем боярышника и зверобоя, были проведены с цветками календулы. В процессе исследования было установлено, что измельчение сырья, изменение времени нагревания и времени настаивания не оказывают значительного влияния на выход флавоноидов в водные извлечения из цветков календулы. Согласно инструкции водное извлечение из цветков календулы следует готовить в виде настоя, т.е. нагревать 15 мин. и настаивать в течение 45 мин.

ВЫВОДЫ

1. Изучена литература, посвященная химическому строению, биологической активности, методам идентификации и количественного определения флавоноидов боярышника, зверобоя и календулы.

В доступной литературе не встречено данных по выбору оптимального метода, следовательно проведение исследований по выбору оптимального метода и разработка методик количественного определения флавоноидов в сырье, препаратах боярышника, зверобоя и календулы является актуальной проблемой.

2. В результате проведенных исследований было установлено, что оптимальным методом, дающим достоверные результаты по сравнению с контрольным методов ВЭЖХ, является спекгрофотометричес-ский метод по реакции комплексообразования с алюминия хлоридом в уксусно-уротропиновом буфере в среде 40-45 % этанола.

3. С помощью выбранного метода разработаны унифицированные методики количественного определения флавоноидов в сырье, препаратах и шроте боярышника, зверобоя и календулы. Подчиняемость

закону Бугера-Ламберта-Бера наблюдается в пределах концентраций 0,0002-0,0020 %. Чувствительность реакции - 0,002 мг/мл. Относительная ошибка определения при доверительной вероятности 0,95 не превышает + 5 %.

4. Разработанные методики были использованы для анализа препаратов и шрота боярышника, зверобоя и календулы, приготовленных по существующему регламенту. Выявлено, что технология получения этих препаратов нуждается в усовершенствовании, так как из сырья в препараты извлекается 40-50 % флавоноидов. Пре-паратаы календулы не нуждаются в усовершенствовании, т.к. в настойку извлекается 75-80 % действующих веществ.

5. Показано, что усовершенствование технологии препаратов зверобоя и боярышника еозможно путем изменения концентрации используемого спирта, увеличения температуры экстракции и уменьшения величины частиц сырья.

6. Оптимальными условиями для приготовления водных извлечений из травы зверобоя является измельченность сырья 0.5 мм, время нагревания 30 мин. и настаивания 10 мин., соотношение сырья и экс*раген?я 2,5:200; д1я календулы - иэмрльченность 0,5 мм. всемя нагревания 15 мин. и настаивания 45 мин., соотношение сыгья и экетрагента 8:200; для боярышника - степень измельчения сырья I мм, время нагсевяния 30 мин. и настаивания 45 мин., соотношение сысья и экотрагента 2.5:200.

7. Показано, что пги использования сырья, пгоходяшего сквозь сито 0,5 мм для звегобоя и календулы, и пгохопящего сквозь сито I мм для боягышника можно значительно снизить сасход сырья: для травы зверобоя р 4 раза, для плодов боярышника в 6 раз, пля цветков календулы в 2 раза. Кроме того, отмечено, что мелкоиз-мельченное сырье можно выпускать в одноразовой упаковке.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Изучение влияния некоторых факторов на полноту извлечения флавоноидов в отвар зверобоя / Коваленко Л.И., Павлихи-на И.А., Попов Д.М., Хакимова Д.Р./У Актуальные проблемы фармацевтической технологии. Науч. труды. Т. ХХХП. - Москва, -1994. - С.163-168.

2. Контроль качества настоев и отваров, содержащих флаво-ноиды и кислоту, аскорбиновую /Аносова О.Г., Колпакова М.В., Мухамеджанова Д.М., Попов Д.М., Приступа Е.А., Хакимова Д.Р.// Проблемы фармации, подготовки и использования провизорских кадров (материалы республиканской научной конференции по фармации и фармакологии), Пятигорск, 1993. - С.134-135.

3. Совершенствование анализа и технологии настоев и отваров, содержащих флавоноиды /Аносова О.Г., Колпакова М.В., Мин-никова Н.И., Мухамеджанова Д.М., Попов Д.М., Приступа Е.А., Хакимова Д.Р.// Фармация. - 1994. -№1. - С.30-34.

»

4. Содержание флавоноидов в различных видах , произ- V растающих на Западном Памире/ Мухамеджанова Д.М., Попов Д.М.,) Юсупов Д.Ю., Хакимова Д.Р.// Хим.-фарм. ж. - 1992. - №1. -

С.41-45.

5. Хакимова Д.Р., Попов Д.М. Разработка и унификация методик стандартизации сырья и препаратов боярышника //Материалы республиканской научно-практической конференции "Проблемы фармацевтов Таджикистана", 20-21 деакбря 1991 г. - Душанбе. - 1991.-C.3I0-3II.

ГШ! мпс з 909 7.80 - 94 г