Автореферат и диссертация по фармакологии (15.00.02) на тему:Целенаправленный поиск индивидуальных веществ и суммарных композиций, характеризующихся антирадикальной активностью в отношении супероксидного анион-радикала

ии¿4гОЭ58

На правах рукописи

АГАДЖАНЯН ВЛАДИМИР СЕРГЕЕВИЧ

Целенаправленный поиск индивидуальных веществ и суммарных композиций, характеризующихся антирадикальной активностью в отношении супероксидного анион-радикала

15.00.02 - фармацевтическая химия, фармакогнозия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата фармацевтических наук

гт атчдггшг'Т/" олло

1 IV! ци VI ¿ииУ

003470958

Работа выполнена в Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Пятигорская государственная фармацевтическая академия Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию»

Официальные оппоненты: доктор фармацевтических наук, профессор

Ведущая организация: Государственное образовательное учреждение

Защита состоится «30» июня 2009 года в 900 часов

на заседании диссертационного совета Д.208.069.01. по защитам диссертаций при ГОУ ВПО Пятигорской ГФА Росздрава (357532, Ставропольский край, Пятигорск, пр. Калинина, 11).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГОУ ВПО «Пятигорской ГФА Росздрава».

Автореферат разослан «15» мая 2009 г Ученый секретарь

Научный руководитель: доктор фармацевтических наук, профессор

Оганесян Эдуард Тоникович

Компанцев Владислав Алексеевич доктор химических наук, профессор Озеров Александр Александрович

высшего профессионального образования «Пермская государственная фармацевтическая академия федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию»

д.ф.н., профессор

диссертационного совета

Е.В. Компанцева

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы. Одной из важных задач современной фармацевтической химии является целенаправленный поиск соединений с заданными фармакологическими свойствами. С этой целыо используют различные подходы, одним из которых является изучение закономерностей взаимосвязи структура - активность. При таком поиске обязателен учет данных биохимической фармакологии, указывающих на причинно-следственные связи между возникновением патохнмических процессов и нарушением функционирования клеточной мембраны. Состояние последней, как известно, существенно зависит от уровня и скорости генерации активных форм кислорода (ЛФК) в организме. Вышедшая из-под лимитирующего контроля антиоксидантной системы организма чрезмерная генерация АФК является причиной оксидантного стресса клеток (увеличение перекисного окисления липидов) и, как следствие, приводит к формированию патологий.

Исходной активной формой кислорода в животном организме является супероксидный анион-радикал 02, на формирование которого в физиологической норме расходуется примерно 2% всего потребляемого кислорода. Большинство же остальных АФК (ОН*, N0% 02\ СЮ" и др.) в той или иной мере являются продуктами его биотрансформации.

Анализ данных литературы, посвященных антиоксидантам и изучению проявляемой ими активности свидетельствует о том, что их номенклатура ограничена преимущественно препаратами, относящимися к двум группам -донорам протонов (токоферол, пробукол, кислота аскорбиновая) и полиенам (ретинол, каротиноиды). Они не лишены недостатков, так как слабо защищают белки и нуклеиновые кислоты от окислительного повреждения.

Эндогенные антиоксиданты являются важнейшим звеном защитной системы организма, поэтому исследования по целенаправленному поиску индивидуальных веществ и/или суммарных композиций, проявляющих как антирадикальную активность, так и способных предохранять элементы собственной антиоксидантной системы, имеют важное значение.

В настоящее время существует четкая классификация известных антиоксидантов, основанная на структурных признаках молекул, ответственных за проявление антиоксидантных свойств. Учитывая это, можно проводить поиск новых антиоксидантов как путем целенаправленного синтеза, так и созданием оптимальных композиций антиоксидантов на основе природных соединений растительног о происхождения.

Одним из таких перспективных и легкодоступных источников суммарных композиций антиоксидантов может служить мякоть плодов тыквы обыкновенной (Cucurbita реро L.). В литературе до сих пор отсутствуют сведения о наличии в её составе фенольных соединений, однако применение в народной медицине в качестве гепатопротекторного, желчегонного, противовоспалительного средства свидетельствует о наличии данной группы соединений и является достаточным обоснованием для проведения химических и биохимических исследований.

Цель и задачи исследований. Целью наших исследований является химическое и биологическое изучение ангиоксидантной активности сухого экстракта из мякоти тыквы обыкновенной, а также выявление взаимосвязи структура-активность 16 индивидуальных производных коричной кислоты, пять из которых являются компонентами данного сухого экстракта.

Для достижения поставленной цели мы сочли целесообразным решение следующих задач:

S с помощью предварительного биохимического скрининга, обосновать выбор растворителя для получения сухого экстракта мякоти тыквы обыкновенной, характеризующегося наибольшей ангиоксидантной активностью;

■S провести химический анализ сухого экстракта и количественно

охарактеризовать в нем основные группы БАВ; S разработать методику количественного определения группы соединений, вносящих существенный вклад в проявляемую сухим экстрактом антиоксидантную активность;

полуэмпирическими квантово-химическими методами изучить основные индексы реакционной способности производных коричной кислоты в отношении АФК на примере (*ОН) и на их основе обосновать структуру, характеризующуюся более высокой антиоксидантной активностью.

Научная новизна. На основе предварительного биохимического скрининга сухих экстрактов, полученных из мякоти тыквы обыкновенной, установлено, что наибольшей антиоксидантной активностью, а также СОД-протекторной активностью обладает сухой экстракт, полученный после обработки сырья спиртом этиловым 70%. Использование данного экстрагента обеспечивает наибольшую концентрацию антиоксидантов в целевом продукте - 174,9±2,4 мг/г (17,5%) в пересчете на кверцетин.

Впервые методом ВЭЖХ в мякоти тыквы обыкновенной определены галловая, изоферулозая, кофейная, цикоревая и коричная кислоты, а также кверцетин, апигенин, суммарное содержание которых в полученном сухом экстракте составляет 12,8%.

Предложена методика спектрофотометрического определения количественного содержания суммы производных коричной кислоты в исследуемом сухом экстракте (найдено 8,24±0,11% в пересчете на кофейную кислоту). По данным химического анализа в нём определены следующие групп БАВ: аминокислоты - 12,68 г/кг (1,27%); полисахариды: ВРПС -3,36±0,12%, ПВ - 13,43±0,34%, ГцА - 9,89±0,21%, ГцБ - 5,44±0,14%; макро и микроэлеменш - 48,78% (в золе); аскорбиновая кислота - 3,98±0,13%; каротиноиды - 1,42±0,04мг/% (0,0014%).

Экспериментально (in vivo) изучены иммунотропная и СОД-протекторная активности сухого экстракта мякоти тыквы. Установлено дозо-зависимое увеличение lgM-антителогенеза (в дозе 100 мг/кгв 1,71 раза; в дозе 500 мг/кг - 1,85 раза относительно контроля), уменьшение воспалительного эффеета при введении разрешающей дозы антигена (в дозе 100 мг/кг на 9,4%, в дозе 500 мг/кг - 37,5% по отношению к контролю). Выявлен дозо-зависимый эффект подавления воспалительных реакций,

вызванных подкожным введением гистамина и декстрана (в дозе 500 мг/кг на 40,3% и 48,2% соответственно). В эксперименте in vivo установлена протекторная активность сухого экстракта мякоти тыквы обыкновенной по отношению к эритроцитарной Cu-, Zn- супероксиддисмутазе.

Полуэмпирическими квантово-химическими методами (РМЗ и AMI) изучены индексы реакционной способности в ряду гидрокси- и метоксипроизводных коричной в отношении активных форм кислорода. По значениям величин порядков связей, связевых чисел и валентностей соответствующих атомов углерода в анализируемых структурах предложен новый показатель - суммарный индекс ненасыщенности (IUA). Он объективнее отражает способность структуры выступать в качестве «ловушки» свободных радикалов.

В эксперименте in vitro установлено, что антиоксидантная активность индивидуальных производных коричной кислоты достоверно, в среднем на 40%, превышает активность рутина, кверцетина и дигидрокверцетина. По результатам квантово-химических расчетов обоснована структура 4-гидрокси-3,5,-ди-трет-бутилкоричной кислоты, для которой экспериментально выявлен наибольший уровень антиоксидантной активности (С1/29,8±0,4 мкМ), который превышает аналогичный показатель для кофейной (С|/2=15,7±0,4 мкМ), синаповой (С1/2=17,0±0,ЗмкМ) и 3,4,5-тригидрокси-коричной (Ci/2=12,0±0,6mkM) кислот, а также дибунола (С, /2=21,2±0,8мкМ).

Сопоставление полученных экспериментальных значений уровня антиоксидантной активности производных коричной кислоты с рассчитанными на основе квантово-химического анализа показателями суммарной ненасыщенности молекулы, позволило выявить линейную зависимость между ними с коэффициентом корреляции 0,911. Такой подход может быть использован в исследованиях по целенаправленному поиску антиоксидантов в ряду других природных соединений.

Практическая значимость работы.

Предложен и обоснован способ получения сухого экстракта из мякоти тыквы обыкновенной. Разработана методика спектрофотометрического определения в нём суммы производных коричной кислоты.

Обоснована и экспериментально подтверждена антиоксидантная активность 4-гидрокси-3,5,-ди-трет-бутилкоричной кислоты, превосходящая таковую дибунола в 1,5 раза.

Исходя из количественного содержания суммы антиоксидантов, а также экспериментально установленной СОД-протекторной и имуннотропной активности, сухой экстракт из мякоти тыквы обыкновенной в перспективе может быть рекомендован для последующего исследования.

Внедрение результатов в практику.

Материалы по изучению тыквы обыкновенной и сухого экстракта, полученного из неё, переданы в НИИ питания РАМН для дальнейших совместных исследований. Для дальнейшего более глубокого фармакологического изучения антиоксидантной активности предлагаемый сухой экстракт мякоти тыквы обыкновенной передан в лабораторию микросомального окисления ГУ НИИ Биомедицинской химии им. В.Н. Ореховича РАМН. По материалам исследования составлено учебно-методическое пособие «Активные формы кислорода и природные антиоксиданты», используемого в учебном процессе факультета последипломного образования ПятГФА.

Положения, выдвигаемые на защиту: ^ обоснование выбора растворителя для получения сухого экстракта мякоти тыквы обыкновенной, характеризующегося наибольшей СОД-протекторной и антиоксидантной активностью;

результаты исследования качественного и количественного состава сухого экстракта мякоти тыквы;

методика количественного определения суммы гидроксипроизводных коричной кислоты в целевом продукте;

^ квантово-химическое обоснование антиоксидантной активности

4-гидрокси-3,5,-ди-трет-бутилкоричной кислоты; ^ корреляционные зависимости между суммарной ненасыщенностью циннамоильного фрагмента в структуре производных коричной кислоты и проявляемой антиоксидантной активностью.

Связь задач с проблемным планом фармацевтических наук.

Диссертационная работа выполнена в соответствии с планом научно-исследовательской работ ГОУ ВПО «Пятигорской ГФА Росздрава», номер государственной регистрации 01.200101060.

Апробация работы и публикации.

Основные положения диссертационной работы изложены на:

> четвертом международном симпозиуме "Компьютерные методы в токсикологии и фармакологии, включающие интернет-ресурсы СМТР1-2007" (Москва, сентябрь 2007 года);

> конгрессе "Человек и лекарство" Краснодар -2008г.;

> 63-й и 64-й научной конференциях «Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции» (Пятигорск 2008-2009г.).

По теме диссертации опубликовано 9 работ, в том числе учебно-методическое пособие, используемое в учебном процессе факультета последипломного образования ПятГФА и 2 статьи в журналах, рекомендованных ВАК РФ.

Объем и структура диссертации.

Диссертационная работа изложена на 138 страницах текста компьютерного набора и состоит из обзора литературы, 3-х глав собственных исследований, общих выводов, списка литературы, включающего 160 источников, в том числе 65 иностранных; содержит 30 таблиц, 20 рисунков.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Обоснование выбора экстрагента

Суммарные композиции антиоксидантов из мякоти плодов тыквы обыкновенной нами были получены в виде сухих экстрактов с использованием в качестве растворителей воды и спирта этилового 40%, 70% и 95% концентрации.

Биохимический скрининг антиоксидантной активности извлечений показал, что сухой экстракт из мякоти тыквы обыкновенной, полученный с использованием спирта этилового 70%, обладает как наибольшей антирадикальной (ингибирование реакции генерации супероксидного анион-радикала на 37,97±1,09уо), так и СОД-прогекторной активностью (сохранение активности фермента на уровне 64,8±1,3%) в сравнении с другими фракциями.

Одновременно с этим изучена суммарная концентрация антиоксидантов в сухих экстрактах. Определения в пересчете на галловую кислоту и/или кверцетин осуществляли на жидкостном хроматографе Цвет Яуза-01 -АА с амперометрическим детектором.

Результаты исследования показали, что максимальная концентрация антиоксидантов содержится в сухом экстракте, полученном с использованием спирта этилового 70%, что хорошо согласуется с данными биохимического скрининга.

Для интерпретации полученных данных как по суммарному содержанию антиоксидантов, так и по проявляемой ими активности, мы сочли целесообразным изучить химический состав данного сухого экстракта из мякоти плодов тыквы обыкновенной (далее по тексту сухой экстракт), что представлено в таблице 1.

Количественное определение антиоксидантов

Суммарную концентрацию антиоксидантов в сухом экстракте определяли жидкое гном хроматографе Цвет Яуза 01-АА. Содержание антиоксидантов составляет 174,9±2,4 мг/г (17,5%) в пересчете на кверцетин,

который рекомендован в качестве стандарта для данного прибора ВНИИ Метрологической службы.

Таблица 1 - Содержание биологически активных веществ в сухом экстракте мякоти тыквы обыкновенной

Макро- и микроэлементы Аминокислотный состав Полисахаридный состав Витаминный состав

48,78% (в золе); Свободные -1,17%; Связанные -0.) %. Преобладающие: Гистидин - 0,26 %; Аспапогиновая кислота - 0,23 %; Тирозин — 0,13%; Фенилаланин - 0,1%. Водорастворимые полисахариды 3,36 % (глюкоза, ксилоза) Пектиновые вещества 13,43% (глюкоза, рамноза) Гемицеллюлоза А 9,89 % (галактоза) Гемицеллюлоза Б 5,44% (глюкоза, рамноза) Аскорбиновая кислота 3,98% Каротиноиды 0,0014%

Определение полифенольпых соединений

Для качественной и количественной характеристики полифенольных соединений нами использован метод ВЭЖХ.

Данным методом в сухом экстракте мякоти тыквы обыкновенной идентифицированы 7 соединений полифенольной природы, среди которых количественно преобладают производные коричной кислоты: изоферуловая -31,25%, цикоревая - 18,22%, коричная - 6,88%, кофейная кислоты - 1,94%, а также галловая кислота - 33,93%, кверцетин - 7,77% и апигенин - 0,0001%. Выраженная антиоксидантная активность исследуемого сухого экстракта обусловлена, в том числе, содержанием перечисленных полифенолов.

Для производных коричной кислоты имеются многочисленные экспериментальные данные, свидетельствующие об антиоксидантной, радиопротекторной, церебропротекторной и нейропротекторной активности. Более того, остаток коричной кислоты в виде циннамоильного фрагмента входит в структуру флавоноидов.

Количественное определение содержания производных коричной кислоты

Для определения количественного содержания производных коричной кислоты использован спектрофотометрический метод. С этой целью нами предварительно была изучена зависимость оптической плотности продукта (>.=355нм), образующегося при взаимодействии кофейной кислоты с алюминия хлоридом, от её концентрации (рисунок 1).

Рисунок 1 - Градуировочный график зависимости оптической плотности раствора (А355нм) от концентрации кофейной кислоты

Установлено, что в пределах концентраций 1-10 мг/л график имеет линейный характер и описывается уравнением у=0,081х+0,009. Коэффициент корреляции при этом равен 0,992, что позволяет использовать предложенную методику для количественного определения содержания гидроксипроизводных коричной кислоты.

При анализе содержания гидроксипроизводных коричной кислоты в исследуемом сухом экстракте следует учитывать поглощение компонентов, не относящихся к производным анализируемого группы соединений.

0,9

1

2

3456789 10

Концентрация кофейной кислоты (Смг/л)

Для устранения влияния такого «фона», а также с целью получения очищенной суммы производных коричной кислоты, сухой экстракт исчерпывающе обрабатывали сухим этилацетатом, фильтровали и фильтрат сушили над безводным сульфатом натрия, после чего полностью удаляли растворитель (на кипящей водяной бане). С полученной суммой полифенолов далее проводили спектральные исследования. На рисунке 2 представлены спектры поглощения растворов стандартного образца кофейной кислоты (а), очищенной суммы полифенольных соединений из сухого экстракта (б), а также продуктов их взаимодействия с алюминия хлоридом (в, г - соответственно).

0.7

0,6

<

0,5

и

1 0,4

о

g 0,3

3 ¡л

о 0,2

Е

и

в

0.1

о

250 275 300 325 350 375 400 425 450

Длина волны Я. ны

Рисунок 2 - Спектры поглощения растворов кофейной кислоты и очищенного комплекса полифенолов из сухого экстракта

Аналогично определяли гидроксипроизводные коричной кислоты, содержание которых в сухом экстракте составляет 8,24±0,11%. Использованная нами методика валидирована согласно рекомендациям ICH по таким показателям, как линейность (у=0,081 х+0,009, R2=0,992), прецизионность (RSD=0,929%), точность (RSD=3,09%).

Интерпретация антиоксидшттой активности кваитово-химическими методами

Выявленная в эксперименте in vitro высокая антиоксидантная и СОД-протекторная активность сухого экстракта, а также количественное содержание в нем производных коричной кислоты явились основанием для проведения последующих исследований с применением методов квантовой механики.

Структурные особенности, а именно, наличие сопряженной системы, включающей ароматическое ядро, виниленовую и карбоксильную группы, создают предпосылки для проявления высокой реакционной способности коричной кислоты в отношении АФК.

Используя полуэмпирические квантово-химическими методы анализа, нами были изучены индексы реакционной способности в ряду гидроксипроизводных коричной кислоты (таблица 2) в возможных радикальных реакциях с активными формами кислорода.

Такой подход с использованием репрезентативного ряда соединений позволяет не только выявить закономерности взаимосвязи структура-антиоксидантная активность, но и избежать неточностей и ошибок в интерпретации полученных результатов.

Таблица 2 - Гидрокси- и метоксипроизводные коричной кислоты

«з

9. R,=R2=R3=R4=H; 1. R2=OH; R3=OCH3; R,=R4=H

10. R,=OCH3; R2=R3=R4=H; 2. R2=OCH3; R3=OCH3; R,=R,=H;

11. R2=OH; Ri=R3=R4=H; 3. R2=R3=R4=OH; R,=H;

12. R2=OCH3; R,=R3=R4=H; 4. R2=OCH3; R3=R4=OH; R,=OH;

13. R3=OH; R,=R2=R4=H; 5. R2=R,=OH; R3=OCH3; R,=H;

14. R3=OCH3; R,=R2=R4=H; 6. R2= R3=OCH3; R4=OH; RI=H;

15. R2=R3=OH; R,=R,=H; 7. R2= R4=OCH3; R3=OH; RI=H;

16. R2=OCH3; R3=OH; RI=R4=H; 8. R2= R3= R,=OCH3; ReH;

Здесь и далее по тексту в анализируемых структурах приводится нумерация атомов, в соответствии с расчетными программами (\Vinmopac 7.21). Сопоставление результатов квантово-химических расчетов позволило

выявить взаимосвязи между структурой и анитрадикальной активностью, а также предложить возможные механизмы взаимодействия с активными формами кислорода. Для выявления наиболее вероятных центров первичной атаки радикала мы использовали величины порядков связей (Р1П,) и связевых чисел (Ым) атомов углерода. Известно, что в реакциях свободнорадикального присоединения более предпочтительным является участие атомов с наименьшими значениями связевых чисел, характеризующих степень «насыщенности» данного атома. Из этого следует, что первичная атака молекул анализируемых структур наиболее вероятна по положениям 1,2,3,5 и 8. Необходимо подчеркнуть, что положение 8 характеризуется наименьшей степенью «насыщенности» (по сравнению с ближайшими атомами), в связи с чем именно по С-8 первичная атака более предпочтительна.

Поскольку АФК характеризуются сравнительно высокими электрофильными свойствами, то для подтверждения направления атаки мы сочли целесообразным рассчитать распределение Малликеновских зарядов и электронной плотности на атомах углерода. Установлено, что наибольшая электронная плотность в анализируемых производных сосредоточена именно в положении С-8.

Дальнейшее последовательное образование аддуктов возможно по положениям С-7, С-6, С-1, С-5. Для подтверждения такого вывода нами осуществлен расчет энтальпий образования промежуточных интермедиатов. Полученные таким путем данные указывают на то, что наиболее устойчивые аддукты образуются при гидроксилировании по С-8 атому.

По такому же алгоритму на следующем этапе нами были рассчитаны порядки связей (Р^) и связевые числа (Ый) для атомов углерода в интермедиате, образующемся на 1-ой стадии гидроксилирования (по С-8). Вторая стадия гидроксилирования будет предпочтительно осуществляться по положению С-7 с образованием диола.

Анализ этих же величин в образовавшемся диоле указывает на то, что следующий этап гидроксилирования должен был бы реализоваться по С-9,

т.е. по углероду карбоксильной группы, что по понятным причинам исключено. Такое несоответствие, по-видимому, объясняется тем, что при толковании реакционной способности атома, не учитывается величина его теоретической валентности.

Поэтому, исходя из значений величин порядков связей, связевых чисел и теоретической валентности соответствующих атомов углерода в анализируемых структурах, нами предлагается учитывать - индекс «ненасыщенности» атача (IUA index unsaturation atom), который численно равен разнице между теоретической валентностью и связевым числом для каждого атома. Чем больше величина индекса ненасыщености атома, тем выше вероятность образования новых связей этим атомом.

Предполагаемые механизмы взаимодействия коричной кислоты с гидроксильным радикалом показаны ниже:

"с он

■ОН

(ГГ

■ он

I

он

•ОН

^V^H с он

поС-8 -1 поС-7

• он

I

• он

не он

поС-6

поС-1

поС-5

Из данных таблицы 3 следует, что наибольшая степень ненасыщенности у С-6 и последующая атака радикала, вероятнее всего, будет проходить именно по этому положению в диоле. Положение С-9 здесь характеризуется наименьшим индексом ненасыщенности.

Аналогично для всех 16-ти исследуемых производных коричной кислоты найдены индексы ненасыщенности ГУА.

Таблица Э - Величины связевых чисел (1ЧД теоретической валентности (V,,) и индекса ненасыщености (ША) атомов углерода в молекуле промежуточного диола

он

I 9 ✓

?8

он

положение Су атома

1 .2 8 7 ..:. 9

3,957 3,959 3,957 3,958 3,959 3,959 3,926 3,929 3,820

М„ 3,777 3,793 3,797 3,810 3,816 3,816 3,793 3,847 3,771

И/А 0.180 0,166 0,160 0,148 0,143 0,143 0,133 0,082 0,049

- сортировка атомов (слева направо) проведена по убыванию значений (ША)___

Сопоставляя между собой динамику распределения электронной плотности и индекса ненасыщенности в ароматическом фрагменте, можно констатировать, что в незамещенной коричной кислоте повышенная электронная плотность отмечается в положениях С-3, С-4 и С-5, а наибольшие значения индекса ненасыщенности - для С-1, С-2 и С-6. Совпадение ориентации обоих индексов на одних и тех же атомах углерода наблюдается в монозамещенных производных, в которых электронодонор ный заместитель находится в положении С-2 (соединения 3, 4), а также для структур с трет заместителями (соединения 13 и 14).

В ароматическом фрагменте изоферуловой кислоты (соединение 9) имеются два атома углерода (С-1, С-5), которые характеризуются наибольшими значениями как электронной плотности, так и индекса «ненасыщенности», а у изомерной феруловой кислоты имеется лишь один такой атом углерода (С-1).

Для гидроксипроизводных следует также учитывать участие фенольных гидроксигрупп в связывании активных форм кислорода, поскольку механизм антиоксидантной активности полифенольных соединений реализуется в том числе и за счет гемолитического расщепления связи О-Н. Оценка реакционной способности фенольных гидроксигрупп осуществлялась нами путем анализа величин порядков связи (Рои). Из полученных данных следует, что более предрасположенной к

гемолитическому расщеплению связи О-Н является гидроксигруппа у С-3 соединения 15 РО-ц=1,01.

Не менее важным дескриптором для анализа и прогнозирования антиоксидантной активности соединений является потенциал ионизации молекулы, который численно равен разности между энергией высшей занятой молекулярной орбитали (Е,тю, относительная электронодонорная способность молекулы) и энергией низшей свободной молекулярной орбитали (Енсмо, относительная электроноакцепторная способность). Найденная таким способом разность Евзмо ^!:с\'о равна первому потенциалу ионизации молекулы. Чем больше эта величина, тем легче переход молекулы в возбужденное состояние и тем выше её реакционная способность. Найденные таким путем значения потенциала ионизации для исследуемых соединений показывают, что соединения 7 (кофейная кислота), 15 (3,5-диметокси-4-гидроксикоричная кислота) и 9 (изоферуловая кислота) характеризуются наименьшими значениями данного дескриптора, что подтверждает их более высокую реакционную способность при взаимодействии с АФК.

Обоснование антиоксидантной активности 4-гидрокси-3,5,-ди-трет-бутилкоричной кислоты

Значительный интерес среди фенольных антиоксидантов представляют пространственно-затрудненные фенолы, например дибунол (ионол), представляющий собой 2, 6 — ди-трет-бутил-4-метилфенол. Принцип молекулярного конструирования подобных соединений основан на использовании «ара-замещенных 2,6-ди-трет-• бутилфенолов с различными функциональными ; группами.

Основываясь на полученных нами , экспериментальных данных и расчетах мы обосновали структуру, которую можно получить путем замены метальной группы в положении 4 дибунола на остаток

Лабораторное название ДИТРЕТОКСИКОР

пропеновой кислоты, что приводит к формированию соответствующего производного, а именно, 4-гидрокси-3,5,-ди-трет-бутилкоричной кислоты. Оно было синтезировано и описано другими авторами в 2008 году при изучении реакции анионной конденсации бензальдегидов. Однако, сведения об антиоксидантной активности данного соединения отсутствуют.

В этой связи по приведенным выше методикам нами осуществлен квантово-химический анализ предлагаемой структуры. Это позволило установить следующие особенности:

S 4-гидрокси-3,5,-ди-трет-бутилкоричная кислота обладает наибольшей суммарной степенью ненасыщенности атомов углерода циннамоильного фрагмента и характеризуется наименьшим значением величины первого потенциала ионизации; S связь О-Н в предлагаемой структуре характеризуется наименьшим значением порядка связи, поэтому легче подвергается гомолитическому разрыву, а образующийся при этом феноксильный радикал имеет более низкую энтальпию образования, чем аналогичный радикал, образуемый из дибунола (для дибунола ДН=-130,55 кДж/моль, для дитретоксикора ДН=-140,64 кДж/моль).

Изучение биологической активности

Исследование СОД-протекторной активности сухого экстракта мякоти тыквы in vivo проводили на кафедре биологии, физиологии и патологии ПятГФА совместно с к.ф.н Дьяковой И.Н., а иммунотропные эффекты данного экстракта изучали на кафедре клинической иммунологии, аллергологии и лабораторной диагностики ФППВ КГМУ под руководством д.м.н., профессора Ханферяна Р.А, за что мы выражаем им свою искреннюю благодарность и признательность.

Установлено что пероральное введение лабораторным животным (мышам) в течение 14 дней сухого экстракта мякоти тыквы обыкновенной достоверно способствует дозо-зависимому эффекту увеличения IgM-антителогенеза (увеличение количества IgM-антителобразующих клеток

на миллион клеток в селезенке в дозе 100 мг/кг в 1,71 раза; в дозе 500 мг/кг — 1,85 раза относительно контроля), а также уменьшению величины отека ланки мыши при введении разрешающей дозы антигена (в дозе 100 мг/кг на 9,4%, в дозе 500 мг/кг - 37,5% по отношению к контролю).

Десятидневное пероральное введение крысам изучаемого сухого экстракта дозо-зависимо подавляет воспалительные эффекты, вызванные подкожным введением гистамипа и декстрана на 40,3% и 48,2% соответственно.

При внутрибрюшинном введении лабораторным мышам метмлглиоксаля в концентрации 55мМ и сухого экстракта мякоти тыквы обыкновенной (в дозе 100мг на 1кг массы животного) активность эритроцитарной супероксиддисмутазы сохраняется на исходным уровне 71,7±2,3%, тогда как активность модифицированного метилглиоксалем фермента составляет всего 22,2±0,9%.

Антиоксидантную активность индивидуальных соединений in vitro определяли по степени ингибирования генерации супероксидного анион-радикала, инициированного аутоокислением адреналина. В эксперименте определяли так называемую концентрацию половинного ингибирования (Cm), т.е. концентрацию, вызывающую ингибирование реакции генерации супероксидного анион-радикала на 50%; при этом, чем меньше значение С1/2, тем выше активность изучаемого соединения.

В таблице 4 приведены результаты данного исследования, го которых следует, что уровень выявленной в эксперименте антиоксидантной активности производных коричной кислоты на три порядка превышает таковой для бензойной и салициловой кислот. Более того, антиоксидантная активность исследуемых производных коричной кислоты достоверна: в среднем на 40% превышает активность рутина, кверцетина и дигидрокверцетина. Для 4-гидрокси-3,5,-ди-трет-бутил-коричной кислоты (дитретоксикора) (соединение 17), выявлен наибольший уровень антиоксидантной активности (С1/2=9,8±0,4 мкМ), который превышал

аналогичный показатель для кофейной (С1/2—15,7±0,4 мкМ), синаповой (С1/2=17,0±0,ЗмкМ) и 3,4,5-тригидроксикоричной (С1/г=12,0±0,6мкМ) кислот, а также дибунола (Ст=21,2±0,8мкМ).

Таблица 4 - Антиоксидантная активность индивидуальных соединений

Название Концентрация половинного ингибирования,реакции генерации супероксидного анион-радикала, Сщ (мкМ) Показатель суммарной ненасыщенности

Бензойная кислота (8,4±0,2) -103 -

Салициловая кислота (3,6*0,1) КГ -

Галловая кислота 55,4±0,5 -

Дибунол 21,2±0,8 -

Аскорбиновая кислота 27,5±0,4 -

Рутин 49,9±0,4 -

Квсрцстин 60,3±0,3 -

Дигидрокверцетин 45,5±0,5 -

Коричная кислота 32,4±0,3 1,612

о-метокси-коричная кислота 26,4±0,4 1,795

л-гидрокси-коричная кислота 30,3±0,5 1,734

3,4-дигидрокси-коричная кислота 15,7±0,4 2,029

З-метокси-4-гидрокси-коричная кислота 23,7±0,6 1,961

3 -гидрокси-4-метокси-коричная кислота 22,2±0,4 2,041

3,4,5-тригидрокси-коричиая кислота 12,0±0,6 2,227

3,5-диметокси-4-гидрокси-коричная кислота 17,0±0,3 2,177

4-гидрокси-3,5,-ди-трет-бутил-коричиая кислоты 9,8±0,4 2,236

Сопоставление полученных экспериментальных значений уровня антиоксидантной активности производных коричной кислоты с рассчитанными на основе квантово-химического анализа показателями суммарной ненасыщенности молекулы, позволило выявить линейную зависимость между ними с коэффициентом корреляции 0,9П. Такой подход может быть использован в исследованиях по целенаправленному поиску антиоксидантов в ряду других природных соединений.

ОБЩИЕ ВЫВОДЫ

1. Предварительный биохимический скрининг сухих экстрактов, полученных из мякоти тыквы обыкновенной, показал, что наибольшей антиоксидантной и СОД-протекторной активностью обладает целевой продукт, полученный с использованием спирта этилового 70%. Данный экстрагент обеспечивает наибольшую концентрацию антиоксидантов -174,9+2,4 мг/г(17,5%) в пересчете на кверцетин.

2. Осуществлен химический анализ сухого экстракта мякоти тыквы обыкновенной, полученного экстракцией спиртом этиловым 70%, и в нем количественно охарактеризованы аминокислоты - 12,68 г/кг (1,27%); полисахариды: ВРПС - 3,36±0,12%, ПВ - 13,43±0,34%, ГцА - 9,89±0,21%, ГцБ - 5,44±0,14%; макро и микроэлементны - 48,78% (в пересчете на золу); аскорбиновая кислота - 3,98±0,13%; кароткноиды - 1,42±0,04мг/% (0,0014%).

3. Изучен полифенолышй состав полученного сухого экстракта к установлено, что преобладающими в нем соединениями являются изоферуловая, кофейная, цикоревая, коричная, галловая кислоты, а также апигенин и кверцетин, содержание которых в сумме составляет 128,23 мг/г (12,82%).

4. Предложена методика количественного определения суммарного содержания производных коричной кислоты в исследуемом сухом экстракте, найдено 8,24±0,11% в пересчете на кофейную кислоту.

5. Использование дескрипторов, рассчитанных полуэмпирическими квантово-химическими методами РМЗ и AMI, позволило выявить наиболее реакционноспособные центры в циннамоильном фрагменте. Установлено, что взаимодействие коричной кислоты с гидроксильным радикалом в первую очередь происходит по виниленовому фрагменту (С7-С8) и далее в следующей последовательности С6, CI, С5.

6. Прогноз акткоксидантной активности для индивидуальных гидрокси- и метоксипроизводных коричной кислоты позволил обосновать

наибольшую активность для 4-гидрокси-3,5,-ди-трет-бутилкоричной кислоты, что далее было подтверждено экспериментально её синтезом и анализом биологического действия.

7. Установлены иммунотропный эффект сухого экстракта мякоти тыквы обыкновенной, а именно увеличение IgM-антителогенеза (в дозе 100 мг/кг в 1,71 раза; в дозе 500 мг/кг - 1,85 раза относительно контроля), а также уменьшение воспалительного эффекта при введении разрешающей дозы антигена (в дозе 100 мг/кг на 9,4%, в дозе 500 мг/кг - 37,5% по отношению к контролю).

8. В эксперименте in vivo установлена протекторная активность сухого зкстршста мякоти тыквы обыкновенной по отношению к зритроцитарнои Cu, Zn - супероксиддисмутазе.

9. Сопоставление экспериментально найденных значений уровня антиоксидантной активности производных коричной кислоты с показателем суммарной ненасыщенности молекул, рассчитанным квантово-химическим методом, позволило выявить линейную зависимость между этими параметрами с коэффициентом корреляции 0,911.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Активные формы кислорода и природные антиоксиданты: учебно-методическое пособие для интернов. - Пятигорск: Пятигорская ГФА, 2009. - 48с. (Соавт. Оганесян Э.Т., Муцуева С.Х.).

2. Применение квантово-химических методов анализа для интерпретации антирадикальной активности в ряду гидроксипроизводых коричной кислоты // Химико-фармацевтический журнал. - 2008. - Т.42, № II-С. 12-17. (Соавт. Оганесян Э.Т.).

3. Применение квантово-химических методов анализа для поиска новых антиоксидантов в ряду производных коричной кислоты // Человек и лекарство; тез. докл. 16 Рос. нац. конгр. 6-10 апр. 2009 г. — М., 2009. — С. 251. (Соавт. Оганесян Э.Т., Муцуева С.Х.)

22

4. Природные антиоксиданты и современные подходы к изучению антиоксидантного действия. - Пятигорск: Пятигорская ГФА, 2009. -Деп. в ВИНИТИ РАН 31.01.06, № 110-В-06. - 39 с.

5. Реактивация эритроцитарной супероксиддисмутазы под влиянием фармакологически активной фракции из мякоти тыквы обыкновенной (Cucurbita реро L.) // Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции: сб. науч. тр. - Пятигорск: Пятигорская ГФА, 2009. - Вып.64. - С. 376-378. (Соавт. Оганесян Э.Т., Дьякова И.Н.).

6. Фенольный состав фармакологически активной фракции, полученной из тыквы обыкновенной (Cucurbita реро L.) // Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции: сб. науч. тр. - Пятигорск: Пятигорская ГФА, 2009. - Вып.64. - С.6-7.

7. Целенаправленный поиск веществ с заданными фармакологическими свойствами // Кубанский научный медицинский вестник. - 2009. - №2. -С. 37-40. (Соавт. Оганесян Э.Т., Кодониди И.П., Смирнова Л.П., Муцуева С.Х., Кодониди М.И., Золотых Д.С.)

8. Экспериментальное изучение антиоксидантной активности в ряду различных производных коричных кислот // Человек и лекарство: тез. докл. 16-18 апр. 2008 г. - Краснодар, 2008. - С. 3. (Соавт. Оганесян Э.Т., Муцуева С.Х.).

9. Application of the quantum-chemical analytical methods to substantiate the antiradical activity in the flavone, chalcone and cinnamic acid hydroxyderivative series // Fourth international symposium on computational methods in toxicology and pharmacology integrating internet resources (CMTPI 2007), Moscow, Russia, September 1-5, 2007. - P.72. (Oganesyan E.).

АГАДЖАНЯН ВЛАДИМИР СЕРГЕЕВИЧ

Целенаправленный поиск индивидуальных веществ и суммарных композиций, характеризующихся антирадикалыюй активностью в отношении супероксидного анион-радикала

15.00.02 - фармацевтическая химия, фармакогнозия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации не соискание ученой степени кандидата фармацевтических наук

Подписано к печати « г., формат 60 х 84 1/16

Бумага книжно-журнальная. Печать - ротапринтная. Усл. печат. л. 1,0 Тираж 100 экз. Заказ № 643

ГОСУДАРСТВЕННОЕ ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ ВЫСШЕГО ПРОФЕССИОНАЛЬНОГО ОБРАЗОВАНИЯ «ПЯТИГОРСКАЯ ГОСУДАРСТВЕННАЯ ФАРМАЦЕВТИТЧЕСКАЯ АКАДЕМИЯ ФЕДЕРАЛЬНОГО АГЕНТСТВА ПО ЗДРАВООХРАНЕНИЮ И СОЦИАЛЬНОМУ РАЗВИТИЮ» (357532, г Пятигорск, пр. Калинина, 11)

Актуальность проблемы. Одной из важных задач современной фармацевтической химии является целенаправленный поиск соединений с заданными фармакологическими свойствами. С этой целью используют различные подходы, одним из которых является изучение закономерностей взаимосвязи структура - активность. При таком поиске обязателен учет данных биохимической фармакологии, указывающих на причинно-следственные связи между возникновением патохимических процессов и нарушением функционирования клеточной мембраны. Состояние последней, как известно, существенно зависит от уровня и скорости генерации активных форм кислорода (АФК)* в организме. Вышедшая из-под лимитирующего контроля антиоксидантной системы организма чрезмерная генерация АФК является причиной оксидантного стресса клеток (увеличение перекисного окисления липидов) и, как следствие, приводит к формированию патологий.

Исходной активной формой кислорода в животном организме является супероксидный анион-радикал 02 , на формирование которого в физиологической норме расходуется примерно 2% всего потребляемого кислорода. Большинство же остальных АФК (ОН*, N0*, 02\ С1СГ и др.) в той или иной мере являются продуктами его биотрансформации.

Анализ данных литературы, посвященных антиоксидантам и изучению проявляемой ими активности свидетельствует о том, что их номенклатура ограничена преимущественно препаратами, относящимися к двум группам -донорам протонов (токоферол, пробукол, кислота аскорбиновая) и полиенам (ретинол, каротиноиды). Они не лишены недостатков, так как слабо защищают белки и нуклеиновые кислоты от окислительного повреждения.

Эндогенные антиоксиданты являются важнейшим звеном защитной системы организма, поэтому исследования по целенаправленному поиску индивидуальных веществ и/или суммарных композиций, проявляющих как антирадикальную активность, так и способных предохранять элементы собственной антиоксидантной системы, имеют важное значение.

В настоящее время существует четкая классификация известных антиоксидантов, основанная на структурных признаках молекул, ответственных за проявление антиоксидантных свойств. Учитывая это, можно проводить поиск новых антиоксидантов как путем целенаправленного синтеза, так и созданием оптимальных композиций антиоксидантов на основе природных соединений растительного происхождения.

Одним из таких перспективных и легкодоступных источников суммарных композиций антиоксидантов может служить мякоть плодов тыквы обыкновенной (Cucurbita pepo L.). В литературе до сих пор отсутствуют сведения о наличии в её составе фенольных соединений, однако применение в народной медицине в качестве гепатопротекторного, желчегонного, противовоспалительного средства свидетельствует о наличии данной группы соединений и является достаточным обоснованием для проведения химических и биохимических исследований.

Цель и задачи исследований. Целью наших исследований является химическое и биологическое изучение антиоксидантной активности сухого экстракта из мякоти тыквы обыкновенной, а также выявление взаимосвязи структура-активность 16 индивидуальных производных коричной кислоты, пять из которых являются компонентами данного сухого экстракта.

Для достижения поставленной цели мы сочли целесообразным решение следующих задач:

S с помощью предварительного биохимического скрининга, обосновать выбор растворителя для получения сухого экстракта мякоти тыквы обыкновенной, характеризующегося наибольшей антиоксидантной активностью;

S провести химический анализ сухого экстракта и количественно охарактеризовать в нем основные группы Б AB; S разработать методику количественного определения группы соединений, вносящих существенный вклад в проявляемую сухим экстрактом антиоксидантную активность;

S полуэмпирическими квантово-химическими методами изучить основные индексы реакционной способности производных коричной кислоты в отношении АФК на примере (ЮН) и на их основе обосновать структуру , характеризующуюся более высокой антиоксидантной активностью.

Научная новизна. На основе предварительного биохимического скрининга сухих экстрактов, полученных из мякоти тыквы обыкновенной, установлено, что наибольшей антиоксидантной активностью, а также СОД-протекторной активностью обладает сухой экстракт, полученный после обработки сырья спиртом этиловым 70%. Использование данного экстрагента обеспечивает наибольшую концентрацию антиоксидантов в целевом продукте - 174,9±2,4 мг/г (17,5%) в пересчете на кверцетин.

Впервые методом ВЭЖХ в мякоти тыквы обыкновенной определены галловая, изоферуловая, кофейная, цикоревая и коричная кислоты, а также кверцетин, апигенин, суммарное содержание которых в полученном сухом экстракте составляет 12,8%.

Предложена методика спектрофотометрического определения количественного содержания суммы производных коричной кислоты в исследуемом сухом экстракте (найдено 8,24±0,11% в пересчете на кофейную кислоту). По данным химического анализа в нём определены следующие групп БАВ: аминокислоты - 12,68 г/кг (1,27%); полисахариды: ВРПС -3,36±0,12%, ПВ - 13,43±0,34%, ГцА - 9,89±0,21%, ГцБ - 5,44±0,14%; макро и микроэлементы — 48,78% (в золе); аскорбиновая кислота — 3,98±0,13%; каротиноиды - 1,42±0,04мг/% (0,0014%).

Экспериментально (in vivo) изучены иммунотропная и

СОД-протекторная активности сухого экстракта мякоти тыквы. Установлено дозо-зависимое увеличение IgM-антителогенеза (в дозе 100 мг/кг в 1,71 раза; в дозе 500 мг/кг — 1,85 раза относительно контроля), уменьшение воспалительного эффекта при введении разрешающей дозы антигена (в дозе 100 мг/кг на 9,4%, в дозе 500 мг/кг - 37,5% по отношению к, контролю). Выявлен дозо-зависимый эффект подавления воспалительных реакций, вызванных подкожным введением гистамина и декстрана (в дозе 500 мг/кг на 40,3% и 48,2% соответственно). В эксперименте in vivo установлена протекторная активность сухого экстракта мякоти тыквы обыкновенной по отношению к эритроцитарной Cu-, Zn- супероксиддисмутазе.

Полуэмпирическими квантово-химическими методами (РМЗ и AMI) изучены индексы реакционной способности в ряду гидрокси- и метоксипроизводных коричной в отношении активных форм кислорода. По значениям величин порядков связей, связевых чисел и валентностей соответствующих атомов углерода в анализируемых структурах предложен новый показатель - суммарный индекс ненасыщенности (IUA). Он объективнее отражает способность структуры выступать в качестве «ловушки» свободных радикалов.

В эксперименте in vitro установлено, что антиоксидантная активность индивидуальных производных коричной кислоты достоверно, в среднем на 40%, превышает активность рутина, кверцетина и дигидрокверцетина. По результатам квантово-химических расчетов обоснована структура 4-гидрокси-3,5,-ди-трет-бутилкоричной кислоты, для которой экспериментально выявлен наибольший уровень антиоксидантной активности (Ci/2=9,8±0,4 мкМ), который превышает аналогичный показатель для кофейной (С1/2=15,7±0,4 мкМ), синаповой (Ci/2=17,0±0,3mkM) и 3,4,5-тригидрокси-коричной (С1/2=12,0±0,6мкМ) кислот, а также дибунола (С 1/2=21,2±0,8мкМ).

Сопоставление полученных экспериментальных значений уровня антиоксидантной активности производных коричной кислоты с рассчитанными на основе квантово-химического анализа показателями суммарной ненасыщенности молекулы, позволило выявить линейную зависимость между ними с коэффициентом корреляции 0,911. Такой подход может быть использован в исследованиях по целенаправленному поиску антиоксидантов в ряду других природных соединений.

Практическая значимость работы.

Предложен и обоснован способ получения сухого экстракта из мякоти тыквы обыкновенной. Для его стандартизации разработана методика спектрофотометрического определения гидроксипроизводных коричной кислоты.

Обоснована и экспериментально подтверждена антиоксидантная активность 4-гидрокси-3,5,-ди-трет-бутилкоричной кислоты, превосходящая таковую дибунола в 1,5 раза.

Исходя из количественного содержания суммы антиоксидантов, а также экспериментально установленной СОД-протекторной и имуннотропной активности, сухой экстракт из мякоти тыквы обыкновенной в перспективе может быть рекомендован для последующего исследования.

Внедрение результатов в практику.

Материалы по изучению тыквы обыкновенной и сухого экстракта, полученного из неё, переданы в НИИ питания РАМН для дальнейших совместных исследований. Для дальнейшего более глубокого фармакологического изучения антиоксидантной активности предлагаемый сухой экстракт мякоти тыквы обыкновенной передан в лабораторию микросомального окисления ГУ НИИ Биомедицинской химии им. В.Н. Ореховича РАМН. По материалам исследования составлено учебно-методическое пособие «Активные формы кислорода и природные антиоксиданты», используемого в учебном процессе факультета последипломного образования ПятГФА.

Положения, выдвигаемые на защиту: ^ обоснование выбора растворителя для получения сухого экстракта мякоти тыквы обыкновенной, характеризующегося наибольшей СОД-протекторной и антиоксидантной активностью; ^ результаты исследования качественного и количественного состава сухого экстракта мякоти тыквы; методика количественного определения суммы гидроксипроизводных коричной кислоты в целевом продукте; ^ квантово-химическое обоснование антиоксидантной активности

4-гидрокси-3,5,-ди-трет-бутилкоричной кислоты; ^ корреляционные зависимости между суммарной ненасыщенностью циннамоильного фрагмента в структуре производных коричной кислоты и проявляемой антиоксидантной активностью.

Связь задач с проблемным планом фармацевтических наук.

Диссертационная работа выполнена в соответствии с планом научно-исследовательской работ ГОУ ВПО «Пятигорской ГФА Росздрава», номер государственной регистрации 01.200101060.

Апробация работы и публикации.

Основные положения диссертационной работы изложены на: ^ четвертом международном симпозиуме "Компьютерные методы в токсикологии и фармакологии, включающие интернет-ресурсы СМТР1-2007" (Москва, сентябрь 2007 года); конгрессе "Человек и лекарство" Краснодар -2008г.; > 63-й и 64-й научной конференциях «Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции» (Пятигорск 2008-2009г.).

По теме диссертации опубликовано 9 работ, в том числе учебно-методическое пособие, используемое в учебном процессе факультета последипломного образования ПятГФА и 2 статьи в журналах, рекомендованных ВАК РФ.

Объем и структура диссертации.

Диссертационная работа изложена на 138 страницах текста компьютерного набора и состоит из обзора литературы, 3-х глав собственных исследований, общих выводов, списка литературы, включающего 160 источников, в том числе 65 иностранных; содержит 30 таблиц, 20 рисунков.

ОБЩИЕ ВЫВОДЫ

1. Предварительный биохимический скрининг сухих экстрактов, полученных из мякоти тыквы обыкновенной, показал, что наибольшей антиоксидантной и СОД-протекторной активностью обладает целевой продукт, полученный с использованием спирта этилового 70%. Данный экстрагент обеспечивает наибольшую концентрацию антиоксидантов — 174,9±2,4 мг/г (17,5%) в пересчете на кверцетин.

2. Осуществлен химический анализ сухого экстракта мякоти тыквы обыкновенной, полученного экстракцией спиртом этиловым 70%, и в нем количественно охарактеризованы аминокислоты — 12,68 г/кг (1,27%); полисахариды: ВРПС - 3,36±0,12%, ПВ - 13,43±0,34%, ГцА - 9,89±0,21%, ГцБ - 5,44±0,14%; макро и микроэлементны - 48,78% (в пересчете на золу); аскорбиновая кислота — 3,98±0,13%; каротиноиды — 1,42±0,04мг/% (0,0014%).

3. Изучен полифенольный состав полученного сухого экстракта и установлено, что преобладающими в нем соединениями являются изоферуловая, кофейная, цикоревая, коричная, галловая кислоты, а также апигенин и кверцетин, содержание которых в сумме составляет 128,23 мг/г (12,82%).

4. Предложена методика количественного определения суммарного содержания производных коричной кислоты в исследуемом сухом экстракте, найдено 8,24±0,11% в пересчете на кофейную кислоту.

5. Использование дескрипторов, рассчитанных полуэмпирическими квантово-химическими методами РМЗ и AMI, позволило выявить наиболее реакционноспособные центры в циннамоильном фрагменте. Установлено, что взаимодействие коричной кислоты с гидроксильным радикалом в первую очередь происходит по виниленовому фрагменту (С7-С8) и далее в следующей последовательности С6, CI, С5.

6. Прогноз антиоксидантной активности для индивидуальных гидрокси- и метоксипроизводных коричной кислоты позволил обосновать наибольшую активность для 4-гидрокси-3,5,-ди-трет-бутилкоричной кислоты, что далее было подтверждено экспериментально её синтезом и анализом биологического действия.

7. Установлены иммунотропный эффект сухого экстракта мякоти тыквы обыкновенной, а именно увеличение IgM-антителогенеза (в дозе 100 мг/кг в 1,71 раза; в дозе 500 мг/кг — 1,85 раза относительно контроля), а также уменьшение воспалительного эффекта при введении разрешающей дозы антигена (в дозе 100 мг/кг на 9,4%, в дозе 500 мг/кг - 37,5% по отношению к контролю).

8. В эксперименте in vivo установлена протекторная активность сухого экстракта мякоти тыквы обыкновенной по отношению к эритроцитарной Cu, Zn - супероксиддисмутазе.

9. Сопоставление экспериментально найденных значений уровня антиоксидантной активности производных коричной кислоты с показателем суммарной ненасыщенности молекул, рассчитанным квантово-химическим методом, позволило выявить линейную зависимость между этими параметрами с коэффициентом корреляции 0,911.