Автореферат и диссертация по медицине (14.00.25) на тему:Эффективность и механизм действия производных пиримидина при экспериментальной нитритной интоксикации

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ И МЕДИЦИНСКОЙ ПРОМЫШЕННОСТИ РОССИЙСКОЙ ¿ЕДЕРАЦИИ БАШКИРСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫ»! МЕДИЦИНСКИЙ ИНСТИТУТ

РГ6 ОД

^ На правах рукопаса

СРУБИЛИН Дмитрий Витальевич

УДК 615.31:547.£53.2:515-9

ЭФФЕКТИВНОСТЬ И МЕХАНИЗМ ДЕЙСТВИЯ ПРОИЗВОДНЫХ ПИРИМИДИНА ПРИ Э КСПЕРИМЕНТАДЬНОЛ ННТРИГНОЛ ИНТОКСИКАЦИИ

14.СО.25 - фармакология

Автореферат диссертации на соискание ученоП степени кандидата медицинских наук

Уфа - 1994

Работа выполнена в Башкирском государственном медицинском институте.

Научные руководители: кандидат медицинских наук,

доцент В.А.Мнвкин доктор медицинских наук, профессор Е.К.Алехик Официальные оппонента: доктор медицинских наук,

профессор Ф.А.Заруднй лпктоп квттининокиу нвук. профессор Г.Г.Максимов Ведущее учреждение - Институт фармакологии Российской АМН

Защита диссертации состоится " Ъ " июня_ 1994 г.

в Ю00 на заседании специализированного совете К 084.35.02 прк Бавкирскок государственно»! медицинскок институте (450000, Уфа, ул.Ленина, 3).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Балкарского медицинского института.

Автореферат разослан " 30 " апреля_ 1994 г.

Ученый секретарь Специализированного Совета доктор медицинских наук

профессор Э.Г.Давлетов

- J. -

Актуальность темы. Нитрита - метгемоглобинообразователи широко используются в химической, металлургической, бумажной, деревообрабатывающей промыиленности, меииностроенни, сельском хозяйстве, при консервировании продуктов (Демеикевич Н.Т., 1972; Лазарев Н.В., Левина Э.Н., 1976; Тиунов Л.А., 1989). Известны нитриты - лекарственные препараты (Машковекий M.Д., 1993). Этк соединения представляют потенциальную, а при определенных условиях к реальную опасность для человека, что обусловливает актуальность изыскания новых эффективных средств профилактики и лечения отравлений нитритами (Голиков С.Н. я соав?., 1986).

Традиционная трактовка механизма токсического действия нитритов сводится к образованию метгемоглобина. Однако исследования последних лет существенно обогатилк понимание проблемы. Установлено, что в процессе метгемоглобинообразования при нитритной интоксикации образуются свободные радикалы (Ж^, ОН, N02), являющиеся активными окислителями биологических субстратов, инициирующие процессы перекисного окисления липвдов, которые приводят к повреждению биологических мембран. Экспериментально показано нарушение отдельных компонентов ентиоксидантной системы при воздействии натрия нитрита (¡Зугзлей Н.В. а соазт., 1986,1988,1989, 199I; Бурбелло А.Т. и соавт., 1990,1991; Chiodi К., liohler S., 1987; Kosaka N., Tyuma L., 1987).

Таким образом, современные представления о действии метге-моглобинообразоватедей открывают новые возможности для разработки средств профилактики я лечения нитратных отравлений. Некоторые исследования демонстрируют целесообразность применения анти-оксидантов - ингибиторов ПОЛ для повыаения эффективности заяиты организме прк отравлении метгемоглобинообразователямк, е-также химическими веществами, имевшими другие механизмы избирательной Токсичности (Абрамова I.И., 1970,1985; Шугалей. И.В. и соавт.,

159I; Буроелло А. Т. и соавт., IS9I; Мышкин З.А. и соавт., 1991, 1993; Бедкетов A.C., 1989).

В последние годы показано наличие антиоксидантных v. мембра-нопротехторннх свойств у некоторых пиримидиновых производных, а также их комплексов с глицирризиновой кислотой (Мыекик Б.А. к соевт., 1991,1993). Известке, что препараты, полученные не ее основе, обладав? антндотным действием (Патент 700^510, Япония, 1970). Б связи с разработкой препаратов ентиоксидактов - потенциальных антагонистов метгемоглобикообразователеГ:, представлялось целесообразным исследование профилактическое ¡: «ечеико.-. аф-фективности новых производных пиримидина, е такзе их комплексов с глицирризиновой кислотой (ГК) при экспериментальной: нктркткоГ: иктоксикацни.

Цель работи: Изыскание ковш: фирн апологически;: средств коррекции токсического действия нитритов средк производных пиримидина.

Задачи исследования.

1. Исследовать антирадикальнув активность производных пиримидина и комплексов f -глицирризиновой кислоты с производными

. пиримидина.

2. Изучить деметгвмоглобинизирувщее действие производных ..пиримидина,, обладавших антирадикальной активностью.

3. Оценить острую токсичность производных пиримидина, комплексов j> -глицирризиновой кислоты с производными пиримидина и

их защитную эффективность при остром отравлении натрия нитритом.

4. Изучить интенсивность процессов перекисного окисления липидов мозга, печени и эритроцитов и'состояние мембран при остром и хроническом отравлении натрия нитритом.

5. Определить перспективность использования антиоксидан-

tob - производных пиримидина зля лечения острых и хронических отравлений нитритами.

Научная новгзка. Б модельных системен различной слоетостк выявлена высокая антирадикальная (антиоксидантная) активность у ОКСИ-, 8мико-. и тио-производных пиримидина к их комплексов с - —г" и 1!и rD у з и:-: с s о г: кислстэй. Установлен;: сг.~21 к'еггд"* "Г!>"'чео7ГоП структурой к активностью в раду производных пиримидина. Исследована способность производных пиримидина и их комплексов восстанавливать кетг енсглоойк -г. vizro»: lt. vivcniii стр^влскь;: неtz'i\z китрнток. Выявлены соединения >-с о~::рsu;:.* v :>-аш:но-

урецкл к их комплексы с глипкррнзиноЕЭК г.:: ело то::, ооладавцие от-четл изьч: л еа етг емэ гл о бики з круг ей i : е ::тсм.

Впервые изучены окси-, аиино- у. тио-прокзводные пиримидк-kö, l так=е v.r. nOK.v.e^CL- с гл-.:и::рр;:31Гг:огэ: ""слгтэГ: г кгчествс фармакологических средств запщты организма при нитритной интоксикации, показана их высокая эффективность.

Показана интенсификация процессе перекисного окисления ли-пидов в эритроцитах, мозге, печени и повреждение мембран при отравлении натрия нитритом. Установлена способность 5-окси-б-ме-тилурацила и 5-аминоурациле ингибировать ПОЛ и стабилизировать мембраны при нитритной.интоксикации.

^ ■ Научно-практическая значимость. Обоснована перспективность дальнейшего доклинического изучения 5-аминоурацила, обладавцегс антиоксидантной (антирадикальной) актавностьг и выраженный« мембранопротекторными свойствами для коррекции нитритной интоксикации. Препарат оксинетацгл (5-окс:'-б-мет::лурецнл) разрешен к медицинскому применение (резекие Фармакологического комитете от II.11.93., протокол й 20). В настоявее время готовятся материалы на новое применение оксиметацила в качестве средстве про-

филактики и лечения токсических метгемоглобинемий.

Положения, выносимые на задиту;

В токсическом действии натрия нитрита существенное значение имеет активация свободнорадикального окисления и повреждение биологических мембран.

Применение производных пиримидина, обладепвдх актноксидакт-ной (антирадикальной) активностью, - перспективный метод лечения нитрктной интоксикации.

Внедрение. Результаты исследования внедрены в лекционные и практические курсы на кафедрах фармакологии £ I к 1г 2 к военной кафедре Башкирского медицинского института.

Апробация работы. Основные результаты работы доложены на 53-й научной конференции студентог к молодых ученых ЕГМК (Уфа, 1986); на международном симпозиуме "Вопросы токсикологии и прикладной экологии" (Пермь, 1991); на учредительном конгрессе Международного общества патофизиологов (Москва, 1991); на 57-й молодежной научной конференции БГМИ "Вопросы теоретической и практической медицины" (Уфа, 1992). По теме диссертации опубликовано 6 печатных работ, 2 работы приняты в печать, получено 4 авторских свидетельства на изобретения я I пслозятальнов реяенке на заявку об изобретении.

Структура и объем работа. Работа изложена на /¿Г страницах машинописи, состоит из введения, обзора литературы, описания методов исследования в собственных наблюдений, обсуждения полученных результатов, списка литературы (включает 371 источник, из которых 107 зарубежных авторов), приложения. Работа иллюстрирована 31 таблицей и 12 рисунками.

Кетеривды в методы исследования. Работа выполнена на 1200 нелинейных мышах массой 16-24 г и 1440 крысах-самцах массой 160-250 г. Исследовались производные пиримидина и их комплексы

- о -

с глипирризиновой кислотой (ГК), а таяяе цистамин я аонол.

Для оценка защитной эффективности азучаамые соединения ззо-дили в дозах 12,5 мг/кг, 25 мг/кг, 50 мг/кг, 100 мг/кг, 200 иг/кг за 60 минут до отравления мышей натрия нитритом Шв4= 180 мг/кг). Модель отравления животных натрия нитритом является одной из наиболее распространенных в экспериментальной фармакологии. используемой при разработка новых средств профилактики и лечения токсических метгемоглобинемнй (Кунаковский .4.С., 1961; Курбат Й.В., Корабдев М.З., 1360; Коствчанко Б.Н., заращук П.13., 1982).

Острую интоксикации у крыс получажи однократным подкожным введением натрия нитрита в дозе ДДкд (90 мг/кг). Модель хронического отравления крыс создавали подкожным ежедневный введением натрия нитрата в дозе 50 мг/'хг в течение 30 суток. 5-аминоурацил (50 мг/'зсг), 5-окси-о-метилурацил (50 мг/'кг), ионод (120 мг/кг), цистамин (50 мг/хг) вводили з профилактическом режиме. В течение 30 зутоз посла отравления регзстрирозали основные биохамичаслгле показатели.

Продукты ПОЛ (диеновые конъпгаты и основания ¡Зиффа) исследовали з липидных экстрактах полушарий головного мозга а лечен;] Clay Н.З., Heed D.J., 1973; Tappel A.L., 1973; Fletcher B.L. . е- al., 1973). Дяеновые хонъпгаты определяла спектрошотометриче-сзл. Расчет псоиззозили в единицах экс-ганками з максимума поглощения дяеновых хоньпгатов (232 нн) на .чг дипидоз. Основания Яле-фа определяли спактрофлуориматрически. Количественно результат выражали в относительных единицах флуоресценции. Диеновые конъ-вгаты в эритроцитах определяли по З.Плацеру и соавт. (1970).

Антирадихальнуп активность соединений регистрировали методом хемилвминесцешгаи з модельной системе инициированного окисления этилбензола по З.Я.Шляпинтоху и соавт. {1966). ?е+2-инду-

о -

цированную хемилюминесценцию сыворотки хрови и влияние производных пиримидина на хемилвминесценцап суспензий митохондрий исследовали по методу О.А.Владимирова, А.И.Арчакова (1972). Об активности препаратов в отношении супероксадного анион-радикала судили по интенсивности восстановления нитросинего тетразолия (Мили-тана К.П., Аманян К.А. и др., 1990).

Деметгемоглобинизирующую активность препаратов ia vitro определяли по И.5.!2угалею, Н.Н.Зопатиной (1986). Метгемоглобин з крови оценивали по М.С.Кушаковекоку (1966). Стойкость зрутроци-тарных мембран к гемолитическому действии соляной кислоты определяли методом кислотных эритрограмм (Тересков И.А., Гательзон И.Н., 1957).

Оценили активность ряда ферментных систем крыс. Каталазу определяли по М.А.Королюку, Л.И.Иванову и др. (IS88), глвкозо-б-росфатдегидрогеназу по G.Glock, r.Uclean (1953), супероксиддис-мутазу по C.Seauchanp, S.Fridovich (1971). Об активности Ха+-£+-АТгазы судили по разности неорганического фосфата (?н) полной среды и среды без Na* и К* в присутствии строфантина К, ингяби-рувщего фермент (Толстухина Т.И., 1982).

Статистическую обработку данных проводила на ПЗЕМ методами вариационной статистики (Каминский 1.С., 1964).

Исследованные в работе производные пиримидина и их комплексы с ГК синтезированы в Институте органической химии ШГ РАН под руководством академика РАЙ Г.А.Толстикова.

Результаты и обсуждение. Результаты проведенных исследований указывают на наличие высокой антирадикальной (антаоксадант-ной) активности у некоторых производных пиримидина, а также на . определенную корреляцию меаду ах химическим строением а антира-•акальной активностью.

Методом хемилюминесценции определяли константу Krj соедине-

ннй, характеризующую скорость реакции неаду молекулами изучаемого соединения я перакисного радикала этялсензола, з результате которой ингибируется цепной свободнорадикальный процесс (Щляпин-тох В.Я» и со авт., 1966). Это служит мерой антирадикального действия препаратов в гидрофобной фазе мембраны. Значение константы К7 изучаемых соединений сравнивала с Ну иокола - эталонного ингибитора свободнорадикального окисления (СРО). Результаты, представленные в таблице I, свидетельствуют о высокой антирадикаяь-кой активности 5-оксз-б-метзлурацила, 5-зыиноурацила, б-амино-2-тиоурацила, б-метял-2-тиоурацила, 2-тяоураиила и нх комплексов с ГК, тогда как глицирризиновая кислота малоактивна.

Таблица I

Антирадикальная активность препаратов (хонстанта Ку)

"111 п/п ! Соединение ! ! Константа Ку ( (моль/л.с.) ! Ку препарата ! ионола

т ! 2 ! 3 ! 4

I 5-аминоурашзл (2,0+0,6)«10^ 8,7»ГО"1

2 4-анинс-2-тиоузац:и (1,3±0,!<)-105 5,7

-5 -У б-емино-2-тпоурац:« (1,3+0,^).Ю5 5,7

б-матил-2-тиоурапил С9,1±0,5)-Г0^ 3,96

5 2-тиоурацил (1,3+0.4)-Ю5 5,65

5 З-охсз-с-.чатплурацял (2,5+0,3).:04 1,13

7 Комплекс ГК с 5-аииноура-цилом (2.0+0,б). Ю5 8,7

8 Комплекс ГК с 4-амино-2-?ио~ урацилом (4,3±Г,3>105 18,7

а Комплекс ГК о 5—зминс-2-г,ю-урацилом 18,7

10 Комплекс ГК с б-метил-2-?ао-урацадом (2.1±0.8)-Ю5 9,13

- а -

Окончание таблицы

I !

2

3

¡.с 1 лииииииэипивал ыыиха

13 Цистамин

6-аминоурацил

15 б-метилураоил

16 Ионол

17 4~оксапиримидиы

18 2-амино-4,б-диоксипиримидин

(1,3+0,4). КГ (2,1+0, б) «Ю3

0,006 9,1-Ю"2 0

0

(3,0+р,9)»101' (2,3+0,6).10*

•1.3.10"3

I

О

о

о о

Более активны производные пиримидина, содержащие аминогруппу з 4, 5 и б положениях, таогруппу во 2 положении, оксагруппу в 5 положении пяримидянового кольца. Обращает внимание существенная разница в активности (на 3 порядка) 6~метилурацила и 5-окси-б-четалурацма, а также б-метзлурацала а 6-.четпл-2-тяоура-цала, содержащих метильную группу в 6 положении пириывдинового кольца. Модификация структуры 6-метилурацала путем замещения группой ОН в положении С^ и тиогруппой в положении С£ существенно повышает значение константы Ку.

Вследствие того, что первичной активной формой 0£ в оксира-дикалгенерируащей слстеме язляется суперохсадный рвззкгл, з образование более реакционных форм происходит вторично, исследовали антирадикальнуи активность водорастворимых комплексных препаратов по отношении к супероксидному анион-радикалу. Исследуемые комплексы ГК с 5-окси-б-метилурацилом, 5-аыиноу.рацилом, 4-амино-2-глоурацилом, 6-амино-2-тиоурацилом, 6-метил-2-тиоурацилом, ионолом обладавт значительной антарадикальной активностью, тор-ыозя процесс обсазозания супероксидного радикала на 42,3?,

50,3%, 59,3:2, 34,02, '40,1%, соответственно по отношении х

контролю.

Анализ Рет -индуцированной хекилпнинесценции митохондрий печени крыс выявил, что производные пиримидина и их комплексы с ГК отчетливо снижают светосумму излучения, причем ингнбирувщий эффект комплексов с ГК выше, чем у индивидуальных соединений, а также цистамина. В порядке возрастания активности исследуемые препараты расположились следуюним образом: глицирризинозая кислота < цистамин <б-метял-2-гиоурацил < комплекс ГК с аонолом < б-амино-2-тиоурацил <5-аминоуращи <комплекс ГК с б-мвтял-2-тяоуре цилом <4-амино-2-тиоурацил комплекс ГК с 5-аминоурацилом < комплекс ГК с б-амино-2-таоурац:иом < комплекс ГК с 4-амяно-2-тиоура-цилом < комплекс ГК с 5-окса-о-метилурацилом. Следует отметать сходные изменения кинетики хемилюминесценцаи под влиянием исследуемых препаратов, которая характеризуется некоторым снижением интенсивности быстрой вспызкя, а также увеличением индукционного периода окисления.

Снижение хемилюминесценцаи з присутствии исследуемых соединений характеризует их влияние на ПОЛ. Данное-положение подтзер:: дается исследованиями, а которых показано, что проазводныэ пар:: мидина, снижающие интенсивность ?е+2-индуцированной хенилюминес-ценции, одновременно подавляют образование з суспензии митохондрий малонозого диальдегида (Мыакин В.А., 1976,1982). Подобная зависимость между интенсивностью свечения л количеством образуй зихся продуктов ПОЛ исключает возможность физического туаения хемилюминесценции препаратами, добавляемыми в систему.

С целью более точного определения "места действия" (локализации) производных пиримидина в мембранах клетки был вычислен коэффициент Ханча, характеризующий распределение препаратов а системе октанол-вода, моделирующий полярную и неполяркую фазы

- хи —

клетки. Полученные данные коэффициента Ханча (5-окса-о-металура-цил - 0,179; б-металурацал - 0,264; 2-таоурацил - 0,271; 6-не-тил-2-тиоурацил - 0,603; б-амино-2-тиоурацил - 0,768; 5-амино-урацил - 0,794; 4-аиино-2-тиоурацил - 0,806) указывают на возможность нахождения соединений как в гидрофобной, так и в гидрофильных фазах, что соответствует оптимальному взаимодействии с водорастворимыми и липофильными свободными радикалами, без образования радикальных состояний ингибитора, способных пролонгировать П01.

Учитывая антирадикальнув активность производных пиримидина, оценили их деметгемоглобинизирувщее действие в модельной системе окисления оксагемоглобина натрия нитритом. Об активности препаратов судили по изменению кинетики накопления метгемоглобина (рнс.1). Высокой активностью в данной модельной системе обладают

5-аминоурацал, оксаыетацаа а ах комплексы с ГХ, оказывающие эффект при концентрациях 5'Ю""-3—10~° Моль/л. Цистамин активен при этнцэнтрацаа 5*10"^ Моль/л. Остальные асследуемые произзодные пиримидина, несмотря на высокую константу Ку, не уменьаали прироста метгемоглобина.

d основном окисление оксагемоглооина натрия нитратом.осуществляется через взаимодействие радикала с двухвалентным железом гема. Поэтому ангибируюаий эффект 5-аминоурацила и 5-окси-

6-метилурацила на накопление метгемоглобина иозет указывать на их антирадикальнув активность в отноаении этого радакала.

В опытах на мынах при остром отравлении натрия нитритом в дозе ЛДсд мг/кг) изучалось деметгемоглобинизирувщее действие препаратов. 5-аминоурацил, 5-окси-б-метилурацил и их комплексы с ГК достоверно понижает уровень метгемоглобина по сравнению с контролем (от 61,62+1,2 в контроле до 49,262+1,3; 46,5+1,8; 48,7+1,4; 43,6+2,1 соответственно), но эффект ниже, чем у циста-

J

Рис.1. Кинетичаскиа криви и ткошюшш метгемоглобина при окислении окси.'омоглобина нитрит-ионом в присутствии различ.шх коли-честц 5-аминоурацила (Л) и оксиио-пцила (Б).

I - контроль; 2 - концентрация ии/ибитора 5*10"? Моль/л; 3 - концентрации млгибитора 5-Ю~5 Моль/л.

МСЫ

Рис.2. Кислотная резистентность эритроцитов крис при остром (А) и хроническом (Б) отравлении натрия нитритом.

■ ■ незащищенные;----защита оксиметацилоы;

-----защита 5-ашшоурацилом;...............зашита цис-

татшои;-»~«-*-н- защита ионолом; 3 - индекс устой-чииости; : показатели интактних жипотиих.

мина (до 36,122+0,9). Остальные пиримидины (4-амино-2-тиоурацид, б-амино-2-тиоурацил, б-метал-2-тиоурацил) обладает незначительной деметгемоглобинизирующей способностью. В то se время уровень метгемоглобина через 3 часа ниже контроля, что говорит об ускорении его восстановления, связанном, вероятно, с активацией ре-дуктазных систем. Таким образом, 5-аминоурацал и оксиметацял ин-габирувт накопление метгемоглобина как в модельной системе, так и in vivo.

В опытах по изучению защитной эффективности установлено, что среднеэффективные дозы (ЕД^) 5-аминоурацила, б-амино-2-тио-урацила, 4-амино-2-таоурацила и их комплексов с ГК в 1,7-2,6 раза низе, чем цистамина. ЕД^ оксиметацила и б-метил-2-тиоураци-ла сопоставимы с цистамином. Среднеэффектавные дозы исследуемых производных пиримидина и их комплексов с ГК примерно равны. В то же время широта фармакологического действия (Ií^q/ES^q). у комплексных препаратов выше, чем у соответствующих им пиримиди-нов. Максимальный защитный эффект 5-аминоурацила, 5-окси-б-ме-тилурацила, 4-амино-2-тиоурацвла, 6-амино-2-тиоурацила и их комплексов с ГК выше, чем у цистамина.

более высокой защитной эффективности производных пиримидина и их комплексов по сравнению с цистамином в условиях отравления мышей смертельной дозой натрия нитрита.

Рядом авторов (Абрамова Ж.И., 1966; Абрамова Ж.И., Марцин-кевич Г.Д., 1970) показана способность метилурецила оказывать отчетливый деметгемоглобинизирующий эффект при отравлении натрия нитритом и анилином. В то же время использованный нами препарат метилурацила не обладал антирадикальной (антиоксидантной) активностью in vitro, не влиял на уровень метгемоглобина и не защищал животных от гибели при остром отравлении натрия нитри-

том. Это может объясняться тем, что исследованный нами препарат, по-видимому, соответствует кристаллической форме I метилурацила (Леонидов Й.З., Елисеева C.B. и соавт., 1969).

Учитывая важнув роль свободных радикалов в патогенезе нит-ритной интоксикации, проведен корреляционный анализ между константой и защитной эффективность!) данных препаратов. Вычисленный коэффициент корреляции (г) равен 0,653 с доверительным интервалом в пределах 0,14^г с 0,81. Это говорит о тесной связи изучаемых показателей а позволяет предполагать, что зааитяое действие производных пиримидина связано с их антиоксидантной (антирадикальной) активностьп.

Натрия нитрат интенсифицирует процесс ПОЛ в крови, мозге, печени крыс при остром и хроническом отравлении, что подтверждается накоплением в них диеновых конъюгатов и оснований Шиффв, а также возрастанием интенсивности хемилхшинесценции сыворотки крови (табл.2,3). При остром отравлении натрия нитритом диеновые конъюгаты (дк) в эритроцитах увеличиваются в 2,1 раза, а в полу-вариях головного мозга и печени - в 1,56 и 1,45 раза соответственно. В дальнейшем их уровень постепенно уменьшается, приближаясь через 24 часа к контрольным показателям.

При хроническом отравлении натрия нитритом максимальное накопление диеновых конъвгатоз в эритроцитах отмечается на 3 сутки, достигая 2402. В дальнейшем идет уменьаение их количества, оставаясь выае нормы почти в 2 раза. Накопление диеновых конъюгатов в полушариях головного мозга и печени менее выражено, чем в эритроцитах. Динамика содержания диеновых коньвгатов в полушариях головного мозга показывает постепенное возрастание'их количества к 10 суткам (в 1,78 раза) и дальнейшее некоторое снижение и стабилизация показателей на уровне 150%» В печени отмечается постепенное увеличение диеновых конъигатов к 7 суткам и

Таблица 2

Содержание диеновых кошюгатов, активность каталазы и супероксиддисмутазы в эритроцитах при остром и хроническом (30 сутки) отравлении крыс натрия нитритом

п/п

Условия эксперимента

Острой отравление

Хроническое отравление

Дионоьио ! Кач'илиза ! Супороксид- ¡Дионовые ¡Каталаза ! Супероксид-коныогати !иМоль/мин ¡дисиутаза !конъюгати ¡мМоль/мин ¡дисмутаза ниоль но I-г!па I г геио-'усл .ед. на ! ниоль на I г!на I г гомо~!усл.од. па гимог'лобина ¡глобина ¡1 мг гено- ¡гемоглобина ¡глобина ¡1 мг гемо-! ¡глобина ! ! ¡глобина

I Интактные 82,1+5,0 31,7+1.8 1,07+0,04 86.2+4,0 31,5+0,92 1,02+0,03

животные 100,0 100,0 100.0 100,0 100,0 100,0

2 Незащищенные 173^27* 20,9+1,12* 0,8±0.05* 179,4+7,3* 20.1+1,2* 0,89+0,032*

животные 210,7 65,9 74,8 208,1 63,8*" 87,8*~

3 Защита окси- 93,2±7,8** 20.0+1.6** 1,1410,04** 115,8+8,4** 30,6+1,1** 1,03+0,037**

метацилом 113,5 90,9 106,5 134,3 97,2 101,0

Защита 5-ами- 104,3+10,2** 27,7+0,9 1,03»0,03** 90,5+9,2** 29,4+1,15** 1,04+0,038**

ноурацилом 127,0 87,'Г 96, з" 105,0 93.3" 102,0

5 Защита цис- 90,0±Ю,8К* 25,9+1.3** 0,93^.0,04* 189,9+9,0^* 23,0+1,07* 0,912+0,040

тамином 119, 4 91,7 86,9 150,7 73,0" 89,0 ~

6 Защита 112.0+8,0^* 26,6+1,3** 0,97+0,05** 123,2+12,0^* 27,3+0,51** 0,976ч0,042

ионолом 136, С 83.9 90,7 132,9 86,7"" 95,0

1-1

Статистически достоворное разтчио по отношению к интактной группе (биологическому контролю) обозначено (и), но ¿равнению с назыцищошшми животными (к*)

О

(□ V 0} к

Содержание днонових нитритом (Л532)

Таблица 3

шшьюгатои при хроническом отравлении крыс натрия

Условия эксперимента I Дни эксперимента

| 7 ! 14 ! 21 1 30

Интактные животные

Незащищенный аивот-ние

Защита оксиметацилом

Защита 5-аминоура-цилом

Защита цистамином Защита иоиолои

Интактнио животние

Незащищенные животные

Защита оксимотацилом

Защита 5-аминоура-цилоы

Защита цистимшюм Защита ионолоы

0,202+0,017 0,3'|0+0,028*

0,2 3 <1+0,022** 0,2 36±0.024**

0,209+0,023** 0,209+0.023**

О,454+0,022 0,6Эб70,03о*

0,Ы4+0,01Ь^ 0,4о5+0,026**

0,518+0,023** 0,4-^+0,023^

0,202+0,017 0,328+0.024*

0,221+0,017** 0,236Т0,016**

0,2X0+0,019** 0,210+0,019**

0,454+0,022 0,600+0,038*

0,416+0,02** 0,537+0,023*

0,462+0,027** 0,494+0,03**

0,202+0,017 0,292+0,017*

0,204+0,018** 0,235+0,023

0,210+0,023** 0,210+0,023**

0,454+0,022 0,658+0,041*

0,410+0,02** 0,481+р,025**

0,524+0,031** 0,450+0,021**

0,202+р,017 0,304+0,025*

0,215^0,019** 0,229+0,02я*

0,205+0,028** 0,205+0,028**

0,454+0,022 0,672+0,039*

0,381+0,026** 0,499+0,022**

0,543+0,035** 0,497+0,026**

Достоверное различие обоблшоио, как в таблица 2; " акстинкиия в максимуме поглощения диеновых конш^атов (232 нм).

стабилизация их значений а пределах 130-146,» з остальные сроки исследования.

Содержание оснований Шиффа в полупариях головного нозга и в печени лишь незначительно увеличивается при остром отравлении. При хроническом отравлении наблвдается постепенное возрастание оснований Зиффа в мозге а печена, становясь статистически значимым к 14 суткам эксперимента (125? и 127,соответственно). На 30 сутки накопление оснований Шиффа достигает своих максимальных значений, составляя 150? для мозга и 172? для печени.

Усиление липопероксидации сопряжено с ингибированием ферментов антиоксидантной задиты, компонентами которой является су-пероксиддисмутаза (СОД) и каталаза. При остром отравлении активность каталазы з эритроцитах уменьшается на 34,1,», а СОД - на 25,2?. К концу суток уровень катзлаза приближается к показателям интактных животных, з у СОД - превосходит ах.

При хроническом отравлении активность каталазы в эритроцитах ниже исходного контроля з течение зсего срока эксперимента. Максимальное падение на 31,5? а 36,2? отмечается соответственно к 3 и 30 суткам. На 7 и 10 сутки актпзность фермента несколько

Л С ÛC . Ci* ) ч< С. СЛ С 1< ТСл .10 IiCuOc ¿îiîi ô «wH « мОЛЬп^л Jôi'ci^ô^i »

Динамика активности СОД эритроцитов аналогична каталазе. Наибольшее падение активности фермента наблядается з I и 30 сутха эксперимента, достигая 17,8? а 12,2? соответственно. В остальные сроки показатели лишь несколько ниже контроля. Синхронность изменений зггпзностп каталазы и СОД объяснима, зела участь, что перекись водорода, разрушаемая каталазой, ингибирует фермент (Дубинина E.S., Ефимова !.§., 1988; Прайор У., 1979; Fridovich S., 1972). В полушариях головного мозга и печени активность каталазы на 30 сутки хронического отравления уменьшается на 31,8? и 33,4?.

Повреждение антаоксидантных ферментов аозет развиваться по сзободнорадикальному механизму (Гуткин Д.В., Петрович В.А., 1982; Джафаров А.И., 1983; Горбатенкова Е.А., 1988; Биленко М.З. 1989; Bartoaz G. et ai., 1981,- Uichelson A.JX. et al'., 1985). Вероятно, поток свободных радикалов, вызывая вспыику П01, ведет также к снижению активности антиоксидантных ферментных систем, что, в свою очередь, усиливает процессы ПОД, т.е. замыкает порочный круг. - - . . ■

Глюкозо-6-фосфатдегидрогеназная реакция является основным .механизмом генерирования НАД#Н, который предохраняет ненасыщенные жирные кислоты, входящие в состав клеточной мембраны, от аномальных взаимодействий с кислородом, поддерживает нормальную степень окисления атомов зелеза гемоглобина, является субстратом для глутатаонредуггазы, которая поддерживает з активном состояна: .глутатнонперохсидазу, разрушающую перекись водорода (Кулаховскай М.С., 1968; Ленинджер А., 1985; Тиунов Д.А., Жуков В.Г., 1991). Пра отравлении затрия нитратом отмечается уменьаение активности фермента в эритроцитах я печени крыс. При остром воздействии это падение з эритроцитах составляет 352. При хроническом отравления з I сутки активность фермента з эритроцитах уыеньааатсл на 302, на 14 сутки - 232, на 30 сутки - 132, а в печени уменынается на 502 к 30 суткам. Наблюдаемая тенденция к повышению сниженной активности глзхззо-с-посгатдегндрогеяаэы з эоятроиятах крыс при хроническом отравлении объясняется, видимо, тем, что в обычных условиях активность фермента в молодых эритроцитах выше, чем з зрелых (Симановский Д.П., Перцева .Ч.Н., 1968).

Так хах производные пиримидина 5-аминоурацял я оксиметаиял помимо высокой антирадикальной активности обладают отчетливым деметгемоглобаназасующим действием, для оценки эффективности производных питзимиляна той нитратной интоксикации были выбраны

эта препараты. В качестве препаратов сравнения тестировались цис-тамин - известный антидот ядов-метгемоглобинообразователея и ионол - известный антиоксидант.

Оксиметацял, 5-аминоурацил, цистамин, ионол в режиме профилактического применения уменыяали накопление продуктов ПОД в мозге, печени, эритроцитах, нормализовали активность антиоксидант-ных ферментов и тлпкозо-6-фосфатдегидрогеыазы во все сроки эксперимента, при этом эффективность производных пиримидина била явно ваза. Активность цистамина уменьшалась при длительном его применении» в отличие от пиримидинов, которые оказывали стабильный эффект. Ионол наиболее активен в печени, что связано с преимущественным его накоплением в этом органе (Проценко Л.§., Будкяна З.П., 1965).

Интенсивность П01 в эритроцитах значительно зыше, чем з мозге и лечена, как при остром, так л лра ::рон-лчесхом отравлении. Это связано, вероятно, с тем, что эритроциты подвергаются прямой атаке саободнорадикальных метаболитов, зозннказэдх прп окислении гемоглобина нитрит-ионом. 3 то se время з мозге л печени усиление липопероксадации происходит, скорее зсего, за счет другого патогенетического механизма. При не'ггймиг-^иьлаом«».! -юз^зйстсл комбинированная гемикоциркуляторная гипоксия, приводящая при определенной степени ее выраженности ¡с наруаению утилизации кислорода, т.е. ко зторачной тканевой гипоксии.

Исследования, проведенные з последние годы, позволяют выявить определенное сходство повреждаемого действия ПОЛ л гипоксии на клеточные мембраны (Владимиров U.A., Арчаков А.И., 1972; Годиков С.Н. и соавт., 1986; Владимиров O.A., 1989). Имеются данные, согласно которым гипоксия может активировать П01 (Меер-сон #.3., Каган 3.2., 1979; Биленко М.З. а соавт., 1983; Виноградов В.М., Урюков D.S., 1985; Меерсон §.3., Белкина 1.М.,

1986).

Латавацая лерекисных процессов вызывает повреждение биолога-' ческах мембран, белковых молекул, встроенных в мембранные структуры, изменения активности мембраносвязанных ферментов (Владимиров U.A., Арчаков А.И., 1972; Tappel A.L., 1973; Jloyd 2.А., 1988; Emerit S., 1986). Поскольку состояние мембран эритроцитов отражает основные особенности клеточных мембран других тканей, имевших сходный тип метаболизма, то по снижении их резистентности можно судить о системном характере повреждении биологических мембран, а также прогнозировать их состояние.

Повреждение мембран обнаружено методом кислотных эритро-грамм (рис.2). При остром отравлении индекс стойкости эритроцитов, характеразувщий их суммарную резистентность, понижается на 16%, далее наблюдается некоторый подъем, достигающий к 12 часам контрольных показателей. Однако к 24 часам индекс стойкости снова понижается на 11% и затем постепенно к 3 суткам возвращается з норму.

При хроническом отравлении резистентность эритроцитов в первые трое суток ниже контроля на 11%, в дальнейшем наблюдается повышение индекса стойкости, достигающего контрольных показателей. Диаграммы распределения эритроцитов по группам стойкости показывают значительное возрастание пониженностойках и низкостойких гвупп эоитсоцатоз во все cdokh хронического отравления с одновременным увеличением группы повыиенностойхих эритроцитов, свидетельствующих о стимуляции эритропоэза. Молодые формы эритроцитов обладают более высокой кислотной резистентностью (Гительзон И.Н., Гамзякова Н.В., 1967).

Лечение хрыс охсиметаиилом, 5-аминоурацилом и ионолом повы-зает стойкость эритроцитов, которая при применении пиримидинов даже псевыаает контрольные показатели. Цистамин был эффективен

- си -

в I сутки отравления, в дальнейшем индекс стойкости менялся незначительно, приближаясь х контроля на 30 сутки. Цистамин, наряду с относительно высокой острой токсичностью, плохо переносится, оказывает гипотензивное действие, вызывает дегенеративное изменение семенников и образование язв (Мозжухин A.C., 1964; Куна П., 1989). Производные пиримидина практически нетоксичны и лишены указанных недостатков.

Ионол обладает мембранодестабялизируощим действием в экспериментах in vitro, знзызая увеличение проницаемости мембран (5а-калоза Р., Давиташвили Н.Г. и др., 1987; Сербинова Е., Харфуф М. и др., 1990). В отличие от них пиримидины обладают отчетливыми мембранопротекторными свойствами (Бсупов Р.Г., Плечев Б.З. и др., 1983; Мьткин ¿э.А. и соавт., 1986; Базкатоз С.А., 1989). Кроме того, ионол, как и другие дипидные антаоксиданты, помимо дейст-зия на яеферментативноа ПОЛ, тормозят липоохсаггназкый путь окисления арахидоновой кислоты, что приводит к изменении соотно-ления иежду физиологически ¿ктизньму л?оду:;тзиа липе- :! оксагеназного путай метаболизма арахадоновой заслоты (Fujimoto J., Canioka Н. et ai., 1983). Известно также, что в результате подавления липооксигеназного пути образования леихотр-деноа, ша-нольные антаоксиданты оказывают цитостатачесхое действие, а также угнетают некоторые звенья иммунного ответа (Bali Sh., Veind-rucn 3. et ai., 1936). Производные пиримидина, напротив, являются стимуляторами иммунитета (Лазарева Д.й., Алехин S.K., 1985).

Характерной особенностью мембранопротекторного действия ок-симетацила и 5-аминоурацила является ах нормализующее влияние не только на процессы ГОЛ, но и на активность некоторых липидза-зисимых ферментов, в частности На-1-,АТ§азу саркоплазматического ретикулума головного мозга. Эффективность цистамина и яонола з этом ..случае была явно ниже. Натрия нитрит снижал активность фер-

мента в мозге крыс на 30 сутки хронического отравления: у здоровых крыс его активность равна 4,98+0,41 мкМоль на I мг белка/час -а у отравленных составила 3,49+0,48 (Р 0,05). В то же время при остром отравлении различие в активности Ла-к- АТФазы мозга отравленных к ннтактных крнс стгткстичесгг недостоверно.

Учитывая совпадение максимального накопления диеновых конъ-югатов и оснований Шиффа на 30 сутки хронического отравления натрия нитритом, с одной стороны, к падение активности фермента в эти сроки, с другой, можно предположить, что его влияние на вк-

ТУРНГ>С7Ъ ГООТ)У6НТ? бНТЬ ОПОСре^ОВ^НО иеро? ПГПТ,

В то же время обнаруженное увеличение содержания диеновых конъюгатов в мозге крыс при остром отравлении нитритом натрия не сопровождается выраженными изменениями активности Н&-Е-АТ§азы. Возможно, что при остром отравлении, когда имеет место увеличение содержания только диеновых коньсгатов к нет заметного повыпе-ния уровня оснований Шиффа (ингибируюцих активность липидзависи-мых ферментов путем образования поперечных "сшивок" в мембранных липидах), активность мембраносвязанных ферментов существенно не отличается от нормы.

Заключая вышеизложенное, уместно обратиться к известному положении о том, что каждый процесс повреждения клеточных структур встречается с определенной системой защиты, выработанной эволюцией. Это относится и к свободнорадиквльному окислении. Проведенные исследования подтверждают его роль и значение в патогенезе отравления натрия нитритом. Одновременно они свидетельствуют о недостаточности собственных систем антиоксидантной защиты и целесообразности применения антиоксидантов при лечении данного отравления. Скрининг антиоксидантов, проведенный в ряду производных пиримидина, позволил выявить новые эффективные препараты - оксиметацил, 5-аминоурацил и их комплексы с глицирризиновой

кислотой.

БаБОДи

1. Натрия нитрит в дозах, вызывающих острое и хроническое отравление, увеличивает содержание токсичных продуктов ПОД (диеновых конъюгатов к оснований Шиффа) в эхзитроцитах, головном мозге, печенк крыс, укеньсае? активность оерментоь ектиоксидактной. защиты (кеталазы к СОД), На-£-£Г§езы саркоплазматического рети-кулума головного мозга, дестабилизирует мембраны эритроцитов.

2. Производные пиримидине: 5-окси-6-метилурацил, 5-амино-урацил, о-амино-2-тиоурацил, ч-амино-2-тиоурацил, б-метил-2-тио-урацил и их комплексные соединения с глицирризиновой кислотой ооладают антилотнык действие*. г условиях экспериментально;. нкт-ритной интоксикации. Антидотная активность пиримидинов к их комплексных соединений примерно одинакова, но широта фармакологического эффекта последних больше. Лечебная эффективность производных пиримидина выае, чем цистамина и ионола.

3. 5-окси-б-метилурацвл и 5-аминоурацил стабилизируют процессы ПОЛ в эритроцитах, головном мозге, печени, нормализуют проницаемость эрятроцитарных мембран, активность антиоксидант-ных и мембраносвязанных ферментов, а также массу, температуру тала и ориентировочные реакции у животных,'отравленных натрия

... нитритом. ••..-.. ...... - ■•. •

Механизм антидотного действия производных пиримидина в существенной степени обусловлен их антиоксидантной (антирадикальной) активностью, меньшее значение имеет способность инги-бировать метгемоглобинообразование.

5. Установленная зависимость между химической структурой и активностью определяет перспективность дальнейшего направленного поиска эффективных антидотов нитритов среди производных пи-

римидина.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Антирадикальная активность и антидотная эффективность производных пиримидина/Мыикин Б.А., Срубилин Д.В., Вакарица

A.i., Алехин Е.К. // Вопросы токсикологии и прикладной, экологии: Тез. докл. международного симпозиума. Пермь, 1991.- С-.23-Т-2С5.

2. Влияние процессов перекисного окисления липидов на ли-пидные и белковые компоненты мембран в постинтоксикационном периоде отравления крыс карбофосом /Мыикин З.А., Сафронов А.П., Срубилин д.В., Вакарица А.ё. // Актуальные вопросы санитарной химии и токсикологии синтетических материалов судостроительного назначения: Сб. науч. тр.- Санкт-Петербург, 1991.- С.127-129.

3. Заоитная эффективность производных пиримидина при геми-ческок гипоксии /мыикин 5 .А., Срубилин Д.5., Вакарица кЛ., Алехин Е.К., Болтина I.A., Муринов Е.Н., Толстикоз Г.А. // Окружавшая среда и здоровье: Сб. науч. тр.- Москва, 199I.- C.I30-I37.

4. Пиримидиновые производные как антиоксиданты Дыикин

B.А., Срубилин Д.В., Вакарица А.Ф. и др. // Ученые Башкирского медицинского института - здравоохранению: Сб. науч. тр.- Уфа, 1992.- С.73-77.

5. Исследование протекторных свойств производных пиримидина при г емической гипоксии /Срубилин .ДЗ. .// Вопросы теоретической и практической медицины: Тез. докл. 57-й научной конференции БГМИ.- Уфа, 1992.- C.4I-42.

6. Toxicity syndrome of peroxidation and its correction vith antioxidants /Myshkin V.A., Srubilin 2.7., Yakarrcsa A.?., Alekhin E.S., Enikeev D.A., Tolstikov G.A. // Constituent Congress International Society for Pathophysiology.- iloscow, I99I--P.255-

7. Комплексное соединение глицирризиновой кислоты с 5-амн-ноурацилом, проявлявшее антидотную и антирадикальную активность /Балтина Л.А., Мышкин В.А., Муринов В.И., Бакарииа А.Ф., Сруби-лин Д.В., Толстиков Г.А. // Авторское свидетельство i 1587873

(22.04.90).

6. Комплексное соединение глицирризиновой кислоты с б-ме-тил-2-тиоурацилом, проявляющее антидотную к антирадикальную активность /Балтина Л.А., Мышкин В.А., Толстиков Г.А., Муринов С.И., Вакарица А.§., Срубилин Д.З. и др. // Авторское свидетельство Ü I706I8I (15.09.91).

9. Комплексное соединение глицирризиновой кислоты с 6-ами-но-2-тиоурацилом, проявляющее антидотную и антирадикальную активность /Балтика I.A., Мышкин В.А., Муринов D.H., Вакарице А.ф. , Срубилин Д.В. и др. // Авторское свидетельство № I706I79

(15.09.91).

10. Комплексное соединение глицирризиновой кислоты с 2-тио-урацилом, проявляющее антидотную и антирадикальную активность /Балтина I.A., Мышкин В.А., Муринов В.И., Вакарица А.Ф., Срубилин Д.В. и др. // Авторское свидетельство Je I706I80 (15.09.91).-

Зак. 5 158 тир 100 экз. Ротапринт КШЦпО "Бсшшсфть" 26.04.94 г.