Автореферат и диссертация по фармакологии (15.00.02) на тему:Стандартизация коровяка (Verbascum) и настоек гомеопатических матричных, получаемых на его основе

На правах рукописи

Копнин Алексей Александрович

СТАНДАРТИЗАЦИЯ КОРОВЯКА (УГЛШАЙСТ М) И ПАС ГОЕК ГОМЕОПАТИЧЕСКИХ МАТРИЧНЫХ, ПОЛУЧАЕМЫХ НЛ ЕГО

ОСНОВЕ

15.00.02 - Фармацевтическая химия, фармакогнозия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата фармацевтических наук

Москва-2007 г.

003053896

Диссертационная работа выполнена во Всероссийском научно-исследовательском институте лекарственных и ароматических растений (ВИЛАР) РАСХН.

Научный руководитель:

Кандидат фармацевтических наук Копытько Янина Федоровна

Официальные оппоненты:

Доктор фармацевтических наук

Доктор фармацевтических профессор

Костенникова Зинаида Петровна Патудин Александр Васильевич

Ведущая организация: Институт стандартизации и контроля лекарственных средств ФГУ «НЦ ЭСМП» Росздравнадзора

Защита диссертации состоится « 9 » 2007 г. в 14:00 на

заседании Диссертационного Совета Д 006.070.01 во Всероссийском научно-исследовательском институте лекарственных и ароматических расчеши (ВИЛАР) РАСХН по адресу: 117216, г. Москва, ул. Грина,7.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке ВИЛАР ло адресу:! 17216, г. Москва, ул. Грина, д.7

Автореферат разослан: « г.

Ученый секретарь Диссертационного совета Д 006.070.01,

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Возросший во всем мире интерес к традиционным методам лечения, к которым в России относят и гомеопатию, привел к значительному увеличению доли гомеопатических лекарственных средств (ГомЛС) на фармацевтическом рынке. Количество зарегистрированных ГомЛС в Российской Федерации насчитывает более 600 наименований комплексных и более 1200 однокомпонентных ГомЛС.

В Российской Федерации отсутствует отечественная гомеопатическая фармакопея, наличие которой унифицировало бы требования к качеству ГомЛС, способствовало бы производству безопасных и действенных лекарственных препаратов.

Настойки гомеопатические матричные (НГМ) являются исходными субстанциями для изготовления ГомЛС, но в пашей стране их выпуск не удовлетворяет существующим потребностям, многие производители ГомЛС пользуются импортными субстанциями. Для организации выпуска качественных и безопасных ГомЛС своевременным является углубленное изучение исходного лекарственного растительного сырья (ЛРС). В последние годы большое внимание уделяется фитохимическим и фармакологическим исследованиям тех лекарственных растений, которые применяются как в официнальной, так и в народной медицине.

В связи с этим является актуальным фитохимическое изучение лекарственных растений с целью разработки порматинпой документации на них (НД) и создание отечественной Гомеопатической фармакопеи.

Одними из таких растений являются растения рода коровяк (УегЬазсит), семейства Норичниковые - Бсгоркикичасеае. В настоящее время в официнальной медицине виды коровяка практически не используются, хотя являются перспективными лекарственными растениями. Кроме того, химический состав травы коровяка как лекарственного растительного сырья изучен недостаточно, методики стандартизации отсутствуют. Поэтому, актуальным является комплексное фитохимическое изучение коровяка с использованием современных физико-химических методов, разработка методик стандартизации и их совершенствование, создание нормативной документации.

Цель и задачи исследования. Целью настоящих исследований является изучение химического состава коровяка густоцветкового, коровяка обыкновенного и коровяка черного и разработка методик их стандартизации.

Для достижения поставленной цеди необходимо было решить следующие задачи:

1. Изучить фитохимический состав свежесобранного и высушенного сырья коровяка с использованием физико-химических методов и разработать методики качественного и количественного анализа по БАВ.

2. Провести исследования химического состава НГМ из свежесобранного и высушенного сырья коровяка. Разработать методики контроля качества НГМ.

3. Разработать методики установления подлинности гомеопатических разведений коровяка.

4. Изучить в сравнительном аспекте химический состав НГМ коровяка густоцветкового и коровяка обыкновенного для подтверждения возможности использования в гомеопатической практике.

5. Оформить проекты Фармакопейных статей на "Коровяка густоцветкового траву высушенную" и "Коровяка густоцветкового 01 настойку гомеопатическую матричную".

Научная новизна. На основании микроскопического анализа сырья видов коровяка, установлены диагностически значимые признаки, характерные для каждого из видов сырья (наличие и особенности строения волосков). Анализируя данные по химическому составу и применению сырья коровяка, теоретически обоснована необходимость разработки методик получения и стандартизации НГМ. Подобраны условия анализа БАВ в сырье и НГМ видов коровяка с помощью физико-химических методов: хроматография в тонком слое сорбента (ТСХ), высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ), хромато-масс-спектрометрия (ГХ-МС), спектрофотометрия в УФ и видимой области спектра и др.

Разработаны методики качественного и количественного определения аминокислот, веществ фенольной природы (флавоноидов и фенолкарбоновых кислот), витаминов, алкалоидов, углеводов в сырье и НГМ видов коровяка.

С помощью разработанных методик в ЛРС качественно и количественно определены флавоноиды, аминокислоты, полисахариды и моносахара, компоненты липофильной фракции. Выявлены различия по составу БАВ в ЛРС в зависимости от вида сырья, а также его состояния (свежесобранное или высушенное). Обнаружено, что в коровяке черном содержится меньшее количество БАВ, чем в 2 других изучаемых видах коровяка. Разработаны методики стандартизации травы коровяка густоцветкового, при этом установлены критерии подлинности и нормы содержания действующих веществ.

Впервые изучен аминокислотный состав сырья и НГМ изучаемых видов коровяка. Найдены и детально описаны анатомо-диагностические признаки, важные при описании и определении подлинности сырья.

С учетом современных требований к НГМ разработаны критерии подлинности и нормы содержания БАВ в НГМ коровяка густоцветкового и коровяка обыкновенного.

Практическая значимость работы. На основании проведенных исследований разработаны:

• методики установления подлинности ЛРС микроскопическим методом (микропрепараты цветков и листьев видов коровяка);

• методики качественного и количественного определения флавоноидов, полисахаридов, аминокислот в ЛРС И НГМ коровяка;

• методика определения содержания суммы флавоноидов в. пересчете на нарингенин, включенная в проект ФС «Коровяка густоцветкового траву высушенную»;

• проект ФС на "Коровяка густоцветкового траву высушенную";

• проект ФС на «Коровяка густоцветкового Т)1 настойку гомеопатическую матричную» для гомеопатической фармакопеи.

Связь задач и исследования с проблемным планом фармацевтической- науки. Диссертационная работа выполнена в соответствии с тематикой и планом научно-исследовательских работ Всероссийского научно-исследовательского института лекарственных и ароматических растений (номер государственной регистрации 01860074455).

Основные положения, выносимые на защиту:

• Результаты исследований химического состава свежесобранного и высушенного сырья и НГМ, приготовленных из него, в сравнительном аспекте;

• Результаты разработки методик качественного и количественного анализа действующих веществ в J1PC и НГМ изучаемых видов коровяка;

• Разработка проектов фармакопейных статей на ЛРС и НГМ в соответствии с учетом современных требований качества на лекарственные средства.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 15 работ.

Во введении раскрыта актуальность темы, определены цель и задачи исследования, сформулирована научная новизна и практическая значимость работы. ;

В первой главе на основании литературных данных рассмотрены сведения о ботанико-морфологической характеристике видов коровяка; химическом составе, фармакологической активности и медицинском применении сырья и настоек гомеопатических матричных (НГМ) растений рода коровяк; методах анализа основных действующих веществ и вопросах стандартизации сырья и НГМ коровяка.

В разделе Пояснение к эксперименту приводятся объекты исследования - свежесобранное и высушенное ЛРС коровяка густоцветкового (Verbascum densiflorum Bertol.), коровяка обыкновенного (Verbascum thapsus L.) и коровяка черного (Verbascum nigrum L), заготовленное в 2002 - 2005 гг. в Московской и Рязанской областях, а также НГМ, полученные из этого сырья. Описываются использованные в исследовании методы и приборы, хроматографические системы, сорбенты и реактивы.

Вторая глава посвящена товароведческому анализу сырья коровяка, установлению морфолого-диагностических признаков и числовых показателей лекарственного растительного сырья (ЛРС) коровяка. Впервые подробно описаны внешний вид и диагностически значимые микроскопические признаки сырья коровяка.

Втретьей главе излагаются результаты фитохимического исследования сырья коровяка, приводится разработка и обоснование разработанных методик качественного и количественного

определения суммы флавоноидов и углеводов в траве и цветках видов коровяка, а также динамика накопления флавоноидов за один вегетационный период.

Вчетвертой-главе приводятся результаты фитохимического изучения HTM видов коровяка, краткая технология их получения, разработка и обоснование методик качественного и количественного определения флавоноидов, аминокислот и липофильной фракции.

Пятая глава посвящена разработке показателей качества и установлению сроков годности JIPC и HTM Verbascum densiflorum, методикам идентификации БАВ в гомеопатических разведениях изучаемых настоек.

Объем и структура диссертации. Диссертационная работа изложена на страницах, содержит таблиц, рисунков и состои т из введения, обзора литературы, пяти глав экспериментальной части, библиографии из 177 источников литературы, из которых 123 - на иностранных языках и приложений.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ 1. Товароведческий анализ JIPC коровяка

Микроскопический анализ. Для микроскопического анализа готовили препараты с поверхности листьев, венчиков, чашелистиков коровяка (ГФ XI изд.).

Для венчика коровяка характерны следующие диагностические признаки: звездчатые многоклеточные волоски на многоклеточной ножке (впервые данный тип волосков упомянут в Государственной Фармакопее VIII издания, а нами описан более подробно); волоски на коротких тычинках булавовидно вздутые, головчатые волоски по краю венчика, а также по жилке венчика встречаются сосочковидные выросты.

При изучении поверхности травы коровяка найден аномоцитный устьичный комплекс, многоклеточные звездчатые волоски на одно- и многоклеточной ножке, маловетвистые и головчатые волоски.

Микроскопический анализ и диагностические признаки идентичны для ЛРС коровяка густоцветкового и коровяка обыкновенного. Микроскопические признаки для сырья коровяка черного совпадают с таковыми для сырья других изучаемых видов коровяка. Все вышеописанные микроскопические признаки цветков и травы коровяка подтверждены фотографическими снимками и

включены в разработанную фармакопейную статью "Коровяка густоцветкового трава высушенная".

Проведено сравнительное изучение числовых показателей (влажность, зола, содержание экстрактивных веществ и допустимых примесей) для JIPC коровяка изучаемых видов.

2. Фитохимич[еское изучение ЛРС коровяка

Для ЛРС коровяка разработаны критерии подлинности, включающие качественные реакции на фенольные вещества, сапонины, гликозиды, углеводы и тонкослойную хроматографию.

В спиртовых извлечениях из ЛРС коровяка густоцветкового и обыкновенного обнаружены зоны адсорбции, соответствующие рутину, кверцетину, лютеолйну, нарингенину. Сравнительный анализ состава флавоноидов в свежесобранном и высушенном сырье методом ТСХ показал, что существенных изменений в компонентном составе не отмечено.

Углеводы (поли - и моносахара) извлекали из сырья водой. Обнаружение зон адсорбции углеводов осуществляли дифениламино-анилин-фосфорно-кйслотным реактивом. Выявлено, что ЛРС коровяка густоцветкового отличается более разнообразным составом углеводов, что выражается в большем количестве их зон адсорбции на хроматограммах по сравнению с двумя другими изучаемыми видами (табл. 1). После гидролиза на хроматограммах обнаружено большее количество глюкозы, галактозы и фруктозы, чем до гидролиза, что, возможно, связано с гидролитическим расщеплением сахарозы и других дисахаридов. По сравнению с литературными данными, нами найдено, что коровяк густоцветковый и коровяк черный накапливают арабинозу и мальтозу, тогда как в коровяке обыкновенном этих углеводов в свободном виде не обнаружено.

Для количественной оценки БАВ в ЛРС коровяка разработаны методики количественного определения. Сырье предложено характеризовать по содержанию суммы флавоноидов и углеводов. При разработке методики количественного определения флавоноидов методом спектрофотометрии при выборе рабочего стандартного образца апробировались рутин, лютеолин-7-гликозид, кверцетин, нарингенин после проведения реакции комплексообразования с алюминия хлоридом (рис. 1). В качестве стандарта выбран раствор PCO нарингенина, максимум поглощения спектра комплекса

Таблица 1

Качественный состав углеводов в траве изучаемых видов коровяка

Содержание свободных Содержание Сахаров

сахар Сахаров после гидролиза

V.dens. V.thaps V. nigrum V.dens. V.thaps. V. nigrum

мальтоза + - + + мало +

арабиноза + - мало + мало +

фруктоза + + — ++ ++ —

глюкоза + " + + ++ ++ +

галактоза + + + ++ ++ +

ксилоза + - + + мало +

которого с алюминия хлоридом совпадает с таковым извлечения из травы коровяка.

В расчетах используется удельный показатель поглощения комплекса нарингенина с алюминия хлоридом в максимуме поглощения при 377 нм, равный 70.

Содержание суммы флавоноидов в пересчете на нарингении и абсолютно сухое сырье в исследуемых образцах травы коровяка густоцветкового (Verbascum densiflorum Bertol.) составляет около 1,93% (свежее сырье) и 1,51% (сухое сырье); в коровяке обыкновенном (Verbascum thapsus L.) - около 1,70% (свежее сырье) и 1,47% (сухое сырье) и в коровяке черном (Verbascum nigrum L.) -около 0,846% (свежее сырье) и 0,539% (сухое сырье). Ошибка единичного определения с 95% вероятностью методики, количественного определения флавоноидов в пересчете на нарингенин в JIPC коровяка не более 8,83% (табл.2).

Для подтверждения отсутствия систематической ошибки были проведены опыты с добавками нарингенина, относительная ошибка определения составила не более ± 2,15 %.

С помощью разработанной методики изучена динамика накопления флавоноидов в ЛРС в течение вегетации, результаты исследования подтверждают, что оптимальным временем сбора сырья является время массового цветения растения.

Спектры комплексов флавоноидов с алюминия хлоридом извлечения из ЛРС, нарингенина, лютеолин-7-гликозида, рутина и кверцетина.

400 450

Wavelength {nm}

Рис. 1. Спектры комплексов с алюминия хлоридом: 1 - флавоно-идов извлечения из ЛРС; 2 - нарингенина; 3 - лютеолин-7-гликозида; 4 - рутина; 5 - кверцетина.

Таблица 2

Метрологические характеристики метода количественного определения суммы флавоноидов в пересчете на нарингенин в

высушенном сы

эье коровяка

Хер S2 S Sx Рх T(P,f) AX e,%

ЛРС коровяка густоцветкового ( Verbascum densiflorum Bertol)

1,51 0,02085 0,1444 0,04338 0,95 2,23 0,02914 4,40

ЛРС коровяка обыкновенного (Verbascum thapsus L)

1,47 0,03495 0,1869 0,05631 0,95 2,23 0,03782 5,56

ЛРС коровяка черного ( Verbascum nigrum L.)

0,539 0,6554 0,8096 0,2439 0,95 2,23 0,1638 8,83

Для цветков коровяка густоцветкового и родственных ему видов предлагается также методика количественного определения суммы флавоноидов в пересчете на рутин, максимум поглощения спектра комплекса рутина с алюминия хлоридом которого совпадает с таковым извлечения из цветков (рис. 2).

Содержание суммы флавоноидов в пересчете на рутин и абсолютно сухое сырье в исследуемых образцах цветков коровяка густоцветкового (Verbascum densiflorum Bertol.) составляет около 0,474% (свежее сырье) и 0,382% (сухое сырье); в коровяке обыкновенном (Verbascum thapsus L.) - около 0,448% (свежее сырье) и 0,381% (сухое сырье) и в коровяке черном (Verbascum nigrum L.) около 0,420% (свежее сырье) и 0,360% (сухое сырье).

1.0-, 0.8-

Wavelength (nm)

Рис. 2. Спектр поглощения комплекса рутина с алюминия хлоридом (верхняя кривая), извлечения из цветков коровяка (нижняя кривая)

Ошибка единичного определения с 95% вероятностью методики количественного определения флавоноидов в пересчете на рутин в ЛРС коровяка не превышает 7,6% (табл. 3).

В ЛРС определено содержание суммы полисахаридов гравиметрическим методом. В ЛРС коровяка густоцветкового содержится полисахаридов больше, чем в таковом коровяка густоцветкового и черного (в высушенном ЛРС соответственно около 34,39%, 31,32% и 20,38%). Установлено, что в свежем сырье полисахаридов содержится в среднем на 2-7% больше, чем в высушенном сырье.

Определение содержания суммы моносахаридов в пересчете на глюкозу проводят после кислотного гидролиза полисахаридов спектрофотометрическим методом - измеряют поглощение продукта реакции углеводов с пикриновой кислотой в максимуме поглощения при 455±5 нм (рис. 3).

Содержание суммы углеводов в пересчете на глюкозу максимально в ЛРС коровяка густоцветкового (0,25-0,15%), в сырье коровяка обыкновенного содержится 0,16 - 0,12% и наименьшее количество в ЛРС коровяка черного - 0,11 - 0,09%. Свежее сырье изучаемых видов коровяка характеризуется более высоким содержанием моносахаридов, по сравнению с высушенным сырьем. Ошибка единичного определения методики количественного определения суммы углеводов не превышает 6,72% (табл. 4).

Метрологические характеристики метода количественного определения суммы флавоноидов в пересчете на рутин в высушенном цветках УегЬазсит

ХСр S2 S Sx Px T(P,i) AX e, %

ЛРС коровяка густоцветкового (Verbascum densiflorum Bertol.)

0,382 0,016855 0,1298 0,03914 0,95 2,23 0,02632 6,89

ЛРС коровяка обыкновенного (Verbascum thapsus L.)

0,381 0,02040 0,1428 0,04307 0,95 2,23 0,028961 7,6

ЛРС коровяка черного (Verbascum nigrum L.)

0,360 | 0,01112 | 0,1055 [ 0,03180 j 0,95 | 2,23 | 0,02338 5,94

ОМ-,--—,---,-—,

400 450 500 550 600

Wavelength (ran)

Рис. 3. Спектры поглощения комплекса углеводов с пикриновой кислотой нижняя кривая - испытуемый раствор, верхняя кривая -стандартный раствор глюкозы

Качественное обнаружение аминокислот в ЛРС коровяка проводили методом ТСХ, зона адсорбции детектировали раствором нингидрина. Установлено, что ЛРС коровяка содержит аминокислоты, причем интенсивность зон адсорбции выше в извлечениях из свежего сырья. Количественную оценку аминокислот осуществляли с помощью аминокислотного анализатора (табл. 5). Суммарное содержание свободных и связанных аминокислот составляет для сырья коровяка густоцветкового и коровяка обыкновенного 0,877% и 0,907%, что свидетельствует о том, что аминокислоты находятся в сырье преимущественно в связанном виде - в виде пептидов. ЛРС коровяка черного содержит гораздо меньшее суммарное количество аминокислот - 0,227%.

Метрологические характеристики методики количественного определения суммы моносахаридов в пересчете на глюкозу в ЛРС

УегЪаясит

хср S'2 S Sx Px T(P,f) | ДХ | e, %

ЛРС коровяка густоцветкового (Verbascum densiflorum Bertol.)

0,1761 0,003407 0,05837 | 0,01760 | 0.95 2,23 0,01183 | 6,72

ЛРС коровяка обыкновенного (Verbascum thapsus L.)

0,1287 0,001398 '0,03739 0,01127 10,95 2,23 0,00758 5,89

ЛРС коровяка черного (Verbascum nigrum L.)

0,1124 | 0,001096 | 0,03310 | 0,00998 | 0.95 | 2,23 | 0ДЮ671 Р^97

3. Фитохимическое исследование настоек гомеопатических матричных УегЬавсиш

Изготовление НГМ коровяка производится из свежего и высушенного ЛРС в соответствии с методами 3 и 4 ОФС 42-0027-05 «Настойки гомеопатические матричные». Изучение компонентного состава НГМ видов коровяка осуществляли с помощью методов ТСХ. ВЭЖХ и ГХ-МС.

Качественный. состав веществ фенольной природы в НГМ коровяка оценивали методом ТСХ. В НГМ коровяка густоцветкового и обыкновенного обнаружены зоны адсорбции, соответствующие рутину, кверцетину, лютеолину, нарингенину. В НГМ коровяка черного содержание лютеолин-7-гликозида сомнительно, т.к. зона адсорбции этого вещества не обнаруживается в системе растворителей этилацетат - уксусная кислота - вода (5:1:1); а в системе бензол - метанол - уксусная кислота (90:16:8) для НГМ того же вида коровяка - не обнаруживаются зоны адсорбции лютеолина и рутина.

Сравнительный анализ состава флавоноидов в НГМ v^з свежесобранного и высушенного сырья методом ТСХ подтвердил, что существенных изменений в компонентном составе не наблюдается.

Состав аминокислот в ЛРС коровяка после кислотного гидролиза, %, в пересчете на абсолютно высушенное сырье___

Аминокислота Коровяк Коровяк Коровяк

густоцвет. обыкнов. черный

Аспарагиновая кислота 0,0152 0,0459

Треонин 0,0364 0,00770 0,00278

Серин 0,0545 0,0273 0,00338

Глутаминовая кислота 0,436 0,593 —

Пролин 0,0152 0,0227 0,0108

Глицин 0,0364 0,00685 0,0248

Алании 0,0667 0,0228 0,0382

Полуцистин 0,00182 0,00327 0,00232

Валин 0,0788 0,0241 0,00691

Метионин 0,0788 0,0139 0,0775

Изолейцин 0,00364 0,00561 0,00294

Лейцин 0,00485 0,00891 0,00198

Тирозин 0,00303 0,00752 0,00250

Фенилаланин 0,00424 0,00824 0,00104

Лизин 0,00424 0,00921 0,00101

Гистидин 0,00242 0,00457 0,00207

Аргинин 0,00303 0,00541 0,0301

Суммарное содержание 0,877% 0,907% h 0,227%

Суммарное содержание флавоноидов в НГМ предлагается оценивать методом слектрофотометрии в пересчете на нарингенин после реакции комплексообразования с алюминия хлоридом.

Содержание суммы флавоноидов в пересчете на нарингенин в настойке в процентах (X) вычисляют по формуле:

а - навеска настойки, в граммах;

- показатель удельного поглощения комплекса нарингенина с алюминия хлоридом в максимуме поглощения при 377 им, равный 70.

Наиболее высокое содержание суммы флавоноидов в пересчете на нарингенин в НГМ коровяка характерно для коровяка густоцветкового (около 0,8% - из свежего сырья и 0,6% - из

высушенного сырья). Значения, полученные для НГМ коровяка обыкновенного из свежего и высушенного сырья, сопоставимы с таковыми для НГМ коровяка густоцветкового и составляют около 0,7 %. В НГМ коровяка черного содержание флавоноидов в НГМ немного ниже - около 0,5 - 0,6 %.

Ошибка единичного определения разработанной методики количественного определения суммы флавоноидов в пересчете на нарингенин в НГМ коровяка не превышает 6,01% (табл.6).

Для подтверждения отсутствия систематической ошибки проведены опыты с добавками нарингенина. Ошибка опытов с добавками не превышает ± 1,85 %.

Исследование состава фенольных соединений НГМ коровяка изучаемых видов проводили также методом ВЭЖХ на хроматографе фирмы «GILSON», Франция с последующей компьютерной обработкой результатов исследования с помощью программы «МультиХром» для «Windows».

Таблица 6

Метрологические характеристики метода количественного определения суммы флавоноидов в пересчете на нарингенин в НГМ

из высушенного сырья Verbascum

Хср S2 S Sx Px T(P,f) ДХ e,%

НГМ коровяка густоцветкового (Verbascum densiflorum Bertol.)

0,661 0,03840 0,1960 0,05908 0,95 2,23 0,03973 6,01

НГМ коровяка обыкновенного (Verbascum thapsus L.)

0,650 0,03411 0,1847 0,05568 0,95 2,23 0,03744 5,76

НГМ коровяка черного (Verbascum nigrum L.)

0,478 0,01916 0,1384 0,04173 0,95 2,23 0,02806 Г 5,87

Исследование состава фенольных соединений НГМ коровяка изучаемых видов проводили также методом ВЭЖХ на хроматографе фирмы «GILSON», Франция с последующей компьютерной обработкой результатов исследования с помощью программы «МультиХром» для" «Windows». В качестве неподвижной фазы применяли колонку ALLTIMA С 8 размером 4,6x250 мм, подвижная фаза - метанол - вода - кислота фосфорная концентрированная (40:60:0,5). Детектирование проводилось при длине волны 254 им.

Подготовка пробы: по 5 мл HTM коровяка густоцветкового и коровяка обыкновенного помещали в мерные колбы вместимостью 100 мл, прибавляли 50 мл 90 % этилового спирта, перемешивали и доводили 90% спиртом этиловым до метки и фильтровали (исследуемый раствор).

Параллельно готовили серию 0,05 % растворов PCO в 90% спирте этиловом: рутина, кверцетина, лютеолина-7-гликозидя, галловой кислоты; коричной кислоты, салициловой кислоты, эллаговой кислоты, танина медицинского, пирогаллола, кемпферола, гесперидина и нарингенина.

По 20 мкл исследуемого раствора и растворов сравнения вводят в хроматограф и хроматографируют. Оценка хроматограммы проводится по временам удерживания и площади пика в автоматическом режиме (табл. 6).

Таким образом, в НГМ коровяка густоцветкового и коровяка обыкновенного идентифицированы флавоноиды - кемпферол, гесперидин и нарингенин.

Таблица 6

Результаты исследования фенольных соединений НГМ _ коровяка методом ВЭЖХ _

Соединение Время НГМ коровяка НГМ коровяка

удержи- густоцветкового обыкновенного

вания, Свежее Сухое Свежее Сухое

сек ЛРС ЛРС ЛРС ЛРС

Кемпферол 303 49,70 34,71 21,10 15,79

Галловая кислота 351 6,57 7,89 5,63 9,46

Танин 501 17,55 18,39 5,63 6,87

Нарингенин 712 2,45 1,69 1,47 0,93

Гесперидин 748 11,64 12,75 5,36 4,76

Пирогаллол 820 — 3,12 - 2,78

Рутин 887 6,17 3,23 1,64 0,97

Лютеолин-7-гликозид 877 3,82 2,75 1,89 1,12

Эллаговая кислота 1378 6,20 21,72 2,15 6,00

Салициловая кислота 1262 10,20 2,45 5,66 1,12

Кверцетин 2082 0,45 0,28 0,26 0,11

Коричная кислота 1769 0,26 0,08 0,21 0,05

В НГМ из высушенного сырья, в отличие от НГМ из свежею сырья присутствуют пирогаллол, галловая и эллаговая кислота, что связано с процессами окисления и восстановления при сушке сырья.

Анализ компонентов липофильной фракции (извлекается из НГМ путем трехкратной экстракции гексаном) гомеопатических настоек коровяка проводили методом хромато-масс-спектрометрии на приборе Saturn 2000 (Varían) с масс-анализатором с ионной ловушкой на капиллярной кварцевой колонке CP-S1L 24 СВ Low Bleed/MS 30м (длина колонки)х0,25 мм (толщина колонки)х0,25 мкм (внутренний диаметр колонки).

Газохроматографические условия анализа: газ-носитель гелий, постоянная скорость потока 1,0 мл/мин, инжектор 1079 с деление потока газа носителя в инжекторе 1:10, температура 280°С, температурная программа колонки: 40°С - 1 мин, нагрев до 150 °С со скоростью 10°С/мин, до 290 °С - 4°С/мин, изотерма при 210°С 13 мин. Исследование липофильной фракции, выделенной из НГМ коровяка густоцветкового и обыкновенного, показало, что в таковой из настойки коровяка густоцветкового обнаружено 43 соединения, из них идентифицировано - 38; из НГМ коровяка обыкновенного - 77 соединений, идентифицированных - 39. Обнаружены свободные жирные кислоты и их этиловые эфиры, эфиры насыщенных карбоновых кислот и другие вещества. В настойках из высушенного сырья проанализированных видов коровяка выявлено уменьшение содержания этиловых эфиров насыщенных кислот и всех ненасыщенных кислот при одновременном увеличении концентрации этиловых эфиров пента - и гептадекановой кислоты. Эти особенности увеличения концентрации этиловых эфиров связаны с естественной сушкой и изменением состава липофильной фракции при хранении.

В НГМ коровяка обнаружены алкалоиды - на основании результатов ТСХ, УФ-спектрофотометрии и литературных данных можно предположить, что в изучаемых НГМ содержатся алкалоиды группы макроциклических 17-членных лактамов (вербаллоцин и вербасин). Эти соединения обладают достаточно высоким поглощением в УФ-свете, благодаря чему их можно обнаружить с помощью ТСХ и в перспективе разработать методику их количественного определения.

По методикам, предложенным для оценки качественного и количественного состава аминокислот в JIPC, проанализированы

НГМ коровяка. Суммарное содержание свободных и связанных аминокислот составляет для НГМ коровяка густоцветкового и коровяка обыкновенного 0,277% и 0,266%, что свидетельствует о том, что более половины аминокислот находится в сырье в связанном виде - в виде пептидов. НГМ коровяка черного содержит гораздо меньшее суммарное количество аминокислот - 0,147%. 5. Разработка показателей качества и установление сроков годности ЛРС, НГМ УегЬавсиш с1ешШогит. Анализ гомеопатических разведений.

Для контроля качества ЛРС коровяка густоцветкового предложены следующие показатели: описание ЛРС, диагностически значимые признаки, качественные реакции, числовые показатели, количественное определение БАВ - флавоноидов в пересчете на нарингенин и суммы полисахаридов. Предложены следующие нормативы: влажность для свежего сырья - не менее 60%, для высушенного сырья - не более 12%; содержание золы общей не более 4%; золы, нерастворимой в 10% хлористоводородной кислоте - не более 0,25%; содержание минеральной и органической примеси не более 1%; сумма экстрактивных веществ, извлекаемых водой и спиртом - 25 и 19% соответственно; содержание суммы флавоноидов в пересчете на нарингенин - не менее 1,0%; содержание суммы полисахаридов - не менее 22%. Срок годности ЛРС предлагаем установить 3 года.

Контроль качества НГМ коровяка регламентируется по следующим показателям: состав настойки; описание; критерии подлинности; сухой-остаток, содержание спирта; плотность; тяжелые металлы; микробиологическая чистота, количественное определение суммы флавоноидов, срок годности

Разработка показателей качества настойки проводилась на пяти сериях препарата. Критерии подлинности настоек включают реакции на вещества фенольной природы с раствором железа окисного хлоридом, на сапонины (пенообразование при встряхивании с водой), а также испытанием методом ТСХ. В качестве стандарта используют раствор лютеолин-7-гликозида в 70 % этиловом спирте. Неподвижная фаза: пластинки со слоем силикагеля "Сорбфил ПТСХ-П-А-УФ". Подвижная фаза: этилацетат-кислота уксусная ледяная - вода (5:1:1). Содержание сухого остатка должно быть не менее 1,5%, плотность -

в пределах от 0,880 до 0,910. Содержание тяжелых металлов составляет не более 0,001%.

Количественное определение суммы, флавоиоидов было проведено по разработанной нами методике. В НГМ коровяка густоцветкового содержание суммы флавоноидов в пересчете на нарингенин должно-быть не менее 0,50%.

Нами проведено изучение состояния НГМ коровяка в процессе естественного хранения по всем показателям качества, регламентируемых проектом ФСП. Срок годности НГМ коровяка установлен 2 года. Наблюдение за настойками в процессе хранения продолжаются.

Для оценки " подлинности гомеопатических разведений Verbascum, которые используются в гомеопатической практике в качестве монопрепаратов, и для изготовления комплексных лекарственных средств, использованы качественные реакции и испытание методом ТСХ, при этом важным является установление наличия веществ, обуславливающих терапевтический эффект, в том числе флавоноидов. Разведения настоек Verbascum готовили по правилам гомеопатической технологии (ОФС 42-0027-05 «Настойки гомеопатические матричные»).

Первое десятичное (1D) разведение Verbascum представляет собой прозрачную жидкость красно-коричневого цвета, со своеобразным запахом. Второе десятичное разведение (2D) -прозрачная жидкость светло-коричневого цвета практически без запаха; третье десятичное разведение (3D) - жидкость бледно-желтого цвета, спиртового запаха и четвертое десятичное разведение (4D) - бесцветная жидкость спиртового запаха.

Первое и второе десятичные разведения при упаривании па кипящей водяной бане дают реакцию с раствором железа окисного хлорида на дубильные вещества, третье десятичное - изменение окраски при добавлении реактива практически не заметно, четвер тое разведение - реакция отрицательна. На хроматограммах исследуемых растворов 1D и 2D разведений НГМ коровяка обнаруживаются зоны, идентичные зонам настойки, но более слабой интенсивности; в разведениях 3D и 4D идентичных зон не обнаружено.

Результаты анализа гомеопатических разведений НГМ коровяка свидетельствуют о том, что методом ТСХ можно определять Б AB, устанавливать подлинность и характеризовать качество разведений, в

том числе и в процессе хранения, до второго десятичного разведения, для последующих разведений полученные данные не могут быть объективными.

ОБЩИЕ ВЫВОДЫ

1. Проведен товароведческий анализ JIPC коровяка, установлены диагностически значимые микроскопические признаки сырья "Коровяка трава высушенная" и "Коровяка цветки высушенные" (определенные виды волосков), определены числовые показатели для JIPC коровяка.

2. С помощью физико-химических методов изучен в сравнительном аспекте флавоноидный, углеводный и аминокислотный состав J1PC видов коровяка, как свежего, так и высушенного, и HTM, изготовленных из него. Показано, что коровяк густоцветковый и коровяк обыкновенный близки по качественному и количественному составу основных групп БАВ, тогда как коровяк черный существенно отличается от них меньшим содержанием флавоноидов и полисахаридов. Следовательно, коровяк обыкновенный также может применяться при изготовлении НГМ.

3. Методом ТСХ и ВЭЖХ впервые изучен аминокислотный состав JIPC и НГМ коровяка густоцветкового, обыкновенного и черного. Идентифицированы 18 аминокислот, из них 7 незаменимых. Содержание аминокислот в сырье в среднем составляет от 0,23 до 0,91%; в НГМ от 0,15 до 0,28%. В основном, среди общего количества аминокислот превалируют серин, метионин, валин, аспарагиновая и глутаминовая кислота.

4. Проведено исследование состава фенольных соединений НГМ коровяка густоцветкового и коровяка обыкновенного с помощью метода ВЭЖХ. В НГМ коровяка качественно идентифицированы флавоноиды - кемпферол, гесперидин, нарингенин, дубильные вещества, фенолкарбоновые кислоты.

5. Разработаны методики количественного определения суммы флавоноидов в пересчете на нарингенин и углеводов в пересчете на глюкозу в НГМ коровяка с помощью метода дифференциальной спектрофотометрии.

6. Проведено исследование состава липофильной фракции, полученной из НГМ коровяка густоцветкового и коровяка обыкновенного, идентифицированы жирные кислоты, терпеноиды,

углеводороды, витамин Е, фитол. Установлены отличия между настойками в зависимости от вида коровяка и от состояния сырья (свежее или высушенное).

7. Показано, что сырье коровяка густоцветкового и коровяка обыкновенного сходно по составу БАВ, следовательно, оно также может быть использовано для изготовления НГМ и других официнальных лекарственных форм.

8. Установлен срок годности JIPC коровяка - 3 года, НГМ - 2 года. По результатам исследования подготовлены проекты ФС на "Коровяка густоцветкового D1 настойку гомеопатическую матричную" и сырье - "Коровяка густоцветкового траву высушенную".

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Даргаева Т.Д., Сокольская Т.А., Копытько Я.Ф., Копнин A.A. Биологически активные вещества настойки коровяка густоцветкового гомеопатической матричной //Тезисы докладов X Российского национального конгресса "Человек и лекарство", Москва, 7-11 апреля 2003 г., С. 601.

2. Копытько Я.Ф., Копнин A.A. Изучение биологически активных веществ настойки коровяка густоцветкового гомеопатической матричной //Сборник научных трудов "Нетрадиционные природные ресурсы, инновационные технологии и продукты" Выпуск 7, Москва, РАЕН, 2003 г., С. 237-238.

3. Сапронова H.H., Копнин A.A. Коровяк //Российские аптеки, приложение к журналу "Ремедиум", № 10, 2003г.

4. Копнин A.A. Применение коровяка густоцветкового в медицинской практике//Тезисы докладов III Конференции молодых ученых России с международным участием "Фундаментальные науки и прогресс клинической медицины", Москва,20-24 января 2004 г., С.352.

5. Копнин A.A. Изучение биологически активных веществ настойки коровяка густоцветкового гомеопатической матричной с помощью физических и физико-химических методов //Тезисы докладов III Конференции молодых ученых России с международным участием "Фундаментальные науки и прогресс клинической медицины", Москва, 20-24 января 2004 г., С.352.

6. Копнин A.A., Копытько Я.Ф., Сапронова H.H., Сокольская Т.А. Изучение анатомического строения сырья коровяка густоцветкового //Сборник научных, трудов 59-й региональной конференции по фармации и фармакологии, Пятигорск, 26-29 января, 2004 г., С.

7. Копнин A.A. Изучение анатомического строения сырья коровяка густоцветкового //Тезисы докладов XI Российского национального конгресса "Человек и лекарство", Москва, 19-23 апреля 2004 г., С. 878.

8. Копнин A.A., Копытько Я.Ф., Даргаева Т.Д., Сокольская Т.А. Стандартизация настойки коровяка густоцветкового гомеопатической матричной //Тезисы докладов XIV Московской международной гомеопатической конференции, Москва, 23-25 января, 2004 г., С. 82.

9. Даргаева Т.Д., Сокольская Т.А, Копытько Я.Ф., Копнин A.A. Совершенствование стандартизации настоек гомеопатических матричных //Тезисы докладов XIV Московской международной гомеопатической конференции, Москва, 23-25 января, 2004 г., С. 84.

10. Сокольская Т.А., Даргаева Т.Д., Копытько Я.Ф., Исаева Н.В., Копнин A.A. Лекарственное растительное сырье и настойки матричные в гомеопатии // Сборник научных трудов международной научной конференции "Генетические ресурсы лекарственных и ароматических растений", посвященной памяти профессора Шретера А.И., Москва, 12-14 июля 2004 г., С. 277-279.

11. Копнин A.A. Изучение анатомического строения сырья коровяка густоцветкового и стандартизация настоек гомеопатических матричных коровяка //Материалы VIII международного съезда Фитофарм-2004, "Актуальные проблемы создания новых лекарственных препаратов природного происхождения", Финляндия, Миккели, 21-23 июня 2004 г., С. 451-455.

12. Сокольская Т.А., Даргаева Т.Д., Копытько Я.Ф., Кирьянов A.A., Копнин A.A. Стандартизация настоек гомеопатических, содержащих фенольные соединения //Тезисы докладов VI Симпозиума по фенольным соединениям. Москва, 28-30 апреля 2004 г., с. 122.

13. Копнин A.A., Копытько Я.Ф. Состав липофильной фракции настоек коровяка обыкновенного гомеопатических матричных// Тезисы докладов VI Симпозиума по фенольным соединениям. Москва, 28-30 апреля 2004 г., С.94.

14. Копнин A.A., Копытько Я.Ф. Фенольные соединения в настойках гомеопатических матричных коровяка (Verbascum)//

Тезисы докладов -XIII Российского национального конгресса "Человек и лекарство", Москва, 3-7 апреля 2006 г., С. 670.

15. Копнин A.A. Изучение фенольных соединений коровяка густоцветкового настойки гомеопатической матричной//! сзисы докладов XVI Московской международной гомеопатической конференции, Москва, 27-29 января 2006 г., С. 109.

16. Копнин A.A., Копытько Я.Ф., Сокольская Т.А. Стандартизация настоек гомеопатических матричных Verbascum densiflorum //Фармация. - 2007. - № - {работа находится в печати.)

Заказ № 94 Тираж: 100 экз.

Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (495) 975-78-56 www.autoreferat.ra

Актуальность темы. Возросший во всем мире интерес к традиционным методам лечения, к которым в России относят к гомеопатию, привел к значительному увеличению доли гомеопатических лекарственных средств (ГомЛС) на фармацевтическом рынке. Количество зарегистрированных ГомЛС и Российской Федерации насчитывает более 600 наименований комплексных к более 1200 одно ко м по н е нтн ы х ГомЛС,

В Российской Федерации отсутствует отечественны гомеопатическая фармакопея, наличие которой унифицировало бы требования к качеству ГомЛС. способствовало бы производств)' безопасных и действенных лекарственных препаратов.

Настойки гомеопатические матричные (НГМ) являются исходными субстанциями для изготовления ГомЛС, но в нашей стране их выпуск не удовлетворяет существующим потребностям, многие производители ГомЛС Пользуются им портным и субстанциями. Дня организации выпуска качественных и безопасных ГомЛС своевременным является углубленное изучение неходкого лекарственного растительного сырья (ЛРС). В последние годы большое внимание уделяется фнтохнмическим и фармакологическим исследованиям тех лекарстнснных растений, которые применяются как в официнальной, так и а народной медицине.

В связи с этим является актуальным фнтохнмнческое изучение лекарственных растений с иелыо разработки нормативной документации на них (НД) и создание отечественной Гомеопатической фармакопеи.

Одними из таких растений являются растения рода коровяк (УегЬаз-сит\ семейства Норичниковые - $сгорка!агккеае. В настоящее время в офннннальнон медицине вилы коровяка практически не используются, хотя являются перспективными лекарственными растениями. Кроме того, химический состав травы коровяка как лекарственного растительного сырья изучен недостаточно* методики стандартизации отсутствуют. Поэтому, актуальным является комплексное фнтохнмнчсскос изучение коровяка с использованием современных физико-химических методов, разработки методик стандартизации и их совершенствование, создание нормативной документации.

Це.зь и задачи исследования. Целью настоящих исследовании являет с* изучение химического состава коровяка гу стопки нового, коровяка обыкновенного и коровяка черною и разработка методик их стандартиза-цин.

Дня достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

1. Изучить фнтокимнческий состав свежесобран нош и высушенного сырья коровяка с использованием физико-химических методов и разработать методики качественного н количественного анализа по БАВ.

2. Провести исследования химического состава Ht M из свежесобранного и высушенного сырья коровяка. Разработать методики контроля качества НГМ.

3. Разработать методики установления подлинности гомеопатических разведений коровяка.

4. Изучить н сравнительном аспекте химический состав НГМ коровяка ■устоцветкоиого и коровяка обыкновепною для подтверждения возможности использования а гомеопатической практике.

5. Оформить проекты Фармакопейных статей на "Коровяка густоцвет-конто трану высушенную" и "Коровяка густо цветкового D1 настойку гомеопатическую матричную".

Научная нови ига. На основании микроскопического анализа сырья видов коровяка, установлены диагностически значимые признаки, характерные для каждого из видов сырья (наличие к особенности строения волосков). Анализируя данные по химическому составу и применению сырья коровяка. теоретически обоснована необходимость разработки методик получения и стандартизации НГМ. Подобраны условия анализа БАВ в сырье vi НГМ видов коровяка с помощью фнчико-химнческн.ч методов; хроматография в тонком слое сорбента (ТСХ), высоко1ффектнвная жидкостная хроматография (ВЭЖХ), хромато-маес-спектрометрия {ГХ-МС), спек-фофотометрия в УФ и видимой области спектра И др.

Разработаны методики качественного и количественного определения аминокислот, веществ фенольной природы (флавонондов и фенолкар-боновых кислот}, витаминов, алкалоидов, углеводов в сырье И НГМ видов коровяка.

С помощью разработанных методик в ЛРС качественно и количественно определены флавономды, аминокислоты, полисахариды и моносахара* компоненты липофидьной фракции. Выявлены различия по составу БАВ в ЛРС в зависимости от вида сырья, а также его состояния (свежесобранное или высушенное). Обнаружено, что в коровяке черном содержится меньшее количество БАВ. чем в 2 других изучаемых видах коровяка. Разработаны методики стандартизации травы коровяка густоивсткового. при jtom установлены критерии подлинности и нормы содержания действующих веществ.

Впервые изучен аминокислотный состав сырья и НГМ изучаемых видов коровяка Найдены и детально описаны анатомо-диагностнческис признаки, важные при описании и определении подлинности сырья.

С учетом современных требований к НГМ разработаны критерии подлинности и нормы содержания БАВ в НГМ коровяка густоцветкового и коровяка обыкновенного.

Практнческан значимость работы. IIa основании проведенных исследований разработаны:

• методики установления подлинности ЛРС микроскопическим методом (микропрепараты цветков н листьев видов коровяка);

• методики качественного и количественного определения флавонон-лов. полисахаридов, аминокислот в ДРС И Е1ГМ коровяка;

• методика определения содержания суммы флавоноидов в пересчете на нариигенин, включенная в проект ФС «Коровяка густоцветкового траву высушенную»;

• проект ФС на "Коровяка густоцветкового траву высушенную";

• проект ФС на «Коровяка густоцветковото Р1 настойку гомеопатическую матричную» для гомеопатической фармакопеи.

Связь задач к исследования с иршлсмньш планом фарманевгн-ческой иаукн, Диссертационная работа выполнена в соответствии с тематикой и планом научно-исследовательских работ Всероссийского научно-исследовательского института лекареIнен-ных и ароматических растений (номер государственной регистрации 01860074455). Основные положений, выносимые на защиту:

• Результаты исследований химического состава свежесобраниого и высушенного сырья и НГМ, приготовленных из него, в сравнительном аспекте;

• Результаты разработки методик качественного и количественного анализа действующих веществ в ЛРС и НГМ изучаемых видов коровяка;

• Разработка проектов фармакопейных статей на ЛРС и НГМ в соответствии с учетом современных требований качества на лекарственные средства.

ОБЩИЕ ВЫВОДЫ

1. Проведен товароведческий анализ ЛРС коровяка, установлены диагностически значимые микроскопические признаки сырья "Коровяка трава высушенная" и "Коровяка цветки высушенные" (определенные виды волосков), определены числовые показатели для ЛРС коровяка.

2. С помощью физико-химических методов изучен в сравнительном аспекте флавоноидный. углеводный и аминокислотный состав ЛРС видов коровяка, как свежего, так и высушенного, и НГМ, изготовленных из него. Показано, что коровяк 1~>стоцветковыП и коровяк обыкновенный близки по качественному и количественному составу основных групп БАВ, тогда как коровяк черный существенно отличается от них меньшим содержанием флавонондов и полисахаридов. Следовательно, коровяк обыкновенный также может применяться при изготовлении НГМ.

3. Методом ТСХ и ВЭЖХ впервые изучен аминокислотный состав ЛРС и НГМ коровяка гусгоцветкового, обыкновенного и черного. Идентифицированы [8 аминокислот, из них 7 незаменимых. Содержание аминокислот в сырье в среднем составляет от 0,23 до 0,91%; в НГМ от 0,15 до 0,28%. В основном, среди общего количества аминокислот превалируют серии, метнонин. валнн. аспарагнновая и глутам иловая кислота.

4. Проведено исследование состава фенол ьных соединений НГМ коровяка густонветкового и коровяка обыкновенного с помощью метода В1ЖХ. В НГМ коровяка качественно идентифицированы флавононды -кемпферол, гесперндин, нарингенин, дубильные вещества, фенолкарбононые кислоты.

5. Разработаны методики количественного определення суммы флавонондов в пересчете на нарингенин и углеводов в пересчете на глюкозу в НГМ коровяка с помощью метода дифференциальной спектрофотометрнн.

6. Проведено исследовал не состава лнпофильной фракции, полученной из Н! М коровяка густоцветкового и коровяка обыкновенного, идентифицированы жирные кислоты, терленоиды, углеводороды, витамин фита л. Установлены отличия между настойками в зависимости от вида коровяка и от состояния сырья (свежее или высушенное),

7. Показано, <гго сырье коровяка густоцветкового и коровяка обыкновенного сходно по составу Б А В, следовательно, оно также может быть использовано для изготовления НГМ и других офицннальиых лекарственных форм.

8. Установлен срок годности ЛРС коровяка - 3 года» НГМ - 2 года, По результатам исследования подготовлены проекты ФС на "Коровяка густоцветкового 01 настойку гомеопатическую матричную1' и сырье -"Коровяка густоиветкового траву высушенную".