Автореферат и диссертация по фармакологии (15.00.02) на тему:Стандартизация и контроль качества противотуберкулезных лекарственных средств

На правах рукописи

00305В1В2

ЯКУБОВ МУХАММАДХОДЖА РАХМАТДЖОНОВИЧ

СТАНДАРТИЗАЦИЯ И КОНТРОЛЬ КАЧЕСТВА ПРОТИВОТУБЕРКУЛЕЗНЫХ ЛЕКАРСТВЕННЫХ СРЕДСТВ

15 00 02 - фармацевтическая химия, фармакогнозия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата фармацевтических наук

Москва - 2007

003056162

Работа выполнена в ГОУ ВПО Московская медицинская академия имени ИМ СеченоваРосздрава

Научный руководитель доктор фармацевтических наук, академик РАМН, профессор Александр Павлович Арзамасцев

Официальные оппоненты

доктор фармацевтических, профессор Дегтерев Евгений Викторович доктор фармацевтических, профессор Пятин Борис Михайлович Ведущая организация

Институт стандартизации и контроля лекарственных средств ФГУ «Научный центр экспертизы средств медицинского применения»

Защита состоится « /С » /// и1 Л л'_2007 г в часов на заседании

Диссертационного совета (Д 208 040 09) при Московской медицинской академии имени И М Сеченова по адресу 119019, Москва, Никитский бульвар, 13

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ММА имени И М Сеченова по адресу 117998, Москва, Нахимовский проспект, 49

Автореферат разослан « /3 » „¿¿у 2007г

Ученый секретарь Диссертационного

совета Д 208 040 09

доктор фармацевтических наук

профессор

Садчикова Наталья Петровна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Несмотря на значительные успехи в области микробиологии проблема инфекционных заболеваний до настоящего времени не потеряла свою актуальность Это обусловлено увеличением количества микроорганизмов, резистентных к большому числу противомикробных лекарственных средств Особое значение в странах и регионах со сложной социально-экономической обстановкой приобретает, в частности, проблема туберкулеза, трудно поддающегося лечению ВОЗ рекомендована стратегия борьбы с туберкулезом, известная под названием Directly Observed Treatment Short-course (курс ускоренной амбулаторной терапии, проходящий под непосредственным наблюдением) В основу стратегии DOTS положены пять основных элементов, в отсутствии каждого из которых она считается малоэффективной Неотъемлемой частью программы является создание надежной системы поставки высококачественных противотуберкулезных лекарственных препаратов для учреждений здравоохранения В первую очередь, это актуально для стандартных лекарственных средств «первого ряда» -изониазида, рифампицина, пиразинамида, этамбутола, используемых для лечения обычного (чувствительного) туберкулеза Низкое качество даже одного из принимаемых больным препаратов на этом этапе нарушает всю систему и может привести к переходу легкоизлечимой чувствительной формы заболевания в туберкулез со множественной лекарственной устойчивостью (ТБ МЛУ) В этой ситуации важно не допустить распространения низкокачественных и особенно фальсифицированных лекарственных препаратов

В Женеве Комитет экспертов ВОЗ по спецификациям для фармацевтических препаратов в 2006 году утвердил план разработки нормативной документации для противотуберкулезных лекарственных средств на следующие препараты

- рифампицин таблетки

- рифампицин капсулы

- рифампицин + изониазид таблетки

- рифампицин + изониазид + пиразинамид таблетки

- изониазид + этамбутола гидрохлорид таблетки

- рифампицин + изониазид + пиразинамид + этамбутола гидрохлорид таблетки

При этом Комитет отметил, что перспективной является разработка методики теста «растворение» для этих противотуберкулезных лекарственных средств В частности для препаратов, содержащих рифампицин, целесообразно

строить кривые растворимости по рифампицину как по менее растворимому веществу

Другой важной проблемой остается фальсификация лекарственных средств Известно, что противомикробные средства подделываются чаще других - их доля среди фальсификатов составляет, по данным ВОЗ, до 30% В мировой практике известны случаи фальсификации противотуберкулезных лекарственных средств В Государственный реестр лекарственных средств входит несколько десятков индивидуальных и комбинированных противотуберкулезных лекарственных средств различных производителей В то же время, в России и в Таджикистане отсутствует комплексный подход к выявлению поддельных противотуберкулезных лекарственных средств с использованием современных аналитических методов

Учитывая вышеизложенное, разработка унифицированных подходов к стандартизации и контролю качества противотуберкулезных лекарственных средств с использованием современных физико-химических методов анализа является актуальной

Цель н задачи исследования. Целью данной работы являлась разработка унифицированных подходов к стандартизации и контролю качества противотуберкулезных лекарственных средств с использованием современных физико-химических методов анализа Для достижения поставленной цели решались следующие задачи

- разработка унифицированной методики анализа субстанций и препаратов противотуберкулезных лекарственных средств методом ИК-спектроскопии,

- составление атласа ИК-спектров субстанций и препаратов противотуберкулезных лекарственных средств,

- разработка унифицированной методики анализа субстанций и препаратов противотуберкулезных лекарственных средств методом ТСХ,

- выбор условий теста «растворение» для сравнения препаратов рифампицина и выявления фальсификатов,

- разработка комплексного аналитического подхода к выявлению фальсифицированных противотуберкулезных лекарственных средств, не содержащих действующие вещества, указанных на этикетке, и содержащих действующие вещества, но изготовленные другим производителем

Научная новизна исследования. Составлен атлас ИК-спектров субстанций и лекарственных препаратов противотуберкулезных лекарственных средств

различных производителей Впервые разработаны методики установления подлинности противотуберкулезных лекарственных средств в лекарственных формах «таблетки» и «капсулы» методом ИК-спектроскопии

Разработана методика пробоподготовки субстанций и лекарственных препаратов противотуберкулезных средств для анализа методом ТСХ Впервые разработана унифицированная методика установления подлинности индивидуальных и комбинированных противотуберкулезных лекарственных средств методом ТСХ

Впервые показано, что тест «растворение» позволяет проводить сравнение препаратов рифампицина и выявлять фальсификаты

Впервые разработан комплексный аналитический подход к выявлению фальсифицированных противотуберкулезных лекарственных средств с использованием методов ИК- и УФ- спектроскопии, ТСХ, качественных реакций и теста «растворение»

Практическая значимость исследования. В Республике Таджикистан принято Постановление Правительства № 524 от 31 декабря 2002 года «Программа борьбы с туберкулезом в Республики Таджикистан на 2003 - 2010 годы», в котором, в частности, говорится об улучшении обеспечения населения качественными противотуберкулезными лекарственными препаратами

Полученные ИК спектры могут быть использованы при стандартизации и контроле качества по разделу «подлинность» соответствующей НД на субстанции и препараты противотуберкулезных лекарственных средств и для выявления фальсификатов

Методика установления подлинности методом ТСХ предлагается для стандартизации и контроля качества субстанций и лекарственных препаратов данной группы лекарственных средств с последующим их включением в соответствующие разделы НД, а также для выявления фальсификатов

Выбранные условия теста «растворение» предлагаются для сравнения препаратов рифампицина различных производителей и для выявления фальсификатов

Апробация работы. Основные положения диссертационной работы доложены и обсуждены на XII и XIII Российских национальных конгрессах «Человек и лекарство» (Москва, 2005 г, 2006 г) Апробация работы проведена на межлабораторной конференции кафедры фармацевтической химии фармацевтического факультета ММА им И М Сеченова 25 декабря 2006 г

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 4 печатные работы

Связь исследования с проблемным планом фармацевтических наук.

Диссертационная работа выполнена в рамках комплексной темы кафедры фармацевтической химии ММА им И M Сеченова «Совершенствование контроля качества лекарственных средств» (№ гос регистрации 01 200 110545)

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 105 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части (материалы и методы, результаты исследования и их обсуждение), выводов, списка литературы, а также отдельно включает в себя 2 приложения Работа иллюстрирована 15 таблицами и 9 рисунками Библиографический указатель включает 125 источника, из них 40 - иностранные Основные положения, выносимые на защиту:

- результаты исследования противотуберкулезных лекарственных средств методами ИК- и УФ-спектрофотометрии,

- результаты изучения хроматографических характеристик противотуберкулезных лекарственных средств методом ТСХ,

- унифицированные методики установления подлинности противотуберкулезных лекарственных средств методом ТСХ,

- результаты биофармацевтического анализа рифампицина с использованием теста «растворение»,

- комплексный подход к выявлению фальсифицированных противотуберкулезных лекарственных средств,

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ 1 ОБЪЕКТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Объектами исследования являлись стандартные образцы, субстанции и препараты противотуберкулезных лекарственных средств (табл 1)

Табл 1 Изучаемые противотуберкулезные лекарственные средства

мнн Структурная формула Химическое название, молекулярная формула, М м , фарм субстанции

Изониазид С V Y H ГИНК-гидразид изоникотиновой кислоты Гидразид 4-пиридинкарбоновой кислоты СбНуЫзО, М м 134 14 Фарм субстанция изониазид

Рифампицин

3-[[(4-Метил-1-пиперазинил)имино]метил]-5,6,9,17,19,21 -гексагидракси-23-метокси2,4,12,16,18,20,22-гептаметил-8-[Ы-(4-метил-1 -пиперазинил) формимидоил] -2,7-(эпиксипентадека[1,11,13] триэнимино) нафто [2,1-Ь] фуран-1,11-(2 Н)-дион 21 ацетат С4зН58^012

М м 822,94 Фарм субстанция рифампицин

Пиразинамид

/С(МН2

Пиразинкарбоксиамид

с5н5м3о,

М м 123 11 Фарм субстанция пиразинамид

Этамбутол

3-(Р,Р?*)-2,2-(1,2-Этандиилдиимино)бис (1-бутанол) (дигидрохлорид) С10Н24М2О2 2 НСЕ М м 277,23 Фарм субстанция этамбутола гидрохлорид

Амикацин

Ы-[4-Амино-2-(3)-гидроксибутил]-0-6-амино-6- дезокси-альфа-й-глюкопиранозил (1-4)]-0-[3-амино-З-дезокси-альфа-Р-глюкопиранозил(1-6)] -2-дезокси-Р-стрептамин Сгг^Цз^Отз 2Н2304 М м 781,76 Фарм субстанция амикацина сульфат

2. ОБОРУДОВАНИЕ И УСЛОВИЯ ИСПЫТАНИЙ

2.1. ИК-СПЕКТРОСКОПИЯ

В работе использовали однолучевой интерференционный (с обратным преобразованием Фурье) ИК-спектрофотометр Инфралюм ФТ-02 (НПФ «ЛЮМЭКС», Россия) Параметры записи спектров диапазон 4000-400 см-1, разрешение 1 см-1, циклическая запись с количеством сканов 20, аподизация стандартная Фоновый спектр (воздух) получали непосредственно перед записью каждого спектра

Управление прибором и обработку спектров осуществляли с использованием программы «Спектралюм» (НПФ «ЛЮМЭКС», Россия) и программы «ACD/SpecViewer», Freeware Version (Advanced Chemistry Development, Канада)

Пробоподготовку субстанций осуществляли в соответствии с требованиями ГФ XI Навеску субстанции массой 15 мг измельчали в агатовой ступке и растирали с 1-2 каплями вазелинового масла качества «для ИК-спектроскопии» Полученную пасту наносили между двумя пластинками из КВг и получали ИК-спектр образца

2.2. ТОНКОСЛОЙНАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ

Хроматографирование проводили на пластинах для высокоэффективной ТСХ «Сорбфил» размером 10x10 см (ЗАО «Сорбполимер», г Краснодар), покрытых силикагелем с люминофорным содержимым Пластины были представлены двумя видами, отличающимися между собой материалом подложки алюминиевая фольга (ПТСХ-АФ-В-УФ) и полимер (ПТСХ-П-В-УФ)

Использовали стеклянную хроматографическую камеру размером 150х120х80 мм Насыщение камеры парами подвижной фазы (ПФ) проводили в течение 20-30 мин

В качестве подвижной фазы для изониазида, рифампицина, пиразинамида и этамбутола гидрохлорида использовали смесь раствор аммиака 25% — ацетон -метанол - этилацетат (1 1 1 7), а для амикацина сульфата раствор аммиака 25% -метанол - ацетонитрил - ледяная уксусная кислота (7 10 12 1)

Для комбинированных противотуберкулезных лекарственных средств пробы наносились полоской 10 мм для четкости сравнения разделившихся веществ Сушку проб противотуберкулезных лекарственных средств осуществляли с помощью нагревательного устройства для сушки пластин УСП-1 (ЗАО «Сорбполимер», г Краснодар) при температуре около 50°С Пробег фронта

растворителя составлял 8 см После хроматографирования пластину высушивали в сушильном шкафу при температуре 110° С в течение 5 минут

После высушивания хроматографическую пластину помещали на 4-5 мин в камеру с парами йода (только для таблеток с этамбутолом) и с помощью раствора нингидрина 0,25%( для амикацина сульфата), а затем проявляли в УФ-свете облучателя хроматографического УФС 254/365 (ЗАО «Сорбполимер», г Краснодар) при 254 им

2 3. УФ-СПЕКТРОФОТОМЕТРИЯ

В работе использовали однолучевой спектрофотометр СФ-103 (Аквилон, Россия) Управление прибором осуществляли с использованием программы «Спектр» (Аквилон, Россия)

Обработку спектров осуществляли с использованием программы «ACD/SpecViewer», Freeware Version (Advanced Chemistry Development, Канада) 2.4. ТЕСТ «РАСТВОРЕНИЕ»

Тест «растворение» проводили в соответствии с ОФС 42-0003-04 «Растворение» на приборе SOTAX AT 7 smart (Швейцария), аппарат «вращающаяся корзинка»

Количественный анализ осуществляли методом УФ-спектрофотометрии по предложенным нами методикам

3.1. ИК-СПЕКТРОСКОПИЯ 3.1.1. ИК- спектры субстанций.

Было проведено исследование противотуберкулезных лекарственных средств с использованием метода ИК-спектроскопии Пробоподготовку осуществляли путем диспергирования испытуемых лекарственных средств в вазелиновом масле

На рис 1 в качестве примера представлен ИК-спектр пиразинамида В изучаемых спектрах полосы около 2955, 2924, 2855 см-1 соответствуют валентным колебаниям Vc-h, 1462, 1378 и 722 см-1 -деформационным колебаниям бон вазелинового масла Полосы с частотами около 2361, 2346, 2334 и 666 см-1 соответствует колебаниям присутствующего в атмосфере углекислого газа

Соответствующая методика пробоподготовки может быть использована при фармакопейном анализе противотуберкулезных лекарственных средств и при накоплении их стандартных ИК- спектров

Следует также добавить, что методика пробоподготовки с вазелиновым маслом является более экспрессной и удобной

Рис 1 ИК-спектр субстанции пиразиамида в вазелиновом масле

3.1.2. ИК-спектры противотуберкулезных лекарственных средств.

В данной работе также решалась задача получения ИК-спектров противотуберкулезных лекарственных средств в готовых лекарственных формах без предварительного извлечения действующего вещества Нами было показано, что при содержании активной субстанции в лекарственной форме «таблетки» и «капсулы» на уровне не менее 30-40% можно получать ИК-спектр, на котором отмечаются практически все полосы, соответствующие полосам поглощения

действующего вещества Вспомогательные вещества не искажают картину и не маскируют полосы действующего вещества

Из рис 1 и 2 видно, что РЖ- спектры субстанции и таблеток пиразинамида различаются крайне незначительно - практически совпадают Аналогичная ситуация наблюдается и для других противотуберкулезных лекарственных средств В настоящей работе был составлен атлас ИК- спектров субстанций и препаратов противотуберкулезных лекарственных средств с целью их дальнейшего использования в качестве стандартных

3.2. ТОНКОСЛОЙНАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ 3.2.1. Общий подход.

По нашему мнению, интерес могут представлять унифицированные методики установления подлинности противотуберкулезных лекарственных средств методом ТСХ В последующем они могут быть включены в общий план исследований по разработке комплексного подхода к обнаружению фальсифицированных лекарственных средств, а также в раздел НД «подлинность» для субстанций и лекарственных препаратов

Нами было исследовано влияние подвижных фаз (ПФ) различного состава на подвижность противотуберкулезных лекарственных средств и селективность хроматографической системы Элюирующую силу ПФ оценивали по полярности входящих в ее состав растворителей, а для оценки селективности последних использовали классификацию Снайдера Полярность ПФ ориентировочно оценивали по диэлектрической проницаемости растворителей Для этого рассчитывали среднее взвешенное значение диэлектрической проницаемости фазы с учетом содержания каждого растворителя

3.2 2. Препараты, содержащие изониазид, рифампицин, пиразинамнд, этамбутола гндрохлорид.

Были изучены ПФ содержащие следующие растворители в различных соотношениях (в порядке увеличения полярности) тетрахлорметан, диэтиловый эфир, хлороформ, этилацетат, ледяная уксусная кислота, изоамиловый спирт, бутанол, изопропиловый спирт, пропанол, ацетон, этанол, метанол, ацетонитрил, вода, раствор аммиака 25%, формамид

При увеличении содержания в ПФ высокополярных компонентов (раствор аммиака 25%, формамид) резко повышается подвижность изучаемых веществ, но снижается селективность хроматографической системы, и все пятна на хроматограмме имеют значения Яг более 0,8, в том числе оказываются на уровне фронта растворителя При использовании в ПФ тетрахлорметана пятна имеют значения менее 0,2, либо остаются на линии старта

Показано, что для снижения эффекта размывания пятен испытуемых веществ следует включать в состав ПФ раствор аммиака 25% Установлено, что оптимальное содержание раствора аммиака 25% в ПФ для комбинированных противотуберкулезных лекарственных средств составляет 10%

Для увеличения селективности хроматографической системы необходимо использовать метанол Оптимальное содержание метанола в ПФ составило 10%

ПФ также должна включать в себя другие растворители, которые хорошо смешиваются с раствором аммиака 25% и метанолом и имеют сильно различающихся между собой значениями диэлектрической проницаемости Последнее обстоятельство позволяет, меняя их соотношение, регулировать полярность ПФ, и следовательно, выбирать оптимальную подвижность изучаемых лекарственных веществ В качестве таких растворителей после ряда исследований были выбраны этилацетат и ацетон (значение диэлектрической проницаемости, соответственно, около 6 и 20)

Таким образом, было установлено, что оптимальные подвижность и разделение пятен изониазида, рифампицина, пиразинамида и этамбутола гидрохлорида наблюдаются в ПФ с промежуточной полярностью (значение диэлектрической проницаемости смеси составляет около 17) следующего состава раствор аммиака 25% - ацетон - метанол — этилацетат (1117) При этом значения Rf находятся в пределах 0,2-0,8, что является оптимальным (Рис 3 )

0,77

пиразинанид

0,55

изониазид

этамбутол рмфанпицин

Рис 3 ТСХ комбинированного противотуберкулезного лекарственного препарата содержащего изониазида, рифампицина, пиразинамида и этамбутола гидрохлорида в ПФ раствор аммиака 25% - ацетон - метанол - этилацетат (1 1 17) Рядом с пятнами указаны значения

Для детектирования всех пятен использовали комбинирование обработки парами йода и облучения УФ-светом с длиной волны 254 нм Пятна рифампицина вследствие его естественной окраски видны на хроматограмме без какой-либо предварительной обработки при естественном освещении Пятна изониазида и пиразинамида проявляются при облучении светом УФ-лампы при длине волны 254 нм (темные пятна на люминесцирующем фоне пластины) Для проявления

пятен этамбутола гидрохлорида требуется обработка парами йода На рис 3 представлена схема соответствующей хроматограммы

Для всех комбинированных противотуберкулезных лекарственных средств используется одна подвижная фаза, в которых препараты разделяются отчетливо в пределах значения К.г

Детектирование в УФ- свете с использованием разработанной методики позволяет различать пятна при нанесении на линию старта изониазида около 2,7 мкг действующего вещества, пиразинамида около 1,45 мкг действующего вещества, рифампицина около 0,55 мкг действующего вещества и этамбутола около 0,1 мкг действующего вещества При проведении детектирования было отмечено, изониазид и пиразинамид при длине волны 254 нм детектируются в виде темных пятен на светящемся (люминесцирующем) фоне пластины 3.2.3. Препараты, содержащие амнкацина сульфат. На линию старта пластин с помощью микрошприца наносили • амикацина сульфата - 6 мкг

Установлено, что оптимальная подвижность пятен амикацина сульфата наблюдаются в ПФ содержащей следующие растворители ледяная уксусная кислота, метанол, ацетонитрил, раствор аммиака 25% При этом значения Бч находятся в пределах 0,2 - 0,8, что, согласно современным представлениям, является оптимальным Для подбора конечного состава ПФ учитывались следующие факты и предположения

Показано, что для снижения эффекта размывания пятен амикацина сульфата следует включать в состав ПФ растворы аммиака 25% и одновременно ледяной уксусной кислоты Установлено, что оптимальное содержание раствора аммиака 25% в ПФ для амикацина сульфата составляет 23,3 %, а ледяной уксусной кислота 3,3 %

Для увеличения селективности хроматографической системы необходимо использовать метанол Оптимальное содержание метанола в ПФ для амикацина сульфата составляет 33,3 %

ПФ также должна в себя включать растворители, которые хорошо смешиваются с растворами аммиака 25%, ледяной уксусной кислотой и метанолом В качестве такого растворителя после ряда исследований был выбран ацетонитрил Для проявление пятен амикацина сульфата пластину опрыскивают 0,25% раствором нингидрина, после высушивают хроматографическую пластину сушат при температуре 110 °С 5 минут и проявляются пятна

В результате был подобран оптимальный состав ПФ, для амикацина сульфата раствор аммиака 25% - метанол - ацетонитрил - ледяная уксусная кислота(7 10 12 1) (Рис 4)

1 0'

О 75

О 5 -

О 25 0 О

О

о з

каиин а. сульфат

<о

о з

супьфа.т (субстанция)

На рис 4 представлена схема соответствующей хроматограммы

3.3. УФ-СПЕКТРОФОТОМЕТРИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ ПРЕПАРАТОВ РИФАМПИЦИНА

Молекула рифампицина содержит различные функциональные группы, обладающие кислотно-основными свойствами и вступающие друг с другом в сложное взаимодействие

Рис 5 Структура и кислотно-основные свойства рифампицина

В первую очередь, необходимо отметить наличие в структуре рифампицина (рис 5) сложной системы я,к- и р,тс-сопряжения, включающей нафталиновое ядро, имино-группу, амидную группу, систему кратных связей и ряд доноров и акцепторов электронов, в том числе фенольные гидроксилы Также в молекуле присутствует пиперазинильный радикал и сложноэфирная группа

Малую растворимость рифампицина в воде можно объяснить, в частности, наличием в составе молекулы имино-группы (основание Шиффа)

Наличие развитой системы сопряжения в структуре рифампицина обусловливает сильный батохромный сдвиг в электронном спектре поглощения и, соответственно, красно-коричневую окраску вещества, а также значительную величину удельного показателя экстинкции в максимумах поглощения Это позволяет использовать для количественного определения данного вещества метод УФ спектрофотометрии Поскольку количественное определение высвободившегося вещества проводили по методике, описанной в разделе «растворение» для капсул рифампицина (ВР 2005), то есть без использования стандартного образца, нами проводилось количественное определение содержания действующего вещества в каждом из испытуемых препаратов

При УФ спектрофотометрическом анализе прибор дает наименьшую ошибку при оптической плотности (А) испытуемого раствора, близкой к значению 0,4343 Зная удельный показатель экстинкции А(1%,1см) для раствора рифампицина в 0,1 М HCl, определяли требуемую концентрацию раствора С(мкг/мл)

На примере анализа препарата «Капсулы Рифампицина» (150 мг) производства Белмедпрепараты ОАО, Республика Беларусь Из 7 капсул испытуемого препарата извлекали содержимое Взвешивали на аналитических весах Средняя масса содержимого 1 капсулы составила 0,212 г Исходя из номинального содержания рифампицина (0,15 г), рассчитывали его долю в составе извлеченного порошка Она составила около 49,6%

Исходя из того, что прибор дает наименьшую ошибку при концентрации испытуемого раствора, близкой к значению 16,5 мкг/мл, а также учитывая долю рифампицина в составе порошка, извлеченного из капсул, рассчитывали массу точной навески

С =

Ах10000 = 0,4343 х10000 А(\%,\см) 263

= 16,5 мкг

мл

16,5

мкг 33000 мкг х 5мл 33 мг

66 ,5 мг

мл 100 мл х 100 мл ' 0,496

Порошок измельчали в ступке, брали среднюю пробу, из которой получали точную навеску по массе, близкую к рассчитанной

Извлечение действующего вещества осуществляли 0,1 М НС1 Около 66,5 мг (точная навеска) порошка содержимого капсул помещали в мерную колбу вместимостью 100 мл, растворяли в 0,1 М кислоте хлористоводородной и доводили объем раствора до метки тем же растворителем 5,0 мл полученного раствора помещали в мерную колбу вместимостью 100 мл и доводили объем раствора до метки кислотой хлористоводородной 0,1 М Полученный раствор фильтровали через фильтр типа «белая лента», отбрасывая первую порцию фильтрата

350 400

Wavelength (пт)

Рис 6 Спектр в УФ и видимой областях раствора содержимого капсул рифампицина (Белмедпрепараты ОАО) Концентрация рифампицина около 16,5 мкг,мл

Расчет содержания рифампицина (мг) в капсулах осуществляли по формуле

А х 100 х 100 х ш„„„„

А (1 %, 1см ) х 5 х т пав х 100 %

А — оптическая плотность испытуемого раствора, А(1%, 1 см) —удельный показатель экстинкции,

, где

ткапс- средняя масса содержимого одной капсулы, мг,

тнав - масса точной навески измельченного содержимого капсул, мг,

100х 100/5 - разведение, мл

Для проверки правильности выбранного максимума поглощения на используемом приборе нами был получен УФ спектр раствора содержимого капсул в среде 0,1 М НС1 (рис 6) В данной среде наблюдаются максимумы 233 нм, 269 им, 336 нм и 473 нм Максимум 336 нм достаточно хорошо выражен и совпадает с максимумом поглощения, указанным в ВР 2005 при количественном определении высвободившегося рифампицина

3.4 ТЕСТ «РАСТВОРЕНИЕ»

Для создания условий, в которых можно дифференцировать профили высвобождения различных препаратов, содержащих одно и то же действующее вещество, подбирали среду растворения, в которой высвобождение вещества будет несколько затруднено

Time, min

Рис 7 Профиль высвобождения капсул Рифампицина производства ОАО Белмедпрепараты На рисунке 7 представлен профиль высвобождения препарата Рифампицин капсулы 150 мг производства Белмедпрепараты ОАО, Республика Беларусь, в следующих условиях

вращающаяся корзинка со скоростью вращения 100 об/мин,

среда растворения 0,01 М раствор НС1 (рН 2,0), объем среды растворения 900 мл, температура среды 37°С При использовании в качестве среды растворения 0,01 М НС1 рифампицин высвобождается незначительно и очень медленно Это можно объяснить нарушением так называемых «условий раковины» («sink conditions»), которые подразумевают использование таких условий растворения, дозировок и объемов среды, при которых не происходит образование насыщенного раствора действующего вещества Это могло произойти и в данном случае Видимо, в среде 0,01 М НС1 происходит слабое протонирование основных центров Растворимость рифампицина вследствие этого снижена и высвобождение затруднено В этой ситуации дальнейшее использование данной среды растворения нецелесообразно

Для создания дифференцирующих условий растворения, которые, в то же время, не приводили бы к преждевременному насыщению раствора, было решено использовать 0,1 М НС1 (рН 1 06 с учетом поправки на ионную силу раствора) При таком значении рН растворимость рифампицина должна увеличиться На рис 8 представлены профили высвобождения рифампицина из испытуемых препаратов

В табл 2 представлены данные по высвобождению испытуемых препаратов в точке 45 мин Из рис 8 и табл 2 видно, что в данной среде рифампицин высвобождается практически полностью Препараты Р-цин (Люпин Лтд) и Рифампицин производства Белмедпрепараты ОАО отвечают требованиям как BP 2005 (не менее 70%), так и ОФС 42-0003-04 (не менее 75%)

Профиль высвобождения препарата Рифампицин (150 мг), ООО НПФ «БИОС» (фальсификат) отличается резким снижением концентрации испытуемого вещества в растворе после точки 35 мин Такое же явление наблюдается и для других испытуемых препаратов, но в значительно меньшей степени Мы предполагаем, что это может быть связано со снижением стабильности рифампицина в ходе проведения испытания, в частности, с окислением с образованием рифампицина-хинона, что, несомненно, сказывается на удельном показателе экстинкции и положении максимума поглощения ввиду резкого изменения хромофора Стабильность субстанции зависит, в том числе, от технологии ее получения и чистоты Меньшую стабильность субстанции в составе фальсифицированного препарата можно объяснить ее низким качеством

Рис 8 Профили высвобождения препаратов рифампицина в 0,1 М НС1

Высвобожде Фармакопейные требования

Препарат ние в точке 45 мин (%)

BP 2005 USP29 ОФС 42-0003-04

Капсулы Рифампицин-Ферейн (150 мг) 63,6

Капсулы Рифампицин

Белмедпрепараты ОАО (150 мг) 76,1

не менее не менее не менее

Капсулы Рифампицин ООО НПФ «БИОС» (150 мг), (фальсификат) 48,7 70% 75% 75%

Капсулы Р-цин (300 мг) 79,8

Таблица 2 Высвобождение испытуемых препаратов в точке 45 мин

На основании полученных данных была проанализирована возможность диффиренцировки исследуемых препаратов по профилям растворения По рекомендации FDA для этого рассчитывали факторы различия и подобия Различие между кривыми отсутствует, если

- фактор различия (f|) принимает значения от 0 до 14,

- фактор подобия (f2) принимает значения от 51 до 100

В табл 3 представлены значения фактора различия и фактора подобия в 0,1М НС1, полученные для каждой пары препаратов

Таблица 3 Значения фактора различия (f|) и фактора подобия (f2) в 0,1 М НС1 для препаратов рифампицина

Р-цин Рифампицин (Белмедпрепараты ОАО) Рифампицин-Ферейн

Рифампицин (Белмедпрепараты ОАО) f, = 42,3 f2 = 25,5 — —

Рифампицин-Ферейн f, = 50,7 f2 = 26,1 f, = 23,7 f2 = 45,4 —

Рифампицин f, = 71,1 f, = 32,3 f, = 30,4

(фальсификат) f2 = 18,7 f2 = 33,2 f2 = 36,3

Каждая пара кривых отличается по параметрам FDA Для установления статистически достоверной разницы можно также применять расчет по отдельным временным точкам с использованием теста Стыодента для независимых выборок - двусторонняя критическая область (с предварительной проверкой гипотезы о равенстве генеральных дисперсий) Покажем это на примере двух наименее различающихся по высвобождению кривых (табл 4)

Из представленных в табл 4 данных видно, что два выбранных препарата различаются в 5 временных точках, что подтверждает результаты, полученные при использовании параметров FDA

Таблица 4 Тест Стьюдента 0,1 М НС1 Рифампицин-Ферейн - Рифампицин (Белмедпрепараты ОАО)

15 мин 25 мин 35 мин 45 мин 60 мин 70 мин

Критерии t эксп = t эксп = t эксп = t эксп = t эксп = t эксп =

Стьюден- -2,219 - 4,096 - 3,764 -3,146 -3,811 -3,130

та t критич = t критич = t критич = t критич = t критич = t критич =

2,262 2,228 2,228 2,228 2,262 2,262

Вывод |t эксп | < t |t эксп I > t |t эксп | > t |t ЭКСП I > t |t эксп | > t |t эксп I > t

критич, критич , критич , критич , критич , критич,

генераль - генераль - генераль - генераль - генераль - генераль -

ные ные ные ные ные ные

средние средние средние средние средние средние

равны различают- различают- различают- различают- различают-

ся ся ся ся ся

Анализ полученных данных свидетельствует о возможности использовать тест «растворение» для определения различий между воспроизведенными лекарственными средствами, а также для выявления фальсифицированных препаратов рифампицина

ВЫВОДЫ

1 Разработана унифицированная методика анализа субстанций и препаратов

противотуберкулезных лекарственных средств методом ИК-спектроскопии и составлен атлас соответствующих РЖ-спектров, которые предлагаются для использования в качестве стандартных при анализе по разделу нормативной документации «подлинность» и для выявления фальсификатов, не содержащих указанное на упаковке действующее вещество

2 Разработаны условия метода ТСХ и методики пробоподготовки субстанций

и препаратов противотуберкулезных лекарственных средств Подобран унифицированный состав подвижной фазы для изониазида, рифампицина, пиразинамида и этамбутола гидрохлорида раствор аммиака 25% - ацетон - метанол - этилацетат (1117) Оптимальная

подвижность пятен амикацина сульфата наблюдается в системе растворителей раствор аммиака 25% - метанол - ацетонитрил - ледяная уксусная кислота (7 10 12 1) Разработанные методики предлагаются для выявления фальсификатов, не содержащих указанные на упаковке лекарственные вещества, и для включения в раздел нормативной документации «подлинность» для субстанций и лекарственных препаратов противотуберкулезных лекарственных средств Показано, что для капсул рифапицина возможен подбор условий теста «растворения», позволяющих дифференцировать дженерики В среде 0,1 М кислоты хлористоводородной наблюдаются значимые различия между профилями растворения всех изученных препаратов рифампицина Это свидетельствует о возможности использовать тест «растворение» для определения различий между воспроизведенными препаратами рифампицина Разработан комплексный подход к выявлению фальсифицированных противотуберкулезных лекарственных средств, не содержащих действующие вещества, указанные на этикетке Для обнаружения таких подделок следует использовать простые качественные реакции, ТСХ и ИК- спектроскопию в средней области Для выявления фальсифицированных противотуберкулезных лекарственных средств, содержащих действующие вещества, указанные на этикетке, но изготовленных другим производителем, возможно использование теста «растворение» в комплексе с другими аналитическими методами при условии параллельного испытания в дифференцирующих условиях подлинного лекарственного средства

Список работ, опубликованных по теме диссертации

М Р Якубов, А П Арзамасцев, В Л Дорофеев Разработка методик экспресс-анализа противотуберкулезных лекарственных средств с использованием метода ТСХ // Человек и лекарство Тез докл XII Росс нац конгр - М, 2005 - С 8-9

М Р Якубов, А П Арзамасцев, В Л Дорофеев Установление подлинности комбинированных противотуберкулезных препаратов с использованием метода ТСХ // Человек и лекарство Тез докл XII Росс нац конгр - М , 2005 - С 9

М Р Якубов, А П Арзамасцев, В Л Дорофеев Установление подлинности монокомпонентных противотуберкулезных препаратов методом ИК- спектроскопии // Человек и лекарство Тез докл XIII Росс нац конгр - М , 2006 - С 44

М Р Якубов, А П Арзамасцев, В Л Дорофеев Экспресс-анализ комбинированных противотуберкулезных средств методом ТСХ // Вестник Воронежского государственного университета Серия Химия Биология Фармация -2006 -№1 -С 230-232

ПМП АХУ-филиал ОАО «РЖД.> ул Новая Басманная, д 6 Зак гд& тир УОО экз 200.2. г

Основные положения диссертационной работы доложены и обсуждены на ХП и XIII Российских национальных конгрессах «Человек и лекарство» (Москва, 2005 г, 2006 г) Апробация работы проведена на межлабораторной конференции кафедры фармацевтической химии фармацевтического факультета ММА им И М Сеченова 25 декабря 2006 г О Б З О Р Л И Т Е Р А Т У Р Ы

ОБЩИЕ ВЫВОДЫ

1. Разработка унифицированная методика анализа субстанций и препаратов противотуберкулезных лекарственных средств методом ИК-спектросконнн н составлен атлас соответствующих ИК-спектров, которые предлагаются для использования в качестве стандартных при анализе по разделу нормативной документации «подлинность» и для выявления фальсификатов, не содержащих указанное на упаковке действующее вещество.

2. Разработаны условия метода ТСХ и методики пробоподготовки субстанций и препаратов противотуберкулезных лекарственных средств. Подобран унифицированный состав подвижной фазы для нтониазида, рифамшшнна, пнразннамида и этамбутола гндрохлорида: раствор аммиака 25% - ацетон - метанол - этнлацетат (1:1:1:7). Оптимальная подвижность пятен амнканнна сульфата наблюдается в системе растворителей; раствор аммиака 25% -метанол - ацетокнтркл ■ ледяная уксусная кислота (7:10:12:1), Разработанные 1^гетоднки предлагаются для выявления фальсификатов, не содержащих указанные на упаковке лекарственные вещества, и для включения в раздел нормативной документации «подлинность» для субстанций и лекарственных препаратов ] 1ротнвотуберкулезныч лекарственных средств, .

3. Показано, что для капсул рифапицина возможен подбор условий теста растворения», позволяющих дифференцировать дженернки. В среде 0,1 М кислоты хлористоводородной наблюдаются значимые различия между профилями растворения всех изученных препаратов рифомпицина- Это свидетельствует о возможности использовать тест «растворение» для определения различий между воспроизведенными препаратами рифамнниина.

4 Разработан комплексный подход к выявлению фальсифицированных противотуберкулезных лекарственных средств, не содержащих 93 действующие вещества, указанные на этикетке. Для обнаружения таких подделок следует использовать простые качественные реакции, ТСХ н ИК- спектроскопию в средней области. Для выявления фальсифицированных i фотиаотуберкулсзных лекарственных средств, содержащих действующие вещества, указанные на этикетке, но изготовленных другим производителем, возможно использование теста «растворение» в комплексе с другими аналитическими методами при условии параллельного испытания в дифференцирующих условиях подлинного лекарственного средства.