Автореферат и диссертация по фармакологии (15.00.02) на тему:Сравнительный анализ методических подходов к оценке биодоступности лекарственных средств (на примере фторхинолонов и бифоназола)

На правах рукописи

ИВЕТТ КАМАЛЬ ЗАХЕР САЛИБ

СРАВНИТЕЛЬНЫЙ АНАЛИЗ МЕТОДИЧЕСКИХ ПОДХОДОВ К ОЦЕНКЕ БИОДОСТУПНОСТИ ЛЕКАРСТВЕННЫХ СРЕДСТВ (на примере фторхинолонов и бифоназола)

15.00.02 - Фармацевтическая химия и фармакогнозия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата фармацевтических наук

Москва - 1997

Работа выполнена в Московской медицинской академии им. И.М. Сеченова и НТЦ "Лекбиотех" АО "Биотехнология".

Научные руководители:

доктор фармацевтических наук, профессор, член-корр. РАМН Арзамасцев А.П.,

доктор биологических наук, профессор Фирсов A.A.

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Жердев В.П., доктор фармацевтических наук, профессор Берлянд A.C.

Ведущая организация - Центр по химии лекарственных средств - Всероссийский научно-исследовательский химико-фармацевтический институт (ЦХЛС-ВНИХФИ)

Защита состоится <№> О• ^ 1997 г.

в_час. на заседании Специализированного Ученого Совета

Д. 074.05.06 при Московской медицинской академии им. И.М. Сеченова по адресу: Москва, Суворовский бульвар, д. 13.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Московской медицинской академии (Москва, Зубовская пл., д. 1).

Автореферат разослан </3> м 1997 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета,

кандидат фармацевтических паук, доцент H.H. Садчикона.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность работы. Оценка биодоступности и биоэквивалентности лекарственных средств является-основным видом фармакокинетического изучения генерических препаратов (Фирсов А.А. и др., 1995 г.). Несмотря на серьезные усилия, предпринимаемые с целью унификации планирования и проведения соответствующих исследований, многие вопросы по-прежнему далеки от своего решения. В значительной мере это обусловлено нерешенностью ряда вопросов, связанных с оценкой биодоступности (Фирсов А.А. и Пиотровский В.К., 1984 г.). В частности, продолжаются поиски надежных способов характеристики скорости всасывания лекарственных веществ. Недавно для этой цели было предложено использовать отношение максимальной концентрации к площади под фармакокинетической кривой - Cmax/AUC -(Endrenyi L. et al., 1991), однако примеров практического применения этого параметра почти нет. До сих пор активно обсуждаются вопросы оптимизации регламента фармакокинетических исследований, однако взаимосвязи между протоколом эксперимента и анализом его результатов часто остаются вне поля зрения. Недостаточно изучено влияние длительности наблюдения за концентрацией лекарственного средства, а также скорости его поступления в системный кровоток на оценку степени всасывания. Кроме того, существует определенное противоречие между настоятельными рекомендациями по поводу перекрестной схемы исследования и оценкой биодоступности по абсолютным значениям площади под фармакокинетической кривой (AUC) и максимальной концентрации (Стах) препаратов (U.S. Pharmacopeia XXIII), хотя перекрестная схема предусматривает возможность использования "относительных" параметров - f = AUC(A)/AUC(B) и f" = Cmax(A)/ Cmax(B), где "A" - изучаемый препарат, "В" -препарат сравнения. Аргументом в пользу параметров f и f" могло бы стать сопоставление межипдивидуальной вариабельности фармакокинетических параметров с внутрииндивидуальной, однако такие сопоставления проводятся редко. Понятно, что надежность результатов испытаний биодоступности зависит и от качества первичных данных, а следовательно от качества аналитического метода.

Эта проблема особенно актуальна для лекарственных веществ, предназначенных для местного применения и обладающих минимальной системной доступностью, когда выводы о преимуществах той или иной лекарственной формы основываются на данных о концентрации препарата в месте его действия, например в коже, подлежащих тканях и др., а не в крови. Это обстоятельство диктует повышенные требования к аналитической процедуре.

Выяснение названных вопросов явилось предметом данной работы, выполненной в рамках плановой темы НИР Московской медицинской академии им. И.М. Сеченова "Стандартизация и контроль качества лекарственных средств" (N0. госрегистрации - 01.91.0039973).

Целью исследования явилось изучение особенностей фармакокинетического анализа при оценке биодоступности лекарственных средств, а также влияния на нее метода количественного определения и регламента эксперимента.

Задачи исследования. Для достижения поставленной цели предстояло:

1) сопоставить возможности оценки скорости всасывания лекарственных веществ по времени достижения максимальной концентрации и величине отношения Стах/ АиС;

2) проанализировать влияние регламента фармакокинетического исследования (в частности, длительности наблюдения за концентрацией лекарственного средства) на оценку биодоступности на примере фторхинолопов;

3) выявить влияние межиндивидуальной и внутри-индивидуальной вариабельности фармакокинстических параметров па оценку степени всасывания фторхинолопов;

4) разработать аналитический метод определения химиотерансвтического препарата, предназначенного для местного применения (на примере бифоназола).

Научная новизна работы. Предложена оригинальная процедура оценки влияния длительности наблюдения за концентрацией препарата н неодинаковой скорости его поступления в системный кровоток па определение степени всасывания.

Впервые установлена более выраженная межипдивидуальная вариабельность фармакокинстических

параметров фторхинолоноп по сравнению с ипутри-индивидуальной и тем самым обоснованы преимущества относительных фармакокинетических параметров перед абсолютными.

Разработан оригинальный метод анализа бифопазола и биоматериале.

Научно-практическая значимость работы.

Проведенный анализ влияния фармакокинетических свойств, межиндивидуальпой и впутрииндивидуалыгой вариабельности параметров па оценку биодоступности фгорхиполонов может быть распространен па другие лекарственные средства.

Рекомендованные приемы оценки биодоступности с помощью относительных параметров универсальны и также могут быть использованы при фармакокинстическом изучении других лекарственных средств. В частности, отношение Cmax/AUC рекомендовано использовать в качестве основного параметра скорости всасывания при опенке биоэквипалентпости лекарственных средств (Правила проведения исследований биоэквивалептпости лекарственных средств. МЗ и МП РФ, 1995).

По результатам фармакокинетичсского изучения 1"о-ный крем бифоназола производства Курганского комбината "Синтез", LOXONE производства Brown & Burk Pharmaceutical PVT. LTD., Индия, NEGAFLOX производства Cadila Labs. LTD., Индия, MICROFLOX производства Micro Nova PVT. LTD., Индия, и ПЕФЛОКСАФЕР производства ФАО Ферейн были разрешены Фармакологическим государственным комитетом МЗ РФ для медицинского применения.

Положения, выносимые на защиту.

1. Способы выявления влияния отсроченного появления лекарственного средства в крови на оценку степени его всасывания.

2. Взаимосвязи между фармакокинетическимн свойствами фторхинолоноп и оптимизацией регламента исследования биодостунности.

3. Сопоставление межиндивидуальной и впутрииндиви-дуальной вариабельности фармакокинетических параметров фторхинолоноп.

4. Обоснование целесообразности использования относительных фармакокинетических параметров.

5. Доказательство преимуществ нового параметра скорости всасывания - Cmax/AUC перед традиционно используемым.

6. Метод количественного определения бифоназола в биологическом материале и результаты фармакоки-нетического изучения препарата.

Апробация работы. Материал диссертации доложен на конференциях лаборатории фармакокинетики НТЦ "Лекбиотех" АО "Биотехнология" (Москва, 19961997гг.). Апробация работы проведена на заседании объединенного коллоквиума лаборатории фармакокинетики и Центра сертификации лекарственных средств АО "Биотехнология" (Москва, 13.03.1997) и на совместной конференции кафедры фармацевтической химии ММА им. И.М. Сеченова и лаборатории фармакокинетики НТЦ Лекбиотех АО "Биотехнология" (Москва, 14.03.1995).

Объем и структура диссертации. Диссертация содержит следующие разделы: введение, обзор литературы, материалы и методы, 3 главы результатов собственных исследований и их обсуждение, выводы, библиографический указатель, включающий работы на русском (9) и иностранном (112) языках и приложения. Диссертация изложена на 140 страницах машинописного текста, содержит 26 таблиц и иллюстрирована 29 рисунками.

Публикации. По результатам диссертационной работы опубликовано 2 статьи.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Изученные препараты. Для исследования были использованы: 1%-пый крем бифоназола производства Курганского комбината "Синтез", РФ, и фирмы Roux-Ocefa S.A., Аргентина; таблетки LOXONE - производства Brown & Burk Pharmaceutical PVT. LTD., Индия, NEGAFLOX -производства Cadila Labs. LTD., Индия, (изучаемые препараты) и NOLICIN - производства KRKA, Словении, (препарат сравнения), содержащие по 400 мг порфлокса-ципа; таблетки MICROFLOX производства Micro Nova PVT. LTD., Индия, (изучаемый препарат) и CIPROBAY -производства Bayer, Германия, (препарат сравнения), содержащие по 250 мг ципрофлоксацина; капсулы ПЕФЛОКСАФЕР - производства ФАО Ферейн, РФ, (изучаемый препарат) и таблетки PEFLACINE

нроизводства Rhone Poulenc Rorcr, Франция-США, (препарат сравнения), содержащие 200 и 400 мг пефлокса-цина, соответственно.

Аналитические методы. При разработке методики количественного определения бифоназола использовали колонку "Silasorb - С18 " (30 см х 4,6 мм; зернение - 10 мкм) и хроматографическую систему Millipore Waters/GPC 204 (США) с инжектором UGK, двухпоршневым насосом переменного хода (модель 501), УФ-снектрофотометром Lambda - Мах (модель 481 LC) и програмным обеспечением Maxima. Содержание препарата в пробах во всех случаях рассчитывали методом абсолютной калибровки.

Количественное определение фторхинолонов включало в себя осаждение белков плазмы двойным объемом метанола и введение аликвоты отцентрифугироваиного супернатанта (12,5 мкл) в хроматографическую систему Millipore Waters/ GPC 204 (США). Для разделения использовали колонку Silasorb 5 - Cs (ЧССР) и подвижную фазу следующего состава: ацетонитрил - этанол - 0,02 M раствор КН2РО4, подкисленный ортофосфорной кислотой до pH 2,85, в соотношении 10:20:70 (об/об); скорость потока - 1,1

мл/мин, флуориметрический детектор (X B03f, = 274 11м, X ям = 418 им). Содержание препарата в пробах рассчитывали методом абсолютной калибровки. Калибровочные графики линейны в следующих диапазонах концентраций: для норфлоксацина от 0,05 до 5,0 мкг/мл; для ципро-флоксацина от 0,02 до 10 мкг/мл; для пефлоксацина от 0,2 до 10 мкг/мл.

Регламент фармакокинетических исследований. Фармакокинетические исследования 1%-ного крема бифоназола проводили на самцах крыс Вистар массой 140 -180 г, наркотизированных нембуталом. На выбритую кожу наносили 160 мг крема производства Курганского комбината "Синтез" (препарат А) или фирмы Roux-Ocefa S.A. (препарат В) и закрывали лейкопластырем. Доза бифоназола составляла в среднем 10 мг/кг в пересчете на активное вещество. Через 0,5; 1; 2; 6; 24 и 48 часов после аппликаиии препаратов А или В крыс забивали и отбирали пробы крови и кожи. К образцам кожи добавляли физиологический раствор в соотношении 1:5 (масса/объем), растирали со стеклянным песком до гомогенного состояния и центрифугировали при 2000 g при комнатной температуре и

течснис 20 мин. Кровь отстаивали, затем из псе получали сыворотку путем центрифугирования при тех же условиях.

Исследования фармакокипетики норфлоксацина, ципрофлоксацина и нефлоксацина проводились у 59 больных (соответственно 36, И и 12) с диагнозом эмпиема плевры или абсцесс легкого. Больные принимали внутрь натощак стандартную дозу изучаемого препарата или препарата сравнения (400 мг норфлоксацина, 500 мг ципрофлоксацина или 400 мг нефлоксацина). Отбор крови производился непосредственно перед и через 0,5; 1; 1,5; 2;. 3; 4; 6 и 8 ч после приема препаратов норфлоксацина и ципрофлоксацина и перед и через 0,5; 1; 1,5; 2; 3; 5; 8 и 24 ч после приема препаратов пефлоксацина. Во всех случаях отобранную кровь центрифугировали, полученную плазму хранили при температуре -20°С до начала исследования.

Фармакокинетический анализ. Поскольку концентрация бифоназола в крови не превышала порога чувствительности метода определения, фармакокинетический анализ проводили только по данным о концентрации лекарственного вещества в коже.

Фармакокинетику бифоназола и фторхи полонов характеризовали величиной максимальной концентрации (Стах) и временем ее достижения (tmax), периодом полу выведения (Т) 2). площадями под фармакокинети-ческой кривой в пределах от нуля до момента отбора последней пробы (AUCt) и от нуля до бесконечности (AUC), отношением Cmax /A\JC и средним временем удержания (MRT). В случае фторхинолонов оценивали дополнительно продолжительность латентного периода (Т0). В качестве оценки относительной степени всасывания препаратов использовали параметры f и f', которые рассчитывали по формулам:

f = AUC(A)/AUC(B), Р = AUC( (А) / AU С( (В).

Кроме того, вычисляли отношение максимальных концентраций препаратов по формуле: f"= Cmax(A)/Cmax(B).

Параметры би- и трехэкснонспциальпых уравнений, описывающих фармакокинетику препаратов, рассчитывали с помощью нелинейного регрессионного анализа (программами TopFit V 1.0.)".

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1. Разработка методики количественного анализа бифоназола

Бифоназол, 1-|(1 - Г - бифепил) - 4 - ил -фенилмегил)- Ш - к мпд,пол, представляет гобои противогрибковое сродство.

Я СНЫ С22 1118 N2

Ранее, при фармакокинстических исследованиях бифоназола применялись два метода анализа - хроматомасс-снектромстричсскии и радиоизотопный (с использованием 14С - изотопа). Оба метода имеют ряд существенных недостатков, ограничивающих возможность их применения в клинике, в связи с этим разработка более простой и доступной методики ВЭЖХ-анализа бифоназола в пробах кожи и сыворотки крови явилась актуальной.

1.1. Условия разделения и детектирования бифоназола. Поскольку бифоназол представляет собой малополярное соединение со слабовыраженпыми кислотными свойствами, для его определения были использованы обращенно-фазные сорбенты, такие как ЬГиЫсояМ 5 - С)«, рВоп(1араск 10 - Сщ, ЗИаэогЬ 10 - С^, БПахогЬ 7,5 - Сн. На основании результатов предварительных экспериментов была выбрана колонка БПазогЬ 10 - Сщ , которая обеспечивала эффективное разделение пика бифоназола и пиков интерферирующих веществ, экстрагируемых из биологической пробы.

При оптимизации компонентного состава подвижной фазы исходили из того, что ацетонитрил является одним из наиболее доступных растворителей, поэтому он и был использован как основной компонент подвижной фазы. Для подавления процессов диссоциации и ионного обмена в адсорбционном слое и для получения симметричного хроматографического пика бифоназола в элюент включили ацетатный буфер.

%

Рис.1. Зависимость степени экстракции (в процентах) бифоназола из гомогепата кожи хлористым метилбиом от |)Н пробы (а) и от соотношения объемов эксграгепта и пробы - б).

-и -

Оптимальным для элюирования бифоназола оказалось объемное соотношение аметоиитрпла и ацетатного буфера (рН = 4) 85:15, которое обеспечивало выход пика через 3,4 мин. Введение метанола в состав подвижной фазы (1 мл на 100 мл) привело к повышению эффективности хроматографирования. Таким образом, в качестве элюента была использована подвижная фаза следующего состава: ацетонитрил - 0,12М раствор ацетата натрия - метанол в соотношении 84:15:1.

С целью выбора оптимальных условий детектирования бифоназола был снят его УФ-спсктр и на этом основании была выбрана длина волны детектирования (254 им).

1.2. Условия выделения бифоназола из биоматериала. Поскольку бифоназол является слабой кислотой, для его эффективной экстракции из гомогената кожи необходима кислая среды. С целью выбора оптимального значения рН были проведены модельные опыты при различных значениях рН (в диапазоне от 2 до 12), см. рис. 1а. Значение рН = 3 было признано оптимальным.

Для выбора наилучшего экстрагента было проведено сравнение эффективности экстракции бифоназола из анализируемой пробы наиболее часто применяемыми экстрагентами: хлороформом, этилацетатом, хлористым метиленом, дихлорэтаном, бензолом и гептаном с 1,7%-ным изоамиловым спиртом. Степень экстракции препарата оказалась наибольшей при использовании хлороформа и хлористого метилена. Тем не менее, при использовании хлороформа вместе с пиком бифоназола на хроматограмме появлялись интерферирующие пики, отсутствующие на хроматограмме экстракта, полученного с помощью хлористого метилена (см. рис. 2 а, б), поэтому последний был признан оптимальным экстрагентом.

При изучении зависимости степени экстракции от объема хлористого метилена было установлено, что она возрастает по мере увеличения соотношения объемов биопробы и экстрагента вплоть до соотношения, равного 1:6, которое и было признано оптимальным (см. рис. 16).

Рис.2. Хроматограммы экстрактов гомогелата кожи, содержащего 5 мкг/мл бифопазола хлороформом (а) или хлористым метиленом (6 и I») с последующим упарпнаиием и токе азота (а и б) пли после регжстракцпи в небольшой объем щелочи (в).

C целыо повышения чувствительности метола анализируемую пробу пытались сконцентрировать с помощью реэкстракции бифоназола в небольшой объем щелочи. Однако появление дополнительного пика на хроматограмме в непосредственной близости от пика бифоназола (см. рис. 2в) затруднило количественное определение. Это заставило нас отказаться от описанной процедуры и упаривать количественно отобранный после экстракции органический слой с перешедшим в него бифоназолом досуха в токе азота с последующим растворением сухого остатка в минимальном количестве метанола.

На основании проведенных исследований, для изучения фармакокинетики бифоназола рекомендована следующая методика. К 0,5 мл биологической пробы (супернатант гомогената кожи или сыворотка крови), подкисленной 0,25 мл 0,1М раствора HCI, добавляют 3 мл хлористого метилена. Смесь осторожно встряхивают в течение 40 мин при комнатной температуре, затем центрифугируют в течение 15 мин при 5000 об/мин. После этого 2,5 мл органического слоя упаривают досуха в токе азота при 45°С, сухой остаток растворяют в 200 мкл метанола и 30 мкл полученного раствора вводят в хроматографическую систему. Хроматографическое разделение проводится на колонке "SilasorblO - С^". Элюирующая система: ацетонитрил - 0,12 М раствор ацетата натрия - метанол в соотношении 84:15:1 по объему. Детектирование проводят с использованием УФ-спекгро-фотометрического детектора при длине волны 254 им. Количественное определение бифоназола проводится методом абсолютной калибровки. Калибровочный график линеен в диапазоне 0,5 - 20 мкг/г ткани, порог чувствительности метода - 0,02 мкг в 1 г ткаии или 1 мл сыворотки крови. Степень извлечения бифоназола из гомогената кожи составляет 84 ± 3%. Результаты определения бифоназола в образцах гомогената кожи (1 мкг/г) представлены в таблице 1.

Таблица 1. Результаты количественного определения бифоназола в образцах гомогената кожи, содержащим его в концентрации 1 мкг/г, методом ВЭЖХ

N0. пробы Найдено бифоназола мкг/г Среднее значение мкг/г Стандартное отклонение мкг/г Коэффициент вариации, %

1 1,0

2 1,08

3 1,0 0,99 0,07 6,94

4 0,88

5 0,96

6 1,04

Средние значения коэффициента вариации при концентрации бифоназола, равной 1 мкг/г, составляли 6,9%, при 10 мкг/г - 2,9%, а при 20 мкг/г - 1,6%.

Разработанная методика проще описанных ранее и позволяет за один рабочий день проанализировать не менее 40 образцов биологического материала.

2. Применение разработанной аналитической методики при фармакокинетическом изучении препаратов бифоназола

Разработанная методика была использована при экспериментальной оценке биодоступности бифоназола после аппликации на кожу крыс препаратов А и В (препарат сравнения). Усредненные фармакокинетические профили бифоназола в тканях кожи представлены на рис. 3. Как видно на рисунке, изученные препараты обладают сходными фармакокинетическими свойствами: в обоих случаях бифоназол быстро проникает в кожу (его максимальная концентрация достигается через 1 - 2 ч) и длительно в ней удерживается - с помощью описанной выше методики процесс снижения концентрации лекарственного вещества удалось проследить на протяжении 48 ч. Как следует из табл. 2, оба препарата характеризуются близкими значениями фармакокинетических параметров.

__- 15-

с, мкг/мл

Рис.3. Усредненные фармакокииетические про(|)11ли бифоназола в коже крыс после аппликации препаратов Л (кресты) и В (квадраты).

Таблица 2. Усредненные значения параметров фармакокинетики бифоназола после накожной аппликации препаратов А и В.

Препа -рат ^гпах > Ч г ^тах» мкг/г лис, мкг*ч/г МЯТ, ч С-тах/'ЛиС, 4 1 (

А 0,71 13,0 215 14,9 0,064 0,95

В 1,46 9,9 227 14,5 0,049 -

Таким образом, разработанная методика позволила надежно сравнить фармакокипетическис свойства двух препаратов бифоназола и оцепить относительную био-достунность одного из них.

-163. Особенности фармакокинетического анализа при оценке биодоступности лекарственных средств (на примере норфлоксацина)

Как было указано выше, кроме качества первичных данных (прежде всего, аналитического метода), на корректную оценку биодоступности лекарственных средств влияют и другие факторы, в частности, длительность наблюдения за изменением концентрации препаратов в крови.

3.1. Параметры степени всасывания. Для оценки относительной степени всасывания лекарственных средств используется модифицированное уравнение Доста:

Г = АиСи,уЧ /АиСсравн , где Г - относительная биодоступность, АиСнзуч и АиСсравн -площади под фармакокинетической кривой соответственно изучаемого препарата и препарата сравнения в пределах от нуля до бесконечности. Вычисление полной площади (АиС), которая представляет собой сумму площади, рассчитанной от нуля до момента отбора последней пробы, (АиСо^). и остаточной площади, рассчитанной от момента

отбора последней пробы до бесконечности, (ЛиС(.„),

АиС = АиОм + АиС^«,, всегда содержит элемент экстраполяции. В связи с этим вместо f для оценки степени всасывания часто используется Р - отношение соответствующих АиСь при условии, что длительность периода наблюдения достаточно велика. Обычно рекомендуется выбрать интервал 0 - Ь так, чтобы отношение АиС^/АиС превышало 80%. Выбор периода наблюдения базируется на анализе усредненных фармако-кинетических кривых. Понятно, что у отдельных испытуемых, вследствие индивидуальных особенностей фармакокипетики, выбранный период может оказаться излишне большим или, наоборот, слишком малым, например, вследствие задержки во всасывании лекарственного вещества, которая может быть неодинаковой для изучаемого препарата и препарата сравнения. Возможные последствия этого проанализированы нами на примере изучения биодоступности норфлоксацина у 18 больных.

Для сопоставления двух вариантов оценки относительной степени всасывания норфлоксацина был проведен корреляционный анализ, который выявил наличие четкой корреляции между I и Г (г = 0,970, рис. 4а).

1

Рис.4. Корреляция между оценками относительной степени всасывания, полученными разными методами ({ И f'): а - с учетом "выпадающих" больных (выделены крестами), в - без учета "выпадающих" больных.

Вместе с тем, в отдельных случаях несоответствие оценок степени всасывания, отражаемых разностью Г-Г,

отнесенной к {, (ДГ, О, оказалось весьма существенным. Так, если в среднем абсолютная величина ЬЯ/Ъ не превышала 5?о, то индивидуальные значения А(/{ у больных N0. 2, 5, 10, 12, 13, 18 достигали 7-23%. Не случайно, коэффициент корреляции между Г и Г, рассчитанный по данным фармакокинетики норфлоксацина у остальных 12 больных без учета перечисленных шести оказалась выше (г = 0,998, рис. 4в), чем при п = 18.

Одной из наиболее вероятных причин выявленных отклонений е от f может быть то, что после приема одного из препаратов величина АиС( сильнее отличается от соответствующего значения АиС, чем для другого препарата, т. с. разность | А1]С1(А)/АиС(А)]

[АиС1(В)/АиС(В)| = Л(АиС1/АиС) отлична от нуля.

Анализ абсолютных значений Д(АиСк/АиС) позволил отмстить, что они наиболее велики именно у больных N0. 2, 5, 10, 12, 13, 18, для которых были характерны "выпадающие"

значения &{/{ (выделены па рис. 4а). Так, если в среднем

абсолютная величина Д(АиС1/АиС) не превышала 0,04, то у перечисленных 6 больных она достигала 0,05 - 0,17. В то же время, степень отклонения АиС1 от АиС практически не отражалась на качестве оценки ( по Г, если значения АиС^/АиС для препаратов А и В были близкими, т. е. при

малых А(АиС,/АиС). Это предположение подтверждено

наличием корреляции между (Г - {') /( и Д(АиС1 /АиС) для

6 больных с наиболее высокими значениями Д(АиС1/АиС).

С другой стороны, несовпадение оценок Г и Г может быть обусловлено сдвигом фармакокипетической кривой для препарата А относительно таковой для препарата В во времени, т. е. различиями в То(А) и Т()(В), что и было

подтверждено наличием взаимосвязи между ^ - Г)/7 и ДТ0 = ТП(А) - Т0(В). Одновременный учет обоих факторов -

Д(АиС( /АиС) и ДТ0, оказывающих влияние на (Г - (')/(, с помощью множественного корреляционного анализа позволил повысить надежность прогнозирования f но Г.

Таким образом, отклонение Г от С, обусловленное различиями в Т0(А) и Т0(В) или в отношениях АиС( /АиС

для изучаемых препаратов, можно свести к минимуму путем коррекции наблюдаемых значений {', с помощью множественного корреляционного анализа.

3.2. Параметры скорости всасывания. Традиционно для оценки скорости всасывания используются максимальная концентрация Стах и момент ее достижения 1тах. Оба параметра связаны с константой всасывания ка, характеризующей процесс всасывания не простой пропорциональностью, а сложной взаимосвязью. Поэтому они достаточно грубо отражают ка, а оценка скорости всасывания по Стах и 1тах является очень приблизительной. В последнее время был предложен новый параметр скорости всасывания (Стах/АиС). Для сравнения оценок скорости всасывания по Стах/АиС и <;тах и для того, чтобы выяснить, насколько они взаимозаменяемы, был проведен корреляционный анализ взаимосвязей между параметрами Стах/АиС и 1/Чтах, имеющими одинаковую размерность (ч 1 ), для 6

больных с "выпадающими" значениями А{/( (см. выше). При этом были использованы данные по обоим препаратам (А и В). Значение коэффициента корреляции между Стах/АиС и 1/1:тах (0,798) оказалось выше, чем для всех 18 больных (0,636). Возможной причиной этого может быть неточность оценки параметра 1тах, которая и побудила предложить новый параметр для характеристики скорости всасывания.

4. Роль регламента Фармакокинетических

исследований при оценке биодоступности лекарственных средств (на примере фторхинолопов)

В предыдущем разделе была проанализирована взаимосвязь между оценкой параметров биодостунности и регламентом фармакокинетического исследования. Выбор последнего в значительной мере определяется фармако-кинетическими свойствами лекарственного средства, что и было продемонстрировано па примере фармакокинетического изучения препаратов группы фторхинолопов (норфлоксацип, ципрофлоксацин и пефлоксацин), которые производятся многими фирмами и поэтому часто являются объектом исследований биодостунности. В связи с том, что изученные препараты каждого из перечисленных фторхинолопов в фармакокинетическом отношении оказались одинаковыми (биоэквивалентными), описываемые ниже особенности

фармакокинстики иорфлоксацина, ципрофлоксаципа и пефлоксаципа иллюстрируются даимыми только по соответствующим препаратам сравнения.

Усредненные фармакокипетичоские профили, полученные после перорального введения препаратов, представлены на рис. 5. Как видно на рис. 5а, пефлоксацин и норфлоксацин появляются в крови раньше (в среднем через 15 мин), чем ципрофлоксапин (в среднем через 35 мин), что указывает на необходимость более раннего начала отбора проб для определения концентрации первых двух препаратов. Соответственно и максимальные концентрации пефлоксаципа и иорфлоксацина в крови достигаются быстрее (в среднем через 1,3 и 1,6 ч), чем для ципро-флоксацина (в среднем через 1,8 ч). Величина Стах после приема иорфлоксацина (в среднем 1,1 мкг/мл) в два раза ниже, чем для ципрофлоксаципа (в среднем 2,4 мкг/мл) и более чем в пять раз ниже, чем для пефлоксаципа (в среднем 5,7 мкг/мл). Максимум наиболее четко выражен у пефлоксаципа и наиболее размыт у иорфлоксацина. Как видно на рис. 5в, после достижения максимальных концентраций процесс снижения уровней иорфлоксацина и ципрофлоксаципа описывается моноэкспонентой (данные "концентрация - время" спрямляются в полулогарифмических координатах), а пефлоксаципа - биэкспо-нентой. Средние значения Т) 2 в случае иорфлоксацина и ципрофлоксаципа были примерно равными (3,7 и 3,2 ч, соответственно); а в случае пефлоксаципа - примерно вдвое выше (8,0 ч).

В связи с отмеченными различиями в длительности циркуляции фторхинолонов в системном кровотоке очевидно, что для корректной оценки Т( а следовательно, АиС, необходимо более длительное наблюдение за концентрацией пефлоксаципа, чем за уровнями иорфлоксацина и ципрофлоксацина. О том же свидетельствует и сопоставление АиС, с соответствующими значениями А11С.

Т. h

Т. h

* Norfloxacin * Ciprofloxacin A Pefloxacin

Рис.5. Усредненные фармакокинетические профили

фторхинолонов в плазме крови: а - натуральные значения концентраций, в - логарифмические значения.

Болыюй №3

i, hour

Больной №8

012340678 t, hour

X Microflox_Q Ciprobay

Pnr.ft. Индивидуальные фармакокипетичсскис профили ципрофлоксацина в плазме крови больных.

Регламент эксперимента может оказывать большое влияние на оценку AUC, т.к. от длительности наблюдения за

концентрацией препарата зависит надежность оценки AUC(.„,

по уравнению AUCt.« = Ct х Ti .■i /0,693, где Ct -концентрация препарата в момент отбора последней пробы крови (t). При преждевременном прекращении наблюдения

величина Т] 2> а следовательно, и AUCt.M занижаются, что, в свою очередь, приводит к занижению AUC. Это было проиллюстрировано на примере анализа усредненной фармакокинетической кривой пефлоксаципа. Как показали расчеты, если бы наблюдение за концентрацией хинолона было прервано через 8 ч, оценка Т) .7 оказалась бы заниженной на 8%: при 8-часовом периоде наблюдения величина Tj/2 составляла 7,67 ч против 8,35 ч при 24-часовом периоде. В результате соответствующее значение

AUCg.„ составило бы 28,0 против 30,5 мкг*ч/мл при 24-часовом наблюдении. Таким образом, 8%-нос занижение величины Т1 /2, полученное при прекращении наблюдения через 8 ч, сопровождается 4%-ным занижением AUC (57,6 против 60,0 мкгхч/ мл).

5. Оценка индивидуальной вариабельности (Ьармакокинетики изученных Аторхинолонов

Выраженная межиндивидуальная вариабельность фармакокинетики изученных фторхинолонов может быть проиллюстрирована на примере ципрофлоксацина (рис. 6). Как видно на рисунке, индивидуальные фармакокинетические профили ципрофлоксацина у больных No. 3 и 8 отличались не только в количественном, но и в качественном отношении.

Анализ индивидуальных значений фармакокинети-ческих параметров норфлоксацина, ципрофлоксацина и нефлоксацина (рис. 7) позволил отметить наибольшую вариабельность параметров Tq, tmax, AUCt, AUC, Cmax, Tj 2 и значительно меньшую вариабельность параметров Cmax /AUC и MRT. Примечательно, что коэффициенты вариации параметра Cmax /AUC для всех трех изученных фторхинолонов были в 2 - 3 раза ниже соответствующих коэффициентов вариации параметра tmax, а коэффициенты вариации параметра Tj/2 (также для всех трех препаратов) -в среднем в 3 раза выше соответствующих коэффициентов вариации параметра MRT (оба параметра характеризуют

Норфлоксацин ОЦипрофлоксацин ■ Пефлоксацин

ч-N

s

s s

03 К

а

аз а

2 н 33 и S

я s

•е-

-в*

m

о «

U Cmax AUCsh AUCCmax/AUC Tie MRT

Рис. 7. Межиндивидуальная вариабельность параметров фармакокинетики фторхинолонов

скорость элиминации). Таким образом, параметр Cmax/AUC является более устойчивой характеристикой скорости всасывания, чем традиционно применяемый параметр tmax, а параметр MRT - более точно оценивает длительность пребывания препарата в организме, чем Т^ 2-

Несмотря на отмеченнную ранее выраженную межиндивидуальную вариабельность фармакокинетических профилей у разных больных, соответствующие внутрииндивидуальпые различия - после приема препаратов А и В у одного и того же больного - были относительно невелики (см. рис. 6). Не случайно, параметры f", f' и f, отражающие соответственно относительные значения Cmax jf" = Стах (А)/Стах (В)), AUCt [f* = AUCt(A)/AUCt (В)] и AUC |f = AUC (A)/AUC (В)], характеризовались значительно меньшей (в 2 - 4 раза) вариабельностью (см. рис. 8).

Таким образом, несмотря па высокую межиндивидуальную вариабельность и соответствующий большой интервал колебаний индивидуальных значений параметров Cmax, AUCt и AUC, их отношения (f", f' и f, соответственно) колеблются в значительно меньших пределах. В результате f", f' или f достаточно надежно характеризуют биодоступность лекарственного средства па относительно небольшом числе испытуемых. Это обстоятельство лишний раз подчеркивает необходимость перекрестных фармакокинетических исследований, позволяющие оперировать отпосителышми параметрами.

<ч

I

К

!=Г

Л

Я

О,

л

в

Ея

а;

—г

5

•е-

Г5 О

100 80 60 40 20 0

НОР

ЦИПРО

ПЕФЛО

Рис. 8. Вариабельность параметра А11С £ фторхинолонов, оцененная по относительным (Г) и абсолютным (АУО) значениям

выводы

1. Разработан простой и доступный аналитический метод количественного определения бифоназола в биологическом материале, позволивший проследить за динамикой изменения его концентрации и течении 48 ч после аппликации 1% кремов бифоназола и сравнить их фармакокинетические свойства.

2. Установлено, что несовпадение оценок степени всасывания, полученных разными методами (но Г п f), может быть обусловлено различиями в отношениях AUCt/AUC для изучаемых препаратов или сдвигом (ЛТ0) фармакокинетической кривой для препарата А относительно таковой для препарата В во времени.

3. Регламент фармакокипетического эксперимента оказывает влияние на надежность оценки периода

полувыведения (Т( 2). остаточной площади (AUCt„), а следовательно - полной площади под кривой "концентрация -время" (AUC).

4. Использование отношения максимальной концентрации (Стах) к AUC (Clnax/AUC) обеспечивает более надежную оценку скорости всасывания препарата, чем показатель времени достижения максимальной концентрации (tmax)> а применение параметра среднего времени удержания (MRT) вместо Tt 2 предпочтительнее для точной оценки скорости элиминации.

5. Негативное влияние межиидипидуальной вариабельности на оценку биодоступности можно снизить, если оперировать не абсолютными параметрами (Сшах, AUC( и AUC), а соответствующими относительными (f", f' и f), т. к. вариабельность первых выше вариабельности вторых. Это обстоятельство диктует необходимость проведения перекрестных испытаний при оценке биодоступности препаратов.

ПУБЛИКАЦИИ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Каденаци И.Б., Агаиитова И.В., Шустова Л.В., Салиб И., Домбровский B.C., Гагаепа Е.В., Кулешова Е.Э., Арзамасцев А.П., Фирсов A.A. Определение бифоназола методом ВЭЖХ при фармакокинетических исследованиях. // Антибиотики и химиотерапия, 1996, т. 41, No. 5, с.19 -24.

-282. Салиб И., Каденапи И.Б., Шустова Л.В., Фирсов A.A. Факторы влияющие tía оценку степени всасывания лекарственного средства при неодинаковой скорости всасывания. ,/ / Рукопись депонирована в ГЦНМБ No. Д-25389, 14.04.1997., Москва 1997, 14 стр.