Автореферат и диссертация по фармакологии (15.00.02) на тему:Применение метода высокоэффективной жидкостной хроматографии в анализе фторхинолонов

На правах рукописи

РГБ ОД

15 ИЮЛ 2002

БРКИЧ ГАЛИНА ЭДУАРДОВНА

ПРИМЕНЕНИЕ МЕТОДА ВЫСОКОЭФФЕКТИВНОЙ ЖИДКОСТНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ В АНАЛИЗЕ ФТОРХИНОЛОНОВ

15.00.02 - фармацевтическая химия, фармакогнозия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата фармацевтических наук

Москва 2002

Работа выполнена в Московской медицинской академии имени И.М. Сеченова

НАУЧНЫЙ РУКОВОДИТЕЛЬ:

Академик РАМН, доктор фармацевтических наук, профессор

А.П. Арзамасцев

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ: доктор фармацевтических наук доктор фармацевтических наук, профессор

Т.Н.Боковнкова

А.С. Берлянд

ВЕДУЩЕЕ УЧРЕЖДЕНИЕ: Центр по химии лекарственных средств -Всероссийский научно-исследовательский химико-фармацевтическим институт (ЦХЛС-ВНИХФИ)

Зашита состоится "_" 2002 г. в_час на заседании диссертационного совета Д.208.040.09 в Московской медицинской академии им. И.М. Сеченова (121019.Москва, Никитский бульвар, д.13). С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ММА им. И.М. Сеченова по адресу: Москва, Зубовская площадь д. 1

Автореферат разослан "_"_2002 г.

Ученый секретарь диссертационного совета

доктор фармацевтических наук, доцент Н.П. Садчикова

о ^з. о

л

Актуальность темы.

В-настоящее время фторхинолоны находят все более широкое применение в медицинской практике. Широкий антибактериальный спектр, высокая эффективность при пероралыюм введении, возможность парентерального введения и относительно низкая стоимость этих лекарственных средств в большинстве случаев делает их препаратами выбора при лечении многих инфекционных заболеваний.Однако их физико-химические свойства изучены недостаточно. То же самое относится и к методам их химического и физико-химического анализа и. в частности, высокоэффективной жидкостной (ВЭЖХ) и тонкослойной хроматографии. Имеется недостаточно сведений о примесях в этих веществах н о методиках их определения. Отсутствуют надежные и простые методики определения производных фторхинолонов в сложных матрицах, содержащих белки, углеводы и другие природные соединения.Поэтому дальнейшее изучение физико-химических свойств фторхинолонов, а также разработка новых и совершенствование существующих методов их анализа представляется целесообразным.

Цель и основные задачи исследования.

Основной целью настоящего исследования являлась разработка и модифицирование методов анализа пефлоксацина. ципрофлоксацина. нор-флоксацина и родственных соединений в различных матрицах.

Для достижения поставленной цели было необходимо решить следующие задачи:

- изучить хроматографическое поведение фторхинолонов в условиях обращеннофазовой и прямо-фазовой ВЭЖХ с использованием колонок с различными сорбентами:

- оптимизировать условия определения фторхинолонов методом ВЭЖХ в субстанциях, лекарственных формах, сыворотке крови, а также многокомпонентных растворах, содержащих высокомолекулярные соединения;

- разработать метод анализа фторхижшопов в составе

липосом.

Методы исследования В работе использованы хроматографические и спектрофотометриче-ские методы исследования, а также математические методы статистической обработки и анализа экспериментальных данных.

Научная новизна.

Разработана унифицированная методика определения ципрофлок-сацина. норфлоксашша и пефлоксашша методом ВЭЖХ. Повышен порог чувствительности при определении примесей в ципрофлоксацине при использовании трилона Б в качестве дополнительного компонента подвижной фазы. Разработана методика с использованием ВЭЖХ на прямофазнои колонке, пригодная, в частности, для определения содержания циироф-локсацина в вытяжке из смазки для протезов кровеносных сосудов. Разработана простая и надежная методика определения пефлоксацина и ии-профлоксацина в сыворотке крови с помощью обрашенно-фазовой ВЭЖХ.

Разработан метод эксклюзионной хроматографии в сочетании с прямой спектрофотометриен для анализа пефлоксацина в липосомах. Оценена валидность предложенных методов и пригодность использованных хроматографических систем.

Практическая значимость работы

Методика количественного определения фторхпнолонов в сыворотке крови использована для изучения фармакокинетических свойств циироф-локсацина и пефлоксацина у человека.

Анализ пефлоксацина в липосомах позволил выявить липосомальные формы пефлоксацина с высоким содержанием связанной формы лекарственного вещества.

Апробация работы.

Основные результаты работы доложены на заседании кафедры фармацевтической химии ММА им. И.М. Сеченова (Москва. 1998 г) и на VII Российском национальном конгрессе "Человек и лекарство" (Москва. 2000).

Внедренне в практику.

Методика количественного определения фторхпнолонов в сыворотке крови внедрена в Государственном Научном Центре прикладной микробиологии Минздрава России. ВНИИ сельскохозяйственной биотехнологии.

ИЛЦ"ПРОДЭКС".

Публикация результатов исследования.

По материалам диссертации опубликовано 3 печатные работы.

Положения, выдвигаемые на защиту

Результаты исследований по разработке и обоснованию унифицированной ВЭЖХ методики определения фторхпнолонов и их примесей: новая методика на основе прямо-фазовой ВЭЖХ для определения фторхпнолонов в составе смазки протезов кровеносных сосудов и других аналогичных изделий; результаты оптимизации пробоподготовки для методики определения фторхпнолонов в сыворотки крови: новый метод определения степени включения фторхпнолонов в лшюсомы.

Связь исследований с проблемным планом фармацевтических наук.

Диссертационная работа выполнена в соответствии с комплексной темой кафедры фармацевтической химии ММА им. И.М. Сеченова "Совершенствование контроля качества лекарственных средств (фармацевтические и экологические аспекты)", номер Государственной регистрации 01970007161.

Объем и структура диссертации.

Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы. 4-х глав экспериментальных исследований, общих выводов, списка литературы. Содержит 175 страниц печатного текста, 22 таблицы. 36 рисунков. Библиографический указатель включает 119 источников литературы,106 из которых на иностранных языках.

Во введении раскрыта актуальность темы, определены цели и задачи

исследования, сформулированы научная новизна и практическая значимость работы.

В первой главе (литературном обзоре) рассмотрено строение современных фторхпнолонов. физико-химические свойства и важнейшие методы их синтеза и анализа.

Во второй главе приведены результаты исследования зависимости хроматографического поведения некоторых фторхинолонов от сосчава подвижной фазы: оптимизированы условия обращенно-фазовои В')ЖХ л.1я количественного и качественного анализа фторхинолонов и их примесей.

Третья глава посвящена разработке метода прямо-фазовой ВЭЖХ л.iя определения цнпрофлоксацина в сложных матрицах, содержащих белки и углеводы.

В четвертой главе разработан простой и надежный метод определения цнпрофлоксацина и пефлоксацина в сыворотке крови: приведены результаты исследования фармакокннетики лекарственных средств, содержащих данные фторхинолоны. предложенным методом и сравнение полученных результатов с литературными данными.

В пятой главе предложен метод эксклюзноштй хроматографии для анализа липосомальных форм лекарственных веществ. Проведено исследование степени включения одного из фторхинолонов в лнпосомы. приготовленные двумя различными способами.

Заключение и основные выводы завершают диссертационную рабоп. СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Согласно требованиям современной фармацевтической практики, изложенным в частности в Фармакопее США (USP 24 ."'Validation of compensai methods") и в правилах GMP [21CFR211.194(а>] необходимо, чтобы методы анализа, которые, используются для оценки соответствия фармацевтических продуктов нормативной документации, удовлетворяли стандартам точности и достоверности, которые подтверждают валидность ме-тода.Ниже перечислены основные общие параметры валидации аналитического метода:

1. Точность

2. Воспроизводимость

3. Специфичность

4. Предел обнаружения

5. Предел количественного определения

6. Линейная зависимость рассчитываемого параметра

7. Межлабораторная воспроизводимость 8.1'обастность

9. Пригодность хроматографического оборудования

Этот подход был использован для оценки разработанных методов на основе ВЭЖХ и эксклюзионной хроматографии низкого давления. I. Оптимизация методики определения чипрофлоксацина н пефлокса-инна в условиях обращеино-фазовой хроматографии.

В настоящее время для определения фторхннолонов с помощью об-ращенно-фазовой ВЭЖХ в нормативной документации, например в Британской Фармакопее н Фармакопее США (USP-24) применяется методика, которая предполагает использование в качестве подвижной фазы смеси аиетонитрил/0.05 М триэтиламмоний фосфат (рН 3.2). Однако в литературе приводятся и другие методики анализа. Для разработки аналитических методов, используемых нами в последующей работе, были определены эффективности пиков ципрофлоксацнна и пефлоксацина (с применением стандартных растворов) при использовании различных подвижных фаз. Концентрация фторхннолонов в пробах, приготовленных с использованием 1% раствора уксусной кислоты, составляла от 10 мкг/мл до 100 мкг/мл при постоянном объеме вводимой пробы.

Основные результаты этих исследований представлены в таблице 1. Эффективность рассчитывали по площадям м высотам пиков по следующей формуле:

N = 5.54 (60 tR H/S)2 (1), где

N - эффективность (число теоретических тарелок) Н - высота хроматографического пика (мкВ); S - площадь этого же пика (мкВс): tR - время удерживания (мин).

Из табл. 1 следует, что эффективность колонки, а также коэффициент емкости (к') и селективность исследованных фторхннолонов. в значительной степени зависят от выбора органического растворителя и присутствия

трнэтиламина в подвижной фазе. Значения коэффшшеша емкие!и. близкие к оптимальным (в интервале от 3 до 10). наблюдаются в системах 1 II 5. Наибольшая селективностьнаблюдаекя для спаемы I.

Таблица 1.

Хромятографпческое поведение цппрофлоксаиина (I) н пефлокешш-па (II) при анализе их стандартных растворов на колонке 4.6 х 2 50 мм, Мик1ео$Н-Сш, 5и (скорость потока 1,5 мл/мнн, 10~2Л мин) с ис-

N Состав подвижной фазы фгорхинолон £ и Л У- 1 £ С о г; V и к' Средняя эффективное™ (число теоретических тарелок) при концентрации фторхннолонов в пробах:

Ю м кг/мл 50 мкг'мл 100 мкг/мл

1 20% ацетонитрнл. 0.05 М триэтиламмо-няЛно-фосфатныЛ б\фер (рН 3.2) 1 8.8 1.11 3,0 3360 3060 2970

II 7.9 2.59 3330 2980 2960

2 40% метанол. 0.05 М триэтнламмо-ниПнофосфатмый буфер (рН 3.2) 1 6.2 1.09 1,82 900 1020 1000

II 5.7 1.59 910 ЮОО 890

3 20% ацетонитрил, 0.05 М аммопмПно-фосфатный буфер (рП 3.2)' 1 5.5 1.1 1.5 2040 1960 2030

II 5.0 1.27 1840 1920 2310

4 Смесь вода/уксусная кислота 60:40 1 3.6 1.03 0,64 620 1830 1780

II 3.5 0,59 1170 1600 1560

5 Смесь вода/уксусная кислота 75:25 1 7.5 0.96 2,41 1460 1550 1630

II 7.8 2,55 1480 1630 1650

Рис. 1. Хроматофамма образца цнпрофлоксацина на колонке 4.6 х 2 50 мм. ЫиМеозП-Сц. 5и. скорость потока 1.5 мл/мин. А -фармакопейная подвижная фаза (Система 1 в табл. I); Б - с добавлением в подвижную фазу 0,1 г/л трнлона Б

ч

Кроме тою. в случае использования подвижных фаз. не содержащих триэтнламнна. или содержащих в качестве ор|эпическою компонета меганол или уксусную кислоту вместо анетоннтрила. наб.тю-дается весьма существенное снижение эффективности хроманнрафнческо-ю разделения. Таким образом, применяемая для анализа фюрмшолопов по нормашвной документации методика (система 1). по-видимому, явля-е1ся ошимальноП среди методик, представленных в таблице 1. В ю же время, лаже при использовании такой методики, эффективности не слишком пысокн и значительно ниже эффективности этой же колонки по нафталину (порядка 7000 теоретических тарелок). Пик целевого продукта несимметричен и имеет пологий спад с фактором асснметрин (на 10% высоты) от 2.1 до 2.5. Нами была исследована зависимость Асимметрии пика от природы и концентрации Нон-парных реагентов (гндроксид тетрабутнлам-нония и додецилсульфат натрия). Оказалось, что хотя времена удерживания при этом изменялись, асимметрия и ширина пика не уменьшались. Была также проверена возможность улучшения формы пика путем добавления в подвижную фазу небольших количеств трнлона Б. поскольку известно. что фторхинолоны могут образовывать комплексы с нонами металлов, а эю ведег к увеличению ширины и асимметрии пиков. При этом была использована подвижная фаза I (см. таблицу 1). содержащая дополнительно 0,1 г/л трнлона Б. С использованием этой подвижной фазы были проанализированы некоторые лекарственные формы цнпрофлоксацина.

Хроматограммы цнпрофлоксацина без добавления и с добавлением трнлона Б в подвижную фазу представлены на рис. 1.

Хотя увеличения эффективности, или уменьшения асимметрии пика основною вещества при добавлении в подвижную фазу трнлона Б не наблюдалось, было отмечено заметное уменьшение ширины пика примеси с большим временем удерживания. Благодаря этому чувствительность определения примесей была повышена, что позволило количественно определить содержание примеси со временем удерживания большим, чем у пика

Ill

ципрофлоксацина. в одной из лекарственных форм пнирофлоксаиииа (таблетки "Ципролет 250 мг" (Dr. Reddv's Laboratories Ltd. Индия)).

Содержание этой примеси, рассчитанное но ошошеншо площади пика примеси к плошали пика шшрофлоксаинна. для исследованных лекарственных форм составило 0.05 - 0.15 %.

Таблица 2.

Данные статистической обработки результатов определения основного вещества п примесей в некоторых образцах таблеюк

цнпрофлоксацниа (п = 5. Р = 95 %. t (f.l') = 2.78)

Образец Содержание ципрофлоксацина. г Содержание примеси 1. % Содержание примеси II. % S Е %

Таблетки "Ципролет 250" (Dr. Reildr's Labs. Ltd., Пиния)

Сер. IC200806 0.243 - - 1.5 10" 3.9 10 ' 1.6

- 0.941 1.3 10 * 0.036 3.8

- - 0.123 3.5 10" 5.9 10"' 4.8

Сер. 2C200II7 0.264 - - 2.9 10 " 5.4 10"' 2.0

0.591 - 2.3 Ю-" 0.015 2.5

- - 0.085 1.3 10" 3.6 10"* 4.2

Сер. 2С200677 0.261 - - 8.9 10" 3.0 10 ' 1.1

- 0.65 - 3.3 Ю"4 0.018 2.8

- - 0.091 3.0 10"' 5.5 I0J 0.6

TaG.neiKii "1'ецнлро 500" (Ауробннло Фарма Лтд, Индия)

Сер. E9I0 0.509 - - 9.0 10" 9.5 10"' 1.9

- 0.132 - 2.1 10" 4.6 10"' 3.5

Сер. E9I7 0.499 - - 3.6 105 6.0 10"' 1.2

- 0.127 - 2.8 10" 5.3 10"' 4.2

Сер. E9I8 0.495 - - 7.0 10" 8.4 10 ' 1.7

- 0.130 - 1.6 10' 4.0 10 ' 3.8

В таблице 2 представлены данные статистической обработки результатов определения основного вещества и примесей в нескольких образцах таблеток ципрофлоксацина. Из таблицы следует, что процентное содержание примесей определяется с погрешностью, не превышающей 6 %. даже при их содержании порядка 0,1 %.

2. Разработка метода определения ципрофлоксацина в сложных матрицах, содержащих белки и углеводы.

Ципрофлоксацин в составе различных смазок и гелей применяют для сниження бактериального загрязнения при использовании в медицинской

It

практике катетеров, протезов кровеносных сосудов и некоторых других специальных изделий.

Многочисленные компоненты таких сложных матриц имеют близкие к фторхинолонам времена удерживания п условиях обращенно-фазовой хроматографии и тем самым препятствуют как качественному, так и количественному определению этих лекарственных веществ. Тем не менее, по литературным данным для фторхинолонов практически неизвестно применение для их анализа других колонок, кроме обращенно-фазовых. 'Зго обусловлено тем. что обычно вещества, имеющие при обращенно-фазовой ВЭЖХ средние времена удерживания при умеренных содержаниях органического компонента в подвижной фазе, не растворяются в безводных растворителях и не удерживаются на прямо-фазных колонках в водных подвижных фазах. Исследование широкого спектра прямо-фазных сорбентов показало, что фторхинолоны практически не удерживаются на колонках. заполненных немодифнцнрованным силикагслем и силнкагелем с ко-валентно связанными Nib- и CN-группами, при использовании в качестве подвижной фазы водного раствора фосфорной кислоты (10 мМ). Однако было обнаружено, что фторхинолоны на колонке с сорбентом "Диасорб-130 ДИОЛ" в тех же условиях дают относительно широкие (эффективность по пику фторхшюлона около 250 теоретических тарелок) пики с временами удерживания около 4 мни (коэффициент емкости к'=0.59) при скорости потока 1 мл/мин (to=2,49 мин). Различные фторхинолоны при этом также имеют небольшие и близкие друг к другу времена удерживания, что делает эту методику непригодной для идентификации и определения примесей фторхинолонов. В обычных случаях данная методика количественного определения не имеет преимуществ по сравнению с более распространенными методами. Однако оказалось, что поглощающие при 278 им (длина волны детекции) компоненты сложной матрицы практически не удерживаются на колонке и элюируются в мертвом объеме вводимой пробы.

Отсутствие сорбции высокомолекулярных компонентов смеси позволяет не только получить достаточное разрешение с пиком фторхшюлона

(^>1.5), но и продлевает срок службы хроматографической колонки. Благодаря этому данный метод имеет определенные преимущества и позволяет количественно определять фторхинолоны в присутствии белков и углеводов. Для разработки данной методики коллнчественного анализа ципрофлоксацина были построены калибровочные графики в присутствии гепарина и альбумина. Концентрация ципрофлоксацина варьировалась в пределах 0.1 - 1 мг/мл. Концентрации гепарина и альбумина составляли 5 и 10 мг/мл, соответственно.

Пример хроматограммы ципрофлоксацина. выполненной по указанной методике, представлен на рисунке 2. Результаты статистической обработки калибровочных графиков методом наименьших квадратов представлены в таблице 3.

Рис. 2. Хроматограммы ципрофлоксацина с использованием колонки, заполненной сорбентом ''Силасорб 130 Диод". А - чистый ципрофлоксацин; Б - ципрофлоксацин с 10 мг/мл сывороточного альбумина. Подвижная фаза - водный раствор фосфорной кислоты (10 мМ). скорость потока-1 мл/мин.

Таблица 3.

Данные статистической обработки результатов, полученных при построении калибровочных графиков для определения иипрофлоксацнна в присутствии гепарина н альбумина (Г = 9, Р=95%, I (Р,0 = 2,26)

Проба Ь а дь Да 5 2 Г

Чистый ципрофлоксацип 1.53 10" -2757 7.5 10* 4.6 10* 1.19 10" 0.998

Ципрофлоксацин с альбумином (10 мг/мл) 1.51 10" -2700 2.90 10" 1.79 Ю4 1.76 Ю* 0.999

Ципрофлоксацин с гепарином (5 мг/мл) 1.51 10" -1616 5.82 10' 3.57 Ю4 7.07 10" 0.999

Из таблицы 3 видно, что параметры статистической обработки для чистого иипрофлоксацнна и для иипрофлоксацнна в присутствии мешающих веществ практически одинаковы. Видно, что во всех трех случаях величины Да превышают величины а. Поэтому можно принять, что прямые с угловым коэффициентом Ь проходят через начало координат. Средний коэффициент вариации калибровочных графиков не превышал 2 %. Результаты исследований показали, что разработанная методика пригодна для определения шшрофлоксацина в присутствии гепарина и альбумина и. в частности. позволяет простым и быстрым методом определять ципрофлоксацип в растворах, полученных при экстракции искусственных кровеносных сосудов.

3. Определение цнпрофлоксацнна н пефлоксацнна в сыворотке крови.

Проблема определения шшрофлоксацина и пефлоксацнна в сыворотке крови связана с тем. что многочисленные компоненты сыворотки крови имеют широкий спектр времен удерживания и большой диапазон спектров

поглощения в УФ и видимой областях. В результате невозможно добиться разрешения анализируемых соединений с компонентами сыворотки крови ни по времени удерживания, ни по длине волны детекшш. Решение этой проблемы заключается с одной стороны в предварительной очистке пробы от мешающих компонентов, а с другой стороны в использовании селективных детекторов с повышенной чувствительностью к анализируемым соединениям. Определение фторхинолонов в сыворотке крови с помощью ВЭЖХ по методикам, известным из литературы, использует только первый подход и требует ряда сложных и длительных операции по подготовке пробы. В то же время, чувствительность флуориметрического детектирования фторхинолонов позволяет анализировать их в концентрациях, существенно более низких, чем при УФ детектировании, а его селективность существенно снижаегт требования к очистке пробы от компонентов сыворотки крови. Поэтому был предложен относительно простой метод анализа, заключающийся в том, что сыворотку крови депротеинизнру-ют двойным объемом ацетонитрила, образующуюся суспензию центрифугируют, а супернатант подвергают хромагографированню с использованием ВЭЖХ. Однако при проверке этой методики оказалось, что пробы фторхинолонов после обработки ацетонитрилом дают пики, плошадь которых значительно меньше, чем площади пиков в водном растворе той же концентрации, и это изменение площади практически не зависит от концентрации аналитов в пробе и вида детектора (флуориметрический или УФ). Аналогичный эффект наблюдался при анализе фторхинолонов в контрольном эксперименте, при котором в пробе отсутствовала сыворотка крови. Это позволило исключить наиболее вероятную версию, объясняющую уменьшение площадей ликов соосаждением фторхинолонов при обработке ацетонитрилом вместе с белками сыворотки крови. Для изучения возможного механизма этого явления нами была изучена зависимость площадей пиков фторхинолонов от соотношения ацетонитрил-1% водный раствор уксусной кислоты во вводимой пробе. Результаты изучения этой зависимости на примере пефлоксацина представлены на рисунке 3. Видно.

что кривая, представленная на рисунке 3. имеет два характерных линейных участка с изломом при концентрации ацетоннтрнла в пробе равной приблизительно 25%. При содержании ацетоннтрнла в пробе меньше 25% площадь пика анализируемого вещества близка к площади пика в 1% водном растворе уксусной кислоты. При высоком содержании ацетоннтрнла в пробе наблюдается резкое уменьшение площади основного пика, а при увеличении концентрации ацетоннтрнла до 66% площадь пика основного вещества составляет примерно 50 % от исходной. На рисунке 4 приведены сравнительные хроматограммы анализа пефлоксашша при низком и высоком содержании ацетоннтрнла в пробе. Видно, что на хроматограм-мах с высоким содержанием ацетоннтрнла перед пиком основного вещества наблюдаются два пика: асснметричный пик с временем удерживания равным ^ и размытый пик с временем удерживания между Ь и основным веществом. Сумма площадей трех пиков, наблюдаемых на рисунке 4-Б. приблизительно равна площади пика основного вещества в 1% водном растворе уксусной кислоты. Вопрос о причинах подобного поведения фторхинолонов при проведении ВЭЖХ представляет определенный ¡»Перес.

Обычно, когда концентрация органического растворителя в пробе превышает концентрацию в подвижной фазе, наблюдается уширение пика анализируемого вещества. При значительном превышении концентрации органического компонента в пробе может наблюдаться элюция всего вещества или его части в "мертвом" объеме. В рассматриваемом случае это может объяснить появление только первого из дополнительных пиков. Кроме того, такие эффекты, как правило, наблюдаются при больших объемах ¡¡робы.

В нашем случае оказалось, что уменьшение площади пика основного вещества не зависит от объема пробы, а время удерживания второго дополнительного пика не соответствует "мертвому" объему хроматографиче-ской колонки.

Ацетонитрил, %

Рис. 3. График зависимости отношения площади пика пефлоксацина в пробе к плошади пика в 1% водном растворе уксусной кислоты от концентрации ацетонитрила в пробе.

Рис. 4. Хроматограммы растворов пефлоксацина (10 мг/мл) в смесях ацетонитрил - 1% водный раствор уксусной кислоты состава 1:9 (А) и 7:3 (Б) на колонке 4.6 х 2 50 мм, Nukleosil-C|8. 5u, скорость потока 1.5 мл/мин, фармакопейная подвижная фаза (Система 1 в табл. 1)

Возможно, что этот эффект обусловлен связыванием фторхинолона с сорбентом по двум различным механизмам. Однако более вероятным объяснением представляется образование дополнительной равновесной формы фюрхинолона в присутствии высокой концентрации аце-тоннтрила. В пользу равновесного характера образования новой формы говорит как уширенная форма соответствующего пика, так и тот факт, что при разбавлении пробы 1% водным раствором уксусной кислоты эффект "раздвоения" пиков немедленно и полностью исчезает: и все вещество элюируется одним пиком. Таким образом, образуются, по крайней мере, две формы фторхинолона. которые являются относительно устойчивыми в сорбированном состоянии, поскольку образующаяся в присутствии значительного количества ацетонигрила форма с меньшим временем удерживания хроматографируетея отдельным пиком, почти не разрушаясь. Па основании полученных данных была разработана методика, согласно которой после депротеинизации сыворотки крови двойным объемом ацетоннтрила проба разбавлялась в четыре раза 1% водным раствором уксусной кислоты. Очевидно, что при этом концентрация ацетоннтрила снижается до 16.5%, что ниже точки излома на рис.3 (25%) и, следовательно, элюция фторхинолона происходит количественно одним пиком. Хотя при такой методике проба разбавляется в 12 раз. высокая чувствительность флуори-метрического детектора позволяет анализировать пробы с исходной концентрацией фторхинолонов вплоть до 50 нг/мл при отношении сигиал-шум более 5:1 (при этом степень обнаружения составляет 97 % для ципрофлок-сашша и 92 % для пефлоксацина). Калибровочные графики линейны в интервале концентраций 50 нг/ мл- 10 мкг/мл. Коэффициент вариации при анализе составлял 6-8 % при концентрациях фторхинолонов в сыворотке

I

крови 20 - 100 нг/мл и 2-4 % при концентрациях 50 - 2000 нг/мл. Хромато-грамма анализа пефлоксацина, содержание которого в сыворотке крови составляет около 1 мкг/ мл, приведена на рис. 5. Таким образом, предложенная нами простая и надежная методика пробоподготовки сыворотки крови в сочетании с разработанными условиями хроматографического анализа

могут быть использованы для определения фторхи полонов в сыворотке крови.

Рис. 5. Определение пефлоксацина в сыворотке крови с флуюорнметриче-ским детектором (возбуждение - 275 им; испускание - 420 нм) на колонке 4.6 х 2 50 мм, ЫиЫеозП-Си, 5и, скорость потока 1.5 мл/мнн. фармакопейная подвижная фаза (Система 1 в табл. 1). Исходная концентрация пефлоксацина 1 мкг/мл. Пробы депротеинизированы двойным объемом ацето-нитрила и разбавлены в четыре раза 1% водным раствором уксусной кислоты. А - профиль элкшии сыворотки крови, ие содержащей лекарственного вещества; Б - профиль элгации сыворотки крови с пефлоксацином.

7ГО-1

ЫНфраю+й

Рис. 6. Содержание лекарственного вещества во фракциях при 'экс-клюзнонной хроматографии липосомалыюй формы пефлоксацина.

С использованием пой методики изучена фармакоытемша двух фторхинолонов при однократном приеме 500 мг нипрофлоксанииа. или 400 мг пефлоксашша.

Для шшрофлоксашша максимальная концентрация в сыворотке крови достигалась в течение 1 ч и составляла 2.47 ± 0.40 мг/л (здесь и далее представлены: величина ± среднеквадратичное отклонение): время ио-лувыведения было равно 3,6 ч; величина Л1)Ся составляла 10.0 ± 1.6 мг/.тч. Для пефлоксашша максимальная концентрация достшалась за 1.6 ч и составляла 5.11 ±0.22 мг/л: время нолувыведения было равно 9.2 ч: величина ЛиСз4 составляла 58,0 ± 5.5 мг/л'ч.

Полученные результаты по временам нолувыведения и максимальным концентрациям в сыворо!ке крови для обоих изученных нами фюр-хинолонов соответствуют данным литературы.

4. Определение содержании пефлоксашша в липосомальных формах.

В последнее время в медицинской практике получили широкое распространение лнпосомальные формы некоторых лекарственных веществ. Они представляют собой коллоидные системы, в которых лекарственное вещество находится внутри небольших сферических частиц, отделенных от раствора эластичной мембраной, обычно образуемой с использованием лешпнна. или других соединений.

Во многих случаях лнпосомальные формы лекарственных веществ обладают рядом преимуществ по сравнению с '"традиционными" лекарственными формами, в число которых входит пролонгированное действие и высокая биодоступиость. Одной из важнейших проблем, затрудняющих использование липосомальных форм, является недостаточно высокая степень включения лекарственною вещества в лштосомы.

В частности, липосомачьные формы фторхинолонов не получили до сих пор широкою распространения именно из-за низкой степени включения. Повышение степени включения фторхинолонов может быть достигнуто изменением методики приготовления липосом. Для мониторинга включения нами были изучены лнпосомальные формы пефлокеацнпа. но-

лученные с использованием при их синтезе яиниел ш смяорожн крови кроликов, специфичных к некоторым инфекционным заболеваниям.

Для определения содержания лекарственных веществ в лниосомах их предварительно следует отделить от тою же лекарственною нешеста, содержащегося в несвязанном виде в растворе, а также разработать мстл детекшш лекарственного вещества в свободной и связанной формах.

Для детекции лекарственного вещества в связанной в лшюсомах форме необходимо разрушить лнпосомы с использованием специальных детергентов, или органических растворителей. Оказалось, чю использование для этих целей I % раствора тритона Х-100 приводило к разрушению оболочек липосом. однако наличие тритона Х-100 в пробах мешало определению пефлоксашша всеми доступными нам методами ВЭЖХ. Поэтому было решено использовать для разрушения липосом изонроннловый спирт, а концентрацию пефлоксашша в получаемом растворе определи)ь сиектрофотометрически.

Оптическую плотность растворов пефлоксашша в нзоиропаполе определяли при максимуме поглощения 283 им. Калибровочный график был линеен до величины оптической плотности 1.0. что соответствует концентрации 6 мкг/мл. При содержании воды в изопропаноле до 10% калибровочный график оставался неизменным. УФ-снектры пефлоксацина в растворе после разрушения липосом практически не отличались 01 спектров чистых веществ.

Для разделения липосомалыюй и свободной форм фторхнно.тонов был использован метод эксклюзнонной хроматографии. Образец лнносо-мальной формы пефлоксашша объемом 0.2 мл наносили на колонку с внутренним диаметром 10 мм, заполненную гелем Сефадекс 0-25 с объемом слоя 10 мл, н элюировали водой. Фракции по 0.5 мл разводили нзо-проианолом до 50 мл и сиектрофотометрически определяли концентрацию пефлоксашша.

На рис. 6 представлен профиль элюцин одной из приготовленных лн-посомальных форм пефлоксашша методом эксклюзнонной хрома кира-

фин. Первый из дпух широких пиков элюируется и свободном объеме колонки ч соотетствуег нефлоксацину. связанному с лнносомами.

Кроме тою. вблизи свободного объема колонки хчюат становился непрозрачным из-за присутствия неразрушенных лнпосом.

И юрой ник соответствует свободному нефлоксацину и элюируется в полном объеме колонки. Параллельно определяли тем же меюдом обшмо кониетраишо нефлоксаинна в исходных липосомальных растворах. I!а(1-дено. что суммарное содержание нефлоксаинна в двух изученных липосомальных формах составляло 9.92 и 10.1 мг/мл.

Как видно из рисунка 6. содержание нефлоксаинна. включенною в лнпосомы одной из испытуемых липосомальных форм достаточно велико и составило 90.4 %. Вторая исследованная лниосомальиая форма имела меньшее, но так же достаточно высокое содержание связанною нефлоксаинна - 80.7%.

Таким образом, исследованные липосомальные формы нефлоксаинна имекп высокую степень включения, а разработанная методика может быть применена для достоверной оценки количества содержания свободных и связанных форм лекарственных веществ в любых липосомальных формах фгорхннолонов.

выводы

1. Исследована зависимость времени удерживания и эффективности инков некоторых фторхинолонов в условиях обращено-фазовой ВЭЖХ от состава подвижной фазы. Установлено, что лу чшие эффективность. селективность и коэффициент емкости наблюдаются при использовании триэтнламмоний-фосфатного буфера (рН 3.2) и ацето-нитрила в качестве органического модификатора.

2. Показано, что добавление в подвижную фазу трилона Б в концентрации 0,1 г/л позволяет определять одну из примесей ципрофлоксацнна (с большим временем удерживания, чем пик основного вещества) при ее содержании менее 0.1 %.

3. Предложена методика определения фторхинолонов в сложных матрицах. содержащих белки и углеводы. Показано, что только один из исследованных прямофазовых сорбентов, "Диасорб-130 ДИОЛ". позволяет добиться достаточного удерживания с использованием в качестве элюента 10 мМ водного раствора фосфорной кислоты.

Необходимое разрешение пиков фторхинолонов с компонентами матрицы наблюдается несмотря на их низкую эффективность и селективность.

4. Разработана новая методика определения ципрофлоксацнна и пефлок-сацина в сыворотке крови, пригодная для изучения фармакокннетики фторхинолонов у человека. Упрошенная пробоподготовка состоит из депротеинизации сыворотки крови двойным объемом ацетонитрила с последующим разбавлением в четыре раза 1% водным раствором у ксусной кислоты.

Недостатки упрощенной пробоподготовкн компенсируются высокой чувствительностью и селективностью флуориметрического детектирования.

5. С использованием разработанной методики проведено исследование фармакокннетики ципрофлоксацнна и пефлоксацина у человека.

Для ципрофлоксацима (однократный прием 500 мг. перорадьно) максимальная концентрация в сыворотке крови достигалась за 1 ч и составляла 2.47мг/л; время полувыведення было равно 3.6 ч: величина лиС8 составляла 10.0 мг/л-ч.

Для пефлоксацина (однократный прием 400 мг. перорально) максимальная концентрация достигалась за 1.6 ч и составляла 5.11 мг/л: время полувыведения было равно 9.2 ч: величина АиС^ составляла 58.0 мг/л-ч.

6. Разработана методика для определения степени включения пефлоксацина в липосомы, основанная на разделении свободной и связанной форм лекарственного вещества методом эксклюзионнои хроматографии на Сефадексе С-25 с последующим анализом фракций методом прямой спекзрофотометрии.

Методика использована для определения степени включения пефлоксацина в липосомы в двух экспериментальных образцах липо-сомалыюй формы ципрофлоксацина.

По теме диссертации имеются публикации:

1. Бркич Г.Э.. Арзамасцев А.П.. Казьмина Э.М.. Михатев A.B.. Определение пефлоксацина и ципрофлоксацина в сыворотке крови методом ВЭЖХ. // Хим.-фарм. журнал. - № 4 1997. - с. 48-50.

2. Бркич Г.Э.. Михалев A.B.. Арзамасцев А.П., Казьмина Э.М. Изучение методом масс-спектрометрии норфлоксацина и родственной примеси образующейся при его синтезе. // В сборн. научи, трудов НИИФ "Фармация на современном этапе - проблемы и достижения" 1997. т. 39.. часть 2. стр. 25-26.

3. Бркич Г.Э., Михалев A.B., Арзамасцев А.П.. Казьмина Э.М. Использование подвижной фазы содержащий Трилон Б для определения примеси в ципрофлоксацине. // В сборн. тезисов VII Российского национального конгресса "Человек и лекарство" М.: - 2000. С.601.