Автореферат и диссертация по фармакологии (15.00.02) на тему:Спектрофотометрия в ближней инфракрасной области как метод контроля качества лекарственных средств

На правах рукописи

ЕЛИЗАРОВА Татьяна Евгеньевна

СПЕКТРОФОТОМЕТРИЯ В БЛИЖНЕЙ ИНФРАКРАСНОЙ ОБЛАСТИ КАК МЕТОД КОНТРОЛЯ КАЧЕСТВА ЛЕКАРСТВЕННЫХ СРЕДСТВ

15.00.02 - фармацевтическая химия, фармакогнозия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

?} О ДПр

Москва - 2009

003468220

Работа выполнена в испытательной лаборатории ООО «KoAJI Фарманализ» (аттестат аккредитации РОСС 1Ш.0001.21ФМ12) и на кафедре фармацевтической и токсикологической химии медицинского факультета ГОУ ВПО Российский Университет дружбы народов

Научный руководитель:

доктор химических наук профессор Т.В. Плетенева Официальные оппоненты:

доктор химических наук профессор Ю.Я. Харитонов

доктор биологических наук профессор A.B. Сыроешкин

Ведущая организация: Московский государственный медико-стоматологический университет

Защита диссертации состоится «22» мая 2009 г. в 14 час. на заседании диссертационного совета Д.212.203.13 при ГОУ ВПО Российский университет дружбы народов по адресу: 117198, Москва, ул. Миклухо-Маклая, д.8.

С диссертацией можно ознакомиться в Научной библиотеке Российского

Университета дружбы народов

по адресу: 117198, Москва, ул. Миклухо-Маклая, д.6.

Автореферат разослан «¿1_» (Х^^М-^иЯ, 2009 г. Ученый секретарь диссертационного совета

доктор биологических наук профессор Е. В. Лукашева

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ДИССЕРТАЦИИ

Актуальность темы. Присутствие на фармацевтическом рынке лекарственных средств (ЛС), не отвечающих нормативным требованиям, стимулирует проведение исследований по совершенствованию контроля качества и разработке экспресс-методик анализа фармацевтической продукции.

В мировой фармацевтической практике в последние годы стал применяться метод ИК-спектрометрии в ближнем диапазоне (БИК-спектрометрия). БИК-спектрометрия - это инструментальный метод количественного и качественного анализа, сочетающий спектроскопию и статистические подходы при исследовании многофакторных зависимостей (С.А. Панков, А.Г. Борзенко - 2006), в том числе хемометрию (О.Е. Родионова, А.Л. Померанцев - 2007, ЯР. Cogdill е! а1. - 2005). Ближний инфракрасный диапазон электромагнитного спектра простирается от 800 нм до 2500 нм (от 12500 до 4000 см"1), т.е. находится между средней ИК-областыо и видимой областью. В то время как спектры, полученные в среднем ИК-диапазоне, являются результатом атомных колебаний, БИК-спектры отражают так называемые обертоны и комбинационные полосы.

Особым достоинством БИК-спектрометрии является возможность проведения анализа материалов без предварительного их разрушения (растворения, концентрирования) и других предшествующих анализу операций, например, вскрытия упаковки (Фармакопеи Европы и США, 2005-2007). В сочетании с хемометрической обработкой информации БИК-спектрометрия представляет собой перспективный метод исследования и анализа как однокомпонентных, так и сложных по составу систем.

В России БИК-спектрометрия находится в стадии освоения и развития и пока не является фармакопейным методом, что не позволяет ее использовать в контроле качества импортных лекарственных субстанций и готовых лекарственных форм. В рамках реализации идеи международной гармонизации методов анализа, внедрение БИК-спектрометрии в систему контроля качества ЛС является актуальной и перспективной задачей. В первую очередь это касается практики межоперационного производственного контроля, контроля качества готовой продукции, а также оценки качества продукции фармацевтического рынка.

Цель диссертационной работы - исследовать возможности метода ИК-спектрометрии в ближнем диапазоне для экспресс-анализа лекарственных субстанций и готовых лекарственных форм. Задачи исследования:

1. Изучить возможности и особенности применения метода БИК-спектрометрии при идентификации лекарственных субстанций и готовых лекарственных форм по производителям и производственным сериям для ЛС разных химических и фармакологических классов.

2. Сформировать библиотеку БИК-спектров и охарактеризовать накопленную спектральную информацию, используя статистические методы обработки результатов (дискриминантный анализ, метод главных компонент, кластерный апализ, метод множественной линейной регрессии).

3. Изучить возможности применения БИК-спектрометрии для оценки содержания действующего вещества в лекарственных препаратах с различной дозировкой.

4. Применить метод БИК-спектрометрии для оценки отдельных показателей качества ЛС.

5. Применить разработанные методики идентификации лекарственных препаратов (случайная выборка) для выявления фальсифицированной фармацевтической продукции.

Научная новизна. В диссертации впервые в РФ исследованы возможности применения метода БИК-спектрометрии для идентификации лекарственных субстанций и готовых лекарственных форм разных производителей, различных серий одного производителя, определении дозировки действующего вещества, а также при выявлении фальсифицированной продукции.

Разработан алгоритм исследования лекарственных препаратов на подлинность (случайная выборка) и доказана возможность его использования для выявления некачественной и контрафактной продукции.

Продемонстрирована возможность применения БИК-спектрометрии в количественном анализе: при определении содержания воды в различных сериях препарата «Аугментин, порошок», производства «СмитКляйн Бичем Фармасьютикалз», Великобритания и определения дозы действующего вещества (5, 10 и 20 мг) в препарате «Эналаприл», производства «Хемофарм А.Д.», Сербия.

Создана библиотека БИК-спектров для ЛС разных химических и фармакологических классов. Накопленная база данных позволила охарактеризовать спектральную информацию статистическими методами обработки результатов (дискриминантный анализ, метод главных компонент, кластерный анализ, метод множественной линейной регрессии).

Практическое значение исследования заключается в разработке алгоритмов анализа ЛС методом БИК-спектромегрии для контроля качества на этапах их производства, сертификации/декларирования, распределения и реализации.

Разработаны методики:

- идентификации лекарственных субстанций и готовых лекарственных форм по производителям, производствегашм сериям для ЛС разных химических и фармакологических классов;

- обнаружения контрафактной продукции;

- оценки отдельных показателей качества;

- оценки содержания действующего вещества в лекарственных препаратах с различной дозировкой.

Сформированы библиотеки спектров 42 наименований лекарственных субстанций и 355 наименований готовых лекарственных форм. Электронная база насчитывает около 18000 спектров. Спектральные библиотеки могут быть использованы контрольно-аналитическими лабораториями промышленных предприятий и лабораториями территориальных органов Росздравнадзора РФ при наличии БИК-спектрометров аналогичных классов.

Результаты диссертационной работы могут быть использованы при разработке общей фармакопейной статьи «ИК-спектрометрия в ближнем диапазоне» для Государственной фармакопеи РФ.

Результаты диссертационной работы могут быть использованы в системе дополнительного образования для слушателей сертификационных курсов повышения квалификации по специальности «Фармация».

Внедрение результатов исследований. Созданная библиотека БИК-спектров лекарственных субстанций и готовых лекарственных форм разных производителей, различных серий одного производителя, фальсифицированной продукции является основой для получения дополнительной к нормативной информации при контроле

качества ЛС, поступающих в Испытательную лабораторию ООО «KoAJI Фарманализ».

В перспективе полученные результаты могут быть внедрены в практику любой Испытательной лаборатории, имеющей соответствующую спектральную аппаратуру.

Результаты исследований внедрены в учебный процесс медицинского факультета (специальность «Фармация») Российского университета дружбы народов (раздел «Стандартизация и контроль качества лекарственных средств»). Для студентов, интернов и аспирантов прочитан курс лекций по актуальным проблемам системы контроля качества ЛС, включающий результаты диссертационной работы по внедрению метода БИК-спектрометрии в фармацевтическую практику.

Полученные результаты могут быть использованы при разработке общей фармакопейной статьи «ИК-спектрометрия в ближнем диапазоне» для Государственной фармакопеи РФ.

Апробация диссертации. Результаты исследований были представлены в периодической печати (опубликовано шесть работ, из них две статьи в журналах, отвечающих требованиям ВАК, 3 тезисов, глава в книге) и доложены на: 1-ой Международной конференции «Физико-химические методы исследования нанообъектов в химии, биологии и медицине». - Туапсе - октябрь 2007; Всероссийской научно-практической конференции «Современные проблемы медико-криминалистических, судебно-химических и химико-токсикологических экспертных исследований». - М. - ноябрь 2007; VIII Международном конгрессе «Здоровье и образование в XXI веке. Концепции болезней цивилизации». - М. - ноябрь 2007; IX Международном конгрессе «Здоровье и образование». - М. - 2008; объединенном научном семинаре кафедры фармацевтической и токсикологической химии и кафедры биологии и общей генетики РУДН.

Структура и объем диссертации. Диссертационная работа изложена на 169 страницах и состоит из следующих разделов: введение, обзор литературы, методы исследования, результаты и их обсуждение, заключение, выводы, библиографический список (157 источников, из них 32 на русском и 125 на иностранных языках). Работа содержит 6 таблиц, 49 рисунков.

Положения, выносимые на защиту: 1. Результаты применения БИК-спектрометрии для идентификации лекарственных субстанций и препаратов разных производителей.

2. Результаты применения БИК-спектрометрии для идентификации лекарственных субстанций и препаратов различных серий одного производителя.

3. Результаты применения БИК-спектрометрии для анализа лекарственных препаратов с различной дозировкой действующего вещества.

4. Результаты идентификации лекарственных препаратов (случайная выборка серий) на основе созданной библиотеки БИК-спектров.

5. Результаты обнаружения контрафактной продукции методом БИК-спектрофотометрии на отечественном фармацевтическом рынке.

6. Результаты оценки отдельных показателей качества, в том числе определения содержания воды в лекарственном препарате методом БИК-спектрофотометрии в сравнении с арбитражным методом (титрование по методу Карла Фишера).

7. Обоснование перспективности внедрения метода БИК-спектрофотометрии в отечественную систему контроля качества ЛС.

СОДЕРЖАНИЕ ДИССЕРТАЦИИ

Глава 1 диссертации посвящена обзору литературы по теме диссертации. В ней дана общая характеристика спектрометрии ближнего инфракрасного диапазона, рассматриваются теоретические основы и методология БИК-спектрометрии, особенности спектрометров для ближнего диапазона, способы представления БИК-спектров, алгоритмы их обработки методами хемометрического анализа. Проанализированы направления практического применения и сделан вывод об ограниченном использовании БИК-спектрометрии в фармацевтическом анализе в настоящее время.

В Главе 2 диссертации описаны:

- объекты исследования (лекарственные субстанции и готовые лекарственные формы);

- оборудование - ИК-спектрометры в ближнем диапазоне двух производителей («Multi Purpose Atialyzer» BRUKER Optik GmbH, Германия и «Nicolet ANTARIS», Thermo Electron Corporation, США), автоматический титратор («784 KFP Titrino», «Metrohm», Щвейцария) для определения воды в лекарственных средствах по методу К. Фишера;

- методики исследования.

Результаты исследования и их обсуждение (глава 3) I. Идентификация субстанций лекарственных средств. На первом этапе исследования была предпринята попытка использования первичных БИК-спектров для решения задач фармацевтического анализа, как традиционно поступают при интерпретации ИК-спектров в средней области. Но, несмотря на выявленные различия на БИК-спектрах субстанций в значениях абсорбции и положении полос поглощения, этой информации оказалось недостаточно для решения поставленных задач. В качестве примера на рис. 1 представлены «традиционные» БИК-спектры ампициллина натриевой соли трех производителей. Разработку методики идентификации ЛС продолжили путем создания статистической базы спектров. Стандартный (библиотечный, «опорный») спектр получали усреднением множества спектров субстанции нескольких качественных серий. Последующая оценка подлинности субстанций и готовых лекарственных форм включала сравнение спектров исследуемых образцов со спектрами рабочих стандартов, предварительно накопленных в компьютерной библиотеке.

Рис. 1. Усредненные БИК-спектры субстанции ампициллина натриевой соли трех производителей: Concept Pharmaceuticals Индия, 3 серии; Cebón Индия, 3 серии; Yiangsu Medicines and Health Products Китай, 1 серия ßiulti Purpose Analyzer BRUKER Optik GmbH, Германия), n = 163.

Хемометрическая обработка спектров субстанций ампициллина натриевой соли (7 серий, 63 спектра) и цефазолина натриевой соли (17 серий, 153 спектра) методом главных компонент (МГК, Principal Component) позволила преобразовать спектральные результаты и представить их в трехмерных координатах, где координатные оси - это вектора главных компонент (ГК). Каждая точка на модифицированном спектре соответствует в пространстве спектру отдельной

субстанции, а совокупность спектров - эллипсоид или сфера — конкретного производителя или производственной серии (рис. 2, 3).

спектрам ЛС

Cebón, Индия

Yiangsu Medicines and Health Products, Китай

c.oo

Concept

Pharmaceuticals, Индия

0.600 0-575

■05

РСЗ

Рис. 2. БИК-спектры после хемометрической обработки методом главных компонент для идентификации субстанции ампициллина натриевой соли по трем производителям, п = 63. (Mulli Purpose Analyzer BRÖKER Optik GmbH, Германия).

Рис. 3. БИК-спектры после хемометрической обработки методом главных компонент для идентификации субстанции цефазолина натриевой соли трех производителей п = 153. (Mulli Purpose Analyzer BRUKER Optik GmbH, Германия).

Несмотря на то, что исследуемые лекарственные субстанции в соответствии с фармакопейными требованиями содержали от 98,0% до 100,5% действующего

Aurobindo Pharma Lid

Ortlid Chanceáis

вещества, их БИК-спектры после хемометрической обработки имели заметные различия для отдельных производителей и конкретных серий. Эти различия не могли быть обнаружены как ИК-спектрометрией в средней области, так и любым другим фармакопейным методом. Расхождения в технологии получения лекарственных веществ, разная степень очистки субстанций, присутствие влаги, нахождение определяемого вещества в том или ином фазовом состоянии (полиморфизм), разная степень дисперсности, длительность хранения субстанции при разных условиях -некоторые из возможных причин наблюдаемых различий.

Разработанная методика явилась основой для последующего формирования спектральных библиотек для лекарственных субстанций и готовых лекарственных форм различных производителей и производственных серий. Например, в ходе дискриминантного анализа («Nicolet ANTAR1S», Thermo Electron Corporation, США) субстанции цефазолина натриевой соли стерильной в таблицу стандартов программы было включено 198 спектров 22 серий. Статистическая значимость отличий выражается в единицах расстояния между рассматриваемыми областями («спектральное расстояние» или «единицы Махаланобиса»). На двумерном графике были обнаружены статистически достоверные различия между тремя классами, соответствующими разным производителям (рис. 4).

Рис. 4. Статистическое разделение образцов субстанции цефазолина натриевой соли стерильной в координатах Махаланобиса (п = 198): квадраты - субстанции Harbin Pharmaceutical Group Со, Китай; окружности - субстанции Orchid Chemicals & Pharmaceuticals Ltd, Индия; треугольники - субстанции Aurobindo Pharma Ltd, Индия. («Nicolet ANTAR1S», Thermo Electron Corporation, США).

В литературе нет однозначного мнения о значениях единиц Махаланобиса, позволяющих оценить границы качественного различия образцов. Накопленный нами экспериментальный материал позволяет сделать вывод о том, что границами таких различий для одинаковых JIC одного производителя следует считать расстояния в три и более единиц Махаланобиса.

Как следует из полученных результатов (см. рис. 4), расстояния между классами субстанций Harbin Pharmaceutical Group Со, Китай и Aurobindo Pharma Ltd, Индия превышали статистические границы в три единицы Махаланобиса. В то же время традиционными методами оценки качества исследуемых субстанций не было обнаружено различий — все субстанции соответствовали существующим требованиям нормативной документации.

Разработанная методика и накопленная со временем спектральная библиотека позволили осуществить идентификацию одной из субстанций цефазолина натриевой соли «вслепую», не зная ее производителя. В спектральной библиотеке ближайший класс по производителю оказался Harbin Pharmaceutical Group Со, и он находился на расстоянии 17,5 единиц Махалонобиса от исследуемой субстанции. Таким образом была подтверждена правильность выбранной нами модели. Как оказалось, субстанция цефазолина натриевой соли принадлежала компании G. Amphray Lab. spa, серия FAZL 0240037, и не была ранее внесена в спектральную библиотеку.

ИК-спектральный анализ в ближнем диапазоне лекарственной субстанции таурина проводили методом дискриминантного анализа, включив в таблицу стандартов программы «TQ Analyst» 153 спектра (17 серий по 9 повторностей). Результаты обработки спектров от двух производителей методом дискриминантного анализа представляли в виде двумерного графика в координатах Махаланобиса по осям X и Y (рис. 5).

Из обнаруженных спектральных различий видно, что БИК-спектры двух производителей разделены на две области. Кроме того, для спектров субстанций, соответствующих заводу «ДП химических реактивов») (Украина) характерно два обособленных участка, что связано с различием качественных признаков двух серий субстанций украинского производителя.

Таким образом, графическое разделение субстанций таурина на два класса свидетельствует об особенностях технологии разных производителей.

a» G » 0>C*a

0 0S öS" » 2

r ™ -Vil 4 #

i t. i |i ? t^ ° aco

i: s 4*1 «

!■ 1: 'Kî 4 * Л

;

Vi tara я Q>0 - Яккпи* Il

Рис. 5. Статистическое разделение образцов субстанции таурина в координатах Махаланобиса (п = 153): квадраты • субстанции ОАО «Фармстандарт-Лексредства» (Россия), треугольники - субстанции «ДП Завод химических реактивов» (Украина). («Nicolet ANTARIS», Thermo Electron Corporation, США).

Обсуждаемые различия могут быть также обнаружены с помощью диагностической процедуры «Statistical Spectra». При ее использовании, кроме усредненных спектров рассматриваемых классов производителей и представлении результатов в виде единиц Махаланобиса, получали статистически достоверный спектр различий.

Аналогичные результаты были получены при дискриминантом анализе субстанции метамизола натрия, для которой в библиотеку стандартов было включено 99 спектров. В координатах Махаланобиса были обнаружены статистически достоверные различия между двумя классами, соответствующими двум производителям (рис. 6).

Рис. б. Статистическое разделение образцов субстанции метамизола натрия в координатах Махаланобиса (п = 99). Квадраты - субстанции ShandogXinhua Pharmaceutical Company, Китай, треугольники - субстанции Wuhan Pharmaceutical Factory, Китай. («Nicolet ANTARIS», Thermo Electron Corporation, США).

Значения расстояний менее трех единиц Махаланобиса для субстанций одного производителя свидетельствует об отсутствии достоверных различий между образцами. Но графическое разделение результатов на два класса для идентичных по своей химической природе субстанций позволяет судить о качественных различиях образцов отдельных производителей. Обнаруженное различие может быть использовано для идентификации источника анализируемой субстанции.

Сравнение лекарственных субстанций разной химической природы. Для подтверждения выявленных возможностей БИК-спектрометрии дискриминантный анализ был применен одновременно к лекарственным субстанциям разных химических классов - метамизолу натрия и таурину. Для этого в таблицу стандартов («опорных» спектров) было включено 252 спектра субстанций. В координатах Махаланобиса оба класса спектров оказались статистически различимы и заняли две области скопления точек (рис. 7). Точки, соответствующие отдельным спектрам в каждом классе, располагались плотно друг к другу и даже накладывались, что свидетельствовало о незначительной внутригрупповой дисперсии. Расстояния в единицах Махаланобиса отдельных точек каждого класса до его центра не превышало 1,2 единиц Махаланобиса.

Рис. 7. Статистическое разделение образцов субстанций метамизола натрия

(квадраты, верхний левый угол) и таурина (треугольники, нижний правый угол), n = 2SZ («Nicolet ANTAR1S», Thermo Electron Corporation, США).

Две области скопления точек, соответствующих спектрам субстанций таурина и метамизола натрия, оказались отдалены друг от друга более чем на 23 единицы Махаланобиса. Полученный результат продемонстрировал эффективность выбранного метода. Выявленное подтверждение высокой межгрупповой дисперсии для субстанций разной химической природы является основой рекомендации применения разработанного алгоритма при идентификации ЛС неизвестного производителя и выявления фальсифицированных ЛС.

Применение сформированной спектральной библиотеки для идентификации неизвестного производителя J1C. Для решения поставленной задачи были использованы уже ранее классифицируемые БИК-спектры субстанции цефазолина натриевой соли стерильной от двух производителей Harbin Pharmaceutical Group Со, Китай и Aurobindo Pharma Ltd, Индия. БИК-спектры 12 серий производителя Harbin Pharmaceutical Group Со были разделены на две группы по 6 серий в каждой. Им были присвоены статусы тестируемого и базового класса. Субстанции другого производителя (.Aurobindo Pharma Ltd) принадлежали пяти различным сериям.

Как следует из полученных результатов (рис. 8), спектры лекарственных субстанций производства Aurobindo Pharma Ltd, Индия занимают отдельную область в левом верхнем углу графика. Спектры тестируемого (неизвестного) и базового классов (Harbin Pharmaceutical Group Со) расположены единой областью - в правом нижнем углу графика. Спектральная дистанция между спектрами разных производителей превышает пороговые значения в три единицы.

2J1* £* .w- hfW ш. м»

• cmjhi. I ] гни», см. j;¿¿vm*,fe*рщв w*. :|Щшин . .....ОТ

i „ J « " . 0п„ а | .................................................................................. S : Sj C.t tURlU OXCMm »0 ........... ^ «

3 33

■ «ц

Рис. 8. Результат определения принадлежности тестируемого класса к одному из известных классов производителей субстанции Цефазолина натриевой соли стерильной (п = 153) - Harbin Pharmaceutical Group Со (треугольники - базовый класс, окружности тестируемый класс), Китай и Aurobindo Pharma Ltd, Индия (квадраты). («Nicolet ANTAR1S», Thermo Electron Corporation, США).

Другим примером обнаружения неизвестного производителя ЛС по данным созданной спектральной библиотеки явились исследования по идентификации субстанции гидрокортизона ацетата. Для идентифкации производителя были исследованы образцы серии субстанции, которые не использовались при калибровке методом дискриминантного анализа. Спектральные расстояния оказались меньше порогового значения - 0,4-4,0 единиц Махалонобиса, что свидетельствовало о принадлежности субстанции этому же производителю.

Таким образом, результаты исследований лекарственных субстанций различных производителей позволили впервые продемонстрировать особенности их качества, неидеитифщируемые существующими нормативными методами.

II. Идентификация готовых лекарственных форм. Лекарственные препараты представляют собой многокомпонентные системы, что накладывает свой отпечаток на проведение исследований методом БИК-спектрометрии. Из фармацевтической практики известно, что некоторые производители выпускают на фармацевтический рынок только ту продукцию, которая характеризуется полным соответствием ИК-спектров в средней области стандартным образцам и имеет совпадение с библиотеками БИК-спектров не менее, ¡ем на 98%. Различия в используемых активных компонентах и вспомогательных веществах отражается на ИК-спектрах в ближнем диапазоне. Как и в случае лекарственных субстанций, представляет интерес разработка аналитических методик обнаружения отличий в идентичной продукции различных производителей и отдельных сериях каждого производителя.

В качестве модели исследования препаратов были выбраны таблетки с действующим веществом э налаприла малеат (ингибитор ангиотензин-превращающего фермента) пяти производителей 35 серий. Однотипность полученной исходной спектральной картины была обусловлена присутствием в составе таблеток практически одних и тех же веществ, в первую очередь, действующего вещества -эналаприла малеата и наполнителя - лактозы моногидрата. Различия в дополнительных полосах поглощения были обусловлены разной природой связывающих веществ - кукурузного крахмала («Эналаприл» Яка 80, «Ренитек», «Энап»), желатина («Эналаприл» Хемофарм) или целлюлозы микрокристаллической («Эднит» Гедеон Рихтер), а также в наличии/отсутствии красителей. Разная интенсивность поглощения при соответствующих длинах волн отражала разницу в количествешюм соотношении указанных вспомогательных веществ. Как и в случае субстанций, хемометрическая обработка 315 спектров таблеток с действующим веществом эналаприла малеат методом главных компонент позволила разделить их по группам в зависимости от производителя (рис. 9).

Рис. 9. БИК-сисктры таблеток с действующим веществом эналаприла малеат (20 мг) пяти различных производителей после хемометрической обработки методом главных компонент, п = 315. (Multi Purpose Analyzer BRUKER Optik GmbH, Германия).

Оценка стабильности показателей качества лекарственных препаратов с использованием сформированной спектральной библиотеки. При мониторировании качества одного из препаратов цефатоксима (полусшггетический антибиотик группы цефалоспоринов III поколения) зарубежного производителя за трехлетний период было обнаружено, что такие фармакопейные показатели, как «цветность» и «прозрачность», постепенно ухудшались. При исследовании образцы препарата цефатоксима были условно разделены на два класса - «старые» и «новые» (с ухудшившимися показателями «цветности» и «прозрачности»). Фирма-производитель при перерегистрации нормативной документации на лекарственную форму, руководствуясь европейскими фармакопейными требованиями, расширила допустимые границы нормативных требований показателя с 0,2 до 0,6. Это привело к ухудшению качества JIC. При спектрофотометрическом определении цветности (X = 430 нм) «старые» образцы имели абсорбцию, близкую к 0,20. Для класса «новых» образцов нормативный показатель «цветность» характеризовался абсорбцией в диапазоне 0,22-0,40. Например, в классе «новых» образцы серий №097885 и № 047007 имели абсорбцию 0,34 и 0,39, соответственно.

Нами была предпринята попытка обнаружить спектральную разницу между условными классами «старых» и «новых» серий препарата «Цефатоксим», применяя разработанные методики исследования. При обработке спектров методом дискриминантного анализа разница между исследуемыми классами достигла более 100 единиц Махалонобиса.

Образцы для анализа поступали непосредственно от производителя готовой лекарственной формы, что исключало включение в исследования контрафактной продукции. Спектральная разница могла быть обусловлена только сменой производителя субстанции. Таким образом, обнаруженная корреляция между нормативными показателями и спектральными характеристиками позволяет прогнозировать возможность применения метода БИК-спектрометрии для оценки стабильности показателей качества JIC.

БИК-спектрометрия лекарственных препаратов с разным содержанием действующего вещества. При контроле качества лекарственных средств важной задачей является оценка правильности дозирования действующего вещества в ЛС. В качестве моделей были выбраны три дозировки (5, 10 и 20 мг) препарата «Эналаприл» производителя АО «Яка 80», Македония, 11 серий. Проведенная хемометрическая обработка методом главных компонент (программа «OPUS IDENT», Bruker Optik GmbH) позволила разделить полученные спектры на три области в соответствии с содержанием действующего вещества (рис. 10).

Рис. 10. Графическая демонстрация избирательности метода БИК-спектрометрии при определении дозировки эналаприла малеата в таблетках «Эналаприл», АО Яка 80, Македония, п = 99. (Multi Purpose Analyzer BRUKER Optik GmbH, Германия).

Эналаприл Я<а 80.20 мг

Эналаприл Я<а, 5 мг

Аналогичные результаты были получены при обработке спектров в программе «TQ Analist» Thermo Electron Corporation, методом множественной линейной регрессии (Stepwise Multiple Linear Régression) с построением калибровочной модели, где концентрация представлена как функция поглощения при разных частотах (рис. 11). Накопленный банк спектральных результатов позволил продемонстрировать возможности разработанной методики для лекарственных препаратов, закупленных произвольным образом в аптечном киоске (Эналаприл, ю мг, № 20, АО Яка 80, Македония, серия 18J006; Эналаприл, 20 мг, № 20, АО Яка 80, Македония, серия 441006: Ренитек 20 мг А'°14, Мерк Шарп и Доум, Нидерланды, серия NF 01280; Эднит 20 мг, № 20, Гедеон Рихтер, Венгрия, серия Т55032А; Энап 20мг, №20, KRKA, Словения, серия N47222).

N ? CN ? Con. Coed.: 0.38870 RMSED Q79S

-Î т i

1 4

* ТЭ j QJ |

ГО £

(_> J

го 1 О i i Î ! о О Calibration + Validation Д Correction

С—.0.. „..,._„„„„ П Doss-correction

3 „„.„.,,, il... . гг .........• » "г'1 ■ ' ' Actual 22

Рис. 11. Калибровка для препарата «Эналаприл, табл. 5 мг, 10 мг и 20 мг», и = 126. «Хемофарм», Словения. («Nicolet ANTARIS», Thermo Electron Corporation, США)

Для всех образцов таблеток был произведен тест их идентификации. Каждый спектр был обработан с помощью программы «OPUS IDENT», которая после математической обработки генерировала идентификационный отчёт соответствия рабочему библиотечному спектру, сформированному из сотен стандартных образцов. Отчет отражал полную информацию об исследуемом препарате (название, дозировка, серия, производитель) и сведения о тех препаратах, спектры которых были включены в формируемую библиотеку и были наиболее близки к спектру исследуемого образца.

На примере таблеток «Эднит 20 мг, № 20», Гедеон Рихтер, Венгрия, серия Т 55032А было также обнаружено, что для серий, спектры которых уже занесены в спектральную библиотеку, идентификация происходит также и по номеру серии. Коэффициент качества совпадения (Hit Quality), или спектральное расстояние, ни в одном образце не превысил допустимый предел (Threshold), или «порог терпимости» идентификационной модели. Это подтвердило достоверность проведенных идентификационных тестов подлинности лекарственных препаратов.

Аналогичные результаты были получены для препаратов: «Амлодипин, таблетки 5 и 10 мг»; «Цинт, таблетки 0,2 и 0,4 мг»; «Гастросидин, таблетки 20 и 40 мг»; «Карведилол, таблетки 12,5 и 25 мг»; «Ксефокэм, таблетки 4 и 8 мг»; «Синорезид, таблетки 12,5 и 25мг»; «Структум, капсулы 500 и 250 мг-».

Статистически достоверные различия между группами препаратов с разным содержанием действующего вещества свидетельствуют о реальной возможности применения метода БИК-спектрометрии для оценки точности дозирования.

Идентификация фальсифицированных лекарственных препаратов методом БИК-спектрометрии. Одна из проблем современного фармацевтического рынка-присутствие контрафактных (фальсифицированных) лекарственных препаратов. Примерно десятая доля всей контрафактной продукции приходится на российский рынок. Поиск простых и доступных аналитических методов для выявления фальсифицированной продукции - важпая задача сегодняшнего дня и настоящей диссертационной работы.

В рамках наших исследований был проведен идентификационный анализ лекарственного препарата «Метронидазол» (группа противомикробных и противопротозойных средств). По просьбе производителя были исследованы образцы трех серий таблетированной формы неизвестного препарата с предполагаемым действующим веществом метронидазол. Полученные спектры сравнивали как со спектрами таблеток истинного препарата пяти серий, предоставленных производителем, так и со спектрами таблеток трех серий, представляющими собой ранее выявленные контрафактные образцы. Всего обработано 99 спектров.

ИК-спектры в среднем диапазоне и первичные БИК-спектры тестируемых таблеток трех серий оказались настолько идентичны, что ii2i.ni было сделано заключение: тестируемые таблетки препарата метронидазол не являются плацебо, содержат активные вещества, аналогичные истинным образцам, изготовлены по

одной и той же технологической схеме конкретного предприятия. В то же время сравнение БИК-спектров тестируемых образцов после хемометрической обработки со спектрами истинной и ранее выявленной контрафактной продукции позволило обнаружить значительные различия (рис. 12).

Образцы всех трех исследуемых групп метронидазола (тестируемые, истинные и контрафактные) заняли различные области в трехмерном пространстве. Истинной продукции (пять серий) соответствовала локализация в элипсоиде значительного размера. Ранее выявленные контрафактные образцы, представленные производителем, заняли три области, не перекрывающиеся между собой.

Рис. 12. Результаты идентификации спектров тестируемых, ранее выявленных контрафактных и истинных образцов таблеток «Метронидазол», п=99.

Тестируемые образцы предполагаемой контрафактной продукции трех серий заняли в пространстве отдельную область, не перекрывающуюся ни с истинными образцами; ни с ранее выявленными фальсификатами. Тестируемые образцы трех серий оказались новыми фальсификатами. Их происхождение отличается от ранее

19

выявленной контрафактной продукции, что позволяет предположить появление нового источника его производства.

Разработанные методики позволили также выявить контрафактную продукцию препарата «Низорал мазь, 20 мг/г» (синтетический противогрибковый препарат). При определении стандартов калибровки исследовали 15 спектров по 10 главным компонентам, в диапазоне от 4000 до 9000 см'1. Для каждой тубы мази были получены спектры, по три на одну пробу. При обработке спектров методом дискриминантного анализа была обнаружена значительная разница между истинными и тестируемыми спектрами - в 17 единиц Махалонобиса по осям X и Y.

Таким образом, описанные примеры проведенных исследований свидетельствуют о возможности применения метода ИК-спектрометрии в ближнем диапазоне для выявления контрафактной фармацевтической продукции.

1П. Оценка показателя качества лекарственных препаратов - определение влажности методом БИК-спектрометрии. Известно, что одним из фармакопейных критериев качества лекарственных средств является показатель «Влажность», оцениваемый количественным содержанием воды. Фармакопеи РФ, Европы, США и Японии для контроля содержания воды в лекарственных препаратах рекомендуют метод Фишера. Этот фармакопейный метод характеризуется достаточно высокой точностью и воспроизводимостью результатов, но требует специального оборудования, реактивов, точной навески образца и длителен при проведении испытаний.

В качестве модельного препарата нами был использован препарат «Аугментин, порошок для приготовления суспензии для приема внутрь 200 мг+28.5 мг» (комбинированный антибиотик, амоксициллша и клавулановой кислоты). Результаты, полученные по разработанной методике на основе БИК-спектрометрии, сравнивали с фармакопейным методом, осуществляя параллельное исследование - титрование реактивом К. Фишера.

Для построения калибровочной модели в методе множественной линейной регрессии (Stepwise Multiple Linear Regression) программы TQ Analyst было включено 90 БИК-спектров препарата «Аугментин» (по 9 спектров от 10 различных серий). Для исследования был выбран частотный диапазон 5000^-5500 см"1, где наблюдается второй обертон воды (рис. 13).

См*«« 24« 3008 тмм ссапчад;

Оука-х папе Омшй

(пи1 смьЬ« АРАОСООЭИ

Рис. 13. Результат определения содержания воды в образце препарата «Аугментин» по разработанной калибровочной модели.

Для описания зависимости между содержанием воды и спектральным откликом была получена калибровочная модель. Для сравнения ее с арбитражным методом на оси абсцисс откладывали значения содержания воды, рассчитанные программой на основании спектральных данных, а по оси ординат наносили значения содержания воды, полученные методом К. Фишера (рис. 14). Как видно, разработанная и фармакопейная методики имеют высокую корреляцию (г = 0,969).

Полученную калибровочную модель использовали для определения содержания воды в образцах других серий препарата «Аугментин», не включенных в построение калибровочной модели. Для каждой серии вычислена относительная ошибка определения воды в исследуемом препарате методом БИК-спектрофотометрии в сравнении с аттестационным методом - титрованием реактивом К. Фишера (табл).

Рис. 14. Корреляция между результатами определения воды в препарате «Аугментин» методм БИК-спектрометрии (абсцисса) и фармакопейным методом (ордината), г= 0,969. п = 99.

Таблица. Результаты определения содержания воды в препарате «Аугментин»

Серия Содержание воды, ш% БИК-спектрометрия Содержание воды, о % Титрование реактивом К. Фишера Относительная ошибка определения, %

307925 6,31 6,17 +2,23

324873 7,15 7,35 -2,71

330270 4,20 4,30 -2,32

334147 7,07 6,93 +1,96

343577 6,28 6,27 +0,08

346264 6,19 6,02 +2,77

Из полученных результатов следует, что относительная ошибка определения воды по новой методике не превышает 3 %.

выводы

1. Детально исследованы возможности метода БИК-спектрометрии при идентификации лекарственных субстанций и готовых лекарствешшх форм по отдельным производителям и производственным сериям одного производителя.

2. Продемонстрирована возможность анализа спектральных различий в БИК-диапазоне для лекарственных средств разных химических и фармакологических классов, отражающих показатели качества, не идентифицируемые нормативными методами.

3. Разработанные идентификационные методики, базирующиеся на хемометрической обработке результатов спектрального анализа, позволили осуществить неоднократное выявление некачественной и фальсифицированной фармацевтической продукции.

4. Разработаны методики оценки отдельных показателей качества лекарственных препаратов. Проведено количественное определение воды в лекарственном препарате «Аугментин» в сравнении с арбитражным методом. Обнаружена корреляция между нормативными показателями и спектральными характеристиками образцов готовых лекарственных форм препарата цефатоксима и продемонстрирована возможность применения метода БИК-спектрометрии для оценки стабильности показателей качества ЛС.

5. Доказана возможность применения БИК-спектрометрии для оценки содержания действующего вещества в лекарственных препаратах с различной дозировкой.

6. Сформирована библиотека БИК-спектров, включающая 42 наименования лекарственных субстанций и 355 наименований готовых лекарственных форм. Накопленная электронная база охарактеризована статистическими методами и насчитывает около 18 ООО спектров.

СПИСОК РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1 .Определение подлинности лекарственных субстанций и готовых лекарственных средств методом ИК-спектрометрии ближнего диапазона / Т.Е. Елизарова, Т.В. Плетенева // Материалы Всероссийской научно-практической конференции «Современные проблемы медико-криминалистических, судебно-химических и химико-токсикологических экспертных исследований». - М.: РИО ФГУ Российский Центр судебно-медицинской экспертизы Минздравсоцразвития России. - 2007,- С. 209-212.

2.0ценка подлинности лекарствешшх субстанций и готовых лекарственных форм методом спсктрофоюмсфии ближнею ИК-диапазона /' Т.Е. Елизарова, Плетенева Т.В. // Научные труды VIII Международного конгресса «Здоровье и образование в XXI веке. Концепции болезней цивилизации». - М.: - 2007. - С. 251.

3.Внедрение спектроскопии ближнего инфракрасного диапазона (БИК) в фармакопейный анализ / Т.Е. Елизарова, М.В Маслова., Т.В. Плетенева // Материалы I Международной конференции «Физико-химические методы исследования нанообъектов в химии, биологии и медицине» 3-9 октября 2007 г. - Туапсе. — с. 40.

4.Хемометрический анализ ИК-спектров в ближнем диапазоне при оценке подлинности лекарственных средств // Т.Е. Елизарова, Т.В. Плетенева // Вестник РУДН (серия медицина). - № 7. - 2008. - С.171-173.

5.Применение метода спектрофотометрии ближнего ИК-диапазона для идентификации лекарственных субстанций и готовых лекарственных форм / Т.Е. Елизарова, C.B. Штылева, Т.В. Плетенева // Химико-фармацевтический журнал. -2008.-42,-№7.-С. 51-53.

6.Контроль качества лекарственных средств - глава в кн. «Современные методы стандартизации лекарственных средств». - под ред. проф. H.A. Тюкавкиной // Т.Е. Елизарова. - М.: «Медицинское информационное агентство», 2008. - С. 70-95.

Елизарова Татьяна Евгеньевна (Россия)

Спектрофотометрия в ближней инфракрасной области как метод контроля качества лекарственных средств

В работе представлены результаты по оценке возможностей метода БИК-спектрометрии, включающего статистические методы многофакторных зависимостей, при идентификации фармацевтических субстанций и лекарственных препаратов разных производителей, различных серий одного производителя, определении дозировки действующего вещества, а также при выявлении фальсифицированной продукции, В работе использованы современные спектрометры с Фурье-преобразователями: Bruker Multi Purpose Analyzer, Германия и Thermo Electron Corporation Antaris, США. Идентификация лекарственных средств без вскрытия упаковки открывает широкие перспективы по внедрению метода в систему контроля качества,

Elizarova Tatyana Е.

NEAR-INFRARED SPECTROPHOTOMETRY (NIR) METHOD FOR QUALITY CONTROL OF PHARMACEUTICAL SUBSTANCES AND PREPARATIONS

The near infrared range (NIR) method is based on the combination of spectrometer and statistical methods of multifactor dependencies analysis and this provides for an excellent opportunity of drug identification. The studies covering the pharmaceutical substances, generic drugs, counterfeit products were conducted for such groups as «name», «manufacturer», «counterfeit product» by making use of the IR-Furie Bruker Multi Purpose Analyzer and Thermo Electron Corporation Antaris, USA. The potential of this method for the identification of drugs without violation of the packing opens good prospects of introducing it into the drug quality control system.

Подписано в печать: 05.04.2009

Заказ № 1883 Тираж -100 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www.autoreferat.ru