Автореферат и диссертация по фармакологии (15.00.02) на тему:Современные токсикологические, аналитические и модификационные аспекты ксенобиотиков

На правах рукописи

Аристидис Михаил ТСАТСДКИС

СОВРЕМЕННЫЕ ТОКСИКОЛОГИЧЕСКИЕ, АНАЛИТИЧЕСКИЕ И МОДИФИКАЦИОННЫЕ АСПЕКТЫ КСЕНОБИОТИКОВ (ПЕСТИЦИДОВ, НАРКОТИКОВ И МЕДИЦИНСКИХ ПРЕПАРАТОВ)

Специальность 15.00.02 - фармацевтическая химия, фармакогнозия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Москва, 2005 г.

Работа выполнена в Центре токсикологии и судебной химии Медицинского факультета Университета Крита (Ираклион, Греция) и Российском химико-технологическом университете имени Д.И.Менделеева.

Научный консультант

Доктор химических наук, профессор Штильман Михаил Исаакович

Официальные оппоненты:

Академик РАМН, доктор биологических наук, профессор, Егоров Алексей Михайлович

Доктор биологических наук Сыроешкин Антон Владимирович

Доктор фармацевтических наук, профессор Соломатин Евгений Михайлович

Ведущая организация:

Российская академия последипломного образования

Защита состоится 23 сентября 2005 г. в 14.00 часов на заседании Совета Д 212.203.13 при Российском университете дружбы народов, 117198 г. Москва, ул. Миклухо-Маклая, д.6.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Российского университета дружбы народов (117198 г. Москва, ул. Миклухо-Маклая, д.6)

Автореферат разослан 20 августа 2005 г.

Ученый секретарь диссертационного совета Д 212.203.13, доктор фармацевтических наук, доцент л

Т.П. Лагуткина

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ ЫАктуальность проблемы

Ксенобиотики - вещества, попадающие в организм из окружающей среды и обладающие определенной биологической активностью, играют важную роль в жизнедеятельности человека и других живых организмов. Они могут оказывать положительное действие (лекарства, биорегуляторы) или проявлять токсичность. Взаимодействие в системе ксенобиотик - живой организм может рассматриваться с учетом ряда аспектов. В первую очередь, это вопросы, связанные с определением ксенобиотиков в биоматериалах; токсикодинамикой и токсикокинешкой поступления, распределения и выведения ксенобиотиков, включая механизмы формирования токсического эффекта и биотрансформации; токсикометгической оценкой хронического действия ксенобиотиков и возможным их депонированием в органах и тканях.

В результате деятельности человеческого общества в биосфере циркулирует все большее число различных чужеродных для человека и животных органических соединений, происходят существенные изменения в организме человека, в составе и качестве пищи, происходят глобальные изменения в окружающей среде. Все эти изменения необходимо контролировать, что требует развития аналитических методов по определению изменений состояния окружающей среды по многочисленным параметрам.

Так, все возрастающее применение пестицидов, поверхностно-активных и многих других биологически активных веществ приводит к серьезным экологическим проблемам. В том числе это относится к широко используемым веществам, обладающим высоким уровнем персистентности (хлорсодержащим пестицидам, фосфорорганическим соединениям, полихлорированным дибензодиоксинам и дибензофуранам), способным накапливаться и загрязнять почву, водоемы и продукты питания, оказывая при этом токсическое воздействие на организм человека и животных. Борьба с отрицательными последствиями действия пестицидов требует развития методов мониторинга -эффективных методов массового контроля и анализа этих веществ как в окружающей среде, пищевых продуктах, так и в организме человека и сельскохозяйственых животных.

Злоупотребление наркотическими средствами является одним из наиболее актуальных вопросов медицины и социальной практики в современном обществе. Постоянный рост потребления наркотических средств и одурманивающих веществ, приобретающий угрожающие масштабы, приводит к формированию ситуации, когда остро встает проблема передозировок и острых отравлений, нередко заканчивающихся смертельным исходом. Не менее важно определение ряда лекарственных средств, часто применяемых в дозах, не соответствующих терапевтическим.

Для получения достоверной картины отравления и решения вопросов экспертной практики, связанных с определением наркотических и ряда лекарственных средств в биологическом материале, на предварительном этапе судебно-химического исследования необходимо использовать высокочувствительные и специфичные методы анализа.

Несмотря на несомненную важность этих проблем во многих случаях их решение далеко от завершения и требует использования новых эффективных подходов. В данной работе для анализа пестицидов, наркотиков и лекарственных веществ применены, модифицированы и развиты одни из наиболее современных подходов, отвечающих выше отмеченным требованиям - сегментный анализ волос и один из иммунных методов -поляризационный флуоресцентный иммуноанализ.

Другим важным аспектом, касающимся взаимодействия организма и ксенобиотиков, является разработка новых методов детоксикации и других подходов, снижающих их отрицательное воздействие на организм и повышающих их эффективность при целенаправленном использовании или введении.

Одним из наиболее современных и интенсивно раз! подходов является использование методов макромолек

примера в настоящей работе предложены как новые сорбенты, способные извлекать токсины из различных сред, так и новые макромолекулярные системы, представляющие собой иммобилизованные на полимерных носителях биологически активные вещества. Как известно, такие системы, постепенно выделяющие действующий агент («controlled release systems»), обладают существенными преимуществами перед низкомолекулярными аналогами. В то же время, несмотря на широкие исследования в этой области, многие аспекты, касающиеся особенностей этих систем остаются недостаточно выясненными, в первую очередь вопросы, связанные с взаимосвязью строения этих систем и их активностью. В работе эти аспекты рассмотрены на конкретных примерах.

1.2. Цель и задачи исследования

Настоящая работа решает фундаментальную проблему - разработку комплекса новых подходов к анализу, мониторингу, модификационным методам снижения отрицательного действия или повышения эффективности специально вводимых ксенобиотиков. Работа направлена на решение следующих конкретных задач:

• Разработка новых и усовершенствованных методов анализа и мониторинга пестицидов, наркотиков и лекарстевшшх веществ:

- Разработка методик сегментного анализа волос на содержание наркотиков, пестицидов и лекарств;

- Разработка новых модификаций поляризационного флуороиммуноанализа пестицидов и наркотиков как метода для быстрого и высокочувствительного скрининга ксенобиотиков;

- Мониторинг хроническою действия пестицидов, лекарств и наркотиков в разных биообъектах с целью корреляции с состоянием организма в условиях Греции;

• Разработка новых макромолекулярных систем для снижения отрицательного действия ксенобиотиков различного типа или повышения их эффективности при целенаправленном использовании:

- Разработка новых макропористых полимерных гелей для сорбционного извлечения микотоксинов;

- Создание новых полимерных комплексов фунгицидов различных групп для эффективного подавления роста микотоксинпродуцирующих грибов;

- Разработка малотоксичной полимерной формы индометацина;

- Выявление взаимосвязи химического строения, скорости гидролитического выделения и биологической активности для полимерных производных биорегуляторов (на примере 2,4-дихлорфеноксиуксусной кислоты)

1.3. Научная новизна работы

Выявлены факторы, влияющие на эффективность определения ксенобиотиков при сегментном анализе волос - методы подготовки образцов, влияние их экзогенного загрязнения, сроки и происхождение образцов и др. - что позволило разработать оптимальнеые методики определения пестицидов органофосфатной и карбаматной групп -метамила и диазенона, а также лекарственных веществ группы антиэпилептиков -карбамазепина, фенитоина и вальпроиновой кислоты. Были выявлены характеры корреляции между концентрациями в волосах и оценкой степени тяжести наркомании для наркотиков групп опиатов, кокаина, продуцентов конопли.

Созданы новые иммуногены и флуоресцентные трейсеры, в том числе лизиновые трейсеры - антигены, меченные флуоресцеином, высокоспецифичные и высокочувствительные для определения пестицидов 2,4-Д и 2,4,5-Т, изученй( стабильность иммунореагентов и полученных тест-систем, что позволило разработать эффективные скрининговые тесты для определения физиологически активных веществ на базе поляризационного флуоресцентного иммуноанализа.

Впервые показана высокая эффективность пористых гидрогелей на основе сшитого поливинилпирролидона для сорбции микотоксинов на примере зеараленона и афлатоксина. Установлено, что эффективность сорбции связана с развитостью пористой системы геля.

В ряду полимерных комплексов, полученных на основе поливинилпирролидона и низкомолекулярных фунгицидов, показано, что во всех случаях полимерные комплексы были более эффективны по уровню антифунгальной активности, причем в ряду фунгицидных карбоновых кислот антифунгальная активность повышалась с уменьшением прочности комплекса, а для полициклических антибиотиков амфотерицина В и нистатина -с увеличением прочности комплекса и молекулярной массы полимерного носителя, что связано с различием в механизме действия этих антифунгальных агентов.

Синтезированы новые полимерные эфиры индометацина и показано, что связывание с полимерным носителем снижает токсичность лекарственного вещества при сохранении его анальгетической и противовоспалительной активности.

Впервые в ряду полимерных эфиров 2,4-дихлорфеноксиуксусной кислоты выявлен характер зависимости между скоростью гидролитического выделения низкомолекулярного биорегулятора и уровнем активности макромолекулярной системы. Показано, что при малых скоростях гидролиза полимерные эфиры не обладали активностью. При высоких скоростях гидролиза характер активности полимера не отличается от характера активности низкомолекулярной кислоты с ярко выраженной концентрационной зоной ингибирования, а при промежуточных скоростях гидролиза полимер проявлял только ростстимулирующую активность.

1.4. Практическая значимость работы

Разработанные методы анализа позволили реализовать текущее исследование пациентов и различных биологических объектов и осуществить мониторинг хронического действия пестицидов, лекарств и наркотиков с целью корреляции с состоянием организма на значительном числе объектов в условиях Греции.

Создан банк данных по пестицидам, наркотикам и лекарствам (антиэпилептикам) с предлагаемой корреляцией по хроническому действию ксенобиотиков и их концентрацией в волосах, а также по контролю над соблюдением терапевтического режима.

Даны рекомендации по комплексу мер, снижающих вероятность отравления пестицидами. Показана значимость использования способа культивирования сельскохозяйственных растений по системе ГСМ (Комплексный контроль культивирования) для эффективного и безопасного использования пестицидов.

Найдены особенности кинетики и динамики антибиотика цефтриаксона при профилактическом межсекционным введении в операциях и особенности кинетики и динамики аптиаритмика амиодарона.

Проведенные иссследования влияния строения полимерных производных биологически активных кислот па их активность позволили создать полимеры с оптимальным строением и препараты на их основе с высокой анальгетической активностью (бандажи), фунгицидной активностью (водорастворимые препараты) и ростстимулирующей активностью по отношению к растениям, что отражено в соответствующих патентах.

Апробация работы. Результаты работы были многократно доложены, в том числе, в виде устных докладов на различных конференциях (217).

Публикации. По теме данного исследования опубликовано 112 статей и обзоров в российских и международных журналах, список которых за последние годы приведен в конце автореферата. Получено 4 патента. Полный список научных трудов по теме приведен в качестве приложения к диссертации.

2. РЕЗУЛЬТАТЫ РАБОТЫ

2.1. Разработка и совершенствование методов анализа ксенобиотиков (пестицидов, наркотиков, лекарственных веществ)

2.1.1. Сегментный анализ волос

Токсикологический анализ необычных биологических образцов (например, волос, слюны, пота, спермы) имеет большое значение и применяется в ряде областей медицины, судебной медицины и охране окружающей среды. Такие образцы могут дать очень важную информацию и имеют определенные преимущества, поскольку результаты анализов могут быть получены быстро, недорого, бесконтактным методом. При этом могут быть получены и вторичные образцы.

Среди таких нетрадиционных биологических образцов, особое место занимают волосы, которые дают наиболее существенную информацию, а секционный (сегментный) анализ волос становится все более применимым на практике методом. Важное достоинство волос как образца для анализа состоит в том, что они сохраняют информацию, полученную в течение достаточно продолжительного временного периода.

Определение наркотических веществ

При разработке методов анализа на содержание наркотиков использовавшиеся в работе образцы волос собирались а) от людей, которым назначались наркотики при длительном лечении или совершенно не использующих наркотики; б) заключенных, подозреваемых судебными органами в распространении или использовании наркотиков; в) смертельных случаях по результатам медицинского освидетельствования.

От каждого пациента собирались волосы с головы, лобковой части, из-под мышек и груди. Во всех случаях было собрано 100-800 мг волос. Образцы хранились при комнатной температуре. При этом регистрировались данные о пациенте (имя, возраст, пол, профессия) и истории его лечения. Для анализа использовали 50-60 мг образца.

Для детектирования ксенобиотиков, извлекаемых экстракцией были использованы газохроматографический-масс-спектрометрический метод (ГХ-МС) и флуоресцентный поляризационный иммуноанализ (ФПИА) (прибор ABBOTT Adx, США). Электронную ионизацию (El) для масс-спектрометрических исследований проводили на масс-спектрометре Finnigan Mat (GCQtm), присоединенном к газовому хроматографу Finnigan Mat. В колонку инжектировали 1 мкл каждого образца.

Детектирование проводили по ионам с m/z 234, 401, 429 для морфина; m/z 204, 287, 340, 399 для метаболита морфина 6-моноацетилморфина; и m/z 204, 327, 369 для героина. Каннабидиол определяли по иону m/z 231; А9 тетрагидроканабинол (ТНС) по ионам m/z 231, 299, 314; каннабинол по ионам m/z 238, 295, 310. Кокаин и его метаболиты детектировали по ионам: кокаин - m/z 82, 182; метилэкогинил - m/z 82, 96; бензоилэкогонил - m/z 82,124,168.

В табл. 1 приведены результаты исследований за 6 лет для 124 объектов - диапазон и средние концентрации положительных образцов на кокаин (кокаин и его метаболит бензилэконин (BE)), морфин (морфин или 6-моноацетилморфип) и иетаболит каннабиноидов (марихуаны и гашиша) - ТНС.

В таблице приведено также количество образцов показавших отрицательные результаты анализа. Таким считался образец у которого в случае анализа на кокаин концентрация определяемого вещества была < 0.2 нг/мг, его метаболита бензоилэкогонил < 0.2 нг/мг; в случае анализа на морфин его концентрация была <02 нг/мг, его метаболита 6-моноацетилморфина < 0.2 нг/мг; и в случае анализа на каннабиноиды - концентрация ТНС была < 0.01 нг/мг.

Таблица 1

Характеристика исследованных образцов на содержание кокаина, морфина и каннабиноидов (марихуаны или гашиша).

Наркотик Общее число образцов Диапазон (нг/мг) Средние концентрации положительных образцов (нг/мг) Число отрицательных образцов

Кокаин 124 0.2-560 35.98 64(51.61%)

Каннабиноиды 124 0.01-3.1 0.65 57 (45.97%)

Морфин 124 0.2-96.8 10.87 80 (64.5%)

Концентрации в положительных образцах варьировались от 0,2 до 560 нг/мг для кокаина со средним значением 35,98 нг/мг; от 0,01 до 3,1 нг/мг для канабиноидов со средним значением 0,65 нг/мг; и от 0,2 до 96,8 нг/мг для морфина со средним значением 10,87 нг/мг.

На рис.1 в качестве примера приведены данные ГХ-МС по концентрации морфина, 6-моноацетилморфина и общего содержания опиатов в секциях волос от эксгумированной женщины. Длина трех первых секций от корневых волос была 1 см, а пяти периферийных секций по 1,5 см.

Время 1 2 3 4,5 6 7,5 9 10,5 Образец вцелом

Сегмент 1 й корень 2-й 3-й 5-й 6-й 7 й в-й

Вемя - месяцы с момента смерти Сегмент * сегмент от корня до дистяльной части волоса (8-й)

Рис.1. Сегментный профиль содержания морфина в волосах. Средняя концентрация морфина, 6-моноацетилморфина (6-МАМ) и суммарного содержания опиатов (нг/мг) в секциях (от корневых до периферических волос).

Временной интервал, приведенный на рисунке, показывает историю потребления героина за 10,5 месячный период, принимая во внимания то, что волосы росли со скоростью около 1 см в месяц. В данном случае трехмесячный период перед смертью был связан со случайным употреблением наркотика (значительное ослабление потребления наркотиков) и попыткой прекращения употребления героина (не полностью воздержавшийся субъект).

Нахождение 6-моноацетилморфина в волосах служит индикатором того, что потреблялся героин. Героин был обнаружен в сегментах 4,5, 7 и 8 на уровне, близком к

пределу обнаружения метода на основе методики экстракции растворителем и определением методом ГХ-МС.

Полученные результаты показали, что героин употреблялся в последние 10 месяц&б жизни. Уровень морфина в секциях образцов, соответствующих трем месяцам перед смертью, был значительно меньше (1,5-2,85 нг/мг), чем уровень за четвертый-десятый месяцы до смерти (7,4-14,8 нг/мг). Семимесячный профиль содержания наркотиков (среднее значение 11,33 нг/мг) в волосах указывает на то, что объект попадает в категорию наркоманов, употребляющих в больших дозах героин

Аналогичный анализ был проведен для всех 124 рассмотренных случаев.

Мы провели случайную выборку волос у наркоманов, принимавших героин и заключенных под стражу за длительное употребление наркотиков и провели секционное исследование волос от этих заключенных. Эти субъекты употребляли от 4 до 10 героиновых доз ежедневно. Данные сегментных профилей анализов волос показывают историю потребления наркотиков для каждого пациента Уровень морфина варьировался от 10 до 60 нг/мг.

Определение лекарственных веществ

В этом разделе был разработан метод анализа отложения в волосах трех антиэпилептических лекарств (карбамазепина, фенитоина и вальпроиновой кислоты). В работе были исследованы выборки из 40 пациентов, принимающих карбамазепин, из 40 пациентов, принимающих вальпроиновую кислоту и из 60 пациентов, принимающих фенитоин при припадках. Лечение происходило в течение 2-24 месяцев. Детектирование извлеченных из образцов волос ксенобиотиков проводили методами флуоресцентного поляризационного иммуноанализа и высокоэффективной газожидкостной хроматографии (ВЭГЖХ).

При подготовке образцов для ФПИА проводили растворение волос и экстракцию анализируемого вещества серным эфиром. Карбамазепин определяли методом ФПИА с использованием прибора Abbott TDx. При анализе образцов ВЭГЖХ 50 мкл экстракта волос в физиологическом растворе инжектировали в прибор Spectra-Physics. Элюцию веществ с колонки контролировали по поглощению на длине волны 220 нм. При анализе использовали колонки SPHERISORB. В качестве подвижной фазы была применена смесь ацетонитрила и воды (2:8). В качестве внутреннего стандарта использовали раствор флунитразепама в ацетонитриле (10 мкг/мл). В этих условиях удалось достичь хорошего разделения фенитоина, карбамазепина и флунитразепама

Проведенные исследования сегментных профилей изменения концентрации карбамазепина, а также антипсихотропных лекарств таких как галоперидонол и хлорпропазин в волосах пациентов, Определенный методом ФПИА, показали, что они клинически проникают в волосы пропорционально полученной дозе лекарства.

Более того, сегментный анализ лекарств в волосах дает представление об истории и дозах получения лекарств, принимая во внимание скорость роста волос.При этом было показано, что карбамазепин связывается с волосами прочнее чем галоперидонол и хлорпропазин (рис. 2).

Следует отметить, что определение в волосах карбамазепина, фенитоина и вальпроиновой кислоты показало определенное различие в результатах анализа для различного цвета волос В наибольшей мере это явление наблюдалось в случае фенитоина. Для вальпроиновой кислоты результаты были в меньшей мере связаны с цветом волос-Для карбамазепина цвет волос не оказывает существенного влияния на количество вещества, найденного в волосах. Для вальпроиновой кислоты также отмечен эффект линейного соответствия между возрастом и цветом волос.

I §

Б ■

l| ¡2

25 20 15 104

л л л Л I

11 II 11II I

1-й

2-й 3-й 4-й сегменты волос

5-й

8K ■ Ф

□ В

Рис. 2. Сравнение концентраций карбамазепина, фенитоина и вальпроиновой кислоты в сегментах волос.

Для всех исследованных лекарств показано, что наблюдается хорошая корреляция между принятой дозой лекарства и концентрацией лекарства в волосах, поэтому, определение присутствия и количества этих лекарств в волосах, может служить реальным критерием расхода лекарства и обеспечивать дополнительную информацию врачам, которые имеют данные о лечении только со слов пациентов, и проверить их соответствие.

Определение пестицидов

В ходе исследования был разработан чувствительный и селективный метод определения фосфорорганических пестицидов (диазинон, фентион и паратион-метил) в волосах. Это метод включает подготовку образца путем гомогенизации волос, экстракцию метанолом и последующую двухфазную жидкостоную переэкстракцию в этилацетат и последующий анализ методом ГХ-МС или газовой хроматографией с детекцией азота и фосфора.

ГХ-МС применялась с различными методами ионизации и детекции. Это существенно облегчает определение следовых количеств химикатов в сложных образцах, таких как волосы Наиболее часто была использованы электронная ионизация (EI) и детекция в селективной ион-мониторинговой программе, мониторинг специфических ионов для каждого исследуемого химиката, обеспечивающие более селективное и чувствительное определение, отрицательная химическая ионизация метана в качестве ионизирующего газа и детекция методом селективного детектирования ионов (SIM), что повышало чувствительность прибора Например, предел определения диазинона был в два паза ниже в измерении в оежиме ионизации отрицательными ионами (NCI), чем в режиме ионизации электронами . В табл.2 суммированы основные различия между двумя методами.

Таблица 2.

Сравнение определений по методу ионизации EI и по методу ионизации NCI.

Метод ионизации

EI NCI

Определяемое М иона Определяемое М иона

вещество вещество

Определяемые ионы Диазинон 179, 304 Диазинон 169

Фентион: 278 Фентион: 263

Предел обнаружения 0 1 нг/мг 0.05 нг/мг

Было изучено попадание диазинона в волосы подопытных животных, которые были подвержены воздействию пестицида путем добавления его в питьевую воду. В качестве подопытных животных были выбраны кролики и крысы. Определение волос крыс проводилось по методу ГХ-МС с детекцией NCI.

В экспериментах с использованием человеческих волос было выявлено влияние на результаты определений концентрации растворов и времени экспозиции измеренных концентраций. При этом было подтверждено, что концентрации пестицидов, найденные в волосах, зависят и от времени экспозиции и от концентрации раствора.

Как уже отмечалось, побочное загрязнение волос может проходить через пищу или при воздействии окружающей среды. Поэтому другой группой проанализированных в волосах пестицидов были хлорсодержащие пестициды, основным источником проникновения этих соединений в организм являются продукты питания. Такие токсикологические поражения наблюдаются до сих пор, хотя использование таких пестицидов запрещено во многих странах.

В Центральной Европе эти вещества перестали использовать с 60-х годов прошлого века, а в Греции - спустя 10 лет. Это отражается на концентрациях, определенных в волосах объектов в Греции и в Бельгии (Табл.3).

Таблица 3.

Концентрация хлорсодержащих ксенобиотиков (нг/г волос) в образцах волос , полученных от объектов из Греции, Румынии и Бельгии

Вещество Греция (п=35) Румыния (п=2) Бельгия (п=10)

(нг/г волос) Среднее значение ± SD (5-95%) Диапазон, % Среднее значение ± SD (5-95%) Диапазон, % Среднее значение ± SD (5-95%) Диапазон, %

а-ГХЦГ 1.4 ± 1.2 о.д.-5.2 3.5 2.4-4.6 1.5 ± 1.2 о.д.-2.8

р-гхцг 6.1 ±4.7 о.д,-16.3 12.0 11.7-12.3 3.5 ±1.9 1.7-7.7

у-ГХЦГ 33.8 ±17.0 18-73.7 16.3 9.8-22.8 9.6 ± 10.5 2.7-36.6

Сумма ГХЦГ 40.8 ± 14.7 21.8-95.2 31.8 24.5-39.1 14.7 ±10.9 6.0-40.8

о,п'- ДДТ 5.9 ±3.6 О.Д.-14.4 3.8 3.4-4.2 2.2 ± 1.0 о.д.-З.б

п,п'- ДДТ 22.0 ± 12.2 5-43.6 7.9 4.8-11 5.9 ±4.3 2.4-13.6

¡Сумма ДДТ 101 ±41.4 12.3-754.2 52.2 34.8-69 6 18.8 ±12.5 8.7-301.8

Сумма ПХБ 5.2 ±5.9 О.Д.-17.6 10.2 10.0-10.4 13.7 ±18.1 о.д.-44.7

* о.д. - не детектировалась (концентрация ниже, чем предел обнаружения метода). ГХЦГ - гексахлорциклогексаны, ДДТ- 1,1-[4,4'(2,4')-дихлордифенил]-2-трихлорэтан, ПХБ - полихлорированные бифенилы

В исследовании, проведенном в сотрудничестве с Лабораторией токсикологии Антверпенского университета, было обнаружено, что концентрация хлорсодержащих пестицидов в волосах людей из Греции заметно выше, несмотря на то, что некоторые из этих людей не имели никакого отношения к сельскому хозяйству В некоторых исследованиях также измерялась концентрация полихлорированных бифенилов.

Бельгийцы, проживающие в более индустриальном регионе, имели значительно более высокие концентрации диоксинов в волосах, чем греки. Аналитический метод, применяемый для этих исследований, включал кислотный лизис волос, твердофазную экстракцию веществ и их анализ с помощью методов ГХ-МС и ГХ с ион-селективной детекцией.

Результаты исследований (табл. 3, рис 3) показали, что образцы волос из Греции содержат значительно больше ДЦТ и гексахлорциклогексанов, но меньше полихлорированных бифенилов (ПХБ). Было также показано, что цвет волос, вероятно, не сильно влияет на концентрацию в них загрязнителей.

ВГХЦГ ОДДГ ЕЭПХБ

100%

75%

а

I

50% -

а

25%

0%

Греция

Румыния

Бельгия

Рис. 3. Относительный вклад ПХБ, ГХЦГ и Д ЦТ в суммарный вклад загрязнителей в трех странах

Таким образом, в целом можно сделать вывод о том, что, несмотря на различные факторы, влияющие на концентрацию соединений в волосах и которые необходимо учитывать, сегментный анализ волос может оказаться очень информативным методом для оценки влияния низких концентраций различных химикатов при длительном воздействии на человека.

2.1.2. Разработка и совершенствование флуоресцентного поляризационного иммуноанализа галондарилоксикарбоновых кислот

В настоящее время разработаны многочисленные гетерогенные и гомогенные иммунохимические методы определения биологически-активных соединений, ответственных за загрязнение продуктов питания и окружающей среды..

В настоящей работе были разработаны новые подходы, материалы и условия для дальнейшего улучшения основных характеристик метода флуоресцентного поляризационного иммуноанализа (ФПИА), как известно, основанного на различии в уровне поляризации флуоресценции специальных всщсств - трейсеров, содержащих флуоресцентную метку и способных к взаимодействию по схеме антиген-антитело.

В настоящей работе в качестве анализируемых веществ были выбраны широко используемые гербициды: 2,4-дихлорфеноксиуксусная кислота (2,4Д) и 2,4,5-трихлорфеноксиуксусная кислота (2,4,5Т). Важность анализа этих соединений подтверждает то, что именно они и некоторые другие ароматические хлорсодержащие соединения являются предшественниками диоксинов

Для проведения анализа была синтезирована серия новых трейсеров для этих гербицидов, представляющих собой меченные флуресцеинизотиоцианатом (ФИТЦ) производные 2,4Д и 2,4,5Т и Ь-лизина или этилендиамина.

Синтез новых трейсеров включал следующие стадии: а) синтез производных аналитов с L-лизином и этилендиамином, б) конъюгирование этих производных с флуоресцентным соединением ФИТЦ, в) выделение и очистка полученных веществ. Синтезированные трейсеры были очищены методом препаративной тонкослойной хроматографии. Их строение было подтверждено данными УФ- и ПМР- спектров.

Измерение поляризации и интенсивности флуоресценции для раститровок антител и градуировочных трафиков ФПИА проводилась на поляризационном флуориметре Adx фирмы ABBOTT по программе «фото-чек», предназначенной для проверки фотометрической системы прибора.

Чувствительность анализа оценивалась по определению: а) параметра 150 (концентрация антигена, дающая 50% снижение значения поляризации флуоресценции) и б) предела обнаружения (концентрации, которая соответствует снижению поляризации флуоресценции на 3 стандартных отклонения). Были также определены и другие аналитические характеристики метода ФПИА: воспроизводимость, специфичность и правильность. Для построения градуировочных кривых мы также предложили использовать зависимость отношения связанной и свободной фракции трейсера (B/F) от концентрации аналита. Для интерпретации результатов были рассчитаны константы аффинности антител с трейсерами и аналитами.

В ходе работы было показано, что наблюдается зависимость между

структурой и тушением флуоресценции, а также уменьшением квантового выхода флуоресценции. Так, наилучшие результаты были получены с моно-меченными трейсерами на основе L-лизина и было показано, что эти трейсеры улучшили характеристики иммуноанализа (параметры предела обнаружения и 15о) в 9 раз по сравнению с результатами, полученными с обычными трейсерами, которые были описаны в литературе ранее.

Использование новых трейсеров не повлияло на другие характеристики ФПИА, такие как специфичность, повторяемость, воспроизводимость и др. Обычно коэффициент вариации результатов (в одном или между анализами) не превышал 8%, а % открытия варьировался в допустимых пределах 90-110%.

Дальнейшее упрощение методу было достигнуто при использовании заранее приготовленного раствора иммунного комплекса антитело-трейсер. Такой иммунный комплекс антитело-трейсер стабилен по меньшей мере 4 месяца при хранении при 4°С. Более того, он стабилен и при комнатной температуре при его хранении в концентрированном виде (в 30 раз). Такой концентрированный иммунореагент может быть непосредственно использован для проведения ФПИА. Уменьшение на один этап добавления реагентов привело к снижению ошибок (уменьшению значения стандартного отклонения) и даже снижению предела обнаружения одно-стадийного метода по сравнению с обычным методом ФПИА.

Таким образом в этом разделе работы был разработан простой и быстрый твердофазный метод синтеза высокоочищенных гаптенов, которые нашли успешное применение в иммуноанализе, причем дополнительное введение Г>-лизина в спейсер новых трейсеров привел к более чем 10-ти кратному улучшению чувствительности ФПИА по сравнению с обычными описанными в литературе данными.

2.2. Мониторинг ксенобиотиков в условиях Греции

2.2.1. Токсикологические исследования острого и хронического воздействия пестицидов на острове Крит

Острая токсикология применения пестицидов

Был проведен мониторинг острых отравлений пестицидами в регионе О.Крит, прежде всего отравления фосфорорганическими соединениями и дипиридилиевым гербицидом паракватом, которые были зарегистрированы за 10-ти летний период (1991-2001).

В качестве образцов анализировались кровь и/или моча, а также желудочный сок, волосы и мертвые ткани. Анализы проводились различными методами после необходимых процедур экстракции при подготовке образцов. Общий токсикологический скрининг на пестициды проводили газохроматографическим методом для летучих соединений, а также методом иммуноанализа и автоматизированным газожидкостным хроматографическим методом на приборе REMEDI HS Drug Profiling System (США) Подтверждающие тесты и количественный анализ выполнялся методами газовой хроматографии (ГХ), высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЖХ) и масс-спектрометрии (МС).

Случаи отравления паракватом (4,4 '-этилен-2,2-этилен-2,2'-дипиридилийдибромидом)

Клинические и токсикологические данные по одиннадцати подтвержденным случаям отравления паракватом, произошедших на острове Крит в течение 1991-2001 годов, приведены в табл.4. У двоих объектов, покончивших жизнь самоубийством, уровень параквата в плазме был 73 и 154 мкг/мл.

Таблица 4.

Клинические и токсикологические данные по одиннадцати подтвержденным случаям отравления паракватом. произошедших на острове Крит в 1991-2001 гг

№ Пол Воз- Раствор Задерж- Начальный Лече- Продол- Резуль-

раст параква ка в уровень ние * житель- тат

(лет) -та (мл) лечении (часы) параквата в плазме (мкг/мл) ность лечения, дни

1 Ж 15 150 ** 2 1.0 ГП 40 Спасен

2 Ж 52 5-10 6 1.6 ГП-ПФ 10 Спасен

3 м 58 5-10 41 2.8 ГП 4 Умер

м 16 80-100 2Уг 4.8 Г11 28 Спасен

5 м 43 >150 -# 165 - - Умер

6 Ж 38 >150 -# 73 - - Умер

7 м 36 5-10 8 1.2 ГП 7 Спасен

8 м 49 20-30 6 2.7 ГП 4 Умер

9 м 33 150 7 6.0 ГП-ГД 3 Умер

10 м 22 30-40 2 2.1 ГП-ГД 16 Спасен

И м 31 -## 4 0.4 ГП-ГД 14 Спасен

* Стандартная процедура лечения включала: промывку желудка и бентонит, если отравление было недавним, введение внутривенно жидкости и маннитола (ГП-гемоперфузия, ПФ - плазмофорез, ГД - гемодиализ).

** Многократная рвота после отравления раствором параквата *** Случаи 4-9 были в результате попыток самоубийства

# Был найден мертвым

## Попадание параквата через кожу

Случаи отравления фосфорорганическими веществами и производными карбаматов

Клинические и токсикологические данные по подтвержденным случаям отравления фософорорганическими веществами (13 случаев) и карбаматами (6 случаев), произошедших на о.Крит в течение 1991-2001 годов, приведены в табл.5. Все случаи были суицидальными попытками за исключением случаев случайного поражения.

Клиническая картина при поражении фосфорорганическими пестицидами обычно заключается в слабости, упадке подвижности и/или сухожильном рефлексе; может наблюдаться гипотония, брадикардия, синдром дыхательной недостаточности и потеря сознания.

Таблица 5.

Клинические и токсикологические данные по подтвержденным случаям отравления фософорорганическими веществами и карбаматами, произошедшим на о. Крит в течение 1991-2001 годов

№ Пол Возраст, лет Пестицид Начальный уровень пестицида в крови, (мкг/мл) Начальная активность холинэсте-разы (ед./л) Лечение" Результат

Механическое вентилирование РАМ

1 Ж 63 Фентион 2.9 350 + + Спасен

2 М 30 Ометоат 1.6 900 - + Спасен

3 М 60_ Диметоат 9.3 480 + + Спасен

4 М 47 Метидатион 2.8 1400 + + Спасен

5 м 42 Диметоат 52.3 595 + + Спасен

6 м 69 Фентион 4.8 _ ** Умер ♦**

7 ж 36 Малатион 108.0 - Умер#

8 м 74 Метидатион 6.2 630 + + Умер

9 м 70 Метидатион 3.3 - - - Умер

10 м 58 Мекарбам 16.3 1050 + + Умер

11 м 40 Фосфамидон 40.0 - Умер#

12 м 13 Фентион 1.0 124 + + Спасен

13 м 67 Фентион 2.7 250 + + Спасен

14 м 35 Метомил 35.0 262 Умер#

15 м 58 Метомил 57.0 300 Умер ***

16 м 52 Метомил 8.0 199 Умер#

17 ж 32 Метомил 5.6 180 Умер#

18 ж 36 Метомил 28.0 245 + - Умер

19 м 60 Метомил 1.6 380 + - Умер

* Стандартная процедура лечения включала: промывку желудка и/или клизма, атропин и внутривенно введение жидкости.

** Данные недоступны

*** Быстро умер (2 часа) после воздействия и на пути в госпиталь

# Был найден мертвым РАМ - пралидоксим

Таким образом, проведенное рассмотрение токсичности выбранных пестицидов, применяемых на о.Крит, подчеркивает, что многие препараты пестицидов, используемые в сельском хозяйстве, имеют высокую токсичность и потенциально летальный эффект (смертельную опасность) На Крите и в других сельских регионах местным сельхозяйственным организациям необходимо проводить специальные семинары и другие обучающие программы для информирования фермеров по правильному использованию пестицидов и необходимым предосторожностям при использовании этих агентов И на центральном, и на местном уровне должна быть разработана законодательная система, а поставки высокотоксичных пестицидов должны быть ограничены и разрешены только для

лиц, соблюдающих все предписанные меры предосторожности. Наконец, важно, чтобы службы скорой помощи и местные врачи оказывали немедленную помощь по идентификации и лечению отравления пестицидами.

Хронические эффекты вследствие воздействия пестицидов

В этом разделе приведены исследования, связанные с воздействием используемых на Крите пестицидов на риск возникновения рака груди. Лабораторные исследования предполагали, что некоторые пестициды имеют заметную эстрогенную активность, а воздействие их высоких концентраций может привести к риску возникновения рака. В данной работе описаны результаты исследования хронического действия пестицидов.

Все исследованные пациенты были подразделены на две группы: первая группа из 522 женщин, которые по крайней мере 10 лет проработали в теплицах не менее 4 часов ежедневно (группа, потенциально подвергнутая воздействию пестицидов), и группа из 540 женщин, которые никогда не работали в сельском хозяйстве (то есть потенциально не подверженная воздействию пестицидов).

Таблица 6

Тип компонентов ткани груди в зависимости от возраста и воздействия

пестицидов

Возраст Фиброаденома Фиброжир Жир Всего

Подверженные воздействию пестицидов 40-49 93 (66.4%) 33 (23.6%) 14 (10.0%) 140

50-59 17 (7.8%) 104 (47.5%) 98 (44.7%) 219

60-75 0 (0.0%) 20 (12.7%) 137 (87.3%) 157

Всего 110 157 249 516

Неподверженные воздействию пестицидов 40-49 89(69.5%) 31 (24.2%) 8 (6.3%) 128

50-59 12 (5.5%) 101 (46.3%) 105 (48.2%) 218

60-75 0 (0.0%) 39 (20.4%) 152 (79.6%) 191

Всего 101 171 265 537

Все 106"Э женщины (возраст от 40 до 75 лет) были обследованы во время массовой проверки молочных желез по программе исследований 1988-1993 годов, и проверялись вплоть до 1998 г Статистические результаты включали показатель оценки относительного риска (КЯ).

Результаты исследований (табл. 6 и 7) показали, что женщины, подвергнутые воздействию пестицидов, имели значительно (Р < 0.05) более высокий риск иметь следующие болезни: аденофиброма, кабельная гиперплазия, склеротическое поражение желез, гиперпластическая болезнь фибры, цистит и воспалительный мастит, чем женщины, не работавшие с пестицидами. 137 из 1053 женщин были обследованы биопсией и гистологическим исследованиям.

Проведенные в этом разделе работы исследования показывают, что женщины, подверженные воздействию пестицидов, имеют более высокий риск возникновения ряда болезней, которые связаны с риском инвазивного рака груди.

Значение показателя относительного риска (Ш1) возникновения этих болезней среди женщин, подверженных воздействию пестицидов, по сравнению с неподверженными воздействию пестицидов равно примерно 2, а для фиброаденомы - примерно 5. При

сравнении женщин в этой популяции можно сделать вывод, что молодые женщины (40-49 лет) имеют более высокий риск рака молочной железы.

Таблица 7

Показатель оценки относительного риска рака молочной железы (№)

Патологии Подверженные воздействию пестицидов Неподверженные воздействию пестицидов Р

Изменения мочевых тканей: 9.9% (51) 7.4% (40) 0.169

Гиперплазия протоков без атяпии 7.0% (36) 3.7% (20) 0.020 1.87

Гиперплазия мочевых тканей и протоков 13.8% (71) 7.4% (40) 0.001 1.85

Фиброаденома: 2.7% (14) 0.6% (3) 0.005 4.86

Воспалительные маститы 6.6% (34) 3.0% (16) 0.006 2.21

Болезни мочевого пузыря 16.7% (86) 11.5% (62) 0.019 1.44

Не гиперпластические фиброзы и склерози-рующий аденоз 7.4 % (38) 3.9 % (21) 0.016 1.88

Липома: 4.5% (23) 3.4% (18) 0.364

Злокачественные изменения 3.5% (18) 2.2% (12) 0.228

Нормальные случаи 28.1 (145) 56.8% (305)

- показатель оценки относительного риска

Параллельно с обследованием молочной железы, также анализировались волосы с головы женщин на содержание хлорсодержащих пестицидов - хлорциклогексаны, ДДТ и полихлорбифенилы. Образцы анализировались методом твердофазной экстракции с последующей ГХ-МС и ГХ-ЕСО детекцией. В целом, концентрация пестицидов хлорциклогексаны и ДДТ была значительно выше в волосах женщин, которые подвергались воздействию пестицидов, тогда как концентрация полихлорбифенилы, который является индустриальным загрязнителем, была выше в волосах женщин, которые не подвергались воздействию пестицидов и жили в больших городах.

Молекулярно-токсикологические исследования

Дополнительные данные по риску заболевания раком груди при хроническом воздействии пестицидов могли дать проведенные нами молекулярно-токсикологические исследования.

В работе была сделана попытка исследовать взаимосвязь между полиморфизмом генов, включенных в метаболизм, и восприимчивостью к поражениям, возникающим при воздействии ксенобиотиков, таких как пестициды, лекарственные вещества и др. токсиканты. Исследования были сосредоточены на взаимосвязи полиморфизма генов с ферментативной детоксикацией ксенобиотиков в организме.

Конкретно исследовалось появление последовательностей (ТТТА)П в гене СУР 19, связанном с функционированием фермента ароматазы, участвующей в детоксикации пестицидов. Исследовалось появление таких последовательностей у пациентов, подвергающихся или не подвергающихся воздействию пестицидов.

Полученные результаты приведены в таблице 8. Как видно, не было обнаружено существенных различий в распределении аллелей между этими двумя группами. Это показывает, что данный конкретный факт полиморфизма не сказывается существенно на предрасположенность к возникновению рака груди. Некоторая предрасположенность к

возникновению рака наблюдалась только у пациентов у которых наблюдалась повторность (ТТТА)10.

Таблица 8

Количества повторностей (ТТТА),, гена СУР 19 для случаев с заболеванием раком груди

Число повторений (ТТТА) Количество случаев с данными повторениями (ТТТА) Р RR (при точн.95%)

Контрольная группа Группа подверженная раку

7-3 197 (0.347) 138 (0.342) 0.014 0.985 (0.765-1.267)

7 81 (0.143) 55 (0.136) 0.062 0.955(0.662-1.376)

8 49 (0.086) 42 (0.104) 0.230 1.125(0.300-4.214)

9 5 (0.009) 4 (0.010) 0.557 1.406(0.404-4.888)

10 4 (0.007) 7 (0.017) 0.122 2.460 (0.716-8.460)

11 211 (0.371) 146 (0.361) 0.048 0.973 (0.760-1.245)

12 15 (0.026) 9 (0.022) 0.159 0.844(0.366-1.947)

13 6 (0.011) 3 (0.007) 0.249 0.703(0.175-2.827)

2.2.2. Определение остаточных количеств пестицидов в сельскохозяйственных продуктах при различных типах культивирования

Уровни содержания загрязнителей в пищевых продуктах находятся под постоянным нарастающим контролем. В настоящее время наиболее широко применяемым методом, обеспечивающими высокий уровень защиты урожая является распространенный в передовых странах комплексный контроль урожая (Integrated Сгор Management - ICM), подразумевающий жесткий контроль и регламентацию на всех стадиях производства, а также систематический мониторинг остаточных количеств пестицидов. Этот подход требует развития методик применения современных методов анализа пестицидов.

Наши исследования были сосредоточены на определении содержания пестицидов в двух наиболее важных экспортных продуктах сельскохозяйственного производства Греции - персиках и оливковом масле.

Для мониторинга образцов оливкового масла была применена жидкость-жидкостная экстракция с последующим модифицированным определением по методу Lentza-Rizos. Экстракция проводилась в два этапа: жидкость-жикостная экстракция и твердо-фазная экстракция. Качественный контроль проводился на газовом-хроматоргафе модели Carlo Erba, Vega Series 6000 с детектором на азот и фосфор (NPD). Для детекции выбранных пестицидов в персиках применялась твердо-фазная экстракция. Определение проводили на газовом хроматографе с масс-спекторометрической детекцией Shimadzu QP 5050А (Япония), снабженным капиллярной колонкой MDN-5S (30 м х 0.32 мм) фирмы SUPELCO (США).

В ходе этих исследований было проведено определение в исследуемых объектах следующих пестицидов: инсектицидов - метамидофоса, диметоата, хлорпирофос-метила, паратион-метила, малатиона, хлорпирофоса, фентиона, эндосульфана, этиона, фосмета, фозалона, азинофос метила; фунгицидов - хлороталонила, каптана; акарицида: дикофола.

Результаты исследований показали, что уровни концентраций обнаруженных пестицидов - паратион-метила, малатиона и хлорпирифоса были ниже максимально допустимого в тех образцах персиков, которые были получены при культивировании по

методике ГСМ. При этом было установлено, что уровень остаточных количеств пестицидов снижался в зависимости от времени сбора (рис. 4).

Метод ЮМ Обычный метод

Предельно допустимые концентрации

1/6-15/6 15/6-30/6

1/7-15/7 15/7-30/7 Дата

1/8-15/8 15/8-30/8

Рис. 4. Концентрации хлорпирифоса в образцах персиков в зависимости от времени сбора (пунктиром показан предельно допустимый уровень согласно требованиям FAO/WHO Codex Alimentarus MRLs)

При исследовании содержания пестицидов в оливковом масле были сравнены образцы, полученные при культивировании по методу ICM и при обычном культивировании на островах Греции. При этом наиболее выражено было содержание фентиона и диметоата.

Было показано, что уровень остаточного содержания пестицидов при культивировании по методу ICM был ниже, чем при обычном культивировании, причем уровень фентиона был выше, чем уровень остатков диметоата. Возможно, это определялось вымыванием водорастворимого диметоата с водной фазой при производстве масл, в отличие от фентиона, растворимого в жирах.

Таким образом, в данном разделе приведены примеры применения современных аналитичексих методов при мониторинге содержания пестицидов в сельскохозяйственной продукции.

2.23. Изучение фармакокинетики некоторых лекарств групп антибиотиков и антиаритмиков

Изучение фармакокинетики лекарственных веществ в организме - один из основных путей выявления безвредности или причин токсических поражений после их приема В соответствии с задачами лаборатории в данной работе приведены примеры такого исследования для ряда лекарств - цевтриаксона (ceftriaxone), используемого при послеоперационном лечении, а также прокаинамида (procainamide) и амиодарона (amiodarone), применяемых в качестве антиаритмических средств. При этом с использованием статистических методов была изучена фармакокинетика и проведен их токсикологический анализ.

При исследовании фармакокинетики цевтриаксона была рассмотрена возможность эффективного введения одной дозы лекарства для профилактики инфекционного заражения после операций и была предложена инъекция лекарства внутрь раны вместо его

внутривенного введения. Для решения этих задач было проведено: определение уровня цевтриаксона в плазме пациентов после полостной операции; сравнение уровня цевтриаксона в тканях раны с терапевтическим уровнем и нахождение скорости и степени систематической адсорбции цевтриаксона в течение 24 часового периода после операции.

Для проведения исследования было проведено определение цевитаксона в крови методом ВЭЖХ. Пробы для определения отбирались в период 0-24 часа после операции. При этом лекарство предписывалось введением внутрь раны н внутривенно

При исследовании проводилось определение цевтриаксона в различных объектах -плазме, ткани раны и в жидкости из раны. 1

Было установлено, что концентрация цевтриаксона после введения в тканях раны и эксудате была выше, чем в плазме. Этот повышенный уровень лекарства сохранялся в течение проведения операции. Это подтверждает перспективность непосредственного введения препарата в зону раны.

Таблица 14.

Концентрация цевтриаксона в тканях и жидкостях из раны (при введении в рану) и в плазме(при внутривенном) введении.

Образец Концентрация цевтриаксона в конце операции

Продолжительность операции 40-70 мин. Продолжительность операции 70-120 мин. Продолжительность операции 120-180 мин.

Ткань раны, мкг/г 1.282 ±404 657 ± 320 255±209

Жидкость из раны, мкг/мл 859 ±345 431 ±279 117 ± 45

Плазма (внутривенное введение),мкг/мл 197.7±32.2 (через 1 час) 197.7±32.2 (через 2 часа 122.7±22.3 (через 3 часа)

Уровень прокаинамида в сыворотке определяли ^методом ВЭЖХ, а также методом поляризационного флуороиммуноанализа (ПФИА) на приборе ТДх фирмы Abbott, что позволяло убедиться в правильности определения уровня лекарства. Уровень амиодарона в сыворотке определяли методом ВЭЖХ.

Параллельно определялась эффективность этих лекарств для достижения синусоидального ритма биения сердца. Определение уровня лекарств прокаинамида и амиодарона проводилось в течение 30 дней после предписания лекарств. Образцы крови для определения уровня амиодарона, и дигоксина в плазме отбирали через 1 час, 24 часа и 30 дней. При этом было проведено сравнение внутривенного успокоительного предписания и предписания при лечении с учетом продолжительности аритмии, размера левого предсердия, продолжительность артериальной фибрилляции предсердий, скорости сокращения сердца и числа эпизодов.

Было установлено, что пациенты, получающие 4миодарон, имеют в 6 раз больше шансов к возвращению к синусоидальному ритму сердцебиения, чем пациенты не получающие такого лечения. Однако, на эффективность лечения амиадароном оказывают влияние такие факторы как продолжительность аритмии и размер левого предсердия. Средняя эффективность лечения амиодароном очень высока (> 90%), но у пациентов с очень большим левым предсердием и хронической фибрилляции предсердия, эффективность падает до относительного низкого уровня (61% and 34,6%, соответственно). Эффективность лечения амиодароном пропорциональна продолжительности лечения.

2.3. Использование макромолекулярных систем для снижения отрицательного действия или повышения эффективности ксенобиотиков

В последнее время широкое внимание уделяется различным типам макромолекулярных систем, находящих применение в медико-биологических областях. В связи с этим большое значение приобрела возможность использования полимеров с одной стороны для снижения отрицательного действия ксенобиотиков на организм человека и, с другой стороны, для улучшения их использования.

В настоящей работе рассмотрен ряд новых макромолекулярных систем, связанных во первых с возможностью дезактивации с их помощью токсинов за счет сорбции, и во-вторых, с возможностью повышения эффективности ряда ксенобиотиков с различной биологической активностью - антифунгалъной, антивоспалительной, гербицидной.

Решение этих задач позволяло с одной стороны синтезировать новые практически ценные макромолекулярные системы с иммобилизованным низкомолекулярным ксенобиотиком, а с другой, разработать общий подход к целенаправленному синтезу полимеров с заданными характеристиками и прогнозированию уровня активности вновь синтезируемых систем с контролируемым выделением активного вещества.

2.3.1. Использование пористых полимерных гелей для сорбции иикотоксинов

Проблема поражения пищевых продуктов и фуража грибами и их токсичными метаболитами (микотоксинами), широко известна.

В настоящее время разработан ряд подходов к инактивации микотоксинов, попавших в пищу и корм животных. Важнейшее место среди методов дезактивации микотоксинов занимает сорбционное извлечение микотоксинов. Этот метод дезактивации является самым простым и заключается в добавлении в корм различных сорбентов, связывающих токсиканты и не позволяющих им проникать в кровеносное русло и распространяться в ткани организма. В настоящей работе рассматривается принципиально новый тип сорбентов на основе сшитого поля-М-винилпирролидона - его пористых гелей, полученных сополимеризацией мономерного N-винилпирролидона (ВП) со сшивающим агентом N,N'- метиленбисакриламидом (МБАА) в условиях присутствия в полимеризуемой системе гетерофазы. Этот принцип реализуется проведением реакции сополимеризации в замороженных растворах. Образующиеся при этом пористые гели обладают развитой пористостью с размером крупных пор 1-100 мкм Методы синтеза таких пористых сшитых гидрогелей, их свойства и способность к набуханию в водных средах и растворах солей приведены в опубликованных нами работах.

Для оценки эффективности полученных пористых гелей в качестве сорбентов, была изучена сорбция ими микотоксинов zearalenone (3PJI) и ochratoxin А (ОХРА) (размер частиц использовавшихся сорбентов был 0,5-1,0 мм в сухом состоянии). Эти микотоксины являются типичными токсикантами, продуцентами микроскопических грибов групп Aspergillus и Pénicillium.

Для сравнения были рассмотрены сорбция этих веществ стандартным сорбентом Polyplasdon и активированным углем (марка Carbomix). В табл.9 приведены полученные данные по сорбции.

Как видно, синтезированные пористые гели проявили значительную величину сорбции, превышающую сорбцию, наблюдавшуюся в случае промышленного сорбента Polyplasdon. А сорбционная емкость образца 4 приближалась к значениям активированного угля. При этом емкость гелей практически не зависела от исходной концентрации микотоксина (для случая ЗРЛ) и находилась в прямой зависимости от пористости исследуемых гидрогелевых систем (выбраны образцы наиболее отличающиеся по степени развитости пористости). Количество сорбированных микотоксинов определяли методом ВЭЖХ по количеству

оставшегося сорбата в водной фазе. Предварительно была подтверждена химическая стабильность микотоксинов в условиях анализа

Таблица 9

Сорбция микотоксинов пористыми гелями на основе СПЛ ВП-МБАА, сорбентом Ро1ур1айёоп и активированным углем

Сорбент Количество пор в 1 см3 Сорбция, мкг/г

ЗРЛ, 12,5 мкг/мл* ЗРЛ, 3,5 мкг/мл* ОХРА, 3,5 мкг/мл*

2 1,42x10" - 672 549

4 5,16x10" - 1260 1180

6 2,39x10" 501 432 300

7 3,13x10" 797 782 498

8 4,59x10" 996 911 670

Ро1ур1аз<к>п - 550 483 201

Активированный уголь - - 1370 1350

* Приведена концентрация исходного раствора микотоксина

Для исследования динамики сорбции был использован метод ВЭЖХ, позволяющий определить концентрацию свободных микотоксинов. Рассмотрение кинетических зависимостей показало, что процесс сорбции протекает достаточно быстро и более половины сорбата адсорбируется в течение 3-4 минут. При этом за 15-17 мин с сорбентом связывается основная часть токсинов (около 80%). В дальнейшем процесс достаточно резко замедляется, хотя его продолжение наблюдается до минимум 120 мин. (примерно до 90% сорбата).

Для рассмотрения закономерностей сорбции микотоксинов пористыми гидрогелями поливинилпирролидона были использованы уравнение изотермы Ленгмюра и уравнение изотермы Фрейндлиха. Результаты исследования показали, что сорбция зеараленона несколько лучше описывается моделью Ленгмюра. Последнее заключение подтверждается тем, что изотерма Ленгмюра описывает адсорбционные результаты лучше, чем изотерма Фрейндлиха для малых количественных отношениях ЗРЛ и сорбента

Таким образом показано, что новые пористые гели на основе сополимера >1-винилпирролидона и N ,М'-метилен-бис-акриламида обладают высокой сорбционной способностью по отношению к микотоксинам (на примере охратоксина-А и зеараленона), и могут быть применены для решения проблем, связанных с необходимостью вывода микотоксинов из различных сред. При этом установлено, что способность отдельных образцов гелей к сорбции определяется развитостью пористой системы гелей.

2.3.2. Полимерные производные фунгицидов

Использование фунгицидов и фунгистатиков играет важнейшую роль в защите пищевых продуктов и фуража от поражения микроскопическими грибами и их продуцентами - микотоксинами, а также в лечении и профилактике ряда заболеваний, вызываемых этими микроорганизмами. В настоящей работе рассмотрен рад новых систем с контролируемым выделением фунгицидов и показана их эффективность.

Для того, чтобы показать эффективность предлагаемых методов в качестве модельных фунгицидов в работе были рассмотрены широко распространенные и изученные фунгистатик сорбиновая (2,4-гексадиен-1-карбоновая) кислота (а) и обладающий антифунгальной активностью антибиотики нистатин (б) и амфотерицин В (в). Эти антифунгальные агенты действуют на грибы в соответствии с различными

механизмами, что, как будет показано ниже отражается на свойствах их иммобилизованных форм.

Исследования антифунгальной активности в отношении ингибирования роста мицелия проводились в условиях стандартного агарового теста по измерению размеров колоний. Для оценки действия полимерных производных фунгицидов на споры было использовано исследование прорастания спор Ршагтт охизрогит Г.вр. гасНЫз-сиситеппит в условиях среды картофельной декстрозы в присутствии глюкозы.

Полимерные формы сорбиновой кислоты

В работе были рассмотрены два типа систем, в которых СК была связана с полимерным носителем связью различной прочности - полимерные производные СК, в которых она была связана с основной полимерной цепью гидролитически лабильной сложной эфирной связью (полимерные эфиры СК), и полимерные комплексы СК с полимерным носителем, образовнные за счет межмолекулярной водородной связи.

При этом в качестве полимерного носителя для получения полимерных комплексов был использован поливинилпирролидон (ПВП), который с одной стороны не обладал собственной антифунгальной активностью, а с другой стороны образовывал межмолекулярные комплексы с веществами различных классов, в том числе, с карбоновыми кислотами, а после введения в него дополнительных функциональных групп мог быть использован для ковалентного связывания СК. Для выявления влияния на биологическую активность и свойства получаемых систем их строения в работе был использован ПВП различной молекулярной массы - от 10 до 360 тыс.

Для получения полимерных носителей, способных образовывать с СК полимерные эфиры был использован метод введения в ПВП эпоксидных групп. В этом случае эпоксидные группы были введены в полимер в условиях реакции Дарзана при взаимодействии карбонильной группы пирролидонового кольца с хлорацетамидом в спиртовой среде в присутствии алкоголята натрия. Содержание эпоксидных групп в полученных полимерах было 7-11 мол.%, что позволило получать полимерные эфиры с достаточно высоким содержанием кислоты при сохранении растворимости в воде всей системы.

Синтез полимерных эфиров проводили взаимодействием ПВП и СК в диметилформамиде при 90°С. Содержание кислоты определяли по поглощению в УФ-области при 254 нм. Полимерные комплексы СК и ПВП получали при нагревании реагентов в водной среде или в среде этанола и выделяли осаждением в серный эфир.

Строение полученных полимерных производных сорбиновой кислоты было подтверждено элементным и функциональным анализом, а также спектрально - методами ИК-, УФ- и ЯМР-спектроскопии. Количество СК в комплексах было около 2,5 масс %.

Связывание СК и полимерного носителя в полимерных комплексах, как было показано ИК-спектральным анализом (пленки нанесенные на германиевые стекла), реализовалось за счет водородной связи между карбонилом пирролидонового кольца и протоном карбоксильной группы СК.

Исследование комплексов, образованных полимерами различной молекулярной массы показало, что прочность связывания СК повышается с увеличением молекулярной массы полимерного носителя. Этот факт был подтвержден исследованием скорости выхода кислоты из комплексов, образованных различными полимерами, через диализную мембрану, изменением интенсивности областей поглощения, отвечающих системе -0Н»«0=С (2212, 2400-2600 см-1), а также исследованием методом флуоресценции конкурентного связывания с ПВП СК и флуоресцентного зонда (1-анилинонафтил-8-сульфокислоты), находящегося в свободном состоянии в виде не флуоресцирующего димера (длина волны возбуждения 373 нм, длина волны максимума эмиссии 480 нм) Как показали исследования вязкости разбавленных растворов выбранных образцов ПВП и комплексов на их основе, связывание кислоты приводит к компактизации

макромолекулярного клубка полимера, что также влияет на скорость выхода свободной кислоты.

Как было показано, все полимерные комплексы, а также полимерный эфир с молекулярной массой Mw=10 кДа показали более высокий ингибирующий эффект, чем СК в воде в отношении ингибирования линейного роста мицелия FO при концентрации 800 ррт (рис. 21). В то же время, все полимерные комплексы были более эффективны, чем полимерные эфиры.

Высокая антифунгальная эффективность полимерных комплексов СК наблюдалась и для других типов грибов (Candida albicans, Candida tropicalis, A. Parasiticus, P Viridicatum). Во всех этих случаях активность кислоты была выше, чем активность сорбата калия.

Зависимости «доза - степень ингибирования» линейного роста мицелия в случае сорбиновой кислоты и ее полимерных комплексов имели вид пропорционально возрастающих зависимостей.

Это, вероятно, определяется более высокой скоростью выделения низкомолекулярного вещества из иммобилизованных препаратов при более низкой молекулярной массе полимерного носителя, что способствует созданию более высокой концентрации препарата в растворе.

Степень ингиб.,%

■ ■

СК Поли- Поли- Поли- Поли- Поли- Полимерный мерный мерный мерный мерный мерный эфир эфир эфир компл компл. компл. ЮкДа 40кДа 360 кДа ЮкДа 40кДа 360 (Да

Рис. 5. Ингибирующий эффект сорбиновой кислоты и ее полимерных производных по отношению к росту мицелия Fusarium oxusporum f sp radicis-cucumermum (концентрация по СК - 800 ppm, температура 27°С, время - 6 дней, рН=6.4, в темноте).

Исследование зависимостей антифунгальной активности сорбиновой кислоты и ее комплексов на основе ПВП различной молекулярной массы от времени при ингибировании роста мицелия Candida tropicalis TEI184 и Aspergillus parasiticus 1130 от времени показало, что активность препарата повышалась при снижении молекулярной массы полимерного носителя и была выше, чем у свободной СК.

Таким образом, использование СК в виде полимерных комплексов с ПВП придает препаратам растворимость в воде и более высокую активность по отношению к ингибированию роста мицелия различных микроорганизмов, относящихся к микроскопическим грибам При этом активность повышается при снижении молекулярной массы полимерного носителя, когда устойчивость комплекса ниже, чем для комплексов на основе полимеров с бочее высокой молекулярной массой.

Полимерные производные антибиотиков

В работе была исследована активность комплексов нистатина и амфотерицина В с ПВП различной молекулярной массы в отношении роста мицелия и прорастания спор

Fusarium oxusporum f sp radicis-cucumerinum (FO) в сравнении с активностью неиммобилизованных антибиотиков.

Полимерные комплексы получали в метаноле. При этом было получено шесть полимерных комплексов антибиотиков и ПВП с использованием полимера различного молекулярного веса. Содержание антибиотиков в комплексах было около 0.25 масс.%.

Значения ED50 комплексов нистатина против роста мицеллия представлены в Табл. 10. Как видно, активность комплексов повышалась с увеличением молекулярной массы полимерного носителя.

Таблица 10

Значения ED50 (ррт) для нистаина и его полимерных комплексов в отношении ингибирования роста мицеллия FO (температура 28°С, рН=7,0, в темноте)

Вещество Mw, кДа ED5o (ррт) SD CV(%) Р

Нистатин 35.7 ±5.214 14.605

Комплекс 25 25 20.8 ±4.154 19.947

Комплекс 30 30 16.3 ± 1.962 12.057 0.000131

Комплекс 40 40 13.7 ±2.585 18.812

Комплекс 90 90 11.7 ±0.151 1.288

Комплекс 360 360 9.1 ±2.437 18.655

Сохраняется отмеченная зависимость активности полимерных комплексов нистатина от молекулярной массы полимерного носителя и при воздействии на споры микроскопических грибов (Табл. 11).

Таблица 11

Значения ED50 (ррт) для нистатина, амфотерицина и комплексов нистатина с ПВП (Mw = 10, 40 и 360 кДа) против прорастания спор Fusarium oxusporum f.sp. radicis-cucumerinum (28°C, pH-7.0 (1 M tris-буфер) 0.01 % раствор глюкозы.

Вещество (водный раствор) Mw, кДа EDso, ррт SD CV(%) Р

Комплекс 360 360 0.1239 ±0.0160 12.898 0.0362

Комплекс 40 40 0.4553 ± 0.0364 15.734

Комплекс 10 10 0.2314 ±0.0851 18.694

Нистатин (в метаноле) - 3.142 ±0.1390 4.423

Амфотерицин В (в метаноле) - 8.399 ± 1.402 16.692

Таким образом, результаты исследований, приведенные в этом разделе показывают, что во-первых при применении иммобилизованных биологически активных веществ, для которых желательна реализация их биоцидного или угнетающего (в данном случае -фунгистатического) действия, прочность связи с полимерным носителем не должна быть чрезмерно прочной, и во-вторых, роль строения полимерного носителя проявляется в том числе в соответствии с механизмом биологического действия активного вещества.

Так, менее стойкие комплексы СК были более активны, чем ее полимерные эфиры, выделяющие кислоту с меньшей скоростью. И в этом случае преимущество иммобилизованных форм проявляется в первую очередь в придании СК растворимости в воде, причем, существенно, что из комплекса кислота выделяется в более активной карбоксильной форме, что нельзя обеспечить использованием солей кислоты, не только менее активных, но и более неустойчивых к процессам разрушения.

С другой стороны, в отличие от полимерных комплексов СК активность полимерных комплексов исследовавшихся антибиотиков повышается с увеличением молекулярной массы полимерного носителя (рис.6).

Концентрация(ппм)

Рис.6. Ингибирование прорастания спор Fusarium oxusporum f.sp. radicis-cucumerinum в присутствии нистатина и его комплексов с ПВП с молекулярным весом 10 кДа, 40 кДа и 360 кДа, соответственно, в чистой культуре (28°С, 10 ч., рН=7.0 (1 М tris-буфер), 0.01 % раствор глюкозы).

По видимому, это явление связано с различием в механизме действия этих антифунгальных агентов. Как было отмечено выше, CK действует на микроорганизм через участие во внутриклеточных процессах, т.е. после проникновения в клетку низкомолекулярного вещества. В этом случае более слабая связь CK с низкомолекулярным ПВП обеспечивает большую концентрацию активного вещества.

Механизм действия нистатина и амфотерицина связан с взаимодействием с мембранами микроорганизмов, с некоторыми компонентами которых они вступают в аффинное взаимодействие и повышение молекулярной массы полимерного носителя улучшает условия взаимодействия комплексов с мембранами микроорганизмов.

2.3.3. Иммобилизация индометацииа

Особенно важную роль играет иммобилизация на полимерных носителях биологически активных, в первую очередь - лекарственных соединений, имеющих высокий уровень побочной активности. В данной работе в качестве такого иммобилизуемого соединения рассмотрено известнное лекарственное соединение, обладающее антивоспалительной и анальгетической активностью - индометацин - 1-(4-хлорбензоил)-2-метил-1Н-индол-3-уксусная кислота.

Несмотря на то, что индометацин является одним из наиболее мощных из известных препаратов с таким спектром активности, возможность его использования в значительной мере ограничена в связи с наблюдаемым побочным действием и высокой токсичностью. В то же время, как было показано, создание водорастворимых иммобилизованных форм индометацина позволяет значительно расширить возможности его использования для лечения сответствующих заболеваний при различных методах введения.

В этом разделе разработаны доступные методы синтеза полимерных производных индометацина. В соответствии с этим в качестве полимеров-носителей в работе были

использованы водорастворимые сополимеры Н-винилпирролидона с аллилглицидиловым эфиром (ВП-АГЭ и винил-2-хорэтиловым эфиром (ВП-ВХЭЭ), и сополимер акриламида с последним сомономером (АА-ВХЭЭ) с молекулярной массой М\у около 20 тыс и содержанием заеньев с активными группами около 10 мол.%. В этих случаях в реакцию с полимерными носителями вводили, сотвественно, саму кислоту или ее калиевую соль. Синтез полимерных эфиров описан в диссертации и опубликованных работах. Полученные полимерные эфиры содержали около 3-5 мол.% (19-22 масс.%) индометацина.

Токсикологические исследования полимерного эфира индометацина включали в себя исследование ульцерогенного действия полимерных производных индометацина на слизистую оболочку желудка крыс. Исследования проводили с использованием полимерного эфира, полученного на основе сополимера М-винилпирролидона и аллилглицидилового эфира с содержанием индометацина около 21 масс.% (5 мол.%).

Выраженность эффекта оценивали в баллах: 0 - нормальная слизистая, 0,5 -гиперемия, 1,0 - единичные эрозии слизистой, 2,0 - множественные эрозии, 3,0 -множественные эрозии, охватывающие % поверхности (субтотальное поражение), 4,0 -множественные эрозии и язвы по всей поверхности слизистой (тотальное поражение). Ульцерогенное действие выражали также в % к максимальному поражению (4 балла).

Полученные результаты приведены в табл. 12. Для сравнения приведены данные по низкомолекулярному индометацину.

Таблица 12.

Ульцерогенный эффект полимерного эфира индометацина

Вариант Доза, мг/кг Ульцерогенный эффект*

подкожно** Баллы % от максимума

Контроль - 0,17 + 0,09 4 + 2

Полимерный эфир 30 0,58 + 0,18 15 + 5

Полимерный эфир 90 1,42 + 0,27 36 + 7

Полимерный эфир 10 1,58 + 0,45 40+11

Индометацин 30 1,92 ±0,36 48 + 9

* Определены как среднее для 8-10 животных.

**Доза расчитывалась с учетом содержаниия в полимере индометацина.

Как видно, ульцерогенное действие (т.е побочное токсическое действие) в случае полимерного эфира выражено значительно в меньшей степени, чем в случае низкомолекулярного индометацина. Степень поражения при введении полимера при одинаковой дозе по индометацину была выражена более чем в три раза слабее.

Лекарственную активность иммобилизованных форм индометациена оценивали по их противовоспалительному и анальгетическому действию Конкретные результаты этих исследований приведены в работе.

Противовоспалительное действие полимерных форм индометацина оценивали с использованием тестов на каррагениновый отек лапы крыс и асептический перитонит у мышей. При изучении уровня каррагенинового отека опыт проводился на крысах-самцах (120-140 г) после введения 0,1 мл 1% раствора каррагенина Выраженность отека лапы оценивали онкометрически с помощью плетизмометра фирмы Ugo Basile (Италия) через 2 ч после индукции воспаления. При изучении противоспалительной активности по отношению к асептическому перитониту опыты проводились на мышах самцах с массой 22-25г. При этом оценивали эксудативную реакцию (перитонит), вызванную внутрибрюшинным введением 0,25 мл 1%-го раствора уксусной кислоты. Выраженность эксудации оценивали по объему эксудата, образующегося в брюшной полости через 2 часа после инъекции уксусной кислоты. Антиэксудативное действие выражали в % уменьшения количества эксудата по отношению к контролю. Раствор полимера вводили в дозах 10, 30 и 100 мг/кг за 1 час и подкожно (3,10 и 30 мг/кг) за 30 мин. до введения уксусной кислоты.

Анальгетическое действие оценивали тестом «корчей у мышей» и тестом «давления на воспаленную лапу у крыс». Анальгетическое действие выражали в % уменьшения гиперальгезии по сравнению с контролем, а также в % уменьшения количества корчей по сравнению с контролем. Корчи у мышей, вызванные уксусной кислотой изучали на мышах-самцах (масса 22-25 г). При исследовании анальгетического действия методом давления на воспаленную лапу у крыс оценивали влияние вводимого анальгетика на снижение порога чувствительности (ДПБЧ) - гиперальгезии, вызванной каррагенивовым воспалением. Уровень ПБЧ замеряли посредством анальгезиметра фирмы Ugo Basile (Италия). Анальгетики вводили за 1 час до введения каррагенана. В этом тесте опыты проводились на крысах-самцах массой 120-140 г.

Во всех рассмотренных случаях уровень антивоспалительного и анальгетического действия был близок к уровню активности не иммобилизованного индометацина. Т.е. несмотря на пролонгированное выделение индометацина из полимерной формы, что выражается в снижении побочной токсичности, последняя проявляет высокий уровень противовоспалительного и анальгетического действия.

Полимерные формы индометацина были использованы для изготовления текстильных бандажей Такие бандажи, содержащие низкомолекулярный индометацин, в настоящее время разрешены к используются при лечении болезненных проявлений в коленных и локтевых суставах. Бандажи были изготовлены из хлопковой ткани, которую пропитывали водным раствором полимерного эфира индометацина, полученного с использованием полимерного носителя сополимера винилпирролидона и аллилглицидилового эфира.

Динамику выделения свободного индометацина в модельных условиях проводили при рН=7,4, контролируя количества выделившегося индометацина по поглощению при 322 нм. Было показано, что в случае использования бандажей с иммобилизованным индометацином выход препарата происходит значительно медленнее, что позволяет избежать его аллергирующего количества в биологических жидкостях. Это позволяет ввести в них большее количество препарата без проявления побочного действия, пролонгируя их действие.

Эффект действия таких бандажей, содержащих различные количества индометацина был сравнен с действием стандартных бандажей с введенным низкомолекулярным индометацином. Исследования проводили на волонтерах с диагностированным артрозом коленей В эксперименте положительное действие бандажей наблюдалось как значительное снижение болевых ощущений. Также было отмечено, что по сравнению с контрольными бандажами, в случае применения которых наблюдались аллергические явления, в случае использования бандажей с иммобилизованным индометацином подобные явления отсутствовали.

При этом наблюдаемое количество действующего вещества в крови было в диапазоне 0,02-0,11 мг/мл, в синовиальной жидкости пациентов оно достигало 0,06-0,33 мг/мл (высокоэффективная жидкостная хроматография). Т.е. в случае бандажей с иммобилизованным индометацином поступающий в организм препарат оказывается преимущественно в синолвиальной жидкости

Проведенные исследования показали, что иммобилизация индометацина с образованием гидролизуемой ковалентной связи с водорастворимым полимерным носителем позволяет получить биологически активные полимеры, которые обладают близким к неиммобилизоваенному индометацину уровнем лекарственной активности, но оказывают значительно меньшее отрицательное действие. Такие полимеры могут быть использованы в составе известных лекарственных форм индометацина.

2.3.4. О возможности регулирования активности полимерных производных ксенобиотиков

Регулирование свойств и активности ксенобиотиков является серьезной проблемой, привлекающей значительное внимание как с точки зрения снижения эффекта от их

отрицательного воздействия на живые организмы, в том числе организм человека, так и с точки зрения возможности получения на их основе препаратов с тем или иным полезным действием.

В частности это относится к некоторым биоцидам, оказывающим на живые организмы ингибирующее или другое отрицательное действие, но проявляющим стимулирующую активность при пониженных концентрациях.

Однако, развитие этой области в значительной мере тормозится крайней ограниченностью сведений, касающихся взаимосвязи строения и свойств образующейся при иммобилизации макромолекулярной системы характером и уровнем ее биологической активности. В данной работе такая взаимосвязь изучена в ряду полимерных производных известного гербицида 2,4-дихлорфеноксиуксусной кислоты (2,4-Д), широко применяемой в значительных дозах для поражения определенных видов растений, но в то же время, проявляющей ростстимулирующую активность при низких концентрациях.

Это исследование было выполнено нами в рамках решения проблемы синтеза и исследования фитоактивных полимеров (полимерных производных регуляторов роста растений) как новых высокоэффективных типов для растениеводства, в ходе работы над которой нами была получена большая группа полимеров, обладающих различной биологической активностью, что отражено в ряде наших публикаций и патентах.

Для исследования был выбран ряд поливиниловых эфиров 2,4-дихлорфеноксиуксусной кислоты (2,4-Д) - регулятора ауксиновой группы, которые значительно отличались по склонности к гидролизу. При этом в качестве характеристики полимера была выбрана скорость гидролитического выделения из него низкомолекулярного бмологически активного вещества, непосредственно связанная с его химическим строением.

Синтез поливиниловых эфиров проводили ацилированием хлорангидридом кислоты в среде диметилацетамида образцов поливинилового спирта различной молекулярной массы - Mw = 12х103, 29х103 и 65х103 Да. В работе были использованы образцы поливинилового спирта, содержащие не больше 1 мол.% остаточных ацетатных групп. Количество введенных в полимер остатков кислоты (2-34 мол.%) регулировали изменяя соотношение реагентов.

Поскольку исследование скорости гидролиза фитоактивных полимеров в реальных условиях затруднено, мы оценивали скорость гидролиза исследуемых полимерных эфиров в модельных условиях Гидролиз полимерных эфиров изучали методом высокоэффективной жидкостной хроматографии при рН=10.0. Склонность полимеров к гидролизу характеризовали начальной константой скорости гидролиза. Эффективную константу скорости реакции для начальной стадии гидролиза (ке/ рассчитывали в соответствии с уравнением второго порядка. Определенные значения ке/° изменялись в пределах 0 02-20.8 л.моль"'с", повышаясь с уменьшением молекулярной массы полимерного носителя и содержания в полимерном эфире остатков регулятора. Конкретные значения ке/ для полимерных эфиров различного строения приведены в тексте диссертации.

Была исследована взаимосвязь константы скорости гидролиза и уровня и характера биологической активности. Для характеристики биологической активности был использован стандартный биотест на регуляторы группы ауксинов - стимулирование отрезков колеоптилей проростков злаков. В данном случае в качестве биологических объектов были выбраны пшеница (Triticum aestivum L., сорт Virginä) и ячмень (Hordenum vulgare L., сорт Hexatichum).

При исследовании биологической активности было найдено, что характер концентрационной зависимости активности кардинально зависит от строения полимера.

Так, полимерные эфиры со значениями начальных скоростей гидролиза в щелочных условиях 0 021-0.035 л.мольбе"1 и содержанием звеньев с остатками 2,4-Д 30.1-33.5 мол % не проявляли никакой активности во всем диапазоне концентраций. В этом случае

концентрация выделившегося регулятора была мала даже при высоких количествах введенного полимера.

Концентрационные зависимости для высоко гидрофильных и водо-растворимых полимеров с низким содержанием звеньев с остатками 2,4-Д 2.4-3.0 мол.% и значениями начальных скоростей гидролиза 7.4-20.8 л.моль~'с~' имели вид экстремальных зависимостей с тенденцией к ингибированию при высоких концентрациях, подобных зависимостям, характерным для низкомолекулярного регулятора.

С другой стороны, полимеры, содержащие промежуточные количества иммобилизованного регулятора (11.2-14.8 мол.%) и имеющие константы скорости гидролиза ке/° в диапазоне 0.38 - 1.43 л.моль"'с'' демонстрировали оптимальные профили концентрационных зависимостей. Эти полимеры стимулируют удлинение отрезков колеоптилей в широком диапазоне концентраций, причем уровень стимулирования практически не снижается при высоких концентрациях полимеров, а уровень стимулирования был заметно выше, чем в случае низкомолекулярной кислоты.

Было установлено, что полученные результаты могут быть использованы для обсуждения влияния скорости гидролиза на уровень активности и других полимерных систем этого же регулятора. В работе были исследованы гидролиз и активность ряда сополимеров аллилового эфира 2,4-Д (АЭ 2,4-Д) с акриламидом, >1-винштирролидоном и акриловой кислотой.

Для этого ряда полимерных эфиров было показано, что несмотря на значительное отличие в сроении полимеров, диапазоны стимулирования и ингибирования соответствовали полимерам с такими же значениями констант гидролиза, как и в случае поливиниловых эфиров 2,4-Д.

Проведенное исследование показывает, что выяснение параметров для прогнозирования биологической активности различных полимерных производных конкретного регулятора роста растений возможно с учетом знания оптимальных констант скоростей гидролиза, определенных в условиях т-уКго. Это подразумевает также возможность прогнозирования уровня и характера активности исходя из определенных в модельных условиях параметров гидролиза. По-видимому эти выводы могут быть использованы в прогнозировании активности некоторых других систем с контролируемым выделением биологически активного вещества.

Выводы

1. Разработан комплекс новых подходов к анализу, детоксикации, модификации, мониторингу ксенобиотиков различного типа (пестициды, наркотики, лекарства).

2. Выявлены факторы, влияющие на эффективность определения ксенобиотиков при сегментном анализе волос - методы подготовки образцов, влияние их экзогенного загрязнения, сроки и происхождение образцов и др. - что позволило разработать оптимальнеые методики определения пестицидов органофосфатной и карбаматной групп - метамила и диазинона, а также лекарственных веществ группы антиэпилептиков - карбамазепина, фенитоина и вальпроиновой кислоты. Были выявлены характеры корреляции между концентрациями в волосах и оценкой степени тяжести наркомании для наркотиков групп опиатов, кокаина, продуцентов конопли.

3. Созданы новые иммуногены и флуоресцентные трейсеры, в том числе лизиновые трейсеры - антигены, меченные флуоресцеином, высокоспецифичные и высокочувствительные для определения пестицидов 2,4-Д и 2,4,5-Т, изучены стабильность иммунореагентов и полученных тест-систем, что позволило разработать эффективные скрининговые тесты для определения физиологически активных веществ на базе поляризационного флуоресцентного иммуноанализа.

4. Разработанные методы анализа позволили реализовать текущее исследование различных биологических объектов пациентов и осуществить мониторинг хронического действия пестицидов, лекарств и наркотиков с целью корреляции с

состоянием организма на значительном числе объектов в условиях Греции. Создан банк данных по пестицидам, наркотикам и лекарствам (антилилептикам) с предлагаемой корреляцией по хроническому действию ксенобиотиков и их концентрации в волосах в том числе качестве контроля над соблюдением терапевтического режима.

5. Методом исследования содержания пестицидов и их метаболитов в сельскохозяйственной продукции (в регионах Греции) показана высокая значимость культивирования сельскохозяйственных растений в соответствии с Европейскими требованиями ICM (интеграционого контроля культивирования) для эффективного и безопасного использования пестицидов.

6. На основе исследования влияния особенностей динамики антибиотика цефтриаксона и антиритмика амиодарона на их эффективность при хирургических операциях предложены оптимальные способы введения этих препаратов.

7. Синтезирован ряд новых пористых гидрогелей на основе сшитого поли-N-винилпирролидона и показана их высокая эффективность по сорбционному извлечению микотоксинов (зеараленона и афлатоксина) из жидких сред. Установлено, что сорбционная способность таких гелей повышается с увеличением развитости их пористой системы.

8. Получен рад новых водорастворимых полимерных комплексов на основе поли-N-винилпирролидона и антифунгальных веществ - сорбиновой кислоты и антибиотиков нистатина и амфотерицина В. Показано, что антифунгальная активность полимерных комплексов сорбиновой кислоты повышается с уменьшением молекулярной массы полимерного носителя, что связано со снижением прочности компонентов системы. С другой стороны, в случае полимерных комплексов полициклическх антибиотиков антифунгальная активность повышается с увеличением молекулярной массы полимерного носителя, что, возможно, связано с взаимодействием иммобилизованной системы с клеточными мембранами.

9. Разработаны методы синтеза ряда новых полимерных эфиров индометацина и показано, что они проявляют высокую лекарственную (анальгетическую и противовоспалительную) активность, но значительно менее токисны (в опытах на ульцерогенное действие). С использованием синтезированных полимеров разработана бандажная лекарственная форма индометацина, обладающая высокой актвиностью по снижению болевых проявлений в суставах и не проявляющая побочных отрицательных эффектов.

10 В ряду полимерных эфиров 2,4-дихлорфеноксиуксусной кислоты в опытах на ауксиновую активность (стимулирование удлинения колеоптилей злаков) показано, что характер проявляемой активности полимеров определяется их спсособностью к гидролитическому выделению низкомолекулярного регулятора. При этом установлено, что при низких скоростях гидролиза полимеры практически не активны. При высоких скоростях гидролиза - концентрационная зависимость их активности не отличается от активности низкомолекулярной кислоты и полимеры проявляют ингибирующее действия в диапазоне повышенных концентраций. При оптимальных - промежуточных скоростях гидролиза полимеры проявляют только стимулирующую активность в широком диапазоне доз и концентраций, что может быть использовано для создания эффективных рострегулирующих препаратов. Полученные результаты могут быть использованы для предсказания активности в соответствии с параметрами гидролиза, найденными в условиях т vitro.

Публикации по теме диссертации

(Приведены статьи последних лет и патенты. Полный список публикаций по теме исследования (329 наименований) приведен в виде приложения к диссертации)

1 Sawopoulos MA, Pallis Е, Tzatzarakis MN, Dialyna LA, Tzanakakis G, Tsatsakis AM. Legal issues of addiction assessment. The experience with hair testing in Greece. J APPL TOXICOL, 2004, 24, In Press. (IF2003: 1.216)

2. Bertsias GK, Katonis P, Tzanakakis G, Tsatsakis AM. Review of clinical and toxicological features of acute pesticide poisonings in Crete (Greece) during the period 1991-2001. MED SCI MONIT. 2004 Nov;10(l l):CR622-7. 2004 Oct 26.

3. Liapakis IE, Kottakis I, Tzatzarakis MN, Tsatsakis AM, Pitiakoudis MS, Ypsilantis P, Light RW, Simopoulos CE, Bouros DE. Penetration of newer quinolones in the empyema fluid. // Eur Respir J. 2004;24(3), 466-70. (IF2002: 2.702).

4. Tzanakakis GN, Margioris AN, Tsatsakis AM, Vezeridis MP. The metastatic potential of human pancreatic cell lines in the liver of nude mice correlates well with cathepsin В activity. // Int J Gastrointest Cancer. 2003;34(1), 27-38. (IF2002: 1 02).

5. Tsatsakis A, Tutudaki M Progress in pesticide and POPs hair analysis for the assessment of exposure Forensic Science International, In Press, Corrected Proof, Available online 10 June

2004, (IF2002: 1.12).

6 Mantzouranis EC, Bertsias GK. Pallis EG, Tsatsakis A.M. Hair analysis differentiates chronic from acute carbamazepine intoxication. // Pediatr.Neurol, 2004, 31 (1), 73-75 (IF2002: 1.02).

7. Tsakiris IN, Danis TG, Stratis IA, Tsatsakis A.M. Monitoring of pesticide residues in fresh peaches produced under conventional and integrated crop management cultivation. // Food Addit. Contam. 2004, 21 (7), 670-677 (IF2002:1.052).

8. Dialyna L, Tzanakakis G, Dolapsakis G, Tsatsakis A.M. A tetranucleotide repeat polymorphism in the CYP19 gene and breast cancer susceptibility in a Greek population exposed and not exposed to pesticides. // Toxicol. Lett., 2004, 151 (1), 267-271 (IF2002: 2.62).

9. Tsatsakis A.M. Challenges in forensic toxicology Analytical instrumentation. // Forensic Sci. Int., 2003, 136, 1-1 Suppl. 1 (IF2002: 1-052)

10. Belivanis S, Fragoulis M, Tzatzarakis M, Tsatsakis A.M. A fatal case due to tricyclic antidepressant intoxication Amitriptyline and nortriptyline distribution in post-mortem biological samples. //Forensic Sci. Int., 2003, 136, 314-314 Suppl. 1 SEP (IF2002:1.052).

11. Tsatsakis A.M., Tsakiris I.N., Tzatzarakis M.N., et al. Three-year study of fenthion and dimethoate pesticides in olive oil from organic and conventional cultivation // Food Addit. Contam. 2003,20 (6): 553-559 (HW 1-050).

12. Tutudaki M., Tsakalof A.K., Tsatsakis A.M. Hair analysis used to assess chronic exposure to the organophosphate diazinon: a model study with rabbits. // Hum. Exp Toxicol., 2003, 22 (3), 159-164 (IF2oo2:1.301).

13. Nikitovic D, Tsatsakis AM, Karamanos NK, et al. The effects of genistein on the synthesis and distribution of glycosaminoglycans/proteoglycans by two osteosarcoma cell lines depends on tyrosine kinase and the estrogen receptor density. // Anticancer, 2003, 23 (1A), 459-464 (IF2002:1.416).

14. Tzanakakis GN, Krambovitis E, Tsatsakis AM, et al. The preventive effect of ketoconazole on experimental metastasis from a human pancreatic carcinoma may be related to its effect on prostaglandin synthesis. // Int. J Gastro. Cancer, 2002, 32 (1), 23-30 2002 (IF2002: 1 -22).

15. Mitropoulou TN, Tzanakakis GN, Nikitovic D, Tsatsakis A.M. et al. In vitro effects of genistein on the synthesis and distribution of glycosaminoglycans/proteoglycans by estrogen

receptor-positive and -negative human breast cancer epithelial cells. II Anticancer Res., 2002, 22 (5), 2841-2846 (ffW 1-416)

16. Baritaki S, Tzanakakis GN, Alifragis J, Tsatsakis A.M., Shtilman M.I. et al. Light scattering and in vitro biocompatibility studies of poly (vinyl pyrrol idone) derivatives with amino-acid-dependant groups. //J.Biomed.Mater Res., 2002, 63 (6), 830-837. (IF2002: 2.105).

17. Tsakiris IN, Toutoudaki M, Nikitovic DP, Tsatsakis A.M., et al. Field study for degradation of methyl parathion in apples cultivated with integrated crop management system. // B. Environ., Contam. Toxicol., 2002, 69 (6), 771-778 (IF2002: 0.490).

18. Shtilman MI, Tsatsakis AM, Alegakis AK, et al. Structure vs release-rate relationships in polymeric esters of plant growth regulators. // J.Mater.Sci 2002, 37 (21), 4677-4682 (IF2002: 0.728).

19. Alifragis J, Rizos AK, Tsatsakis AM, Shtilman M.I. et al. New polymeric systems with controlled release action: a light scattering investigation. // J.Non-Cryst.Solids, 2002, 307. 882-886 (IF2002: 1.363).

20. Baritaki S, Krambovitis E, Alifragis J., Tsatsakis AM, Shtilman M.l. et al. Immunoreactivity and light scattering studies of polyvinyl pyrrolidone polymeric derivatives. // J.Non-Cryst.Solids, 2002,307: 898-904 (IF2002: 1-363).

21. Hatzidakis GI, Tsatsakis AM, Krambovitis EK, et al. Use of L-lysine fluorescence derivatives as tracers to enhance the performance of polarization fluoroimmunoassays. A study using two herbicides as model antigens. // Anal.Chem. 2002, 74 (11),: 2513-2521 №002:4.532)

22. Tsatsakis AM, Tsakiris IN, Maxaira K, et al. Assessment of safe harvesting after methyl parathion application in peaches. // B. Envir.Contam.Tox., 2002, 68 (6), 824-830 (IF2002: 0.490).

23. Tsatsakis AM, Bertsias GK, Liakou V, et al. Severe fenthion intoxications due to ingestion and inhalation with survival outcome. // Hum. Exp. Toxicol., 2002, 21 (1), 49-54 (IF2002: 1.301).

24. Charvalos E, Tsatsakis A, Tzatzarakis M, et al. New nystatin polymeric complexes and their in vitro antifungal evaluation in a model study with Fusarium oxysporum. // Mycopatologia, 2002,153 (1): 15-19 2002 (IF2002: 0.848).

25. Covaci A, Tutdaki M, Tsatsakis AM, et al. Hair analysis: another approach for the assessment of human exposure to selected persistent organochlorine pollutants. // Chemosphere, 2002,46 (3), 413-418 (IF2002:1.181).

26. Papanikolaou N, Paspatis G, Dermitzakis A, Tsatsakis AM, et al.Neutropenia induced by paraquat poisoning. // Hum. Exp. Toxicol., 2001,20 (11), 597-599 (IF2002:1.301).

27. Charvalos E, Tzatzarakis M, Tsatsakis A, et al. Controlled release of water-soluble polymeric complexes of sorbic acid with antifungal activities. // Appl. Microbiol. Biot., 2001, 57 (5-6), 770-775 (IF2002: 1-754).

28. Psaroudakis K, Tzatzarakis MN, Tsatsakis AM, et al. The application of histochemical methods to the age evaluation of skin wounds - Experimental study in rabbits. // Am.J.Foren. Med. Path., 2001,22 (4): 341-345 (IF2002: 0.409).

29. Machera K, Goumenou M, Kapetanakis E, Tsatsakis AM, et al. Determination of potential dermal and inhalation exposure of operators following malathion 50EC applications on greenhouse tomatoes. II Toxicoljgy, 2001, 164 (1 -3), 85-85 Suppl. S (IF2002: 1.752).

30. Tutudaki M, Tsatsakis AM, Covaci A, et al. Hair analysis- an alternative method of assessing exposure to organochlorine pollutants. // Toxicology, 2001, 164 (1-3), 85-86 Suppl. S (IF2002: 1.752.

31 Tsatsakis AM, Tsakiris NI, Danis GT Assessment of safe harvesting after methyl parathion application. // Toxicology, 2001,164 (1-3), 86-86 Suppl. S (IF2002: 1.752).

32. Alegakis AK, Tsatsakis AM, Vrekousis M, Shtilman M.I., et al. // Toxicology, 2001,164 (13): 173-174 Suppl. S (IF2002:1.752).

33. Tsatsakis A, Tsakiris J, Rodinko M. Assessing long term exposure for drugs, pollutants and pesticides using sectional hair testing. // Toxicology, 2001, 164 (1-3): 231-231 Suppl. S №002:1.752).

34 Dolapsakis G, Vlachonikolis IG, Varveris C, Tsatsakis A, et al. Mammographie findings and occupational exposure to pesticides currently in use on Crete. // Eur. J.Cancer, 2001, 37 (12), 1531-1536 (IF2002: 3.460).

35. Tzatzarakis MN, Tsatsakis AM, Charvalos E, et al. Comparison of in vitro activities of amphotericin, clotrimazole, econazole, miconazole, and nystatin against Fusarium oxysporum. // J Envir. Sei. Health, 2001, В 36 (3): 331-340 (IF2002: 0.672).

36. Pataki M, Anatoliotakis N, Tzanakis N, Tsatsakis AM, et al. Availability of antidotes in hospital pharmacies in Greece. //Vet.Hum.Toxicol., 2001, 43 (2), 103-105 (IF2002: 0 473).

37. Tsatsakis AM, Bertsias GK, Mammas IN, et al. Acute fatal poisoning by methomyl caused by inhalation and transdermal absorption. // B. Environ. Contam. Tox., 2001, 66 (4), 415-420 (IF2002: 0.490).

38. Michalodimitrakis EN, Tsiftsis DDA, Tsatsakis AM, et al. Sudden cardiac death and right ventricular dysplasia. // Am.J. Foren. Med. Path., 2001,22 (1), 19-22 (IF2002: 0.409).

39. Tsatsakis AM, Tzatzarakis MN, Psaroulis D, et al. Evaluation of the addiction history of a dead woman after exhumation and sectional hair testing. // Am.J. Foren. Med. Path, 2001, 22 (1), 73-77 (IF2002: 0.409).

40. М.И. Штильман, В.Ю. Хвостова, Р.И Ташмухамедов, Т.А. Головкова, A.M.Tsatsakis. Эпоксидсодержащий поли-Ы-винилпирролидон. // Пластмассы - 2001. - N.7. - С.5-9.

41. Tzatzarakis MN, Tsatsakis AM, Lotter MM, Shtilman M.I., et al. Effect of novel water-soluble polymeric forms of sorbic acid against Fusarium oxysporum f. sp radicis-cucumerinum. // Food Addit. Contam. 2000, 17 (12), 965-971 (IF2002: 1.050).

42. Ramoutsaki IA, Haniotakis S, Tsatsakis AM. The snake as the symbol of medicine, toxicology and toxinology. // Vet Hum. Toxicol., 2000, 42 (5), 306-308 (IFiW: 0.531).

43. Tsatsakis AM, Tzatzarakis M. Sectional hair testing. Judicial and clinical applications. // Pure. Appl. Chem., 2000, 72 (6), 1057-1066 (IF,999: 1.81).

44. Tsatsakis AM, Psillakis T, Paritsis N. Phenytoin concentration in head hair sections: A method to evaluate the history of drug use. // J.Clin. Psyhopharm., 2000, 20 (5), 560-573 (IF]999: 5.738).

45. Alegakis AK, Tzatzarakis MN, Tsatsakis AM, et al. In vitro study of Oxytetracycline adsorption on activated charcoal. // J Environ. Sei. Health, 2000, В 35 (5): 559-569 (ffW 0.672).

46. Ramoutsaki IA, Ramoutsakis YA, Haniotakis S, Tsatsakis AM, et al. Remedies used in Hellenic history. //Vet.Hum.Toxicol., 2000,42 (4), 238-241 (IF1999: 0.531).

47. Ramoutsaki IA, Tsatsakis AM. Where are the "roots of toxicology"? The authors respond .// Vet. Hum. Toxicol., 2000,42 (4): 245-245 (IF1999: 0.531).

48. Tzatzarakis M, Tsatsakis AM. Liakou A, et al. Effect of common food preservatives on mycelial growth and spore germination of Fusarium oxysporum. // J Environ. Sei Health, В 2000, 35 (4), 527-537 (IF2002: 0.672).

49. Vardas РЕ, Kochiadakis GE, Igoumenidis NE, Tsatsakis AM, et al. Amiodarone as a first-choice drug for restoring sinus rhythm in patients with atrial fibrillation - A randomized, controlled study. // Chest., 2000, 117 (6), 1538-1545 (IF^m: 2.480).

50. Ramoutsaki IA, Ramoutsakis YA, Tsikritzis MD, Tsatsakis AM, et al. The roots of toxicology: An etymology approach. // Vet. Hum. Toxicol 2000, 42 (2), 111-111 (IFiw--0.531).

51. Rizos AK, Doetschman DC, Dwyer DW, Tsatsakis AM, Shtilman M.I., et al. Study of dichlophenac polymeric derivative with 12-DOXYL spin probe. // Polymer, 2000, 41 (3): 1131-1138 (IF2002:1.681).

52. Petrakis I, Gonianakis C, Vrachassotakis N, Tsatsakis AM, et al. Prospective study of preincisional intraparietal single-dose ceftriaxone in reducing postoperative wound infection in type I and II diabetic patients. // Acta Diabetol., 1999, 36 (3), 159-162 (IF19M: 1.1).

53. Kokori H, Giannakopoulou CH, Hatzidaki E, Tsatsakis AM, et al. An unusual case of lead poisoning in an infant: Nursing-associated plumbism. // J Lab. Clin. Med., 1999,134 (5), 522525 (IF2002:1-992).

54. Papaioannou A, Zeaki M, Tzanakis N, Tsatsakis AM, et ai. Plasma levels of lidocaine during fiberoptic bronchoscopy and its effects on cognitive function. // Am. J.Resp.Crit.Care, 1999, 159 (3), A737-A737 Suppl. S №002: 5.956).

55. Rizos AK, Tsatsakis AM, Shtilman MI, et al. Dynamics of self-release polymeric derivatives. // Abstr. Pap. Am. Chem., 1999, S 218: 14-PMSE Part 2.

56. Штильман М.И., Тсатсакис A.M., Влахос Дж., Драгасаки M., Шашкова И.М., Лоттер М.М. Биологическая активность поливиниловых эфиров 2,4-дихлорфеноксиуксусной кислоты.// Физиология растений, 1998.-Т.45,- N. 1.- С.108-111.

57. Штильман М.И., Tzatzarakis M., Tsatsakis А.М., Лоттер М.М. Полимерные фунгициды (обзор). // Высокомолек.соед. Сер.Б,- 1999,- Т.41,- N.8.- С.1363-1375.

58. Штильман М.И., Tsatsakis А.М., Vlahos J.C., Хачанян А.А., Dragassaki M., Восканян П.С., Шашкова И.М. Гидролиз и биологическая активность ряда водорастворимых полимерных эфиров арилсодержащих карбоновых кислот.// Высокомол. соедин., Сер.А.- 1997,- T.39.-N.11.- С.1761-1766.

59. Штильман М.И., Tsatsakis А.М., Хачанян А.А., Восканян П.С., Selala M., Шаппсова И.М. Гидролиз поливиниловых эфиров биологически активных карбоновых кислот.// Высокомол.соедин., Сер.Б,- 1996,- Т.38.- N.6.- С.1076-1079.

60. Tsatsakis AM, Manousakis A, Anastasaki M, et al. Clinical and toxicological data in fenthion and omethoate acute poisoning. // J.Environ-Sci.Health, 1998, В 33 (6),: 657-670 (IF2oo2'-

0.672).

Патенты по теме диссертации

1. Greece Pat. N. 1001718, 18.11.94. OBI, Api. N.93/0100325. 30.07.93. Int.Cl. 5 A61K47/48. Tsatsakis A.M.,Shtilman M.I.,Lakarova E.V., Tsakalov A.K. Water-soluble polymeric „derivatives of indomethacin.

2. Greece Pat. N. 1001719, 18.11.94. OBI. Apl. N. 93/0100326. 30.07.93. IntCl. 5 A61K9/70. Tsatsakis A.M., Michalodimitrakis E., Shtilman M.I., Kurumali E. Pharmaceutical compositions: Bandages with immobolized indomethacin formulation.

3. Greece Pat. N.0100344/93 (1993).OBI (Greek Organization Industrial Property). Apl. 920100479. Tsatsakis A.M., Shtilman M.I., Vlahakis J„ Shashkoiva I.M. New water-soluble polymeric plant growtyh regulators.

4. Eur.Pat. N. 0609638A1, EPO Bulletin 94/32, ¡0.08.94, bit.Cl. 5 A01N25/10, Appl. N.93600016.5 (1993). Tsatsakis A.M, Shtilm hkova

1.M.Aiahverdiev S. New water-soluble polymeric plar

_Объем 2,0 п. л._Тираж 100 экз

Издательский центр РХТУ им Д. И. Менделеева

Лрмстмднс Михаил Т-«Савремеиные токснко.югич« кодификационные »спеты i наркотиков и медицинских гфспар»

РНБ Русский фон,л

Дяссерпшр* решает фундаменгальй подходов к анализу, мониторингу, моДификй! О f) i) А, А

действия или повышения эффскшвности спй ¿ииО"^

Разработаны методы анализа, позвб пациентов и различных биологических 1 / |

хронического действия песгщщдов, лекаре

состояниеморгантмаН*значительном чис.Чс д . ___—

данных по пеетвдидам, наркотикам и лекарствам с предлагаемой корреляцией по хроническому действию ксенобиотиков и их концентрации в волс*сах, в том ч«сле качестве контроля над соблюдением терапевтического режима.

Созданы новые иммуногейы и флуоресцентные трейсеры, что позволяю разработать эффективные скрининГовые тесты для опредедениК физиологически активных веществ на базе поляризационного' флуоресцентного илмуноанализа.

Впервые показана высокая эффективность суперпористых гидрогелей на осюве сшитого поливинилпирролидона для сорбции микотоксинов на примере зеараленоаа и афлатоксина Созданы Препараты на полимерной основе с высокой анальгетичеосой активностью (бандажи), фунгицидной активностью (вйдорастюриМые препараты) и ростстимулирующей активностью fto отношению к растениям, что отражено в соответствующих патентах.

Aristidis Michail Tsatsakis (Gretce)

"Modem toxicological, analjlical afld modification aspects of xenobiotics (pesticides, narcotics and medical preparations)"

The thesis solves the fiiidamefttal problem «developing of the set of new approaches to analysis, monitoring and modification methods for decreasing of negative effect Or increasing of efficiency of specially introduced xenobiotics.

Analysis methods which alleVv realizing of current exarninati6a of patients and biological objects gbd carrying oiit of mbnitoring of pesticides, medicines and narcotic action, purposely, for correlation with organism status of considerable amount of objects under the conditions of Greece region. The data bank is created for pesticides, narcotics and medicines with suggested correlation of xenobiotics chronic action and their concentration in hair with die quality of therapeutic regitnen control.

New immunogens and fluorescent tracers were created which allowed developing of effective screening tests for determination of physiologically active substances based on polarization fluorescent imnumoanalysis.

For the first time, the high efficiency of super-porous hydrogels on the basis of cross-linked polyvinylpyrrolidine was showed for sorption of mwotoxines. Polymeric formulations with high analgetic activity (bandages), fungicide activity (water soluble preparations) and growth promotional activity against plants were created. It is reflected m cotrespciiding patents.

1.1.Актуальность проблемы.

Ксенобиотики, т.е. вещества попадающие в организм из окружающей среды и обладающие определенной биологической активностью, играют важную роль в жизнедеятельности человека и других живых организмов. Они могут оказывать как положительное действие (лекарства, биорегуляторы), так и могут являться токсикантами с различными типами активности. При этом взаимодействие в системе «ксенобиотик - живой организм» может рассматриваться с учетом ряда аспектов.

С одной стороны, это вопросы, связанные с анализом ксенобиотика, динамики его попадания в организм, распределением и метаболизмом в организме, оценками уровней терапевтических эффектов и токсичности при различных методах введения или экспозиции, оценки хронического действия ксенобиотиков и выявление их возможной аккумуляции в организме, возможных последствий от этой аккумуляции. В связи с этим важными являются выводы по снижению этих последствий путем различных предохранительных и дальнейших терапевтивтических мер. Для практического решения вопросов профилактики и лечения большое значение имеет выявление признаков генетической предрасположенности к воздействию ксенобиотиков.

В результате деятельности человеческого общества в биосфере циркулирует все большее число различных, чужеродных для человека и животных, органических соединений, имеют место существенные изменения в организме человека, в составе и качестве пищи, происходят глобальные изменения в окружающей среде.

Все эти изменения необходимо как минимум контролировать, что требует развития аналитических методов по определению изменений состояния окружающей среды по многочисленным параметрам.

Все возрастающее применение пестицидов, минеральных удобрений, поверхностно-активных и многих других биологически активных веществ приводит к серьезным экологическим проблемам. В том числе это относится к широко примененяемым веществам, обладающим высоким уровнем перси стентности (хлорсодержащим пестицидам, фосфорорганическим соедиениям, полихлорированным дибензодиоксинам и дибензофуранам и другим), способным накапливаться и загрязнять почву, водоемы и продукты питания, оказывая при этом токсическое воздействие на организм человека и животных. Именно эти соединения являются основными загрязнителями рек и грунтовых вод.

Борьба с отрицательными последствиями действия этих соединений требует развития методов мониторинга - эффективных методов массового контроля и анализа этих веществ как в окружающей среде, пищевых продуктах, так и в организме человека и сельскохозяйственных животных. В этих случаях необходимы простые и экспрессные методы определения загрязнителей.

Злоупотребление наркотическими средствами является одним из наиболее актуальных вопросов медицины и социальной практики в современном обществе. Постоянный рост потребления наркотических средств и одурманивающих веществ, приобретающий угрожающие масштабы, приводит к формированию ситуации, когда встает проблема передозировок и острых отравлений наркотическими и лекарственными средствами, нередко заканчивающихся смертельным исходом. Не менее важно определение ряда лекарственных средств, часто применяемых на уровнях передозировки.

Для получения достоверной картины отравления и решения вопросов экспертной практики, связанных с исследованием биологического материала на наличие наркотических и ряда лекарственных средств, на предварительном этапе судебно-химического исследования необходимо использовать высокочувствительные и специфичные методы анализа.

Исключительная важность определений этих веществ связана с необходимостью быстрого, простого и точного определения их влияния на организм человека и животных.

Для получения статистически верных определений физиологически активных веществ необходимо проводить сотни, тысячи и более анализов. Поэтому к современным тест-системам предъявляются определенные требования - простота выполнения анализа, непродолжительность по времени постановки, высокая производительность, низкая стоимость определений и др.

Несмотря на несомненную важность этих проблем, во многих случаях их решение далеко от завершения и требует использования новых эффективных подходов.

В данной работе для анализа пестицидов, наркотиков и лекарственных веществ применены, модифицированы и развиты одни из наиболее современных подходов, отвечающих выше отмеченным требованиям -сегментальный анализ волос и один из иммунных методов -поляризационный флуоресцентный иммуноанализ.

Другим важным аспектом, касающимся взаимодействия организма и ксенобиотиков, является разработка подходов, снижающих их отрицательное воздействие на организм и повышающих их эффективность при целенаправленном использовании или введении.

Одним из наиболее современных и интенсивно развиваемых в этом направлении подходов является использование методов макромолекулярной химии.

В то же время, несмотря на наличие громадного числа работ, связанных с взаимодействием ксенобиотиков и различных полимеров и полимерных систем, многие аспекты применения высокомолекулярных соединений в этих направлениях остаются нерешенными.

В качестве примера новых подходов в этой области в настоящей работе предложены как новые сорбционные системы, способные эффективно извлекать токсины из различных сред, так и новые макромолекулярные системы, представляющие собой иммобилизованные на полимерных носителях биологически активные вещества. Как известно, такие системы, постепенно выделяющие действующий агент («controlled release systems») обладают существенными преимуществами перед низкомолекулярными аналогами. В то же время многие аспекты, касающиеся создания и применения этих систем, остаются недостаточно выясненными, в первую очередь вопросы, касающиеся взаимосвязи строения этих систем и их активностью. В работе эти аспекты рассмотрены на конкретных примерах. 1.2. Цель и задачи исследования

Настоящая работа решает фундаментальную проблему - разработку комплекса новых подходов к анализу, мониторингу, модификационным методам снижения отрицательного действия или повышения эффективности специально вводимых ксенобиотиков.

Работа направлена на решение следующих конкретных задач:

• Разработка новых и усовершенствованных методов анализа и мониторинга пестицидов, наркотиков и лекарственных веществ:

- Разработка методик сегментального анализа волос на содержание наркотиков, пестицидов и лекарств;

- Разработка новых модификаций поляризационного флуороиммуноанализа пестицидов и наркотиков как метода для быстрого и высокочувствительного скрининга ксенобиотиков;

- Мониторинг хронического действия пестицидов, лекарств и наркотиков в разных биообъектах с целью корреляции с состоянием организма в условиях Греции;

• Разработка методов применения новых макромолекулярных систем для снижения отрицательного действия ксенобиотиков различного типа или повышения их эффективности при целенаправленном использовании:

- Разработка новых супермакропористых полимерных гелей для сорбционного извлечения микотоксинов;

- Создание новых полимерных комплексов фунгицидов различных групп для эффективного подавления роста микотоксинпродуцирующих грибов;

- Разработка полимерной формы индометацина, обладающей пониженной побочной токсичностью;

- Выявление взаимосвязи химического строения, скорости гидролитического выделения и биологической активности для полимерных производных биорегуляторов (на примере 2,4-дихлорфеноксиуксусной кислоты).

1.3. Научная новизна работ

Выявлены факторы, влияющие на эффективность определения ксенобиотиков при сегментальном анализе волос - методы подготовки образцов, влияние их экзогенного загрязнения, сроки и происхождение образцов и др. - что позволило разработать оптимальные методики определения пестицидов органофосфатной и карбаматной групп -метамила и дизенона, а также лекарственных веществ группы антиэпилептиков - карбамазепина, фенитоина и вальпроиновой кислоты. Были выявлены характеры корреляции между концентрациями в волосах и оценкой степени тяжести наркомании для наркотиков групп опиатов, кокаина, продуцентов конопли.

Созданы новые иммуногены и флуоресцентные трейсеры, в том числе лизиновые трейсеры - антигены, меченные флуоресцеином, высокоспецифичные и высокочувствительные для определения пестицидов 2,4-Д и 2,4,5-Т, изучены стабильность иммунореагентов и полученных тест-систем, что позволило разработать эффективные скрининговые тесты для определения физиологически активных веществ на базе поляризационного флуоресцентного иммуноанализа.

Впервые показана высокая эффективность суперпористых гидрогелей на основе сшитого поливинилпирролидона для сорбции микотоксинов на примере зеараленона и афлатоксина. Установлено, что эффективность сорбции связана с развитостью пористой системы геля.

В ряду полимерных комплексов, полученных на основе поливинилпирролидона и низкомолекулярных фунгицидов показано, что во всех случаях полимерные комплексы были более эффективны по уровню антифунгальной активности, причем в ряду фунгицидных карбоновых кислот антифунгальная активность повышалась с уменьшением прочности комплекса, а для полициклических антибиотиков амфотерицина В и нистатина - с увеличением прочности комплекса и молекулярной массы полимерного носителя, что связано с различием в механизме действия этих антифунгальных агентов.

Синтезированы новые полимерные эфиры индометацина и показано, что связывание с полимерным носителем снижает токсичность лекарственного вещества при сохранении его анальгетической активности.

Впервые в ряду полимерных эфиров 2,4-дихлорфеноксиуксусной кислоты выявлен характер зависимости между строением полимерного эфира, скоростью гидролитического выделения низкомолекулярного биорегулятора и уровнем и характером активности макромолекулярной системы. Показано, что при малых скоростях гидролиза полимер не обладал активностью. При высоких скоростях гидролиза характер активности полимера не отличается от характера активности низкомолекулярной кислоты с ярко выраженной концентрационной зоной ингибирования, а при промежуточных скоростях гидролиза полимер проявлял только ростстимулирующую активность. Установлено, что эта закономерность сохраняется при переходе к полимерам иного строения. 1.4. Практическая значимость работы.

Разработанные методы анализа позволили реализовать текущее исследование пациентов и различных биологических объектов и осуществить мониторинг хронического действия пестицидов, лекарств и наркотиков с целью корреляции с состоянием организма на значительном числе объектов в условиях Греции.

Создан банк данных по пестицидам, наркотикам и лекарствам (антипилептикам) с предлагаемой корреляцией по хроническому действию ксенобиотиков и их концентрации в волосах, в том числе в качестве контроля над соблюдением терапевтического режима.

Даны рекомендации по комплексу мер, снижающих вероятность отравления пестицидами.

Показана значимость использования способа культивирования ICM (Комплексный контроль культивирования) для эффективного и безопасного использования пестицидов. Найдены особенности кинетики и динамики антибиотика цефтриаксона при профилактическом межсекционным введении в операциях и особенности кинетики и динамики антиаритмика амиодарона.

Проведенные иссследования влияния строения полимерных производных биологически активных кислот на их активность позволили создать полимеры с оптимальным строением и препараты на их основе с высокой анальгетической активностью (бандажи), фунгицидной активностью (водорастворимые препараты) и ростстимулирующей активностью по отношению к растениям, что отражено в соответствующих патентах.

Апробация работы. Результаты работы были многократно доложены, в том числе, в виде устных докладов на различных конференциях (217 публикаций).

Публикации. По теме данного исследования опубликовано 112 статей и обзоров в российских и международных журналах. Получено 4 патента. Полный список научных трудов по теме приведен в качестве приложения к диссертации.

2. РЕЗУЛЬТАТЫ РАБОТЫ

3. ВЫВОДЫ

Разработан комплекс новых подходов к анализу, детоксикации, модификации, мониторингу ксенобиотиков различного типа (пестициды, наркотики, лекарства).

Выявлены факторы, влияющие на эффективность определения ксенобиотиков при сегментальном анализе волос - методы подготовки образцов, влияние их экзогенного загрязнения, сроки и происхождение образцов и др. - что позволило разработать оптимальные методики определения пестицидов органофосфатной и карбаматной групп -метамила и диазинона, а также лекарственных веществ группы антиэпилептиков - карбамазепина, фенитоина и вальпроиновой кислоты. Были выявлены характеры корреляции между концентрациями в волосах и оценкой степени тяжести наркомании для наркотиков групп опиатов, кокаина, продуцентов конопли. Созданы новые иммуногены и флуоресцентные трейсеры, в том числе лизиновые трейсеры - антигены, меченные флуоресцеином, высокоспецифичные и высокочувствительные для определения пестицидов 2,4-Д и 2,4,5-Т, изучены стабильность иммунореагентов и полученных тест-систем, что позволило разработать эффективные скрининговые тесты для определения физиологически активных веществ на базе поляризационного флуоресцентного иммуноанализа. Разработанные методы анализа позволили реализовать текущее исследование различных биологических объектов пациентов и осуществить мониторинг хронического действия пестицидов, лекарств и наркотиков с целью корреляции с состоянием организма на значительном числе объектов в условиях Греции. Создан банк данных по пестицидам, наркотикам и лекарствам (антипилептикам) с предлагаемой корреляцией по хроническому действию ксенобиотиков и их концентрации в волосах, в том числе в качестве контроля над соблюдением терапевтического режима.

Методом исследования содержания пестицидов и их метаболитов в сельскохозяйственной продукции (в регионах Греции) показана высокая значимость культивирования сельскохозяйственных растений в соответствии с Европейскими требованиями ICM (интеграционого контроля культивирования) для эффективного и безопасного использования пестицидов.

Выявлены особенности динамики антибиотика цефтриаксона и антиритмика амиодарона при различных способах введения на их эффективность при хирургических операциях.

Синтезирован ряд новых пористых гидрогелей на основе сшитого поли-К-винилпирролидона и показана их высокая эффективность по сорбционному извлечению микотоксинов (зеараленона и афлатоксина) из жидких сред. Установлено, что сорбционная способность таких гелей повышается с увеличением развитости их пористой системы. Получен ряд новых водорастворимых полимерных комплексов на основе поли-Ы-винилпирролидона и антифунгальных веществ -сорбиновой кислоты и антибиотиков нистатина и амфотерицина В. Показано, что антифунгальная активность полимерных комплексов сорбиновой кислоты повышается с уменьшением молекулярной массы полимерного носителя, что связано со снижением прочности компонентов системы. С другой стороны, в случае полимерных комплексов полициклических антибиотиков, антифунгальная активность повышается с увеличением молекулярной массы полимерного носителя, что возможно связано с взаимодействием иммобилизованной системы с клеточными мембранами. Разработаны методы синтеза ряда новых полимерных эфиров индометацина и показано, что они проявляют высокую лекарственную (анальгетическую и противовоспалительную) активность, но значительно менее токисны (в опытах на ульцерогенное действие). С использованием синтезированных полимеров разработана бандажная лекарственная форма индометацина, обладающая высокой активностью по снижению болевых проявлений в суставах и не проявляющая побочных отрицательных эффектов.

10. В ряду полимерных эфиров 2,4-дихлорфеноксиуксусной кислоты в опытах на ауксиновую активность (стимулирование удлинения колеоптилей злаков) показано, что характер проявляемой активности полимеров определяется их способностью к гидролитическому выделению низкомолекулярного регулятора. При этом установлено, что при низких скоростях гидролиза полимеры практически не активны. При высоких скоростях гидролиза - концентрационная зависимость их активности не отличается от активности низкомолекулярной кислоты и полимеры проявляют ингибирующее действия в диапазоне повышенных концентраций. При оптимальных промежуточных скоростях гидролиза полимеры проявляют только стимулирующую активность в широком диапазоне доз и концентраций, что может быть использовано для создания эффективных рострегулирующих препаратов. Полученные результаты могут быть использованы для предсказания активности в соответствии с параметрами гидролиза, найденными в условиях in vitro.