Автореферат и диссертация по фармакологии (15.00.02) на тему:Синтез и исследование полисахарид-аминокислотных конъюгатов

На правах рукописи

КРАСНИКОВА

Александра Викторовна

СИНТЕЗ И ИССЛЕДОВАНИЕ ПОЛИСАХАРИД-АМИНОКИСЛОТНЫХ

КОНЪЮГАТОВ

15.00.02 - фармацевтическая химия, фармакогнозия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

САНКТ-ПЕТЕРБУРГ 2004

Диссертационная работа выполнена на кафедре химии и технологии лекарственных веществ Санкт-Петербургской государственной химико-фармацевтической академии (СПХФА) Министерства Здравоохранения Российской Федерации

Научный руководитель:

доктор фармацевтических наук, профессор ИОЗЕП АНАТОЛИЙ АЛЬБЕРТОВИЧ

Официальные оппоненты:

доктор химических наук, профессор СЕВБО ДМИТРИЙ ПЕТРОВИЧ доцент, кандидат химических наук КУЗНЕЦОВА ТАТЬЯНА ЕВГЕНЬЕВНА

Ведущая организация: Медицинская академия последипломного образования НИИ Медицинской микологии им. П. Н. Кашкина (Санкт-Петербург)

Защита состоится мсьегг.в /V часов на заседании Диссертационного Совета Д 208.088.01 при Санкт-Петербургской государственной химико-фармацевтической академии по адресу: 197376, Санкт-Петербург, ул. Проф. Попова, д. 14.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке СПХФА по адресу: Санкт-Петербург, ул. Проф. Попова, д.4/6.

Автореферат разослан

г.

Ученый секретарь Диссертационного Совета,

кандидат фармацевтических наук, доцент ^^ М.В.Рыжкова

I. Общая характеристика работы.

Актуальность проблемы. Производные аминокислот вызывают постоянный интерес благодаря своему исключительно широкому спектру действия. Они входят в состав многих лекарственных препаратов, предназначенных для лечения самых разнообразных заболеваний (пенициллиновые и це-фалоспориновые антибиотики, мстотрексат, фенибут, аминалон, глицин, ме-тионин и др.). При этом, >1-ацил-а-аыинокислоты, как правило, не вызывают нежелательных побочных эффектов и предназначены для больных, которым противопоказано использование традиционных средств.

В этой связи большой интерес представляют полисахарид - аминокислотные конъюгаты, в которых аминокислота присоединена к полимеру разными типами ковалентпой связи. Это связано с тем, что химическая фиксация лекарственных субстанций на полисахаридной матрице позволяет создавать препараты пролонгированного действия с низкой токсичностью и необходимым балансом липофильно - гидрофильных свойств. Полисахариды, в большинстве своем, нетоксичны, не вызывают аллергических реакций, легко выводятся из организма и представляют интерес как группа неспецифических транспортных макромолекул, способных обеспечить направленную доставку действующего лекарственного вещества к биомишеням. В связи с этим актуальность работ по химической модификации полисахаридов аминокислотами не вызывает сомнений, одназко описанные в литературе методы синтеза декстран-аминокислотных конъюгатов несовершенны и требуют дополнительных исследований.

Для модификации полисахаридов в Санкт-Петербургской химико-фармацевтической академии разработано несколько химических схем, позволяющих связывать биологически активные вещества (БАВ) с полимером разными химическими связями. Все они могут быть использованы для создания физиологически активных полимеров (ФЛП) на основе полисахаридов и аминокислот, но систематические исследования в этом направлении не были проведены.

Цель и задачи исследования. Целью исследования была разработка методов химической модификации декстрана аминокислотами, для создания новых и совершенствования уже известных БАВ, в которых аминокислоты связаны с полимером разными химическими связями. Для достижения поставленной цели было необходимо: а) определить условия образования и стабильность азида карбоксиэтилдекстрана и исследовать его реакционную способность с аминами; б) исследовать реакционную способность этилового эфира и азида карбоксиметилдекстрапа, азида карбоксиэтилдекстрана, декст-ран- и карбоксиметилдекстранполиальдегидов с аминокислотами; в) определить влияние условий реакций и строения исходных веществ на выход целевого продукта; г) разработать методы анализа полученных веществ; в) изучить биологическую активность некоторых из синтезированных соединений.

Научная новизна, В работе впервые подробно изучена устойчивость азидов карбоксиэтилдекстрана и их реакция с аминогруппами в алифатических и ароматических соединениях и доказана возможность использования этих реакций для синтеза ФАП на основе декстрана, аминов и аминокислот. Впервые установлено, что для каждой аминокислоты и амина в реакциях с азидом карбоксиэтилдекстрана и декстрапполиальдегидами существует оптимальное значение рН среды, при котором достигается максимальные выходы амидов и азометинов. Показано, что при взаимодействии азида карбоксиэтилдекстрана с ароматическими аминами между оптимальными значениями рН и рКл аминов существует линейная зависимость, что степень ами-дирования азидов возрастает с увеличением амина и линейно зависит от значений а,-констант Гаммета.

Практическая значимость. Разработанные технологичные методы модификации декстрана аминами, аминокислотами и антибиотиками позволяют вводить в полимер заданное количество низкомолекулярных фрагментов и осуществлять синтез новых антимикробных и антивирусных соединений. Предложенные методики количественных определений декстрана и его производных, а также пенициллиновых антибиотиков дают хорошо воспроизводимые результаты, позволяют сократить количество необходимого для анализа исследуемого вещества, время и трудоемкость анализа.

Апробаиия работы. Основные результаты работы доложены на X Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва 2003), IV международной научно-практической конференции «Здоровье и образование в XXI веке» (Курск 2003), третьей международной конференции «Идеи Пас-тера в борьбе с инфекциями» (С.Петербург 2003), научно-методической конференции СПХФА (С.Петербург 2004).

Публикации. По теме диссертации опубликованы три статьи и тезисы четырех докладов на конференциях.

Объем и структура диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, обсуждения результатов, экспериментальной части, выводов и библиографии. Работа изложена на 153 стр., содержит 42 табл., 32 рис. Библиография включает 150 источник, из них 47 на иностранных языках.

II. Содержание работы.

Для создания новых и совершенствования уже известных биологически активных веществ нами предлагается химическая модификация декстрана аминами и аминокислотами по "карбоксиметильной", "карбоксиэтильной" и "альдегидной" схемам, включающим синтез карбоксиметил-(И), карбоксиэтилдекстрана (IX), их производных (Ш-ХШ), а также декстран- и карбокси-метилдекстранполиальдегидов (XVII, XVIII) и реакции этих полимерных соединений с аминами и аминокислотами - см. схему стр. 5.

Схема 1

ЩОСНзСОСШа)* КМД-Ка П

КУ-2-в

ЩОСНгСООН^ кмд-н

ион

ГОСНгСООНХ-у -

и(ОСН2СООС2Н5)у

ХИМИЧЕСКАЯ МОДИФИКАЦИЯ ДЕКСТРАНА асн,сооао1г

- и ' "

/

о

I'

СН,=С1ГСОму Р1Г ^ юС?ШСОСЖаЬ.у (ОСгН^ОМНзЭу VIII

ло/

ОССНО),

ДПА

ээкмд

1)ГИНГМЦ

2) №011

IV

ЮСНгСОСШ)^ (ОСН2СОЫН-НН2)у

V

гкыд

1СУ02/ II"

2)№ЮН

гасн2соон^у

(ОСНзСОМз),

VI

АзКМД

Щ-РШг 2) N80 Н

ЛОСНзСООКа^у (ОСН2СОННК)у ■

лснох

(ОС112ОООНа)у КМДПЛ XVI

1ЫЧН;

XV

МНг-\Нг

(СН-М-И)*

С(СНО),к - (СНО^у

(0С1ЬС00Ыа)у (СН=К-К)у

XVIII ХУЛ

КМДПА-ЛК ДПА-АК

альдегидная схема

лкэд-т

КУ-2-8

ГОС2Н4СООН)х_у (ОС2Н4СО№12)у

АКЭДН 1)01Г .2)11*

УШа

АмКМД

VII

карооксиметильная схема

ЦОСгЩСООН)* КЭД-Н IX

РЬСН2ОН

гГ0С2Н4С0011)х.у (ОС^СООСЦР^

БЭЮД I Х 2)ЛЫОн1

ЮС2Н4СООКа)х.у

-»"(ОСг^СОМНЫНг^

ПОД I XI

НМ02/ Н*|

ГОС2Н4СООЩ..У (ОСгЩСОКз^ АзКЭД | XIII

2)МаОн1

ГОС2Н4СО(Жа)*.у (ОС2Н4СОМЖ)у

АмЮД ™

карбоксиэтилъная схема

И • -СЛ- СНАНз, СНЗ- СН- НООС -СН2- СН2- , НООС-СНг-СНгСНг, НООСЧСНЛ-СНг. I

соон

У

шгснисн)2-акнг, ед-сн2-сн- , он-соон соон

сн2. сн_

I

соон

ОН-С,Н5-СН2-СН- , СООН

II •

^^ соон н

I _рСН2-СН-, »ЮОС-СЦ-СНг-СНг-СН- • Ч| \СН3

К!' соон соон Ч-^СН,

соон

Чистоту синтезированных веществ доказывали методом ТСХ. Полученные полисахаридные образцы характеризовали степенью карбоксиалки-лирования (Ска), алкоксикарбонилалкилирования (Са.1ка), гидразинокарбони-лалкилирования (С™), аминокарбонилалкилирования (Сака) и степенью ази-докарбонилалкилирования (Сюш) - число карбоксильных, сложноэфирных, гидразидных, амидных и азидных групп, в расчете на моносахаридное звено полимера, которые рассчитывали на основе результатов объемного, кондук-тометрического и иодометрического титрования, элементного анализа и УФ спектроскопии. Количество сложноэфирных, гидразидных и азидных групп в модифицированном декстране определяли спектрофотометрическим методом, основанным на цветной гидроксамовой реакции. Полученные вещества исследовали также методами ИК и ЯМР13 С спектроскопии.

Полисахаридальдегиды и их азометины стандартизовали по степени замещения и - числу альдегидных и азометиновых групп, приходящемуся на моносахаридный фрагмент полимера. Число альдегидных групп в образцах определяли гидроксамовым и оксимным методами.

1. Синтез карбоксиметилдекстрана, его эфиров, гидразидов и азидов.

Методы синтеза карбоксиметилдекстрана (КМД) описаны в литературе, однако устойчивость и реакционная способность этиловых эфиров (ЭЭКМД) и азидов карбоксиметилдекстрана (АзКМД) изучены недостаточно. В связи с этим нашей задачей было по известным методикам (см. схему 1) получить образцы №-соли КМД (II), его этилового эфира (IV), гидразида (V) и азида (VI), стандартизовать их и исследовать устойчивость эфиров и азидов.

При исследовании устойчивости этиловых эфиров КМД при 17-20°С в водных растворах триэтаноламина (ТЭА), который в ряде случаев необходимо добавлять в реакционную массу для растворения реагентов, было установлено, что за 1 час число эфирных групп в полисахариде уменьшается практически наполовину. Однако в связи с тем, что ацилирование первичных алифатических аминов ЭЭКМД завершается за 0.5-1 час, использование ТЭА в этих случаях возможно.

Рис.1. Содержание азидных групп в образцах КМД (в % от исходной

Сазка) в зависимости от времени выдержки их растворов при 20°С и рН 10 (1), 8(2), 6(3), 4(4), 2(5).

время, мин

Азиды карбоксиметилполисахаридов используются для ацилирования антибиотиков, ферментов и др. БЛВ и достаточно исследованы. Однако при изучении устойчивости водных растворов азида КМД (VI) оказалось, что число азидных групп в полисахаридных образцах, способных вступать в реакции ацилирования, резко снижается при увеличении рН и времени выдержки (рис. 1). Это несколько отличается от полученных ранее результатов. При изменении рН среды с 2 до 4 за 2 часа число азидных групп уменьшается, более чем в 2 раза, а при рН 10 уже через 20 минут их остаётся около 10%.

Таким образом,

- этиловые эфиры КМД можно использовать для К-ацилирования в присутствии ТЭА, если время основной реакции не превышает 0.5-1 час;

- азиды КМД в водных растворах быстра разрушаются, особенно в щелочных и нетральных средах, поэтому реакции ацилирования рационально проводить при 0°С.

2. Синтез карбоксиэтилдекстрана, его амидов, эфиров и гидрази-

дов.

Карбоксиэтильная схема модификации полисахаридов мало изучена. Поэтому одной из наших задач было поиск новых и совершенствование уже известных методов синтеза производных карбоксиэтилдскстрана (КЭД). Синтез КЭД (IX), его амидов (VIII), эфиров (X) и гидразидов (XI) (см. схему 1) осуществляли по описанным в литературе методикам.

Исследование ЯМР 13С спектров образцов исходного декстрана и КЭД с С,а=0.8 позволяет сделать вывод, что реакция алкилирования в данном случае протекает с малой селективностью и идет по положениям С2-0, С3-0 и С*-0 моносахаридного звена декстрана приблизительно в равных количествах. При этом могут быть звенья, содержащие заместители по трем положениям, по двум, по одному и вообще не содержащие заместителей.

Предложенная ранее методика синтеза гидразида КЭД из гидразингид-рата и амида КЭД (АКЭД) длительна (10 суток), имеет небольшой выход продукта , приводит к ацилированию гидразина по двум атомам азота и получению нерастворимых в воде веществ. Для устранения этих недостатков нами предложен синтез гидразида КЭД, основой которого является методика получения гидразидов низкомолекулярных карбоновых кислот. Он заключается в ацилировании гидразингидрата полисахаридкарбоновой кислотой или её амидом в среде органических растворителей в присутствии каталитических количеств оксида алюминия.

В ИК-спектрах образцов гидразида КЭД в Н-форме наблюдаются полосы поглощения при 1730 см-1, относящиеся к у(С=0) карбоксильной группы, а также полосы поглощения при 1640-1650 и 1550-1560 см"1 характерные 6(И-Н) «амид II» и у(С=0) «амид I». В спектре гидразида полученного из амида КЭД полосы поглощения «амид I» и «амид II» расширены за счет вклада непрореагировавших амидных групп полисахарида.

Уже первые опыты по синтезу гидразидов показали, что замена поликислоты на её амид, а также использование Н-формы АКЭД и перемешивания реакционной массы увеличивает выход целевого продукта (С,*» > 0.280.36). Существенное влияние перемешивания на скорость реакции объясняется гетерогенностью реакционной массы. Перевод карбоксилатных групп АКЭД в Н-форму увеличивает число ацильных групп в молекуле полимера, способных реагировать с гидразингидратом.

Синтез гидразида КЭД из соответствующего сложного эфира в некоторых случаях более удобен. В связи с этим нами исследована зависимость степени превращения сложноэфирных групп бензилового эфира КЭД в гидразидные от времени реакции с избытком гидразингидрата при 17-25°С. Оказалось, что за 3 часа реакция проходит на 94 %, а за 8 часов сложноэфир-ные группы превращаются в гидразидные на 100%.

Таким образом,

- при взаимодействии декстрана с акриламидом в водных растворах щелочи гидроксильные группы моносахаридного звена в положениях С2, С3 и С4 алкилируются приблизительно в равной степени, а в полимерной цепи карбоксиэтильные группы располагаются неравномерно.

- реакция амида КЭД (или его Н-формы) с гидразингидратом в присутствии бутанола, толуола и оксида алюминия является удобным методом синтеза гидразида КЭД.

- полное превращение сложноэфирных групп КЭД в гидразидные в избытке гидразингидрата при 17-25°С происходит за 8 ч.

3. Исследование устойчивости и реакционной способности азидов карбоксиэтидекстрана.

При синтезе ФАП на основе антибиотиков и ферментов удобно использовать азиды карбоновых кислот, которые ацилируют амины уже при 0 - 20°С. Азид КЭД мало изучен, поэтому нашей задачей было исследовать его устойчивость и реакционную способность.

Азид КЭД (XIII) получали добавлением нитрита натрия и соляной кислоты к охлажденному до 0°С раствору гидразида КЭД ^ДИ) с последующей выдержкой реакционной массы при 0°С в течение 1,5-2 часов. Число азидных групп в растворах определяли спектрофотометрическим методом после добавления к ним гидроксиламина и хлорида железа (III).

В ИК спектрах образцов азида КЭД, осажденных из реакционной массы этанолом, обнаружена полоса поглощения при 2160 см , характерная для валентных колебаний , которая исчезает при обработке азидов нуклео-фильными реагентами.

В результате исследования устойчивости водных растворов азида КЭД в зависимости от времени, температуры и рН среды (рис. 2) установлено, что число азидных групп в полисахаридных образцах, способных вступать в реакции ацилирования, резко снижается при увеличении рН раствора и мало

меняется (на 5-10%) при увеличении температуры раствора с 0 до 20°С и времени выдержки, что дает возможность проводить реакцию при комнатной температуре. При этом азиды КЭД более устойчивы, чем азиды КМД.

Рис.2. Содержание азид ных групп в образца КЭД (в % от количеств азидных групп в поли мере в момент образова ния) в зависимости о времени выдержки и растворов при 20°С и р 2(1), 4(2), 6(3), 8(4), 1 (5).

Реакционную способность азида КЭД исследовали в реакциях с ароматическими и алифатическими аминами. К раствору азида (XIII) добавляли избыток амина, с помощью раствора кислоты или щелочи доводили значение рН до 2-10, и смесь выдерживали при 15-20°С 1-18 ч. Продукт реакции осаждали этанолом и переосаждали из раствора щелочи для удаления ионосвя-занного амина

В ИК спектрах замещенных амидов КЭД (XIV), обработанных кислотой, имеются полосы поглощения при 1540-1550,1650-1670 и 1490-1610 см"1, характерные для 5(К-Н), «амид П», V (С=0), «амид I» и V (С=С) бензольного кольца (при ацилировании ароматических аминов), отсутствующие в спектрах исходных полисахаридов, и сохраняется полоса поглощения 1720-1730 см'1 карбоксильной группы. В УФ спектрах растворов синтезированных N ариламидов в 0.1 н. №ОН обнаружены максимумы поглощения, характерные для ароматических соединений.

Для сравнительной характеристики реакций азида КЭД с разными аминами определяли степень амидирования (% превращения азидных групп в амидные) Сы.

Таблица 1.

Оптимальные значения рН среды (рН^) и степени превращения азидных групп в амидные в реакциях азидов с аминами (17-20°С, 18 ч, 5

Амин оп рНопт ^ам

РИСН2МН2 9.37 - 10 70

л-ЙОСЛШг 5.25 -0.24 7 72.0

л-М?/С6Н4Ш2 5.12 -0.17 6 61.9

РЬШ2 4.6 0 5,5 50.1

л-ВгС6Н4Ш2 3.9 0.232 4 37.5

л-Ш2СбН4Ш2 1.02 0.778 0 10.0

Как и ожидалось (табл. 1, рис. 3), кислотно-основные взаимодействия аминов в реакционной среде оказывают существенное влияние на результат реакции. Для каждого амина существует свое оптимальное значение рН реакционной среды, при котором выход замещенного амида максимальный. Чем меньше нуклеофильность реагента, тем в более кислой среде достигается максимальная степень амидирования азидов. Наоборот, сильные основания лучше реагируют с азидами в нейтральных и щелочных средах. Это, вероятно, связано не только с влиянием концентрации протонов на количество нуклсофила в реакционной массе и электрофильность ацильной группы, но и с различной растворимостью аминов в воде.

Рис. 3. Зависимость степени амидирования (%) азидов от величины рН среды в реакциях с п-броманилином (1), анилином (2) и фенетидином (3) (17-20°С, 18 ч, 5 моль амина на 1 моль моносахаридного звена).

Установлено, что оптимальные значения рН, при которых достигаются наибольшие степени превращения азидных групп КЭД в амидные в реакциях с ароматическими аминами, линейно зависят от рКл амина: рН = 1.5636рЛ"а - 1.7201; п=5, ^ = 0.9833

Используя эту зависимость можно по известному значению рА*а амина найти оптимальную величину рН среды для его ацилирования без предварительных опытов.

Как и в случае карбоксиметилдекстрана, степень превращения азид-ных групп в амидные в реакциях азидов КЭД с ароматическими аминами зависит и от заместителя в бензольном кольце. Электронодонорные заместители увеличивают, а электроноакцепторные уменьшают по сравнению с реакцией азида с анилином (табл. 1). При этом зависимость Сам от констант заместителей оп в уравнении Гаммета носит линейный характер: Сам = -58.05сгЛ + 53.266 (п=5, Я2 = 0,9812)

Как оказалось, порядок смешения реагентов также существенно влияет на степень превращения азидных групп в амидные. Если в реакционную массу загружают сначала амин, а затем щелочь для создания заданного значения рН, то выход целевого продукта выше, чем при загрузки щелочи в первую очередь. Вероятно, при обратной загрузке реагентов в отсутствии амина азидные группы гидролизуются щелочью.

Таким образом:

- азид КЭД при 0 - 20°С более устойчив, чем азид КМД, но также в нейтральных и щелочных средах быстрее разрушается, чем в растворах кислот;

- для каждого амина в реакции с азидом КЭД существует оптимальное значепие рН среды, при котором достигается максимальный выход замещенных амидов. Между оптимальными значениями рН и ароматических аминов существует линейная зависимость.

- степень амидирования азидов КЭД возрастает с увеличением ароматического амина и линейно зависит от значений о„-констант Гаммета.

4. Синтез декстран-аминокислотных конъюгатов.

Существующие методы синтеза полисахарид-аминокислотных конъю-гатов недостаточно изучены, сложны и не всегда позволяют получать ФАП с заданными характеристиками. В связи с этим нашими задачами были поиск новых и совершенствование уже известных методов связывания аминокислот с декстраном разной по прочности химической связью для синтеза конъюга-тов с необходимым содержанием аминокислоты.

С этой целью нами исследованы реакции аминокислот с этиловым эфиром и азидом КМД, азидом КЭД и полисахаридальдегидами.

В ИК спектрах II*- форм аминокислотных производных КМД и КЭД имеются полосы при 1530-1540 и 1640-1675 смл, характерные для 6(№Н) "амид II" и \'(С=0) "амид I ", и полоса поглощения при 1720-1730 см-1, характерная для карбоксильных групп КМД, КЭД и аминокислот. В спектрах полученных соединений также наблюдаются полосы поглощения при 810890 см-1, характерные для ароматических циклов исходных аминокислот.

В УФ спектрах растворов ^замещенпых амидов карбоксиалкилдекст-рана, содержащих ароматические циклы, в 0.02 н. растворе NaOH обнаружены максимумы поглощения, отсутствующие в спектрах исходного полисахарида

Количественно реакции производных КМД и КЭД, а также ДПА и КМД-ПА с аминокислотами характеризовали степенью амидирования Сш и степенью превращения функциональных групп, прореагировавших с

аминокислотами

4.1. Ацилирование аминокислот этиловым эфиром карбоксиметил-декстрапа.

Реакцию ЭЭКМД с аминокислотами вели в воде при 0-20°С 1-24 ч или в этаноле при 78°С 5-20 ч в присутствии триэтаноламина (ТЭА). Избыток аминокислоты 3-5 моль на 1 моль моносахаридного фрагмента полисахарида.

Было установлено, что этиловый эфир КМД в присутствии ТЭА ацили-рует аминокислоты в воде и в этаноле, но в реакциях с аминокислотами выход целевого продукта значительно меньше, чем с другими аминокислотами (табл. 2).

Этот факт, вероятно, можно объяснить, во-первых, большим влиянием карбоксильной группы в а-аминокислотах на нуклеофильность аминогруппы и её доступность для ацилирующего агента, чем в других аминокислотах, а во-вторых, физико-химическими свойствами аминокислот. Добавление оснований в реакционную массу для растворения субстрата в воде вызывает гидролиз сложного эфира КМД. Увеличение времени ацилирования аминокислот в воде не повышает значение Сам, т.к. не вступившие в реакцию с аминокислотой сложноэфирные группы КМД гидролизуются.

Таблица 2.

Результаты ацилирования аминокислот этиловым эфиром КМД (См~0.37-0.59, Салка=0.33-0.37) в воде и в этаноле (5 моль и 3 моль амина на 1

моль монозвена полисахарида, соответственно)

Аминокислота % прореагировавших сложноэфирных групп (Сач)

в воде, рН 8,16 ч, 20°С в этаноле, 5ч, 78°С, ТЭА

0,Ь-а-аланин 21 18(32")

Р-аланин 52 40

у-аминомасляная 71 58

е-аминокапроновая 76 68 (100а)

О.Ь-лизин. 94 -

В,Ь-триптофан 7,3 21"

0,Е-{5-фенил-а-аланин 29,2 27'

° - за 8 ч;6 - за 20 ч.

Ацилирование в одинаковых условиях а-, |3-, у- и Е-аминокислот ЭЭКМД в воде и этаноле показало, что чем дальше расположена аминогруппа в молекуле субстрата от карбоксильной, тем выше степень превращения сложных эфиров КМД в амидные. Причем реакция в воде идет значительно быстрее, чем в спирте, но зависимости от положения аминогруппы в молекуле и в воде и в этаноле приблизительно одинаково.

Несмотря на меньшую скорость реакции, модификацию декстрана аминокислотами лучше вести в этаноле, в котором гидролиз сложноэфирных групп затруднен. Это позволяет увеличивать время выдержки и добиваться более высоких значений С^, чем в воде. Так, увеличение времени ацилиро-вания а-аминокислот до 20 ч повысило степень превращения сложноэфир-ных групп КМД в амидные в 1.8 раза, а в случае е-аминокапроновой кислоты за 8 ч величина Сш достигла 100%.

4.2. Ацилирование аминокислот азидами карбоксиметилдекстрана.

Ацилирование а-аминокислот этиловым эфиром КМД затруднено, поэтому мы исследовали реакцию этих аминокислот с азидом КМД.

К раствору азида карбоксиметилдекстрана, полученного, как описано ранее, после разложения избытка азотистой кислоты мочевиной, добавляли раствор натриевой соли аминокислоты (1-3 моль на 1 моль моносахаридно-го звена), с помощью растворов щелочи или кислоты создавали необходи-

мую величину рН среды и водой доводили объем реакционной массы до заданного (4-7 мл). Реакционную смесь выдерживали при 0-25°С 1-24 ч.

Как и в случае аминов, при ацилировании а-аминокислот существуют оптимальные значения рН, при которых степень превращения азидных групп полисахаридов в амидные максимальная (табл. 3, рис. 4).

Рис. 4. Зависимость степени амидирования (%) азидов КМД в реакциях с аминокислотами от рН среды (24 часа, 17-20°С), 1-дийодтирозин, 2- фенилала-нин, 3-глутаминовая кислота.

В результате опытов установлено, что оптимальные значения рН реакции азида КМД с исследуемыми аминокислотами приблизительно одинаковые 8-9, и только для глутаминовой кислоты (содержащей две карбоксильные группы) оно достигает 11.

Таблица 3.

Результаты ацилирования а-аминокислот азидом КМД при оптимальных значениях рН среды (16 часов, 18 - 20°С, 3 моль аминокислоты на 1

моль моносахаридного фрагмента)

Аминокислота Изоэлектри-ческая точка Концентрация азида КМД, ммоль/мл рн опт. Сш,%

глутаминовая 3.22 0.086 11 86

В,Ь-Р-фенил-а-аланин 5.07 0.095 8 98

О.Ь-тирозин - 5.66 0.095 8 64

Б.Ь-дииодтирозин - 0.078 9 54(69")

0,Ь-триптофан 5.89 0.090 8 34(45б)

0,Ь-гистидин 7.64 0.093 8 70

'-24 ч;°-0°С, 24 ч.

Исследования показали, что при ацилировании фенилаланина (избыток аминокислоты 3 моль на 1 моль моносахаридного звена) полное превращение азидных групп КМД в амидные происходит за 2 часа. С другими аминокислотами реакция может идти медленнее, поэтому в ряде случаев увеличение времени реакции, изменение порядка загрузки реагентов позволяет повысить степень амидирования азидных групп.

Следует заметить, что азид КМД ацилирует а-аминокислоты лучше, чем этиловый эфир КМД. При определенных условиях Сам азида в реакциях с большинством исследуемых а-аминокислот выше 70%, а в ряде случаев пре-

вышает 90%. И только в случае триптофана, ацилирование которого в отличие от других кислот идет в гетерогенной среде, Сам не превышает 45%.

4.3. Ацилирование аминокислот азидами карбоксиэтилдекстрана.

Азид КЭД использовался ранее для синтеза ФЛП на основе декстрана, но для ацилировавая аминокислот не применялся.

Реакцию аминокислот с азидом КЭД (XIII) проводили так же, как с азидом КМД, варьируя величину рН среды.

Рис.5. Результаты ацилирова-ния 0,Ъ-Р-фенил-а-аланина

азидами КМД(1)и КЭД (2) от рН среды (2 и 24 ч, соответственно, 18 - 20°С, 3 моль аминокислоты на 1 моль мо-носахаридного фрагмента). рИ

Как и ожидалось, при ацилировании а-аминокислот азидом КЭД существуют оптимальные значения рН (рис.5, табл. 4.), при которых степень превращения азидных групп в амидные максимальная. Так, оптимальные значения рН среды реакции азида с фенилаланином - 10, при этом аминокислота ПОЛЕЮСТЬЮ растворяется в воде и реакционная масса гомогенна.

Таблица 4.

Результаты ацилирования а-аминокислот азидами КМД и КЭД при оптимальных значенниях рН среды (2 и 24 ч, соответственно, 18 - 20°С, 3 моль аминокислоты на 1 моль моносахаридного фрагмента, концентрация полиса-

харида 0.084-0.087 ммоль/мл)

Аминокислота Изоэлектри-ческая точка Азид КМД Азид КЭД

рН опт. Сач,% рН опт. ст,%

глутаминовая 3.22 11 86 И 88

В,Ь-Р-фенил-а-аланин 5.07 8 86 10 80

0,Ь-тирозин 5.66 8 58 10 57

Щ,-дииодтирозкн - 9 77 12 75

0,Ь-триптофан 5.89 8 34 9 36

Б,Ь-гистидии 7.64 8 54 12 56

Как и в случае ацилирования ароматических и алифатических аминов азид КЭД реагирует с аминокислотами в более щелочных средах, чем азид КМД, и оптимальные значения рН этой реакции изменяются в более широком интервале (с 9 до 12) (рис. 5). Для сравнения, замена азида КМД на азид КЭД в реакциях с бензиламином и анилином смещает оптимальные величины рН реакционных сред с 8 до 10 и с 2 до 5, соответственно.

Это можно объяснить меньшей реакционной способностью азидов КЭД и повышением активности нуклеофила при более высоких значениях рН. При этом большая устойчивость азидов КЭД в водных растворах по сравнению с азидами КМД позволяет увеличивать время реакции до 18-24 ч.

Ацилирование аминокислот азидами КМД и КЭД в одинаковых условиях приводит к приблизительно одинаковому выходу целевых продуктов (табл. 4).

Исследование влияния времени реакции на результаты взаимодействия азидов карбоксиэтилдекстрана с аминокислотами показало, что для их завершения достаточно 16 - 24 ч.

4.4. Реакции аминокислот с полиальдегидами.

Альдегидную схему модификации полисахаридов можно отнести к наиболее простым и перспективным методам синтеза ФАП. В связи с этим нами изучены реакции декстранполиальдегида (ДПА) и карбоксиметилдек-стран-полиальдегида (КМД-ПА) с аминокислотами.

Декстран и КМД окисляли по стандартной методике метапериодатом натрия. Реакцию ДПА и КМДПА с аминокислотами вели в воде при 18-20°С в течение 3 - 6 ч при рН 7-13. Избыток аминокислоты составлял 3 моль на 1 моль моносахаридного фрагмента полимера. Кислотность среды контролировали иономером и поддерживали с помощью 0.1 н. раствора щелочи. Об окончании реакции судили по прекращению изменения рН среды.

Рис. 6. Влияние рН среды на степень превращения альдегидных групп ДПА в азометиновые в реакциях с D.L-триптофаном (1), БХ-Р-(2) и

аланином (3).

Исследование зависимости степени превращения альдегидных групп в азометиновые от рН среды и в реакциях ДПА и КМД-ПА с аминокислотами показало, что для каждой аминокислоты, как и для аминов, существует оптимальное значение рН, при котором выход азометинов максимальный. Причем в реакциях аминокислот с ДПА и КМД-ПА оптимальные значения рН разные, но в обоих случаях находятся в районе 11 - 12.5. Это несколько более высокие значения, чем оптимальные рН для алифатических аминов (для бензиламина- 10.5).

При исследовании кинетических характеристик реакции ДПА с аланином были определены порядок, константа скорости и энергия активации реакции. Выражение для скорости реакции имеет вид Ур=к-СдпА'СА0 где ^константа скорости реакции; Сдпа, Са - концентрации ДПА и а-аланина

а 9 10 11 13 и

соответственно. Дробный порядок реакции, возможно, объясняется пространственными препятствиями для атаки нуклеофилом карбонильной группы.

Таким образом:

- Этиловый эфир КМД, азиды КМД и КЭД, а также декстран- и карбок-симетилдекстранполиальдегиды могут быть использованы для синтеза ФАП с заданным содержанием аминокислот, в которых аминокислоты связаны с декстраном разными по прочности химическими связями.

- Этиловый эфир КМД - одно из наиболее доступных производных декстрана - ацилирует аминокислоты в воде и в этаноле, тем лучше, чем дальше расположена аминогруппа от карбоксильной, однако для достижения больших Сш синтез ФАП лучше проводить в этаноле.

- Ацилирование а-аминокислот азидами КМД и КЭД идет с более высоким выходом целевого продукта, чем в случае этилового эфира КМД. При этом азиды КЭД реагируют при более высоких значениях рН среды, чем азиды КМД, и для каждой кислоты существует оптимальное значение рН, при котором достигается максимальная

5. Синтез антибиотик-полисахаридных коньюгатов.

Целый ряд широко применяемых в настоящее время антибиотиков представляют собой аминокислоты (антибиотики группы пенициллина и цс-фалоспоринов, леворин и др.) В связи с этим нашей задачей было применить разработанные методы модификации декстрана аминокислотами для синтеза антибиотик - полисахаридных конъюгатов. С этой целью исследованы реакции этилового эфира и азида КМД с 6-АПК и амоксициллином.

В ИК спектрах полученных соединений наблюдаются полосы, характерные для амидной группы, а также полоса при 1740-1750 см"1, характерная для четырехчленного лактамного цикла.

Количественно конъюгаты и реакцию ацилирования антибиотиков ха-растеризовали так же, как и в случае амидов КМД. Значения СамКа рассчитывали по данным элементного анализа и спектрофотометрического метода, основанного на гидроксамовой реакции, разработанного нами для анализа пенициллиновых антибиотиков. Первый метод дает возможность определить общее число аминокарбонилметильных групп в полисахариде, а второй -число молекул активного антибиотика, сохранивших лактамные циклы.

5.7. Ацилирование 6-аминопенициллановой кислоты этиловым эфиром карбоксиметилдекстрана.

Взаимодействие этилового эфира КМД с 6-АПК проводили в воде и в спирте в присутствии триэтаноламина, аналогично реакции эфира с аминокислотами.

Было установлено, что ацилирование в воде позволяет ввести в молекулу декстрана 0.3-0.4 моль 6-АПК на 1 моль моносахаридного звена. Однако лактамный цикл 6-АПК легко разрушается под действием кислот и щело-

чей, и в полученных веществах его сохраняют не более 65% аминокислотных фрагментов.

В связи с этим, вами предложено ацилирование 6-АПК ЭЭКМД в этаноле при 20°С. В этих условиях реагирует около 5Э% сложноэфирных групп КМД и практически вся введенная в полимер 6-АПК (до 0.2 моль на моноса-харидный фрагмент) сохраняет Р-лактамный цикл.

Установлено также, что сохранность Р-лактамного цикла при модификации полисахарида 6-АПК возрастает во много рал, если получать конъюга-ты, содержащие ковалентно- и ионосвязанный антибиотик. Так, ацилирова-нием 6-АПК этиловым эфиром КМД в спирте без переосаждения из водного раствора щелочи был получен продукт, содержащий 1.17 моль 6-АПК на моль монозвена полисахарида, при этом аминокислота практически на 100% сохранила свою структуру.

5.2. Ацилирование антибиотиков азидами карбоксиметилдекстра-

на.

К раствору азида карбоксиметилдекстрана, после разложения избытка азотистой кислоты мочевиной, добавляли порошок Н-формы или раствор натриевой соли антибиотика, с помощью раствора» щелочи или кислоты создавали необходимую величину рН среды и водой доводили объем реакционной массы до заданного. Реакционную смесь выдерживали при 0-25°С 1-24 ч.

Результаты ацилирования 6-АПК азидом КМД, как и в случае других аминокислот, зависят от рН реакционной массы. При загрузке аминокислоты в реакционную массу в твердом виде (реакционная масса гетерогенная) наибольшая степень замещения достигается при рН около 6.

Продукт, полученный ацилированием 6-АПК азидом КМД при оптимальном рН без переосаждения из водной щелочи, содержал 0.3 моль 6-АПК на моль моносахаридного фрагмента, при этом степень разрушения лактамных циклов по сравнению с исходной субстанцией антибиотика составила лишь 5%. В связи с тем, что при рН 6 большинство карбоксильных групп КМД существуют в виде натриевой соли, большая часть 6-АПК связана с полимером ковалентной связью.

Наилучшие результаты ацилирования амоксициллина натриевой соли были достигнуты при рН 8 (как и в случае фенилаланина). Модификация декстрана амоксициллином без переосаждения продукта из щелочи позволила решить проблему сохранения структуры антибиотика. Синтезированное вещество содержало 0.43 моль ковалентно- и ионносвязанного амоксицилли-на на моль моносахаридного фрагмента, степень разрушения лактамных циклов 5%.

Таким образом,

- Этиловый эфир и азид КМД могут быть использованы для синтеза аи-тибиотик-декстрановые конъюгаты с содержанием 6-АПК и амоксициллина от 0.2 до 1.26 моль на моносахаридный фрагмент. При этом синтез конъюга-

тов с ковалентно- и ионносвязанной аминокислотой позволяет сохранить структуру вводимого в полимер антибиотика.

6. Разработка методов анализа синтезированных веществ.

Общепринятые методы анализа низкомолекулярных органических соединений не всегда применимы для исследования производных декстрана. В связи с этим возникла необходимость в совершенствовании существующих и разработке новых методов анализа синтезированных образцов.

7.1. Совершенствование методики спектрофотометрического анализа гидразидов и азидов карбоксиэтилдекстрана.

Существующий метод анализа гидразидов и азидов карбоксиэтилполи-сахаридов основан на их превращении в соответствующие гидроксамовые кислоты, которые с железом (Ш) образуют окрашенные растворы.

.О

—С'

HNO;

О

NIljOH

.О

NIIOH

Fe

.О

NH-0'

Fe з

ЫНЫН2 N3

Однако разработанные ранее условия анализа гидразидов КЭД не всегда позволяют получить воспроизводимые результаты, особенно при исследовании образцов с большим содержанием гидразидных и амидных групп. Предположив, что это связано с недостаточным избытком реагентов и, следовательно, малой скоростью превращения анализируемых гидразидов в азиды и гидроксамовые кислоты КЭД, мы увеличивали избыток всех загружаемых реагентов в 2 раза, а также изменили температуру и время синтеза гид-роксамовой кислоты, т.к. предложенный ранее синтез её при 40°С не очень удобен для анализа.

Исследовав зависимость оптической плотности окрашенных растворов от времени выдержки с гидроксиламином при 20°С установили, что 100% -ное превращение азидов в соответствующие гидроксамовые кислоты происходит за 20 минут. Относительная погрешность определения С™» менее 5%.

7.2. Разработка метода количественного определения содержания полисахаридов в растворе.

Известно, что в присутствии серной кислоты и фенола сахара и их производные приобретают желто-коричневую окраску и это используется для их количественного определения. Однако методики, описанные в литературе, оказались непригодными для анализа полисахаридов, т.к. интенсивность и стабильность окраски получаемого в ходе анализа раствора сильно зависит от структуры полимера, порядка загрузки реагентов, времени выдержки и температуры реакции.

Для повышения полноты гидролиза полисахарида и уменьшения влияния кислоты на синтез окрашенных веществ мы разделили загрузку серной кислоты и фенола. К исследуемому водному раствору полисахарида сначала

добавляли концентрированную серную кислоту, и смесь нагревали, варьируя время реакции. Затем к полученному раствору добавляли 5% раствор фенола и пробу вновь нагревали, варьируя время реакции.

На основании полученных результатов нами предлагается следующая методика количественного определения полисахарида в исследуемых образцах: к водному раствору полисахарида (10-80 мкг в 1 мл) добавляют концентрированную серную кислоту и смесь нагревают 30 минут при 70°С, затем к полученному раствору добавляют раствор фенола в воде и выдерживают 20 минут при 70°С, после чего раствор охлаждают при 0°С 5 минут и определяют оптическую плотность окрашенных растворов при 488 нм на фотоэлектро-колориметре. Раствор сравнения - те же компоненты без полисахарида. Для построения калибровочного графика нами использовался образец этилового эфира КМД с содержанием заместителей 0.72 моль на 1 моль монозвена полисахарида.

Таблица 5.

Воспроизводимость определения массы этилового эфира КМД в иссле-

дуемых образцах (Р=95%, гЛ2.78)

Образсц Масса навески, мг Метрологи-

ЭЭКМД Взята для анализа Определена ческие характеристики

1 3.04 Х=3.052

Скм-0.76 3.05 3.09 8„=0.0356

Сэыг0.49 3.05 5х2=0.0159

3.08 ДХ=0.041

3.00 е=1.34%

2 3.28 Х=3.238

С».«0.97 3.24 3.28 8Х=0.0853

С™=0.69 3.19 5Х2=0.0381

3.20 ДХ=0.0979

3.24 £=3.02%

Результаты определения количества модифицированного декстрана с помощью предложенной нами методики укладываются в нормы допустимых отклонений.

7.3. Спектрофотометрический анализ пенициллиновых антибиотиков.

Существующие методы количественного определения пенициллиновых антибиотиков трудоемки, длительны, для них необходимы сложная аппаратура и особые реагенты. В связи с этим нами рассмотрена возможность использования гидроксамовой реакции для количественного определения пеницил-линовых антибиотиков спектрофотометрическим методом.

Ге3+

3

На основании исследований влияния температуры, времени, соотношения и концентрации реагентов на интенсивность окраски растворов полученных комплексов с железом (III) нами были определены условия количественного определения пеницилиновых антибиотиков. К точной навеске антибиотика (48 мг) добавляли щелочной раствор гидроксиламина, (полученный смешением раствора гидроксиламина гидрохлорида с раствором гидроксидом натрия и раствором карбоната калия в соотношении 2:1.2:0.8). Смесь выдерживали 20 минут при 0°С, после чего к ней добавляли раствор соляной кислоты и раствор хлорида железа (III) в соляной кислоте и доводили объем раствора дистиллированной водой до метки. Оптическую плотность окрашенных растворов измеряли при 485 и 487 нм на фотоэлектроколориметре. Раствор сравнения - те же компоненты без антибиотика.

Для построения калибровочных графиков использовали 6-АПК, ампициллина тригидрат и ампициллина натриевую соль, амоксициллина тригид-рат и амоксициллина натриевую соль. Определение содержания активного антибиотика в субстанции проводили йодомстрическим титрованием согласно фармакопейной методике.

Как оказалось, результаты определения активного антибиотика в субстанции с помощью предложенной нами методики укладываются в нормы допустимых отклонений. Они практически не отличаются от результатов анализа антибиотиков фармакопейным методом (табл. 6), при этом предлагаемая методика позволяет сократить массу анализируемого вещества, время и трудоемкость анализа в 3 раза. Так, например, при наличии калибровочного графика на анализ антибиотика гидрокссамовым методом требуется 0.5 ч, в то время как фармакопейным- 1.5 ч.

Таблица 6.

Результаты анализа образцов антибиотиков разными методами

Содержание активного антибиотика,%

Образец Иодометриче- Гидроксамовая ре-

ское титрование акция

6-АПК* 71.9±0.6 71.6*0.7

Ампициллина тригидрат 87.5±1.5 87.4±0.8

Ампициллина натриевая соль 88.1±1.8 88.3*1.1

Амоксициллина тригидрат 88.4±1.2 88.6*2.2

Амоксициллина натриевая соль 67.3±1.1 67.6*0.7

"-метрологические характеристики определения 6-АПК - Х=71.б, Б,=0.6384, 5^=0.2352, ДХ=0.7324, с=1.02%

КНгШ -•ЧН, '

соон

н2м-|—Г\сн3 ГеС13

^ И^сНз "НС1

ян-он соон

ноос N"-0-

н3c^sJ_L^•нг

Таким образом,

- увеличение реагентов вдвое и изменение условий превращения азидов в гидроксамовые кислоты в методике количественного определения гидра-зидных и азидных групп КЭД привело к хорошо воспроизводимым результатам с относительной погрешностью определенна С„3 не более 5 0тя%5

- предложенная методика анализа полисахаридов с раздельной загруз -кой серной кислоты и фенола дает хорошо воспроизводимые результаты при количественном определении декстрана в исследуемых образцах.

- предложенный метод количественного анализа пенициллиновых антибиотиков, основанный на гидроксамовой реакции, дает хорошо воспроизводимые результаты, позволяет сократить массу анализируемых веществ, время и трудоемкость анализа, по сравнению с фармакопейным методом.

8. Исследование антивирусной активности производных декстрана.

Изучение цитотоксического и противовирусного действия синтезированных веществ проведено в НИИ Гриппа РАМН под руководством ведущего научного сотрудника, кандидата биологических наук А.И. Мигунова.

Ремантадин-декстрановые конъюгаты, которые получали реакцией ЭЭКМД, ДПА и КМД-ПА с 1-адамантилэтанамином, оказались менее токсичны, чем исходный ремантадин, и не оказывали токсического действия на клетки ХАО в максимально испытанных концентрациях 200 мкг/мл.

Эфиры КМД и декстранполиальдегиды практически не обладают противовирусной активностью, однако продукты реакции ремантадина с ДПА и КМД-ПА снижают репродукцию вируса гриппа, приблизительно также, как ремантадин и полирем.

Вирус гриппа состоит из РНК и белковой оболочки, которую можно рассматривать как полиаминокислоту. В связи с этим нами изучена способность ЭЭКМД, ДПА, КМД-ПА взаимодействовать с вирусом гриппа и инги-бировать свойство вируса гриппа типов А и В агглютинировать эритроциты кур

В качестве образцов вируса использовали вакцину, содержащую вакцинные штаммы А/Новая Каледония 20/99 (НШ1), А/Резвир-17 (Н3Ш) и В/Бейджинг 243/97. Способность вируса группа в присутствии различных производных декстрана агглютинировать эритроциты кур определяли по реакции гемагглютинации (РГА). В качестве контроля использовали вирусную суспензию, не содержащую полисахарид.

Оказалось, что все производные декстрана подавляют гемагглютини-рующую способность вируса гриппа, что, вероятно, связано с взаимодействием полисахарида с поверхностью вируса за счет реакций аминогрупп вирусной оболочки и сложноэфирных, карбоксильных и альдегидных групп полисахарида. Сам декстран не влияет на гемагглютинирующую активность вируса гриппа, которая остается на исходном уровне даже через 3 месяца.

Ингибирование гемагглютинирующей активности вируса гриппа усиливается при увеличении концентрации производных декстрана, времени инкубации и температуры.

При сравнении ингибирующего действия различных функциональных групп оказалось, что наиболее активными заместителями в молекуле декстра-на являются сложноэфирные группы, подавляющие гемагглютипирующую активность вируса гриппа до нуля при 20 и 37°С уже за первые сутки выдержки. Альдегидные группы ДПА и КМДПА ингибируют активность вируса гриппа в меньшей степени.

Установлено также, что ДПА в концентрации, блокирующей гемагглю-тинирующую активность способен подавлять размножение вируса гриппа типа А на переживающих фрагментах хорион-аллантоисной оболочки куриных эмбрионов, не вызывая при этом цитотоксического действия.

ВЫВОДЫ

1. Взаимодействие этоксикарбонилметил-, азидокарбопилметил- и ази-докарбонилэтилдекстрана, а также декстран- и карбоксиметилдекстраиполи-альдегидов с аминокарбоновыми кислотами - удобный метод получения дек-стран-аминокислотпых конъюгатов, позволяющий варьировать число аминокислотных остатков в физиологически активном полимере.

2.Модификация декстраиа а-аминокислотами с использованием азидов идет с более высоким выходом целевого продукта, чем в случае этилового эфира карбоксиметилдекстрана, который ацилирует аминокислоты, тем лучше, чем дальше аминогруппа от карбоксильной.

3. Выход продукта в реакциях с азидов и полиальдегидов декстраиа с аминокислотами зависит от рН среды, и для каждой аминокислоты существует оптимльное значение рН, при котором степень превращения азидных и альдегидных групп в амиды и азометины максимальная. Азиды наиболее устойчивы в растворах кислот, стабильнее и реагируют с аминами в более щелочных средах, чем азиды карбоксиметилдекстрана.

4. Технологичным методом синтеза гидразида карбоксиэтилдекстрана является реакция амида карбоксиэтилдекстрана с гидразингидратом в присутствии бутанола, толуола и оксида алюминия.

5. Предложенные методики количественного анализа пенициллиновых антибиотиков и гидразидов декстрана, основанные на гидроксамовой реакции, а также методика количественного анализа декстрана с раздельной загрузкой серной кислоты и фенола дают хорошо воспроизводимые результаты, позволяет сократить количество анализируемых веществ, время и трудоемкость анализа, по сравнению с существующим методом - фармакопейным йодометрическим титрованием.

Предварительные испытания показали, что азометины декстранполи-альдегидов с основанием ремантадина имеют противовирусные свойства на уровне ремантадина, но менее токсичны. Этиловый эфир КМД и декстранпо-лиальдегиды ингибируют гемагтлютинирующую и инфекционную актив-

ность вируса гриппа типов А и В, не проявляя при этом токсичность, в связи с чем представляют интерес для дальнейшего изучения.

По теме диссертации опубликованы следующие работы:

1. Красникова А.В., Иозеп А.А. Спектрофотометрическое определение пенициллиновых антибиотиков // Хим.-фарм. журнал - 2003. - Т. 37, № 9 - С. 49-51.

2. Красникова А.В., Васильева Ю.Л, Иозеп А.А. Ацилирование аминов азидами карбоксиэтилдекстрана // Ж. прикл. химии - 2004. - Т. 77, № 2 -С. 265-267.

3. Красникова А.В., Иозеп А.А. Ацилироание аминокислот производными декстрана // Ж. прикл. химии - 2004. - Т. 77, № 5 - С. 801-804.

4. Красникова А.В., Иозеп А.А. Применение гидроксамовой реакции для количественного определения антибиотиков пенициллинового ряда // X Российский национальный конгресс «Человек и лекарство». - Тез. докл. М.: 7 -И апреля 2003, С.621.

5. Красникова А.В., Иозеп А.А. Синтез декстран-пенициллиновых конью -гатов // Материалы IV междунар. научно-практической конф. «Здоровье и образование в XXI веке». Курск. 23 мая 2003.- С. 344-345.

6. В.В. Зарубаев, А.И. Мигунов, А.В. Красникова и др. Изучение цито-токсического и противовирусного действия коньюгатов производных декст-рана и ремантадина // Материалы третьей междунар. конф. «Идеи Пастера в борьбе с инфекциями». СПб. 4-5 сентября 2003.- С.98.

7. Красникова А.В., Иозеп А.А. Применение фенола и серной кислоты для количественного определения модифицированного декстрана // Материалы научно-методической конф., СПб, 20 февраля 2004.- С.85.

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

ЛР № 021251 от 23.10.97. Подписано в печать 12.05.2004. Тираж 100. Заказ 515. Санкт-Петербургская государственная химико-фармацевтическая академия. Издательство СПХФА—член Издательско-полиграфической ассоциации вузов Санкт-Петербурга, 197376, С-Петербург, ул. Профессора Попова, 14

04-14636

Производные аминокислот вызывают постоянный интерес благодаря своему исключительно широкому спектру действия. Они входят в состав многих лекарственных препаратов, предназначенных для лечения самых $ разнообразных заболеваний (пенициллиновые и цефалоспориновые антибиотики, метотрексат, фенибут, аминалон, глицин, метионин и др.). При этом, N-ацил-а-аминокислоты, как правило, не вызывают нежелательных побочных эффектов и предназначены для больных, которым противопоказано использование традиционных средств.

В этой связи большой интерес представляют полисахарид — аминокислотные конъюгаты, в которых аминокислота присоединена к полимеру разными типами ковалентной связи. Это связано с тем, что химическая фиксация лекарственных субстанций на полисахаридной матрице позволяет создавать препараты пролонгированного действия с низкой токсичностью и необходимым балансом липофильно - гидрофильных свойств. Полисахариды, в большинстве своем, нетоксичны, не вызывают аллергических реакций, легко выводятся из организма и представляют интерес как группа неспецифических транспортных макромолекул, способных обеспечить направленную доставку действующего » лекарственного вещества к биомишеням. В связи с этим актуальность работ по химической модификации полисахаридов аминокислотами не вызывает сомнений, однако описанные в литературе методы синтеза декстран-аминокислотных конъюгатов несовершенны и требуют дополнительных исследований.

Для модификации полисахаридов в Санкт-Петербургской химико-фармацевтической академии разработано несколько химических схем, позволяющих связывать биологически активные вещества (БАВ) с полимером разными химическими связями. Все они могут быть использованы для создания физиологически активных полимеров (ФАП) на основе полисахаридов и аминокислот, но систематические исследования в этом направлении не были проведены.

Цель и задачи исследования. Целью исследования была разработка методов химической модификации декстрана аминокислотами, для создания ^ новых и совершенствования уже известных БАВ, в которых аминокислоты связаны с полимером разными химическими связями. Для достижения поставленной цели было необходимо: а) определить условия образования и стабильность азида карбоксиэтилдекстрана и исследовать его реакционную способность с аминами; б) исследовать реакционную способность этилового эфира и азида карбоксиметилдекстрана, азида карбоксиэтилдекстрана, декстран- и карбоксиметилдекстранполиальдегидов с аминокислотами; в) определить влияние условий реакций и строения исходных веществ на выход целевого продукта; г) разработать методы анализа полученных веществ; в) изучить биологическую активность некоторых из синтезированных соединений.

Научная новизна. В работе впервые подробно изучена устойчивость азидов карбоксиэтилдекстрана и их реакция с аминогруппами в алифатических и ароматических соединениях и доказана возможность использования её для синтеза ФАП на основе декстрана, аминов и * аминокислот. Впервые установлено, что для каждой аминокислоты и амина в реакциях с азидом карбоксиэтилдекстрана и декстранполиальдегидами существует оптимальное значение рН среды, при котором достигается максимальные выходы амидов и азометинов. Показано, что при взаимодействии азида карбоксиэтилдекстрана с ароматическими аминами между оптимальными значениями рН и р7^а аминов существует линейная зависимость, что степень амидирования азидов возрастает с увеличением рКа w амина и линейно зависит от значений стл-констант Гаммета.

Практическая значимость. Разработанные технологичные методы модификации декстрана аминами, аминокислотами и антибиотиками позволяют вводить в полимер заданное количество низкомолекулярных фрагментов и осуществлять синтез новых антимикробных и антивирусных соединений. Предложенные методики количественных определений декстрана и его производных, а также пенициллиновых антибиотиков дают хорошо воспроизводимые результаты, позволяют сократить количество необходимого для анализа исследуемого вещества, время и трудоемкость анализа.

Апробация работы. Основные результаты работы доложены на X Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва 2003), IV международной научно-практической конференции «Здоровье и образование в XXI веке» (Курск 2003), третьей международной конференции «Идеи Пастера в борьбе с инфекциями» (С.Петербург 2003), научно-ж* методической конференции СПХФА (С.Петербург 2004). Ф

ВЫВОДЫ

1. Взаимодействие этоксикарбонилметил-, азидокарбонилметил- и ази-докарбонилэтилдекстрана, а также декстран- и карбоксиметилдекстранполи-альдегидов с аминокарбоновыми кислотами - удобный метод получения дек-стран-аминокислотных конъюгатов, позволяющий варьировать число аминокислотных остатков в физиологически активном полимере.

2.Модификация декстрана а-аминокислотами с использованием азидов идет с более высоким выходом целевого продукта, чем в случае этилового эфира карбоксиметилдекстрана, который ацилирует аминокислоты, тем лучше, чем дальше аминогруппа от карбоксильной.

3.Выход продукта в реакциях азидов и полиальдегидов декстрана с аминокислотами зависит от рН среды, и для каждой аминокислоты существует оптимальное значение рН среды, при котором степень превращения азидных групп в амиды и азометины максимальная. Азиды наиболее устойчивы в растворах кислот, стабильнее и реагируют в более щелочных средах, чем азиды карбоксиметилдекстрана.

4. Технологичным методом синтеза гидразида карбоксиэтилдекстрана является реакция амида карбоксиэтилдекстрана с гидразингидратом в присутствии бутанола, толуола и оксида алюминия.

5. Предложенные методики количественного анализа пенициллиновых антибиотиков и гидразидов декстрана, основанные на гидроксамовой реакции, а также методика количественного анализа декстрана с раздельной загрузкой серной кислоты и фенола дают хорошо воспроизводимые результаты, позволяет сократить количество анализируемых веществ, время и трудоемкость анализа, по сравнению с существующими, в том числе фармакопейными, методами.

Предварительные испытания показали, что азометины декстранполи-альдегидов с основанием ремантадина имеют противовирусные свойства на уровне ремантадина, но менее токсичны. Этиловый эфир КМД и декстранпо-лиальдегиды ингибируют гемагглютинирующую и инфекционную активность вируса гриппа типов А и В, не проявляя при этом токсичность, в связи с чем представляют интерес для дальнейшего изучения.