Автореферат и диссертация по фармакологии (15.00.01) на тему:Разработка состава и технологии плазмозамещающего раствора комплексного действия

На правах рукописи

ГАБИТОВА Наталия Александровна

Разработка состава и технологии плазмозамещающего раствора комплексного

действия

15.00.01 - Технология лекарств и организация фармацевтического дела

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата фармацевтических наук

Санкт-Петербург - 2005

Диссертационная работа выполнена на кафедре технологии лекарств и фитопрепаратов Государственного образовательного учреждения высшего профессионального образования Санкт-Петербургская государственная химико-фармацевтическая академия, а так же на базе ООО "Научно-технологическая фармацевтическая фирма Полисан" (г. Санкт-Петербург).

Научный руководитель:

кандидат химических наук, доцент Громова Лидия Ивановна

Официальные оппоненты: доктор фармацевтических наук, профессор

доктор фармацевтических наук, профессор

Манойлова Людмила Михайловна Чакчир Борис Александрович

Ведущая организация:

Московская медицинская академия им. И.М. Сеченова

Защита состоится "20"декабря 2005 г. в 15 часов на заседании диссертационного совета Д 208.088.01 в Санкт-Петербургской государственной химико - фармацевтической академии по адресу: 197376, Санкт-Петербург, ул. проф. Попова, д. 14

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке СПХФА по адресу: 197376, Санкт-Петербург, ул. Проф. Попова, д.4/6.

Автореферат разослан ноября 2005 г

Ученый секретарь

Диссертационного Совета,

доктор фармацевтических наук, доцент

М.В. Рыжкова

ПАЯ 7/

¿•Мб ¿в у г 7

з

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность темы

Спасение пациента в условиях острой массивной кровопотери является важнейшей задачей инфузионно-трансфузионной терапии. Тяжесть состояния организма при кровопотере связана с накоплением продуктов жизнедеятельности тканей, развитием гипоксии и нарушением метаболизма. Основой современных методов коррекции этих изменений является восстановление объема жидкости внеклеточного пространства, показателей гемодинамики и восстановление системы клеточного дыхания. С этой целью, наряду с введением гемодинамических коллоидных плазмозаменителей (на основе декстрана, оксиэтилированного крахмала, желатина или полиэтиленгликоля), в программу инфузионной терапии включают солевые растворы, обладающие антигипоксическим эффектом.

В качестве антигипоксантов в инфузионно-трансфузионной терапии используют соли янтарной и фумаровой кислот. И сукцинат, и фумарат являются субстратами цикла Кребса, но в условиях гипоксии только сукцинат позволяет сохранить энергосинтезирующую функцию митохондрий и снижает концентрацию в крови других интермедиатов цикла (В.Н. Лузиков, 1980). Натриевая соль меглу-мина сукцината применяется в составе препарата Реамберин®. Антигипоксическое действие данной соли доказано при проведении клинических исследований (А.Л. Коваленко и др. 1999; М.Г. Романцов и др., 2000).

Включение солевых растворов в программу лечения шоков увеличивает объем вливаемой жидкости и может привести к развитию отека легких. Поэтому современным направлением инфузионно-трансфузионной терапии является использование препаратов, сочетающих свойства и коллоидных и солевых растворов, что делает актуальным их разработку.

Цель и задачи исследования Целью настоящего исследования является выбор состава, разработка технологии производства и методик стандартизации инфузионного лекарственного пре-парата Реоплазмин.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

- Осуществить выбор гемодинамического компонента лекарственного препарата;

- Обосновать количественный состав компонентов препарата;

- Изучить свойства выбранных компонентов с точки зрения влияния на показатели качества препарата;

- Разработать и экспериментально обосновать технологию производства инфузионного препарата;

- Разработать и валидировать методики стандартизации препарата;

- Определить срок годности инфузионного препарата;

- На основании полученных результатов разработать нормативную документацию на данный лекарственный препарат (проект фармакопейной статьи предприятия и лабораторный регламент производства).

Научная новизна

Изучен качественный и количественный состав ионов, присутствующих в желатине. Разработана оригинальная мет лены оптимальные параметры процесса.

и установ-

БИБЛИОТЕКА С. Пете «Э

ЗЗЙЙ

Установлены коэффициенты уравнения Марка-Куна-Хаувинка, определяющего эмпирическое соотношение между характеристической вязкостью и средней молекулярной массой желатина. Полученные значения коэффициентов используются при расчете средних молекулярных масс.

Разработана оригинальная методика количественного определения N- ме-тилглюкамина и янтарной кислоты в препарате.

Разработаны, теоретически и экспериментально обоснованы состав и технология оригинального инфузионного препарата комплексного действия Реоплазмин на основе ПЭГ-20 ООО.

Практическая значимость работы

Обоснован состав препарата Реоплазмин и разработана технология его производства.

Разработанные методики количественного определения компонентов использованы в проекте ФСП на препарат.

Разработан и утвержден лабораторный регламент производства препарата Реоплазмин, раствор для инфузий.

На защиту выносятся:

1. Результаты исследований по разработке состава и технологии инфузионньгх препаратов комплексного действия:

- на основе желатина (Реоплазмин-G);

- на основе полиэтиленгликоля-20 ООО (Реоплазмин - PEG);

2. Результаты изучения физико-химических свойств желатина и разработки технологии его модификации;

3. Результаты изучения влияния осмолярности солей янтарной кислоты на величину осмолярности препарата;

4. Разработанная методика определения молекулярной массы модифицированного желатина в препарате;

5. Разработанные методики количественного определения компонентов препарата;

6. Экспериментальные данные по изучению стабильности и установлению сроков годности препарата Реоплазмин, обоих составов.

Апробация материалов диссертации Результаты диссертационной работы доложены на 3-й Международной научно-практической конференции "Здоровье и образование в XXI веке" (Москва,

2002), X Российском национальном конгрессе "Человек и лекарство" (Москва,

2003), 4-й Международной научно-практической конференции "Здоровье и образование в XXI веке" (Москва, 2003), Международной научно-практической конференции, посвященной 85-летию химико-фармацевтической академии (Санкт-Петербург, 2004), 5-й Международной научно-практической конференции "Здоровье и образование в XXI веке" (Москва, 2004), 5-й научной конференции "Аспирантские чтения-2004" (Самара, 2004).

Публикация результатов исследования.

По материалам диссертации опубликовано 11 печатных работ.

Связь задач исследования с проблемным планом фармацевтических наук Диссертационная работа выполнена в соответствии с тематикой и планом научно - исследовательских работ Научно - технологической фармацевтической фирмы "Полисан" (г. Санкт-Петербург).

Объем и структура диссертации

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, 4-х глав экспериментальных исследований, выводов и списка литературы. Работа изложена на 159 страницах машинописного текста, содержит 61 таблицу и 27 рисунков. Библиографический указатель включает 175 источников, из них 38 на иностранных языках. Приложения включают: сборник методик количественного определения ионов в желатине, заключение о биологической эффективности препарата Реоплаз-мин, заключения микробиологического анализа сырья, лабораторный регламент производства препарата, проект ФСП, акт использования результатов диссертационной работы.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Исследования по выбору и обоснованию качественного и количественного

состава препарата

Для придания препарату гемодинамических и антигипоксических свойств и приближения его к плазме крови в состав введены гемодинамический компонент, антигипоксант и неорганические соли.

В качестве антигипоксического компонента в состав препарата введена натриевая соль меглумина сукцината, получаемая в процессе приготовления препарата растворением в 1 л - 5 г янтарной кислоты, 8,26 г N-метилглюкамина (МГА) и 1,7 г натрия гидроксида. Концентрации данных компонентов установлены по результатам скрининговых исследований, проведенных в институте токсикологии МЗРФ.

Выбор ионов для введения в состав препарата осуществляли исходя из их биологического действия и концентрации в плазме крови. Наиболее важными для поддержания гомеостаза являются ионы натрия, калия, магния и хлора. Мольные концентрации ионов, введенных в состав препарата в сравнении с их концентрацией в плазме крови и форма введения иона представлены в табл. 3.

Таблица 3 - Концентрации ионов, введенных в состав препарата

Наименование иона (форма введения) Содержание в плазме крови, ммоль/л Содержание в препарате, ммоль/л

Натрий (№ОН, №С1) 143,0-147,0 145,2

Калий (КС1) 4,0 4,0

Магний (М§С12 • 6 Н20) 1,00-1,50 1,26

Хлор (№С1, КС1, MgCl•6 Н20) 100,0-110,0 108,0

Согласно данным табл. 3 состав и концентрации ионов в препарате соответствуют их концентрациям в плазме крови, что свидетельствует об изоионичности и изотоничности препарата.

Плазмозамещающие растворы гемодинамического действия предназначены для длительного пребывания в кровяном русле, что обеспечивается введением высокомолекулярно! о компонента. Выбор высокомолекулярного вещества осуществляли исходя из их биологического действия, возможных неблагоприятных эффектов и результатов маркетингового исследования данной группы инфузионных растворов проведенного ЗАО "Цитомедмаркетинг Фарм" по заказу ООО "НТФФ Полисан". В качестве гемодинамических компонентов при производстве инфузионных препаратов гемодинамического действия используют декстран, осиэтили-

рованный крахмал, модифицированный желатин и полиэтиленгликоль.

Каждый из этих компонентов в составе плазмозамещающих растворов обладает как достоинствами, так и недостатками. На основании сравнительного анализа в качестве возможных гемодинамических компонентов для исследований были выбраны желатин и полиэтиленгликоль-20000. Данные высокомолекулярные соединения производятся в Российской Федерации, обладают низкой токсичностью, практически не влияют на систему гемостаза, имеют небольшое количество побочных реакций. Препараты на основе этих компонентов представлены на рынке ограниченно, что обеспечивает перспективность их внедрения.

Для выбора одного из этих высокомолекулярных веществ были проведены исследования по разработке состава, технологии, методик стандартизации и изучению стабильности двух составов на основе, как желатина, так и полиэтиленгли-коля-20000. В качестве рабочих названий были приняты Реоплазмин-Сг и Реоплаз-мин-РЕО.

Выбор концентрации желатина и полиэтиленгликоля проводили исходя из свойств их водных растворов различных концентраций. Для состава на основе желатина (Реоплазмин-О) использовали оценку динамической вязкости (табл. 1), биологического действия (рис. 1) и температуры застывания препарата.

Таблица 1 - Сравнение вязкости препарата Реоплазмин-0 различных составов с вязкостью плазмы крови и крови _

Вязкость плазмы крови, мПа-с Вязкость крови, мПа-с Вязкость препарата, мПа-с

5% модифицированного желатина 8% модифицированног о желатина

1,87±0,2 4,50±0,50 1,81 ±0,03 2,62±0,04

1 —II

V

V

—

-0-

-0,25 О 0,25 0,5 0,75 1 1,25 1,5 1,75 2

Т ч

♦ 5% желатина Ш 8% желатина А без лечения '

Рис. 1 Объем циркулирующей плазмы после лечения составом Реоплазмин-0

Состав, содержащий 5 % модифицированного желатина, имеет вязкость близкую вязкости плазмы крови (табл.1), что может обеспечить изовязкостность

препарата.

Обе концентрации желатина в составе препарата показали высокую биологическую эффективность по показателю восполнения объема циркулирующей плазмы (ОЦП) после острой массивной кровопотери (рис. 1). Препарат с концентрацией желатина равной 5 % уступает препарату с концентрацией 8 %. Это объясняется механизмом создания гемодинамического эффекта за счет осмотического давления модифицированного желатина.

Оценка агрегатного состояния препарата, содержащего желатин в различных концентрациях, показала, что Реоплазмин-О, содержащий 8 % желатина образует гель как при О °С, так и при 4 °С. В то же время препарат с 5 % желатина не застывает при данных температурах. Отсутствие застывания при низких температурах является одним из важных требований к препаратам на основе модифицированного желатина.

На основании полученных результатов для изучения был выбран препарат, содержащий модифицированный желатин в концентрации 5 % (50 г/л). Он имеет вязкость близкую к вязкости плазмы крови, мало отличается от препарата, содержащего 8 % модифицированного желатина, по результатам оценки влияния на объем циркулирующей плазмы крови и при низких температурах не образует гель.

Определение оптимальной концентрации высокомолекулярного компонента для состава на основе полиэтиленгликоля-20 ООО (Реоплазмин-РЕв) проводили исходя из оценки динамической вязкости препарата в сравнении с вязкостью плазмы крови (табл. 2) и биологического действия (рис. 2).

Таблица 2 - Сравнение вязкости препарата Реоплазмин-РЕО различных составов с вязкостью плазмы крови и крови_

Вязкость плазмы крови, мПа-с Вязкость крови, мПа-с Вязкость препарата, мПа-с

1,5 % ПЭГ-20 ООО 3% ПЭГ-20 000 6% ПЭГ-20 000

1,87±0,20 4,50±0,50 1,25±0,04 1,90±0,06 3,95±0,12

Т, ч

—♦— 1,5% ПЭГ-20000 —3% ПЭГ-20000 6% ПЭГ-20000 -•-без лечения

Рис. 2 Объем циркулирующей плазмы после лечения составом Реоплазмин-РЕО

Полученные данные показывают, что к вязкости плазмы крови наиболее близка вязкость препарата, содержащего 3% ПЭГ - 20 ООО.

При оценке уровня объема циркулирующей плазмы (ОЦП) в состоянии острой массивной кровопотери все три концентрации ПЭГ - 20 ООО в составе препарата показали высокую эффективность, но наибольшее увеличение ОЦП у препарата содержащего 3 % ПЭГ - 20 ООО. Наименьшая эффективность у препарата с 6% ПЭГ-20 ООО.

На основании полученных результатов был выбран для дальнейшего изучения препарат, содержащий полиэтиленгликоль-20 ООО в концентрации 3 % (30 г/л), обладающий наибольшей эффективностью и имеющий вязкость близкую к вязкости плазмы крови.

Рекомендуемые составы Реоплазмин-ЧЗ и Реопллазмин-РЕО приведены в табл. 4.

Таблица 4 - Составы препаратов Реоплазмин-й и Реоплазмин-РЕС

Компонент Содержание, г/л

Реоплазмин-G Реоплазмин-PEG

Полиэтиленгликоль- 20 000 f?/.//: 30,00

Желатин 50,00 н

Янтарная кислота 5,00 5,00

Ы-метилглюкамин 8,26 8,26

Натрия гидроксид 1,70 1,70

Натрия хлорид 6,00 6,00

Калия хлорид 0,30 0,30

Магния хлорид 0,12 0,12

Изучение физико-химических свойств желатина

Для производства инфузионных растворов в РФ используют пищевой желатин, производимый по ГОСТ 11293-89 марок К-13 и К-11, но при приготовлении и последующем анализе плазмозамещающего раствора на основе желатина было установлено, что показателей качества, контролируемых при производстве желатина по ГОСТ, недостаточно для характеристики его в качестве сырья для получения инфузионного препарата. Была поставлена задача: ввести дополнительные показатели входного контроля качества желатина, в первую очередь, контроль содержания в нем ионов, аналогичных входящим в состав плазмы крови. Установлено, что из исследованных ионов в состав желатина входят ионы натрия, калия, магния, кальция, железа окисного, хлориды, карбонаты и сульфаты. На показатели качества и безопасность препарата Реоплазмин - G могут повлиять ионы натрия, калия, магния, кальция и хлора. Результаты количественного определения данных ионов в пересчете на 5 % раствор желатина в сравнении с их концентрациями в плазме крови и прописи препарата приведены в табл. 5.

Приведенные в таблице результаты показывают, что введение указанных ионов в состав разрабатываемого лекарственного препарата без учета их содержания в исходном желатине может привести к их завышенному содержанию в препарате. Превышение концентрации иона кальция относительно его содержания в плазме крови составило 260 %, что может негативно повлиять на систему гемостаза при введении препарата пациенту (Болдырев A.A., 1990; Evans P.A. at all, 1998), а превышение концентрации ионов на 720 % может повлиять на проведение нервного импульса в периферической и центральной нервной системе (Горн, М. М. и

др., 2000). Следовательно, необходимо снижать концентрацию этих ионов, подвергая желатин специальной обработке перед его использованием для производства плазмозамещающих растворов.

Таблица 5 - Сравнение количественного содержания ионов в плазме крови, 5 %

Наименовали е иона Количественное содержание ионов, ммоль/л

в плазме крови в 5 % растворе желатина в составе препарата

марка К-13 марка К-11

Натрий 145,0±2,0 11,10±0,70 11,40±0,60 145,2

Калий 4,0 0,26±0,03 0,06±0,005 4,0

Магний 1,25±0,25 12,95±0,45 13,55±0,45 1Д

Кальций 2,5 11,45±0,55 11,45±0,55 -

Хлорид 105,0*5,0 21,48±0,60 20,92±0,60 108,0

Разработка технологии модификации желатина

Так как исходный желатин обладает способностью образовывать гель, перед его введением в препарат необходимо проводить его модификацию с целью укорочения белковых молекул. Общепринятым методом уменьшения молекулярной массы высокомолекулярных веществ является гидролиз.

Г| отн 8

7 6 5 4 3 2

1 0

О 100 200 300 400 500 600

Т, мин

80 °С ♦ Ы-метилглюкамин —■ — Янтарная кислота - * - Натрия гидроксид 100 "С " М-метилглюкамин —НГ—Янтарная кислота - • - Натрия гидроксид

Рис. 3 Динамика изменения относительной вязкости в процессе гидролиза

желатина

В качестве возможных гидролизующих агентов рассматривали входящие в состав раствора вещества щелочного (Ы - метилглюкамин, натрия гидроксид) и кислотного (янтарная кислота) характера, в концентрации соответствующей прописи препарата (табл. 4). Процесс проводили при двух температурах: 80 °С и

\\

1 ч

Д \ % 'KlZ "

100 °С. Так как существует зависимость между молекулярной массой высокомолекулярного вещества и относительной вязкостью его раствора, об изменении молекулярной массы в процессе гидролиза судили по изменению относительной вязкости. Изменение относительной вязкости во времени при различных условиях проведения эксперимента представлено на рис. 3. Оно соответствует степенной математической функции у = а-х ь. Существует начальный период гидролиза, в течение которого происходит резкое падение вязкости, затем наступает период, в течение которого скорость гидролиза уменьшается.

Результаты проведенных экспериментов показывают, что при температуре гидролиза 80 °С время достижения относительной вязкости 2,07 (измерение вязкости при температуре 60 °С), соответствующей среднечисловой молекулярной массе желатина (М„) 30 000, изменяется следующим образом: при гидролизе натрия гидроксидом оно составляет около 60 минут; гидролиз янтарной кислотой не позволяет достичь данного значения за 360 минут, гидролиз N - метилглюкамином не позволяет достичь необходимого значения относительной вязкости за 540 минут. При гидролизе натрия гидроксидом в точке оптимальной вязкости расчетная скорость гидролиза (Дт^/ДТ) составляет 0,01 мин'1. При несоблюдении четкого времени гидролиза и разной скорости охлаждения реакционной массы велика вероятность получения нестандартного препарата.

При температуре гидролиза 100 °С время достижения необходимой относительной вязкости составляет: при гидролизе натрия гидроксидом около 35 минут, при гидролизе янтарной кислотой 180 минут, при гидролизе N - метилглюкамином 300 минут. Скорости гидролиза в точке оптимальной вязкости составляют: для натрия гидроксида - 0,05 мин"1, янтарной кислоты - 0,001 мин"1, N - метилглюкамина

- 0,002 мин'1. Использование натрия гидроксида при данной температуре гидролиза нецелесообразно, так как достижение необходимой относительной вязкости происходит за очень короткое время, что не позволяет контролировать скорость гидролиза и, следовательно, не позволит от серии к серии получать стандартный гидролизат желатина.

Определение застывания препаратов при температуре 4±1 °С показало, что в жидком состоянии остаются растворы, полученные на основе щелочных гидроли-затов желатина. Препарат, полученный на основе кислотного гидролизата, застывал при данной температуре, что исключает использование в качестве гидроли-зующего агента янтарной кислоты.

Исходя из полученных данных, в качестве гидролизующего агента выбран N

- метилглюкамин, так как его использование позволяет получить не застывающий при низких температурах препарат. Скорость гидролиза в оптимальной точке значения относительной вязкости позволяет обеспечить стабильное качество гидролизата желатина и препарата Реоплазмин - в по показателю средняя молекулярная масса модифицированного желатина. Рекомендуемая температура гидролиза N -метилглюкамином - 100 °С, что позволяет обеспечить достижение оптимальной относительной вязкости гидролизата за 5 часов.

Удаление избытка ионов магния и кальция, влияющих на фармакологическую безопасность препарата при введении его пациенту, из гидролизата желатина проводили методом осаждения с образованием карбонатов осаждаемых ионов. В качестве осадителя по результатам определения остаточных концентраций ионов в гидролизате желатина был выбран натрия карбонат. Отделение получаемого осадка магния и кальция карбонатов, исходя из его агрегатного состояния, рекомендо-

вано проводить центрифугированием со скоростью не менее 6000 об/мин.

Изучение физико-химических свойств полнэтиленгликоля-20 ООО

Для производства состава на основе ПЭГ-20 ООО нами были использованы полиэтиленгликоли производимые по ТУ 2499-010-05784466-2003 (ФГУТГ ГНЦ НИОПИК, Россия) и по Европейской фармакопее (Пика, Франция). Так как препараты, полученные на основании данных субстанций, не отличались друг от друга по результатам определения показателей качества, было принято решение использовать в качестве сырья ПЭГ-20 000 производства ФГУП ГНЦ НИОПИК (Россия). Так как полиэтиленгликоль-20000 является стандартной субстанцией с молекулярной массой 20 000±3000, нами не проводилась разработка методики определения его молекулярных масс. Но показателей качества, контролируемых при производстве ПЭГ-20 000 по ТУ, недостаточно для характеристики его в качестве сырья для получения инфузионного препарата. Рекомендовано ввести дополнительные показатели для входного контроля полиэтиленгликоля-20 000: микробиологическая чистота, тяжелые металлы, посторонние примеси.

Сравнение молекулярно-массовых характеристик желатина и полиэтиленг-

ликоля - 20 000

Сравнение молекулярно-массового распределения желатина, полученного с применением разработанной методики модификации, и полиэтиленгликоля-20 000 приведены на рис. 4. Результаты получены методом гельпроникающей хроматографии.

% во

45 40

35 30 25 20 15 10 5 0

0 5000 5000 10000 - 20000 30000 - 40000 - 50000 60000- >70000

10000 20000 30000 40000 50000 60000 70000

Диапазоны молекулярных масс

Рис. 4 Распределение фракций молекулярных масс модифицированного желатина и полиэтиленгликоля-20000

Молекулярно-массовое распределение ПЭГ-20 ООО находится в узком диапазоне молекулярных масс, что объяснимо стандартностью данного высокомолекулярного компонента. Фракции молекулярных масс модифицированного желатина распределены в широком диапазоне, но как видно из графика содержат небольшое количество низкомолекулярной фракции (от 0 до 10 000), что может позволить данному веществу оказывать достаточный биологический эффект при введении

препарата пациенту, что было доказано при проведении исследований биологической эффективности по показателю восполнения объема циркулирующей плазмы для выбора концентрации желатина в препарате (рис. 1).

Степень полидисперсности модифицированного желатина была определена экспериментально и составила 0,49±0,04. Степень полидисперсности полиэти-ленгликоля - 20 ООО равна 0,04±0,03 (Седова Л.А. и др., 1993). Приведенные значения свидетельствуют о том, что желатин, полученный по разработанной методике модификации, более полидисперсен чем ПЭГ-20 ООО, который является практически монодисперсным полимером.

Изучение физико-химических свойств солей янтарной кислоты При анализе качества разрабатываемого препарата Реоплазмин-О по показателю "осмолярность" было выявлено отличие теоретического и экспериментального значения осмолярности растворов. Было сделано предположение, что причиной значительных различий в осмолярности растворов является присутствие в составе препарата малодиссоциирующей янтарной кислоты, так как неорганические соли, входящие в состав препарата (табл. 4), диссоциируют практически нацело.

Результаты определения осмолярности модельных растворов методом криоскопии показали, что экспериментальная осмолярность динатриевой соли янтарной кислоты меньше теоретической на 13 %. Полученное значение экспериментальной осмолярности натриевой соли меглумина сукцината ниже теоретической на 12 %. Результаты сравнения теоретической и экспериментальной осмолярности для препаратов Реоплазмин-0 и Реоплазмин-РЕО представлены в табл. 6.

Так как физиологическое значение осмолярности плазмы крови колеблется в пределах 270 - 300 ммоль/л, что составляет ± 5 % от ее среднего значения -285 ммоль/л, можно рекомендовать указывать на этикетке теоретическое значение осмолярности лекарственного препарата при отличии теоретического значения от экспериментального менее чем на 5 %, а при большем различии -экспериментальное значение осмолярности инфузионного препарата. Исходя из этого для препарата Реоплазмин-0 рекомендовано указывать на этикетке экспериментальное значение осмолярности, а для препарата Реоплазмин-РЕО - теоретическое значение показателя. Практическое отсутствие отличий в значениях осмолярности для препарата Реоплазмин-РЕО объясняется солюбилизирующими свойствами полиэтиленгликоля - 20 000.

Таблица 6 - Результаты сравнения теоретической и экспериментальной осмолярности препаратов Реоплазмин - G и Реоплазмин - PEG _

Перепарат Теоретическая осмолярность, ммоль/л Эксперименталь ная осмолярность, ммоль/л Отклонение, %

Реоплазмин - G 346 329±1 4,9

Реоплазмин - PEG 346 349±2 0,9

Разработка методик стандартизации препарата

Для стандартизации состава Реоплазмин-О были разработаны методики определения средних молекулярных масс модифицированного желатина и количественного определения желатина,

Для составов Реоплазмин-О и Реоплазмин-РЕО разработана методика количественного определения янтарной кислоты и М-метилглюкамина.

Для количественного определения остальных компонентов этих двух соста-

вов (табл.4) (полиэтиленгликоля - 20 ООО, ионов натрия, калия, магния и хлора) использованы известные методики, в которые внесены изменения с учетом концентраций данных компонентов в составе препарата. Такие показатели качества препарата как прозрачность, цветность, рН, тяжелые металлы, осмолярность, токсичность, стерильность определяли в соответствии с требованиями Государственной фармакопеи СССР XI и иностранных фармакопей.

Методика определения средних молекулярных масс желатина в составе Реоплазмин-О

В качестве метода определения средних молекулярных масс модифицированного желатина был выбран вискозиметрический метод, позволяющий определить как среднечисловую, так и средневесовую молекулярные массы по уравнению Марка - Куна - Хаувинка (1), определяющего зависимость между средней молекулярной массой и характеристической вязкостью препарата.

I=к-м\ о.

Ы

где [г|] - характеристическая вязкость, 100 мл/г;

М - средняя молекулярная масса;

К, а - константы уравнения, зависящие от природы растворителя и полимера.

Установление констант уравнения провели методом гельпроникающей хроматографии (ГПХ). График зависимости десятичного логарифма средних молекулярных масс образцов препарата, определенных методом ГПХ, от десятичного логарифма их характеристической вязкости, определенной вискозиметрическим методом, представлен на рисунке 5.

igln]

4,20

4,30

4,40

4,50

4,60

4,70

-0,5 -0,55 -0,6 -0,65 -0,7 -0,75 -0,8 -0,85

4,80

1 у - 0 goir - 4 ж»7* 1

R2 = 0,867 R2 = 0.8702 |

1 Ж 1

♦ у У !

•¿с ■ ■ в f Vй j

У а i

/ А ■ 1

и' i i

« Мп

Mw •

-Мп--Mw

igM

Рис. 5 Зависимость десятичного логарифма характеристической вязкости от десятичного логарифма средней молекулярной массы

Вывод уравнений зависимости характеристической вязкости от средних молекулярных масс был сделан на основании уравнений линий аппроксимации данных зависимостей. Уравнение Марка - Куна - Хаувинка для расчета среднечисло-вой молекулярной массы (М„) имеет вид (2):

\ц\ = 0,004 • 103 • М'052

(2)

Уравнение Марка - Куна - Хаувинка для расчета средневесовой молекулярной массы (М„) имеет вид (3):

[7]= 0,013 •Ю"3-м°'901 (3)

Методика количественного определения желатина Для количественного определения модифицированного желатина в препарате Реоплазмин-О был использован колориметрический метод, основанный на окрашивании белка сульфатом меди в присутствии лимонной кислоты с последующим определением оптической плотности полученного раствора. Экспериментально определен линейный диапазон зависимости оптической плотности от концентрации модифицированного желатина в растворе, пригодный для проведения количественного определения который составляет 8-21 г/л желатина.

Косинус угла наклона линии зависимости оптической плотности от концентрации модифицированного желатина в пределах линейного диапазона остается постоянным. При построении графика с использованием трех точек теоретической концентрации модифицированного желатина в разведении установлена возможность определения практической концентрации желатина в препарате с использованием постоянного значения косинуса угла наклона линии. Для определения косинуса угла наклона графика строили прямые по значениям оптических плотностей препаратов с различным содержанием модифицированного желатина при теоретических концентрациях - 10, 15 и 20 г/л. Проводили расчет косинуса, используя заложенную концентрацию желатина, рассчитанную для точки 15 г/л. Экспериментально определенный косинус угла наклона графика, являющийся постоянной величиной (К) в формуле расчета концентрации модифицированного желатина, равен 0,01675. Формула имеет вид (4):

X 0,01675-15 ^ ^ ' (4)

где С -концентрация желатина в препарате, г/л;

А2 - оптическая плотность раствора препарата, соответствующего теоретической концентрации 15 г/л;

А0 - отрезок, отсекаемый графической прямой на оси ординат: Кразв - коэффициент разведения препарата; X - постоянная величина (косинус угла наклона прямой). Методика количественного определения янтарной кислоты и N - метилглюками-

на

Методика количественного определения янтарной кислоты и N - метилглю-камина в инфузионном растворе Реоплазмин основана на разделении препарата методом ион-парной высокоэффективной жидкостной хроматографии с последующей регистрацией его рефрактометрическим детектором. Было предложено использовать метод внешнего стандарта. Проведение ряда экспериментов показало, что оптимальной подвижной фазой является водная фаза, состоящая из фосфатного буфера с рН 2,7, содержащего гептилсульфонат натрия, при скорости элюирования - 0,5 мл/мин; объем анализируемой пробы - 20 мкл.

Общее время хроматографирования в этой системе составило 20 минут,

времена удерживания компонентов приблизительно: янтарной кислоты -11,1 мин, N - метилглюкамина - 13,4 мин (рис. 6). Результаты определения условий пригодности хроматографической системы представлены в табл. 7.

Проведена валидация разработанных методик по показателям "избирательность", "правильность" и "сходимость". Результаты валидации для двух составов препарата представлены в табл. 8.

эдс.в

0Л15

ОЛЮ

оде

одю

О 1 4 0 в 10 II 14 10 18 Ю

1 - пик янтарной кислоты 1 - пик Ы-метлггаокамнна

Рис. 6 Хроматограмма препарата Реоплазмин

Таблица 7 - Результаты определения условий пригодности хроматографической системы

Название компонента в ?, % N Т Я

Янтарная кислота 0,64 0,20 9302 1,49 -

N - метилглюкамин 0,62 0,19 9979 1,55 4,74

Относительные ошибки определения характеристической вязкости и средних молекулярных масс находятся в пределах, позволяющих сделать вывод о сходимости данной методики, так как рекомендуемый предел относительной ошибки данного метода составляет 5 %. Разработанные методики количественного определения компонентов обладают избирательностью, необходимой правильностью и сходимостью (для фотоколориметрии не более 3 %, для ВЭЖХ не более 5 %) Разработка технологии производства инфузионного препарата комплексного действия на основе желатина Так как в состав пищевого желатина марок К-11 и К-13 входят те же ионы, которые используются для получения изоионичного препарата Реоплазмин-О, были выведены формулы пересчета загружаемых компонентов в зависимости от концентрации ионов в желатине.

Определен порядок загрузки компонентов. Для растворения янтарной Кислоты ее прибавляют к гидролизату желатина, имеющему щелочной рН. Солюби-лизирующие свойства Ы-метилглюкамина позволяют раствориться всему количеству загруженной Ж при рН 10. После растворения янтарной кислоты рН раствора равен 4,5. Прибавление к раствору эквимолярного янтарной кислоте количества

натрия гидроксида обеспечивает нейтральный рН препарата. Соли добавляют последовательно исходя из прописи от наибольшего к наименьшему количеству.

Таблица 8 - Результаты валидации аналитических методик

Наименование методики Препарат Валидационные характеристики

Избирате льносгь Правильность, е,% Сходи мость, £,%

90 100 110

Определение молекулярной массы желатина Характеристическая вязкость Реоплазмин-0 - - - - 0,96

Среднечисловая молекулярная масса - - - - 0,91

Средневесовая молекулярная масса - - - - 1,07

Количественное определение желатина Реоплазмин-0 соотв 2,84 0,42 2,06 0,57

Количественное определение янтарной кислоты Реоплазмин-0 соотв. 0,70 0,78 0,27 0,99

Реоплазмин-РЕО соотв. 0,31 0,95 0,35 0,86

Количественное определение N метилглюкамина Реоплазмин-0 соотв. 0,91 0,76 0,70 0,81

Реоплазмин-РЕО соотв 0,80 0,39 0,76 0,87

При проведении работ по выбору режима стерилизации для препарата Рео-плазмин-0 получены результаты, свидетельствующие о невозможности использования термической стерилизации, так как при автоклавировании происходит уменьшение средней молекулярной массы модифицированного желатина на 6 %. Поэтому для препарата данного состава рекомендована стерилизующая фильтрация.

Общий выход препарата по разработанной технологии производства составляет 93,5 %.

Технологическая схема производства препарата Реоплазмин-0 приведена на рис. 7.

Разработка технологии производства инфузионного препарата комплексного действия на основе полиэтиленгликоля-20 ООО

Для препарата Реоплазмин-РЕО установлен порядок загрузки компонентов, исходя из их физико-химических свойств. Полиэтиленгликоль загружается в раствор первым, так как он имеет по прописи наибольшую концентрацию по сравнению с остальными компонентами, хорошо растворим в воде и обладает солюбили-зирующими свойствами. В его растворе хорошо растворяется N - метилглюкамин, который создает щелочную среду для растворения янтарной кислоты. Затем в раствор вводится натрия гидроксид для достижения рН раствора близкого к рН плазмы крови. Соли (натрия хлорид, калия хлорид и магния хлорид) вводятся в раствор препарата в порядке уменьшения массы их загрузки.

ВР 11 Подготовка помещении

ВР 1 2 Подготовка оборудования

ВР 1 3 Подготовка технологической одежды

ВР 1 4 Подготовка персонала

тп 21 Проведение гидролиза желатина

ТП 22 Осаждение ионов кальция и нагния

тп 41 Подготовка бутылок

тп 42 Подготовка пробок

ТП 43 Подготовка колпачков

ТП 44 Стерилизующая фильтрация и укупорка

ТП 45 Контроль на механические включения

Санитарная

ВР 1 обработка

производства

ТП 2 Приготовление гидролизата желатина 10%

ТПЗ Приготовление раствора препарата

ОТХОДЫ

потери

Фильтрация, асептический розлив и укупорка

ТП 4

< >

УМО 5 Маркировка, упаковка

потери

Готовая продукция

Рис. 7 Технологическая схема производства препарата Реоплазмин-0

ВР 11 Подготовка помещений

ВР 1 2 Подготовка оборудования

ВР 1 3 Подготовка технологической одежды

ВР 1 4 Подготовка персонала

ТП 21 Приготовление раствора

ТП 22 Фильтрация

ТП 31 Подготовка бутылок

ТП 32 Подготовка пробок

ТП 33 Подготовка колпачков

ТП 34 Розлив и укупорка

ТП 41 Стерилизация

ТП 42 Перемешивание

ТП 43 Контроль на механические включения

Санитарная

ВР 1 обработка

производства

Приготовление

и фильтрация

раствора

■

ТП 3 Розлив и укупорка

потери

ТП 4 Стерилизация и потери ^

контроль

1

УМО Маркировка, отходы

5 упаковка

Готовая продукция

Рис. 8 Технологическая схема производства препарата Реоплазмин-РЕО

В качестве метода стерилизации использована стерилизация паром под давлением. При его применении не происходит качественных и количественных изменений препарата. Выбран режим стерилизации: 121±1 °С (рИ5б = 0,11 МПа) в те-

чение 15 минут, рекомендуемый в фармакопея*, который обеспечивает необходимый показатель гарантированной стерильности (8АЬ=10"6). Микробиологическая нагрузка препарата для обеспечения надежности метода стерилизации должна соответствовать микробиологической категории 1.2.Б. Подтверждено, что все субстанции, используемые для приготовления разрабатываемого лекарственного препарата Реоплазмин-РЕС, соответствуют данной категории.

Так как полиэтиленгликоль-20 ООО при высоких температурах обладает свойством "обратного растворения", препарат при стерилизации расслаивается, поэтому перед просмотром на механические включения рекомендовано ввести дополнительную технологическую стадию перемешивания раствора препарата во флаконе для восстановления его однородности.Общий выход препарата по разработанной технологии производства составляет 96 %.

Технологическая схема производства препарата Реоплазмин-РЕО приведена на рис. 8.

Экспериментальные данные по изучению стабильности и установлению сроков годности препарата Реоплазмин различного состава

С целью установления сроков годности по 5 серий препарата каждого из изучаемых составов были заложены на хранение. Одну часть серий хранили в сухом, защищенном от света месте при температуре (+ 20)-(+ 25) °С, а другую в условиях ускоренного старения при температуре (+ 40)°С.

Для состава Реоплазмин-в установлен срок годности 1 год, при большем сроке хранения препарат не соответствует требованиям проекта ФСП по показателям относительная вязкость и средневесовая молекулярная масса.

> Реоплазмин-G —■— Рэоллаэмин-РВЗ

Рис. 9 Изменение объема циркулирующей плазмы во времени после введения препаратов Реоплазмин-G и Реоплазмин-РЕО

Данные по ускоренному старению и естественному хранению состава Реоплазмин - PEG указывают на то, что препарат, содержащий в составе полиэти-

ленгликоль-20 ООО, выдерживает хранение в течение 2-х лет (срок наблюдения). Раствор сохраняет все качественные и количественные характеристики в течение всего срока хранения.

Выбор состава препарата из двух исследованных проводили на основании результатов фармакологических исследований, оценки технологии, экономических аспектов производства и результатов определения стабильности.

По биологическому действию - показателю длительность и величина восполнения ОЦК (рис. 9) - препарат на основе желатина уступает препарату на основе ПЭГ-20 ООО.

Для производства препарата Реоплазмин-0 необходимо введение дополнительных технологических стадий (рис. 7, ТП 2. Приготовление гидролизата жела-шна 10%), связанных с использованием нестандартного для производства инфу-зионных растворов оборудования, что может вызвать необходимость реконструкции действующего производства при внедрении данной технологии. Расчет производственных циклов для препаратов обоих составов показал, что производство препарата на основе желатина занимает в 2 раза больше времени, чем производство препарата на основе полиэтиленгликоля - 20 ООО, причем для проведения гидролиза желатина требует двусменной работы.

Компонент Содержание, г/л

Полиэтиленгликоль- 20 ООО 30,00

Янтарная кислота 5,00

М-метилглюкамин 8,26

Натрия гидроксид 1,70

Натрия хлорид 6,00

Калия хлорид 0,30

Магния хлорид 0,12

Срок годности состава Реоплазмин-О, равный 1 году, не позволит проводить эффективное внедрение на рынок препарата данного состава, этим он уступает составу Реоплазмин-РЕО, имеющему срок годности 2 года, установленному только по сроку наблюдения.

На основании рассмотренных выше аспектов принято решение о выборе состава препарата на основе полиэтиленгликоля-20 ООО более подходящего для условий действующего производства, несмотря на широкую мировую известность гемодинамических препаратов на основе желатина.

Состав разработанного препарата Реоплазмин представлен в табл. 9.

В результате проведенных исследований, обоснован состав стабильного препарата комплексного действия реоплазмин, разработана технология его производства и осуществлена стандартизация препарата. Подготовлен проект фармакопейной статьи предприятия, разработан и утвержден лабораторный регламент производства.

ВЫВОДЫ

1. Экспериментально установлен качественный состав и оптимальные концентрации компонентов изучаемых составов Реоплазмин-G и Реоплазмин-PEG, обеспечивающие изоионичность, изовязкостность и изогидричность;

2. Впервые установлен качественный и количественный ионный состав примесей неорганических солей, содержащихся в желатине, что обусловливает введение дополнительных показателей качества при стандартизации субстанции;

3. Для введения в инфузионный препарат желатина разработаны методика его модификации с использованием в качестве гидролизующего агента N - ме-тилглюкамина и методика удаления из гидролизата желатина избыточного количества ионов магния и кальция, влияющих на безопасность препарата;

4. Установлено что натриевые и натрий-меглуминовые соли янтарной кислоты влияют на величину осмолярности инфузионного препарата, уменьшая значение экспериментальной осмолярности по сравнению с теоретическим значением показателя;

5. Экспериментально обоснована технология производства препаратов, содержащих в качестве гемодинамических компонентов модифицированный желатин и полиэтиленгликоль-20 ООО;

6. Для стандартизации состава, содержащего желатин: разработана методика определения молекулярной массы модифицированного желатина методом вискозиметрии; разработана и валидирована методика количественного определения желатина с применением метода колориметрии. Для стандартизации обоих составов разработана и валидирована методика количественного определения янтарной кислоты и N-метилглюкамина методом ион-парной обра-щенно-фазовой ВЭЖХ с применением рефрактометрического детектора;

7. На основании сравнительной оценки результатов изучения свойств исходных компонентов, стабильности, биологического действия, технологичности препаратов на основе модифицированного желатина и полиэтиленгликоля-20 ООО, экономических аспектов их производства в качестве гемодинамиче-ского компонента выбран полиэтиленгликоль-20 ООО.

Список опубликованных работ по теме диссертации

1. Габитова H.A., Громова Л.И. Реоплазмин - новый плазмозамещающий раствор комплексного действия // Научные труды 3-й Международной научно-практической конференции "Здоровье и образование в XXI веке" 29-31 марта 2002 года. - М.: РУДН, 2002. - с. 139.

2. Габитова H.A., Борисова М.А., Громова Л.И., Алексеева Л.Е. Исследование процесса гидролиза желатина // Фармация, № 4,2002. - с. 25-26.

3. Габитова Н.. Алексеева Л. Применение плазмозаменителей комплексного действия - современное направление инфузионной терапии // Врач, №11,

2002. - с. 45.

4. Габитова H.A., Громова Л.И. Определение гидролизованного желатина в препарате "Реоплазмин" // Фармация, № 2, 2003. - с. 20-22.

5. Габитова H.A., Громова Л.И. Изучение ионного состава желатина // Фармация, №6, 2003.-с. 21-22.

6. Габитова H.A., Алексеева Л.Е. Разработка плазмозаменителей комплексного действия - проблемы и перспективы // Тезисы докладов X Российского национального конгресса "Человек и лекарство" 7-11 апреля 2003 года. - М.,

2003.-с. 592-593

7. Габитова H.A., Коваленко A.JI. Изучение молекулярно-массового распределения плазмозамещающих препаратов на основе гидролизованного желатина // Материалы X Российского национального конгресса "Человек и лекарство" 7-11 апреля 2003 года. - М.:, 2003. - с. 593.

8. Габитова H.A. Изучение осмолярности растворов натриевых солей янтарной кислоты // Научные труды 4-й Международной научно-практической конференции "Здоровье и образование в XXI веке" 23-25 мая 2003 года. - М.: РУДН, 2003. - с. 141.

9. Габитова Н. А., Коваленко A.JI., Алексеева J1.E., Громова Л.И. Разработка полифункционального плазмозамещающего препарата Реоплазмин // Материалы международной научно-практической конференции, посвященной 85-летию академии. - СПб.: Изд-во СПХФА, 2004. - с. 159-161.

10. Габитова H.A. Выбор концентрации плазмозамещающего компонента в ин-фузионном растворе комплексного действия Реоплазмин // Региональная медицинская наука: тенденции и перспективы развития. Аспирантские чтения - 2004: Сборник материалов докладов V научной конференции молодых ученых. Самара 14 октября 2004 года. - Самара: ООО "Офорт"; ГОУВПО "СамГМУ", 2004. - с. 466-468

11. Габитова H.A., Коваленко A.JT. Этапы разработки плазмозамещающего препарата комплексного действия реоплазмин.// Научные труды V международной научно-практической конференции "Здоровье и образование в XXI веке" 21-23 октября 2004 года. - М.: РУДН, 2004. - с. 80.

На правах рукописи

ГАБИТОВА Наталия Александровна

Разработка состава и технологии плазмозамещающего раствора комплексного

действия

15.00.01 - Технология лекарств и организация фармацевтического дела

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата фармацевтических наук

Подписано в печать 16.11.2005. Формат 60 x 90/16. Бумага тип. Печать ризограф. Заказ 12011. Тираж 100 экз.

ООО «Загородный 30» Санкт-Петербург, ул. Социалистическая, д. 2/30 (812)713-29-09

IP 22 8 В О

РНБ Русский фонд

2006-4 26427

гидрофосфата и натрия ацетата, а так же солей и оснований, обеспечивающих рН раствора близкое к рН крови.Изовязкостность. Вязкость препарата по возможности должна приближаться к вязкости плазмы крови, так как она влияет на режим движения крови в кровяном русле и очень важна для гемодинамических растворов.1.2.3 Современная классификация плазмозамещающих растворов В настоящее время инфузионно-трансфузионная терапия прочно заняла самостоятельное место в лечении различных категорий больных.Важнейшими показаниями к применению средств инфузионно - трансфузионной терапии в клинической практике являются: гиповолемия, клеточная и белковая недостаточность крови, интоксикация, а так же нарушения гомеостаза, реологических свойств крови, водно - электролитного баланса, кислотноосновного состояния, транскапиллярного обмена. Эти состояния могут быть обусловлены различными обстоятельствами экстремального характера: травмой, кровопотерей, инфекцией и острыми заболеваниями. При данных состояниях проводится неотложная интенсивная инфузионно-трансфузионная терапия, направленная на восстановление отдельных функций организма и нормализацию гомеостаза в целом [12, 57, 117, 163].Для восполнения объема циркулирующей крови и лечения шоков различного генеза используют консервированную донорскую кровь, различные компоненты крови: различные виды эритроцитарной массы, нативную плазму, свежезамороженную плазму, криопреципитат, тромбоцитарную массу и тромбоконцентрат, так же препараты на ее основе (альбумин, протеин) и инфузионные растворы [57].Основными недостатками крови, ее компонентов и препаратов на их основе является непродолжительное время хранения, опасность передачи при переливании патогенных вирусов (вирусы гепатита, ВИЧ и т.д.) и возникновение большого количества побочных эффектов. Побочные эффекты связаны с тем, что донорская кровь представляет собой чужеродную ткань, неизбежно отторгаемую организмом реципиента. У человека выработана целая система отторжения чужеродной ткани и по мнению некоторых специалистов [17], переливание крови является антифизиологическим явлением.По этим причинам в настоящее время частота использования плазмозамещающих растворов в лечении кровопотерь в 3 - 4 раза больше числа переливаний донорской крови, ее препаратов и плазмы. Плазмозамещающие препараты доступны, высокоэффективны и вызывают значительно меньший процент побочных осложнений [14, 62, 129].В настоящее время разработана рациональная классификация инфузионных препаратов, в основу которой положены их функциональные свойства и действие.В соответствии с лечебными функциями (кровопотеря и шок различного происхождения, интоксикация, дефицит белка) выделяют группы инфузионных растворов, представленные в таблице 1.2 [14, 18, 77, 107].Таблица 1.2 - Классификация инфузионных препаратов Функциональная группа Гемодинамические(коллоидные плазмозамещающие) Дезинтоксикационные Для парентерального питания Показания для назначения При кровопотере, лечении шоков различного генеза, при операциях для восстановления гемодинамики и микроциркуляции, а так же для гемодилюции Для лечения заболеваний, сопровождающихся интоксикациями: отравления, ожоги, лучевая болезнь, лейкоз, болезней печени и почек и др.Применяются для коррекции нарушений обмена веществ, развивающихся при различных тяжелых заболеваниях.Используемые препараты Основа Декстран Желатин Оксиэтилированный крахмал Полиэтиленгликоль Поливинилпирролидон Белковые гидролизаты Смеси аминокислот Жировые эмульсии Растворы глюкозы Наименование Полиглюкин, Неорондекс, Реополиглюкин, Декстран 40, Реоглюман, Реомакродекс.Желатиноль, Гелофузин: Волекам, ХАЕСстерил.Полиоксидин Гемодез, Глкжонеодез Гидролизин, Амикин.Полиамин, Фреамин, Аминостерин и др.Липовеноз, Липофундин и др.5-40 % глюкоза, Глюкостерил.Таблица 1.2 - Продолжение Регуляторы водно - солевого и кислотно - основного состояния Кровезаменители с функцией переноса кислорода Комплексного действия Регулируют кислотноосновное равновесие, водно - электролитный баланс и отчасти состав крови.Моделируют дыхательные функции крови Сочетают в себе различные свойства крови (гемодинамическое, дезинтоксикационное, газотранспортное, регулирующее водно - солевой и кислотно - основной балансы) и оказывают лечебное воздействие.Солевые растворы Корректоры электролитного и кислотно-основного состояний: О смодиур етики: На основе гемоглобина На основе фторуглеродов Изотонический раствор натрия хлорида, Раствор Рингера, Дисоль.Раствор Хартмана, Рингер - лактат, Трисамин.Маннитол 15%, Сорбитол 20 % .Геленпол, Полигемоглобин Перфторан, Оксиджен Реамберин (дезинтоксикационное, антигипоксическое, гепато-, нефро- и кардиопротекторное действие), Лактасол (дезинтоксикационное и гемодинамическое действие), Мафусол (регуляция водносолевого и кислотно-основного баланса, уменьшение интосикации и повышение энергопродукции), Полифер и Рондферрин (гемодинамическое и гемопоэтическое действие), Реоглюман (гемодинамическое, дезинтоксикационное и осмодиуретическое действие) Плазмозаменители комплексного действия сочетают в себе не только различные функции крови, но и предупреждают развитие осложнений, вызванных шоками различного происхождения. В последнее время врачи отдают предпочтение данным растворам [15, 20, 52], что подтверждает необходимость разработки препаратов этой группы. Наибольшее количество современных препаратов комплексного действия разработано на основе гемодинамических препаратов [27].Оценка российского рынка растворов гемодинамического действия, проведенная в 2001 году [3], показывает, что препараты группы декстранов в основном производятся в России (ОАО "Красфарма" и ОАО "Биохимик"), но есть и зарубежные средства в основном из Белоруссии (РУП "Белмедпрепараты").На основе декстрана зарегистрированы не только гемодинамические растворы, но и препараты комплексного действия Рондферрин, Полифер и Реоглюман.Группу растворов на основе желатина представляют только Желатиноль (ООО Самсон-Мед, Россия) и Гелофузин (B.Braun Melsungen AG, Германия) и спрос на эти растворы не удовлетворен.Группа оксиэтилированного крахмала полностью представлена зарубежными препаратами. Единственный отечественный препарат Волекам зарегистрирован, но в производство не внедрен. Эти препараты имеют достаточно высокие показатели наполнения каналов распределения, тем не менее, в структуре продаж 2000 г. - представлены ограниченно. Цены на эти препараты существенно выше, чем на другие группы гемодинамических плазмозамещающих растворов, и распределены в широком диапазоне.Группа плазмозаменителей на основе полиэтиленгликоля представлена препаратами Полиоксидин и Полиоксифумарин (разработчик и патентообладатель Российский НИИ гематологии и трансфузиологии). На рынке фигурирует только Полиоксидин производства ОАО "Красфарма", тогда как Полиоксифумарин в производство не внедрен. Опыт применения данной группы инфузионных препаратов еще не велик, тем не менее, эти препараты привлекают к себе внимание специалистов, как новая группа растворов.Диапазон распределения цен на инфузионные препараты гемодинамического действия, дающий возможность оценить уровень ценовой конкуренции в группе, представлен в таблице 1.3.Таблица 1.3 - Распределение инфузионных препаратов гемодинамического действия в различных ценовых диапазонах Фармакотерапевтическая подгруппа Препараты декстрана Ценовые диапазоны (USD), % $0$1 12,8 $1$2 49,4 $2$3 21,1 $3$4 $4$5 16,7 $5$6 $6$7 $7$8 $8$9 $9$10 $10$11 $11$12 $12$13 $13$14 Таблица 1.3 -Продолжение Препараты желатина Препараты ОЭК Препараты ПЭГ Всего 13,6 30,5 9,8 33,3 5,1 16,7 0,9 10,5 7,8 2,4 14,5 4,5 21,5 6,6 12,7 3,9 31,0 9,5 2,4 0,7 4,8 1,5 1,5 0,5 2,9 0,9 Наиболее высокие показатели характерны для группы полиэтиленгликолей и желатина, где уровень ценовой конкуренции наиболее высок, так как наибольшее количество цен сосредоточено в одном ценовом диапазоне. В то же время в группе декстранов ценовую конкуренцию можно было бы охарактеризовать как умеренную, так как цены на препараты распределены по четырем ценовым диапазонам практически равномерно, а в группе ОЭК - как достаточно низкую, так как в ней наблюдается распределение цен в 10 ценовых диапазонах.Все рассматриваемые сегменты препаратов являются вполне перспективными. Они имеют достаточно большой потенциал для расширения. В связи с ограниченным характером предложения внедрение на рынок препаратов на основе желатина является весьма перспективным. Что касается группы ОЭК, то здесь основным ограничивающим фактором развития сегмента является низкая платежеспособность бюджетов здравоохранения, не соответствующая высокому уровню цен. Тем не менее, ориентацию на этот сегмент следует признать весьма разумной, учитывая хорошие клинические перспективы данной группы.Оценивая перспективы группы полиэтиленгликолей, можно предположить, что при адекватном продвижении эти препараты будут востребованы рынком.1.3 Обзор компонентов для создания комплексного препарата, обладающего гемодинамическими и антиоксидантными свойствами При острой кровопотере интенсивная терапия прежде всего направлена на восполнение объема циркулирующей крови (ОЦК), поддержание адекватной тканевой перфузии, нормализацию гемокоагуляции и улучшение метаболизма клетки.При массивной кровопотере происходит не только уменьшение снабжения тканей и органов кислородом, но и * нарушение механизма потребления кислорода, что так же негативно сказывается на общем состоянии организма.В соответствии с современными схемами лечения [65] восполнение ОЦК производят препаратами, содержащими в своем составе гемодинамическии компонент, представляющий собой высокомолекулярное вещество. Восстановление системы клеточного дыхания осуществляют введением в состав препарата фармакологически-активного компонента - антигипоксанта.1.3.1 Гемодинамические компоненты препарата В качестве гемодинамического компонента используются высокомолекулярные вещества, разрешенные к применению в медицине и за счет осмотического эффекта длительное время удерживающие препарат в кровяном русле.1.3.1.1 Желатин Раствор желатина был первым плазмозамещающим раствором, предложенным для лечения шока и кровопотерь [62]. Первые сообщения о применении на людях растворов желатина появились в 1915 году [107, 171].По своей природе желатин является денатурированным белком, полученным из коллагенсодержащих тканей скота в результате ступенчатой тепловой и химической обработок [107]. Кислотная обработка применяется для получения желатина из кожи свиньи, щелочная для обработки любого другого коллагенсодержащего сырья [16]. В России применяется желатин, полученный щелочной обработкой.Типичный аминокислотный состав желатина, приведенный Т. Lepold, представлен в таблице 1.4 [157].Таблица 1.4 - Аминокислотный состав желатина Аминокислота I Глицин Алании Валин Содержание, % "Кислотный" желатин 26,40 10,70 2,77 "Щелочной" желатин 27,5 11,0 2,59 Таблица 1.4 - Продолжение Лейцин Изолейцин Треонин Серии Метионин Цистин Фенилаланин Тирозин Лизин Гистидин Аргинин Аспарагин Глутаминовая кислота Пролин Гидроксипролин 3,34 1,36 2,19 4,13 0,88 0,10 2,56 0,60 4,14 1,01 9,10 6,70 11,30 16,20 13,50 3,33 1,72 2,22 4,21 0,89 0,10 2,23 0,29 4,50 0,78 8,80 6,70 11,40 16,35 14,10 Желатин не содержит незаменимую аминокислоту триптофан.Современная классификация модифицированных желатинов, используемых для производства инфузионных растворов, выделяет три типа: тиожелатин, оксиполижелатин, сукцинированный желатин.Желатин сшитый мочевиной (тиожелатин) получают межцепочным связыванием полипептидов из желатина, каждый из которых имеет среднюю молекулярную массу 12 000 - 15 000, с применением в качестве катализатора гексаметилдиизоцианата. Ri-COOH +NH 2-R 2 ** R i -CONH-R 2 + Н 20 Полученный тиожелатин имеет среднюю молекулярную массу 24 500.Препараты на основе сукцинированного желатина увеличивают объем циркулирующей крови, что приводит к увеличению венозного возврата и сердечного выброса, повышению артериального давления и улучшению перфузии периферических тканей; вызывают осмотический диурез и этим обеспечивают поддержание функции почек при шоке; снижают вязкость крови, улучшают микроциркуляцию. Благодаря своим коллоидно-осмотическим свойствам они предотвращают или снижают вероятность развития отека межклеточного пространства. Эффект замещения объема сохраняется в течение 5 часов [102].Согласно фармакокинетическим исследованиям препаратов на основе модифицированного желатина, после введения желатин не накапливается в организме. Его основная часть выделяется через почки, около 10 - 15 % выводится через кишечник, а оставшийся желатин расщепляется тканевыми протеиназами и метаболизируется в организме благодаря протеолитическим ферментам [46, 128].Препараты на основе желатина не обладают большой длительностью объемозамещающего эффекта, так как оказывают его не за счет связывания воды, а за счет высокого коллоидно-осмотического давления [107]. Существуют противоречивые данные по влиянию растворов желатина на систему свертывания крови. По одним данным эти препараты безопасны в отношении влияния на гемостаз [128], другие исследователи сообщают, что они влияют на агрегацию тромбоцитов [11, 146].1.3.1.2 Декстран С начала применения декстрана как гемодинамической основы для плазмозамещающих растворов в мировой медицинской практике прошло более 60 лет. В России первые работы по созданию препарата на основе декстрана были проведены в Ленинградском НИИ гематологии и переливания крови в 1952 году [62, 107].Декстран - водорастворимый высокомолекулярный полимер глюкозы, являющийся продуктом жизнедеятельности бактерий Leuconostoc mesenteroides. Декстран имеет большую линейную молекулу с ветвлениями, в которой глюкозные единицы соединены главным образом а-1,6, а так же а-1,4, а-1,3 (незначительное число) и а-1,2 связями. Для получения плазмозамещающих растворов гемодинамического действия используют декстран, содержащий не менее 90 % а-1,6 связей, т.е. имеющий разветвленную структуру [62].Растворы нативного декстрана непригодны для использования в качестве плазмозамещающего компонента, так как они создают недостаточное осмотическое давление, слишком вязки, обладают токсичностью и изменяют иммунореактивные свойства организма. Молекулярная масса нативного декстрана составляет (1-30)" 10 . Для возможности внутривенного введения и для уменьшения негативного влияния нативного декстрана на организм, его частично гидролизуют, выделяют среднемолекулярную фракцию, которую очищают и используют для приготовления препаратов.Одним из способов модификации нативного декстрана является его частичный гидролиз у-радиацией с последующим фракционированием.Для производства инфузионных препаратов используются среднемолекулярный декстран с молекулярной массой 50000-70000 и низкомолекулярный декстран с молекулярной массой 30000-40000, описанные в европейской и американской фармакопеях [145, 171].Препараты на основе среднемолекулярных декстранов оказывают плазмозамещающее, противошоковое, восполняющее ОЦК и антиагрегатное действие. Вследствие высокого осмотического давления, превышающего в 2,5 раза осмотическое давление белков плазмы, они вызывают активное привлечение тканевой жидкости (20-25 мл на 1 г полимера) и удерживают ее в сосудистом русле достаточно длительный период. Введение препаратов на основе декстранов повышает суспензионную устойчивость крови, уменьшает ее вязкостные характеристики, обладает выраженным антиагрегантным действием на тромбоциты.Препараты на основе низкомолекулярных декстранов уменьшают вязкость крови, восстанавливают кровоток в мелких капиллярах, нормализуют артериальное и венозное кровообращение, предотвращают и снижают агрегацию форменных элементов крови, оказывают дезинтоксикационное действие. По осмотическому механизму стимулируют диурез, чем способствуют (и ускоряют) выведению ядов, токсинов. Выраженный волемический эффект положительно сказывается на гемодинамике и одновременно сопровождается вымыванием продуктов метаболизма из тканей, что вместе с увеличением диуреза обеспечивает ускоренную детоксикацию организма.Проведенные фармакокинетические исследования препаратов показали, что декстран выводится из организма, преимущественно, почками, в течение первых 24 ч около 50 %, а через 3 суток в крови определяются лишь следовые концентрации декстрана.Недостатком препаратов на основе декстрана является их негативное влияние на систему гемостаза [13, 14]. Примерно у 60-70 % пациентов на фоне парентерального введения полисахаридов сохраняется вероятность образования иммунокомплексов, как следствие реакции антиген-антитело [107].1.3.1.3 Оксиэтилированный крахмал Оксиэтилированный крахмал (ОЭК) для производства плазмозамещающих растворов применяется с начала 60-х годов XX века.Амилопектиновый крахмал кукурузы или картофеля, на основе которого ведут получение ОЭК является природным полисахаридом очень близким к структуре гликогена. .Основными параметрами, отражающими физико - химические свойства ОЭК являются: молекулярная масса, молекулярное замещение (Ms) и степень замещения (Ds). Величина Ms представляет собой среднее число гидроксильных групп, приходящихся на глюкозную единицу и является основным показателем, отражающим время циркуляции крахмала в сосудистом русле. Величина Ms в зависимости от заданных свойств может находиться в пределах 0,4 - 0,8. Показано что ОЭК с Ms 0,8 сохраняется в крови в течении 60 суток, а с Ms 0,55 - на протяжении 10 суток. Считается, что в сосудистом русле ОЭК образует комплекс с амилазой. При этом получается соединение с большой молекулярной массой, обеспечивающее длительное гемодинамическое действие препарата, содержащего ОЭК [62].За счет способности связывать и удерживать воду растворы ОЭК обладают способностью увеличивать объем циркулирующей крови на 85-100 % от введенного объема (плазмозамещающее действие устойчиво сохраняется в течение 4-6 ч). При введении в составе инфузионного раствора, ОЭК восстанавливает нарушенную гемодинамику, улучшает микроциркуляцию, реологические свойства крови (за счет снижения показателя гематокрита), снижает агрегацию тромбоцитов и препятствует агрегации эритроцитов. Сходство структуры гидроксиэтилкрахмала со структурой гликогена объясняет высокий уровень переносимости и практическое отсутствие побочных реакций.Проведенные фармакокинетические исследования препаратов ОЭК показали, что после внутривенного введения ОЭК выводится почками (за 24 ч - около 70 % введенной дозы пентакрахмала и 40 % - гексакрахмала) и с желчью.Время полувыведения - 4,94 ч. Основное количество ОЭК выводится из кровеносного русла за 14 дней, оставшиеся 10 % - за 24 дня [62, 102].Выраженность изменений гемостаза при применении растворов ОЭК зависит, помимо молекулярной массы, и от степени молекулярного замещения (характеризующей долю остатков глюкозы, замещенной на гидроксильные группы). В большей степени снижают гемостатический потенциал препараты высокомолекулярного ОЭК с высокой степенью замещения, в частности ОЭК 450/0,7. Наименьшее влияние отмечено для препаратов ОЭК 200/0,5 [107].Степень молекулярного замещения оказывает косвенное действие на выраженность гипокоагуляционного эффекта препарата. Увеличение количества замещенных (гидроксилированных) глюкозных остатков тормозит элиминацию молекулы ОЭК и продлевает время нахождения препарата в сосудистом русле.Это особенно важно учитывать при многократном введении: растворы ОЭК со степенью замещения более 0,6 обладают способностью к кумуляции и после длительного применения концентрация ОЭК может превысить допустимые пределы [14].1.3.1.4 Полиэтиленгликоль В 1993 году Ленинградским научно - исследовательским институтом гематологии и переливания крови впервые в России был получен патент на плазмозамещающий раствор "Полиоксидин" для лечения шока и кровопотери, содержащий в качестве гемодинамического компонента полиэтиленгликоль 20 000 [92]. Ранее полиэтиленгликоль применялся в фармацевтической промышленности только для производства суппозиторий, мазей и таблеток, а так же для консервации костного мозга и крови человека [39, 62].Свойствами полиэтиленгликоля, определяющими его применение в инфузионных растворах являются[2, 28, 39, 98, 109, 150]: - Хорошая растворимость в воде. • Структура водородных связей в воде не изменяется от введения полиэтиленгликоля вследствие геометрического подобия и соответствия расстояний в молекулах ПЭГ и воды. • Полиэтиленгликоли характеризуются аномальной растворимостью в воде. В воде растворяются не сами полиэтиленгликоли, а их гидраты.При нагревании гидраты разрушаются, полиэтиленгликоли выпадают в осадок, вызывая помутнение раствора. При охлаждении раствор снова становится прозрачным. - Способность растворять гидрофильные и гидрофобные лекарственные вещества. - Устойчивость к действию электролитов. - Стабильность при хранении. - Устойчивость к действию высоких температур. - Осмотическая активность. - Низкая токсичность. При внутрисосудистом введении растворы ПЭГ не проявляют токсического действия и выводятся из организма без изменений, не оказывают побочного действия на организм и не вызывают нарушений функционального состояния печени, почек и сердечной мышцы. В первые сутки однократного введения раствора 80-85 % ПЭГ выводится из кровеносного русла через почки, полное выведение происходит к 5-7 суткам. Накопления полимера в органах и тканях не происходит.Полиэтиленгликоль в инфузионном препарате снижает степень агрегации эритроцитов и вязкость плазмы, тем самым, увеличивая микроциркуляцию.Введение ПЭГ в кровь ведет к снижению гемодинамического сопротивления [36, 92, 93].Основной недостаток растворов на основе полиэтиленгликоля-20 000 в том, что они применяются в медицинской практике непродолжительное время (по сравнению с остальными компонентами) и поэтому мало изучена возможность возникновения негативных последствий при их применении.1.3.2 Фармакологически активный компонент препарата В метаболических превращениях, происходящих в клетках при гипоксии, возникающей в процессе развития шока, центральными звеньями являются аэробный энергетический обмен и активация перекисного окисления липидов (ПОЛ) [63, 147].В связи с этим, целесообразно использовать препараты, способные коррегировать энергетический обмен и стабилизировать клеточные и субклеточные мембраны. Учитывая многогранность патогенеза, необходимо обеспечивать комплексное применение лекарственных средств, позволяющих воздействовать на различные звенья патогенетической цепи. Использование антигипоксантов и антиоксидантов может решить эту задачу.Янтарная кислота обладает универсальным характером фармакологической активности, поэтому именно на ее основе был разработан комплексный субстратный антигипоксант/антиоксидант для коррекции процессов свободнорадикального окисления при гипоксических нарушениях - Реамберин (ООО "НТФФ Полисан", Россия) [55, 91,103].Янтарная кислота (ЯК) - универсальный внутриклеточный метаболит, широко участвующий в обменных реакциях организма [38, 48, 53]. Она является продуктом пятой и субстратом шестой реакции цикла трикарбоновых кислот (цикл Кребса, рисунок 1.1) [8, 73, 114, 121]. Содержание ЯК в тканях организма человека и животных, составляет 0,2-0,8 ммоль/кг, а ее концентрация в плазме не превышает 0,04 ммоль/л [8, 48]. ЯК - малотоксичное соединение, не обладающее мутагенным и тератогенным действием [40, 48, 60, 154]. I<— СО-»СоЛ A tMMM а -К*т|хлумр«тмпядропиюммй кэмготсв CoA-SH Рисунок 1.1 Цикл трикарбоновых кислот (Цикл Кребса) [73] Окисление ЯК в шестой реакции цикла Кребса осуществляется с помощью специфического фермента - сукцинатдегидрогеназы [8, 73, 114, 175], характерной особенностью которой является локализация на внутренней мембране митохондрий и независимость её активности от концентраций окисленной и восстановленной форм никотинамидадениндинуклеотида (НАД+/НАДН). Это позволяет сохранить энергосинтезирующую функцию митохондрий в условиях гипоксии при нарушении НАД-зависимого дыхания клеток, выполняя каталитическую функцию по отношению к циклу Кребса [66-71, 156]. ЯК снижает концентрацию в крови других интермедиатов цикла - лактата, пирувата и цитрата, накапливающихся в клетках на ранних стадиях гипоксии [49, 60],что представляет собой распространенное явление, возникающее в условиях дефицита кислорода во внешней среде, а также в результате состояний, связанных с нарушением функций дыхательной, сердечно-сосудистой систем, а также транспортной функции крови, приводя к снижению доставки кислорода к тканям до уровня, недостаточного для поддержания функций, метаболизма и структуры клетки.Сукцинатдегидрогеназа обеспечивает сохранение окислительных превращений сукцината при низких парциальных давлениях кислорода, в то время как окисление НАД-зависимых субстратов при недостаточной оксигенации тормозится накоплением восстановленных форм НАД*" [58]. Феномен быстрого окисления ЯК сукцинатдегидрогеназой, сопровождающийся АТФ-зависимым восстановлением пула пиримидиновых динуклеотидов, получил название "монополизация дыхательной цепи", биологическое значение которого заключается в быстром ресинтезе АТФ клетками [59, 156].В таблице 1.5 приведены основные фармакологические эффекты янтарной кислоты.Таблица 1.5 - Основные фармакологические эффекты янтарной кислоты [54] Биологический эффект Антигипоксический Гепатотропный Радиопротекторный Применение Реализуется ограничением объема ишемических повреждений, снижением уровня продуктов ПОЛ, увеличением средней продолжительности жизни экспериментальных животных.Обусловлено повышением уровня соотношения НАДН+/НАД, стимуляцией синтеза мочевины и энергетического обмена в гепатоцитах. Активация сукцинатдегидрогеназы в митохондриях гепатоцитов, нормализует печеночный холестаз и препятствует жировой дистрофии печени; повышает устойчивость мембран гепатоцитов к радикальному окислению.Радиопротекторная активность невысока и обусловлена влиянием на метаболические процессы в клетках, снижая оксигенацию ядра и цитоплазмы, активируя клеточное дыхание, стимулирует синтез белка и АТФ. Таблица 1.5 - Продолжение Кадиопротекторный и антиаритмический Антиоксидантный Обусловлено активацией сукцинатдегидрогеназного пути окислительного ресинтеза АТФ, снижением уровня жирных кислот и НАД-зависимых субстратов цикла Кребса в зоне гипоксии. Повышением периода биоэлектрической активности сердца, увеличением толерантности сердца к физическим нагрузкам, улучшением гемодинамики.Антиаритмический эффект реализуется потенцированием противоаритмической активности других препаратов, влияя на калиевый/кальциевый обмен в кардиомиоцитах.Антиоксидантная активность янтарной кислоты в условиях ишемии проявляется снижением уровня свободных радикалов, ослаблением деструкции мембранных элементов.Ингибирует индуцируемые ионами двухвалентного железа процесс перекисного окисления липидов.Таким образом, янтарная кислота является перспективной для создания комплексных метаболических лекарственных препаратов с антигипоксическои и антиоксидантной фармакологической направленностью.Высокая биологическая активность янтарной кислоты послужила предпосылкой создания на её основе ряда эффективных лекарственных препаратов с различным фармакологическим действием. Однако биологическое действие янтарной кислоты "in vivo" ограничено вследствие плохой проницаемости через биологические мембраны, особенно в присутствии избытка анионов хлора. Для повышения биодоступности янтарной кислоты была получена ее натрий - N метилглюкаминовая соль (меглумина сукцинат натриевая соль), впервые использованная в составе препарата Реамберин раствор для инфузий [91]. N-метилглкжамин образует стабилизированный водородными связями полиспирта комплекс, легко переносящий янтарную кислоту через поляризованные клеточные мембраны. N-метилглюкамин (МГА) часто используется в лекарственных препаратах для солюбилизации и стабилизации различных биологически активных соединений. Он является производным линейного полиспирта Д - сорбита - 1 дезокси-1-(Ы - метиламино)-ё-глюцитол (N-метилглюкамин, меглумин). МГА впервые синтезирован в 1932 г. химической реакцией из N - метиламина и Dглюкозы [165].Химическое строение молекулы МГА характеризуется мощными внутрии межмолекулярными водородными связями между гидроксильными группами и вторичным азотом, что и обуславливает его высокую солюбилизирующую активность и растворимость в подавляющем большинстве органически растворителей.Эти уникальные свойства данного соединения позволяют использовать МГА для создания новых растворимых лекарственных форм или стабилизации физико-химических свойств лекарственных препаратов. В качестве солюбилизатора и стабилизатора лекарственных препаратов МГА зарегистрирован американской, британской и японской фармакопеями [35, 56, 138, 150, 155, 161, 172].Несмотря на регистрацию МГА только в качестве солюбилизирующего и стабилизирующего солеобразователя лекарственных готовых форм, в ряде научных исследований показано, что МГА обладает антиагрегантным действием, обусловленным как нормализацией кальциевого обмена в тромбоцитах, так и действием на их аденозиновые рецепторы [141, 158].Кроме того, установлено, что МГА улучшает реологические свойства крови и гемодинамику кровообращения, а также показано ослабленное воздействие осмотического шока на клетку [141, 149]. Предполагается, что фармакологические эффекты МГА обусловлены образованием стабильных комплексов аминоспирта с альбуминами крови и белками клеточных мембран за счет мощных водородных связей [141, 142].Взаимодействие МГА с другими ионами и компонентами в плазме крови имеет весьма сложный характер. В исследованиях авторов [139, 140] показано, что в водные растворы МГА при внутривенном введении влияют на силу сердечной мышцы, сократимость крупных артерий и синтез адреналина, а также на состояние эпителия и эндотелия, оказывают влияние на функциональную активность кардиомиоцитов и транспорт кислорода в легких.Исследования метаболизма и фармакокинетики МГА показали, что при внутривенном введении 93 % вещества выделяется почками в течение 24 часов в неизменном виде, а при оральном применении, приблизительно, 15% введенной дозы обнаруживается в суточной моче, около 40 % в фекалиях и лишь 20 % в виде двуокиси углерода в выдыхаемом воздухе [152, 159, 170]. N-метилглюкамин является нетоксичным высокоактивным солеобразующим и солюбилизирующим агентом, обладающим различными видами биологической активности, что может быть использовано для получения новых лекарственных препаратов с улучшенными фармакологическими характеристиками.1.4 Факторы, влияющие на качество инфузионного препарата При разработке лекарственного препарата стабильность компонентов является одним из главных критериев качества. Препарат должен удовлетворять физическим, химическим, терапевтическим и токсикологическим критериям.На качество инфузионного препарата влияют: - Свойства вещества, входящего в состав препарата и условия хранения лекарственного препарата; - Первичная упаковка; - Метод стерилизации. г 1.4.1 Свойства вещества и условия хранения Процессы, происходящие в лекарствах при хранении, можно разделить на физические, химические и биологические. Интенсивность этих процессов определяется температурой, светом, рН среды, составом воздуха и другими факторами.Температурный режим оказывает значительное влияние на стабильность при хранении препаратов. Повышение температуры ускоряет физические, химические, биохимические и микробиологические процессы. Рассчитанное увеличение скорости реакции при повышении температуры позволяет предсказывать срок годности препарата при естественных условиях хранения. Однако механизм или путь разрушения вещества часто изменяется при различных температурах [123 ,167].На скорость химических процессов, происходящих в лекарственных препаратах при хранении, также оказывает влияние лучистая энергия (свет солнца, бактерицидных ламп и других источников). Обычно воздействие света ускоряет разложение веществ, причем сухие кристаллические вещества, в отличие от их растворов, более устойчивы к свету. В присутствии катализаторов, например, примеси тяжелых металлов и др. усиливается разлагающее влияние света.Готовые лекарства хранят с учетом физико-химических свойств входящих в них ингредиентов [123]. Возможные методы стабилизации препаратов приведены в литературе [120, 124, 132, 167].1.4.2 Первичная упаковка Компоненты упаковки для парентеральных продуктов должны быть рассмотрены неотъемлемо от продукта, так как они могут влиять на стабильность, токсичность и безопасность препарата. Компоненты упаковки находящиеся в непосредственном контакте с препаратом включают различные типы стекла, резины, полимерных материалов [145, 163].При хранении растворов для инфузий в бутылках происходит выщелачивание, т.е. вымывание ионов натрия и калия из стекла, что приводит к изменению рН среды, а при глубоком гидролизе образованию так называемых блесток. Кроме того, при хранении может происходить процесс гидролиза солей с выделением органических оснований и ускоряться процесс окисления препаратов. Щелочность стекла также способствует развитию микрофлоры.С каждым годом расширяется использование в качестве упаковочного материала полимеров (полиэтилена, полипропилена, поливинилхлорида, полистирола, полиамидов, фторопластов и др.). Полимеры могут содержать исходные и промежуточные продукты синтеза, катализаторы, красители, пластификаторы, а также продукты окислительной деструкции, которые могут переходить в раствор при хранении, повышать токсичность лекарственных средств и активно с ними взаимодействовать. Проницаемость пластмассовой упаковки для паров, воды, газов и микроорганизмов приводит к быстрой инактивации антибиотиков (пенициллина, стрептомицина и др.). Возможны явления адсорбции лекарственных веществ полимером, а также разрушение, полимера под воздействием лекарственных веществ. Это приводит не только к инактивации, нарушению стабильности и уменьшению срока годности препарата, но и к образованию токсических компонентов [132, 145].1.4.3 Метод стерилизации Из известных методов стерилизации [34, 132, 145, 163, 172] для инфузионных препаратов используются: стерилизация влажным теплом (насыщенным паром под давлением, пароводяной смесью, перегретой водой, паровоздушной смесью) и стерилизующее фильтрование. Для выбора метода стерилизации необходимо собрать информацию об устойчивости компонентов препарата и первичной упаковки к нагреву и влажности, так же о видовом составе бионагрузки, так как некоторые микроорганизмы устойчивы к воздействию высоких температур.Наиболее эффективным является метод стерилизации с использованием пара под давлением. Однако необходимо быть уверенным, что упаковка препарата непроницаема для пара, а вещества, входящие в состав препарата, термоустойчивы.Стерилизующая фильтрация стала применяться только последние 20 лет, когда появились достаточно надежные мембранные фильтры. Основным недостатком данного метода является необходимость обеспечивать асептические условия при розливе раствора [34, 163].1.5 Стандартизация многокомпонентных инфузионных лекарственных препаратов При анализе лекарственных форм, содержащих три и более ингредиента, редко удается найти единый метод, позволяющий определить все компоненты.Поэтому сочетают несколько методов, основываясь на физических и физикохимических свойствах компонентов [6, 96]. Количественный химический анализ лекарственных веществ в многокомпонентных смесях может быть выполнен без разделения компонентов смеси или после предварительного разделения смеси на отдельные компоненты [108]. Анализ сложных лекарственных смесей без разделения можно осуществить путем подбора условий, при которых определение одного компонента не мешает определению других - титриметрические, спектрофотометрические, фотоколориметрические, рефрактометрические и другие методы анализа [6, 74, 94, 112, 151].Анализ с использованием разделения компонентов проводится методом ВЭЖХ, он дает возможность наиболее эффективно осуществлять избирательное распределение компонентов анализируемого образца, что имеет существенное значение для фармацевтического анализа. Данный метод позволяет разделять на индивидуальные вещества многокомпонентные смеси нелетучих органических соединений сложной химической структуры с различной молекулярной массой [6, 44, 108, 134].ГЛАВА 2 Объекты и методы 2.1 Объекты исследования 2.1.1 Желатин Желатин в РФ производится по ГОСТ 11293 - 89 и представляет собой гранулы, крупинки, пластинки или порошок, от светло желтого до желтого цвета, пресного вкуса, без постороннего запаха. В холодной воде подвергается набуханию, растворим в горячей воде [42]. Желатин стабилен на воздухе. Водные растворы желатина стабильны длительное время, если стерильны и хранятся в холодном месте. Желатин может быть гидролизован большинством протеолитических ферментов [150].Для медицинской промышленности применяют пищевой желатин двух марки: К-11 и К-13. рН 1 % водного раствора желатина 5-7.2.1.2 Полиэтиленгликоль - 20 000 Полиэтиленгликоль - 20 000 (ПЭГ-20 000) производится в соответствии с требованиями ТУ 2499-010-05784466-2003, описан в Европейской фармакопее и является продуктом полимеризации окиси этилена.Структурная формула: Н(-ОСН2СН2)пОН где п «455 Относительная молекулярная масса 20 000 ± 3000 Полиэтиленгликоль - 20 000 представляет собой чешуйки или цилиндрические гранулы диаметром до 3 мм и длиной до 20 мм от белого до кремового цвета. Очень хорошо растворим в воде, растворим в метиленхлориде, практически нерастворим в спирте, жирных и минеральных кислотах. рН водного раствора 6-8 [99, 144]. Степень полидисперсности полимера: 0,04±0,03 [92].2.1.3 Янтарная кислота Янтарная кислота (ЯК) в РФ производится в соответствии с ФС 42-000900, ФСП 42-0035-0926-01, ФСП 42-0275-4517-03.Структурная формула: О О ' СН7 — СН, ' но чон Относительная молекулярная масса: 118,09 Эмпирическая формула: С4Н6О4 Химическое название: 1,4 - бутандиовая кислота.2.1.4 N-метилглюкамин N-метилглюкамин (меглумин, МГА) производится по НД 42-10844-00, ФСП 42-0275-4518-03, описан в Европейской фармакопее и фармакопее США [144, 174] и представляет собой белый кристаллический порошок без запаха.Легко растворим в воде, умеренно растворим в спирте, очень мало растворим в н-октаноле, практически нерастворим в ацетоне, хлороформе и диэтиловом эфире [75, 76].2.1.5 Натрия гидроксид Натрия гидроксид производится по ГОСТ 4328 - 77 и представляет собой белые чешуйки, куски или цилиндрические палочки с кристаллической структурой на изломе; сильно гигроскопичен, хорошо растворим в воде и спирте; быстро поглощает из воздуха углекислоту и воду и постепенно переходит в углекислый натрий [84].Формула: NaOH Молекулярная масса: 40,00 2.1.6 Натрия хлорид В качестве сырья для инфузионных препаратов используется натрия хлорид, производимый по ФС 42-2572-95.Он представляет собой бесцветные кристаллы или кристаллический порошок, легко растворим в воде. рН раствора препарата с массовой долей 5% 5 8 [83, 85].Формула: NaCl Относительная молекулярная масса: 58,44 2.1.7 Калия хлорид Калия хлорид производится по ГОСТ 4234-77, и описан в Европейской фармакопее. Он представляет собой белый кристаллический порошок, растворимый в воде [51].Формула: КС1 Относительная молекулярная масса: 74,55 2.1.8 Магния хлорид 6-водный Магния хлорид 6-водный производят по ГОСТ 4209-77. Он представляет собой белые очень гигроскопичные, расплывающиеся на воздухе, кристаллы, растворимые в воде и спирте этиловом [72].Формула: MgCl2 • 6Н20 Относительная молекулярная масса: 203,30 2.1.9 Натрий углекислый Был использован натрий углекислый, производимый по ГОСТ 83-79, который представляет собой белый зернистый порошок, легко растворимый в воде [82].Формула: Na2C03 Относительная молекулярная масса: 105,99 2.2 Методы исследования 2.2.1 Высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ) Качественное и количественное определение N-метилглюкамина и янтарной кислоты было проведено методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ). Выбран оптимальный вариант данного метода - ион-парная обращенно-фазовая ВЭЖХ. Ион-парная хроматография - это жидкостная хроматография, в которой подвижная фаза содержит сорбируемое ионогенное вещество (ион-парный реагент) и разделение смеси веществ происходит за счет различия способности веществ к образованию ионных пар и (или) коэффициентов распределения ионных пар между подвижной и неподвижной фазами [104].Суть метода заключается в динамическом модифицировании обращеннофазового сорбента группами, обладающими ионообменными свойствами. Для этих целей в типичные подвижные фазы для обращенно-фазовой хроматографии добавляют гидрофобные органические соединения с ионогенными группами. Для разделения оснований используют алкилсульфаты или алкилсульфонаты натрия (алкил от С4 до С12) в количестве 0,001 - 0,01 моль/л, создавая буферным раствором рН 2 - 5. В ион-парном режиме селективность разделения неионогенных компонентов анализируемой пробы ограничивается обращеннофазовым механизмом удерживания, а удерживание оснований заметно возрастает, улучшается форма их хроматографических пиков [105, 106, 115, 153].Удерживание в ион-парном режиме обусловлено достаточно сложными равновесными процессами, конкурирующими между собой. С одной стороны, поверхность сорбента может приобретать ионообменные свойства и в этом случае удерживание подчиняется закономерностям ионообменной хроматографии. С другой стороны, возможно образование ионной пары непосредственно в объеме элюента, затем эта пара сорбируется на неполярной поверхности по обращенно-фазовому механизму [134].Количественное определение N-метилглюкамина и янтарной кислоты проводили на приборе SCL-10A vp с рефрактометрическим детектором RID10А (Shimadzu, Япония).2.2.2 Потенциометрия В основе потенциометрического метода лежит зависимость потенциала электрода от концентрации определяемого иона [110]. Различают прямую и косвенную потенциометрию или потенциометрическое титрование [47, 95].Метод прямой потенциометрии был использован для определения рН. Определение проводили на приборе Acidimetr 333 (Druoma Praha, Чехословакия) в соответствии с требованиями ГФ XI.2.2.2.1 Потенциометрическое титрование Зависимость равновесного потенциала индикаторного электрода от состава раствора можно использовать для нахождения конечной точки титрования. Потенциометрическим титрованием определяли количественное содержание полиэтиленгликоля - 20 000 в разрабатываемом препарате.Для проведения потенциометрического титрования использовался автоматический титратор 785 DMT Titrino (Metrohm AG, Швейцария).2.2.3 Осмометрия Осмолярность, как показатель качества инфузионного раствора, приводится в фармакопее США и Европейской фармакопее [145, 172]. В настоящее время введение осмолярности как показателя качества в фармакопейную статью предприятия для инфузионного препарата является требованием Фармакопейного комитета МЗиСР РФ. Европейская фармакопея рассматривает только экспериментальную осмолярность, фармакопея США 24 издания [172] требует производить расчет теоретической осмолярности и при многокомпонентном составе инфузионного препарата определение экспериментальной.При увеличении концентрации ионов в растворе увеличивается взаимодействие между частицами, поэтому значение осмотической концентрации уменьшается по сравнению с идеальной осмолярностью. Теоретическая осмолярность комплексной смеси не может быть рассчитана с достоверной точностью, поэтому используют определение экспериментальной осмолярности на приборе - осмометре.Определение экспериментальной осмолярности проводили на миллиосмометре МТ-2 (НЛП "Буревестник", Россия).2.2.4 Определение молекулярной массы Важными характеристиками качества плазмозамещающих растворов являются молекулярная масса высокомолекулярного вещества, входящего в состав препарата, и его молекулярно-массовое распределение. В химии высокомолекулярных соединений используется понятие средней молекулярной массы.Величина средней молекулярной массы полимера не может однозначно характеризовать его свойства, так как при одинаковой средней молекулярной массе различные образцы полимера могут отличаться по соотношению низко- и высокомолекулярных фракций. Для описания количественного распределения фракций вводится понятие степень полидисперсности [16, 61, 133].Различают среднечисловую и средневесовую молекулярные массы.Среднечисловой молекулярной массой (Мп) называется отношение массы полимера к числу молекул: ^ nlMl+n2M2+... YuniMi где, пь n2, iij - число молекул с молекулярной массой М ь М2, Mj, соответственно.Для определения среднечисловой молекулярной массы применяют криоскопический, эбулиоскопический и осмометрический методы, а так же метод эксклюзионной хроматографии.Средневесовая молекулярная масса выражается уравнением: ^ # т г , (2.3) bniMi где, пь п2, П; - масса молекул с молекулярной массой Mi, М2, Mi} соответственно, г.Наличие низкомолекулярных фракций сильно сказывается на значении Мп, а высокомолекулярной фракции на значении Mw.Степень полидисперсности полимера (и) оценивают по величине отношения Mw к Мп [133].М_ м и = —^-1 (2.4) В работе были использованы такие методы определения молекулярных масс, как эксклюзионная хроматография и вискозиметрия.2.2.4.1 Гельпроникающая (эксклюзионная) хроматография Гельпроникающая хроматография (ГПХ) представляет собой колоночный разделительный метод, основанный на не ионных молекулярно-ситовых эффектах, и обеспечивает разделение веществ исключительно в соответствии с размерами их молекул [7, 44, 106, 112].На колонку подается растворенная в элюенте смесь молекул различных размеров. Крупные молекулы, неспособные проникнуть внутрь гранул, двигаются вдоль колонки вместе с подвижной фазой, для них коэффициент распределения Kav = 0. Наиболее мелкие молекулы, размеры которых заведомо меньше диаметра пор в гранулах, равномерно распределяются между подвижной и неподвижной фазами. Значение коэффициента распределения для таких молекул близко к единице. Для молекул промежуточной величины благодаря статистическому распределению размеров пор окажется доступной только часть объема неподвижной фазы. Для них коэффициент распределения: 0 < Kav < 1, поэтому зоны таких молекул будут мигрировать вдоль колонки быстрее, чем мелкие молекулы, но медленнее, чем крупные. В результате происходит фракционирование исходной смеси молекул на зоны в зависимости от их размеров.Зоны выходят из колонки в порядке убывания этих размеров [90].Определение коэффициента распределения, характеризующего движение хроматографической зоны вдоль колонки при гель-фильтрации, производят по формуле [86, 90]: где TR - среднее время выхода фракции (середина временного диапазона между началом и концом элюирования фракции); Т0 - время выхода пика неудерживаемого компонента; Tt - время выхода пика низкомолекулярного компонента.Все величины в правой части уравнения определяют опытным путем. Для определения То через колонку пропускают раствор высокомолекулярного вещества - голубого декстрана ("Blue Dextran 2000", Pharmacia). Определение Tt проводят, пропуская раствор низкомолекулярного вещества.Для определения молекулярной массы необходимо калибровать колонку стандартами молекулярных масс, выбираемыми в зависимости от определяемого полимера. Для каждого стандарта молекулярной массы рассчитывают коэффициенты распределения.Графики указывают на наличие линейной связи между логарифмом молекулярной массы белка (IgM) и величиной Kav [90]. По результатам калибровки строят калибровочный график данной колонки в координатах IgM - Kav (рисунок 2.2). igM lgM=aKav+b К av Рисунок 2.2 График зависимости десятичного логарифма молекулярной массы от коэффициента распределения В зависимости от того, какая молекулярная масса стандарта используется для построения графика, среднечисловая или средневесовая, такую молекулярную массу и определяют для исследуемого образца. По формуле графика расчитывают формулу зависимости молекулярной массы от коэффициента распределения, по которой ведут расчеты молекулярных масс для исследуемых образцов.М = ЮаК+" (2.6) Для определения молекулярных масс исследуемого образца проводят хроматографирование при тех же условиях, что и калибровка. После проведения хроматографии пик, в пределах которого элюируется образец разбивается на фракции одинаковой ширины (число фракций = п). Для каждой фракции рассчитывается средневзвешенное значение коэффициента распределения для всего образца (Kav*) по формуле: 1=1 А V'=i ) (2.7) l=n где ^At- сумма значений оптической плотности всех фракций хроматограммы; А; - оптическая плотность данной фракции.По формуле (2.6) рассчитывают средние молекулярные массы исследуемых образцов.Определяли среднечисловую и средневесовую молекулярные массы рабочих образцов препарата, содержащего в составе модифицированный желатин, для определения констант уравнения 2.13.2.2.4.2 Вискозиметрия.Вискозиметрия является косвенным методом для определения молекулярной массы высокомолекулярного вещества, который требует предварительного определения постоянных в уравнении, выражающем зависимость вязкости от молекулярной массы. Для определения констант используют прямые методы определения молекулярной массы (светорассеяние, криоскопия, осмометрия, гельпроникающая хроматография). Достоинствами вискозиметрии являются: возможность одним измерением вязкости определить как средневесовую, так и среднечисловую молекулярные массы, простота вискозиметрической аппаратуры и хорошая воспроизводимость результатов.Различают динамическую, кинематическую, относительную, удельную, приведенную и характеристическую вязкость [16].Расчет относительной вязкости (г]отн) проводят по формуле: Чотн , (2.8) Щ к J где г) и г|о - вязкость раствора полимера и растворителя соответственно.Часто вязкость выражают как удельную вязкость (г)уд), которая показывает, какая часть вязкости раствора обусловлена присутствием в нем растворенного вещества: Луд= - = — -1 = Чотн1 (2.9) Удельная вязкость, отнесенная к концентрации раствора, называется приведенной ВЯЗКОСТЬЮ (Лприв): Луд V = 7 " . (2.10) где с - концентрация раствора, г/100 мл.Для растворов полимеров вязкость является функцией молекулярной массы, формы, размеров, гибкости макромолекул. Что бы определить структурные характеристики полимеров, приведенную вязкость экстраполируют к нулевой концентрации. В этом случае вводится понятие характеристической вязкости ([п]): [7]=Hm^« = l i m ^ r (2-ii) Характеристическая вязкость выражается в единицах, обратных единицам концентрации.Для измерения характеристической вязкости из раствора препарата готовили пять растворов различных концентраций. Для каждого раствора определяли хср и рассчитывали приведенную вязкость и отношение In f]omH ' с. Затем в программе Microsoft Excel строили зависимость от концентрации Г|Прив и рассчитанного отношения [133]. Свободный член уравнения линии тренда (точка пересечения с осью ординат) - характеристическая вязкость (рисунок 2.3). _уд 1,2 С О 0,1 0,2 0,3 0,4 С, г/100 мл Рисунок 2.3 Определение характеристической вязкости. График зависимости приведенной вязкости от концентрации Эмпирическое отношение между характеристической вязкостью и молекулярной массой описывается уравнением Марка-Куна-Хаувинка [7, 16, 61, 112,133]. [тЦ = К-Ма, (2.12) где К, а - константы уравнения, зависящие от природы растворителя и полимера.Молекулярную массу полимера вычисляли, подставляя полученное значение [г|] в это уравнение.Логарифм характеристической вязкости является линейной функцией логарифма молекулярного веса: lg[?]] = \gK + a\gM, (2.13) Определение констант в уравнении проводили с использованием метода гельпроникающей (эксклюзионной) хроматографии. Рассчитывали характеристическую вязкость образцов препарата с известным (определенным методом гельпроникающей хроматографии) значением среднечисловой и средневесовои молекулярных масс. Строили график зависимости логарифма молекулярной массы от логарифма характеристической вязкости. Уравнение графика является уравнением 2.13. По этой зависимости определяли константы уравнения 2.12 К и а.2.2.5 Атомно - эмиссионная спектрометрия Атомная спектроскопия основана на поглощении или испускании видимого или УФ-излучения [111].Метод атомно-эмиссионной спектроскопии (АЭС) основан на термическом возбуждении свободных атомов или одноатомных ионов и регистрации оптического спектра испускания возбужденных атомов.Количественное определение ионов натрия и калия проводили методом атомно-абсорбционной спектрометрии на пламенном фотометре М410 (Sherwood, Великобритания) [162] в соответствии с требованиями ГФ XI. Использовали светофильтры для калия - 768 нм, для натрия - 589 нм. Газовый состав: горючее - пропан-бутан, окислитель - воздух.2.2.7 Молекулярная спектроскопия Определение методами спектрофотометрии и фотоколориметрии [6, 47] проводили в соответствии с требованиями ГФ XI на спектрофотометре UV mini-1240 (Shimadzu, Япония).2.2.8 Титриметрия Для анализа использовали методы комплексонометрического (определение ионов магния и кальция) и прямого осадительного титрования по Мору (определение ионов хлора) [6, 74, 96].Все анализы методом титрования проводились в соответствии с требованиями ГФ XI с использованием полуавтоматического дозатора Dosimat 765 (Metrohm AG, Швейцария).2.2.9 Статистическая обработка результатов анализа Статистическую обработку результатов осуществляли согласно методике ГФ XI (вып.1, с. 199) "Статистическая обработка результатов химического эксперимента" на персональном компьютере с использованием пакета программ статистической обработки данных [33, 110, 112].2.2.10 Валидация аналитических методик Валидация - это документированное доказательство, что аналитическая методика применима для необходимых целей [160].При валидации разработанных методик применяли характеристики: избирательность (специфичность, Specifity), правильность (Accuracy), сходимость (Repeatability) [80, 81, 87, 88, 89, 160, 172].Избирательность - способность однозначно оценивать определяемый компонент в присутствии других компонентов в составе пробы. Для количественного определения - обеспечение точного результата, который позволяет правильно установить содержание анализируемого компонента в препарате.Правильность характеризует степень соответствия между известным истинным значением и значением, полученным по данной методике. Определяли анализом модельных смесей с точно известным содержанием определяемого компонента. Концентрация определяемого компонента в анализируемых смесях 90, 100, 110 % от указанного в прописи. В качестве параметра оценки использовали относительную ошибку результата отдельного измерения (е).Сходимость - параметр точности, характеризует точность методики при ее выполнении в одних и тех же рабочих условиях в течение короткого отрезка времени. Оценку проводили по относительной ошибке результата отдельного измерения (г) при анализе одного образца с содержанием определяемого компонента 100 % в десятикратной повторности.2.2.11 Биологическое исследование длительности волемического действия Данное исследование было проведено в Институте Токсикологии МЗиСР РФ.

2.2.11.1 Животные Эксперименты выполнялись на нелинейных белых крысах-самцах массой 160-170 г, возраст 3 месяца. При исследовании использовали группы животных, состоящие из 20 крыс.2.2.11.2 Моделирование гемморрагического шока [64] Острую кровопотерю у крыс воспроизводили путем однократного кровопускания, в течение 3-5 минут из хвостовой вены в количестве от 2 % до 4 % от массы тела (5-6 мл на крысу или 30 мл/кг).Препараты вводились через 10 минут после кровопускания внутривенно в хвостовую вену медленно в течение 1,5-2 минут в объеме кровопотери.2.2.11.3 Лабораторные исследования [9] Объем циркулирующей плазмы определяли по разведению красителя (краски Эванса Т-1824) перед кровопотерей, через 10 минут после кровопускания и через 10 минут, 1 и 2 часа после введения препаратов.Глава 3 Разработка состава и технологии препарата 3.1 Разработка состава препарата Разрабатываемый препарат направлен на лечение острой массивной кровопотери, поэтому должен обладать гемодинамическими и антигипоксическими свойствами. Для придания этих свойств в состав препарата введены следующие компоненты: - Гемодинамический; - Антигипоксант; - Неорганические соли.В качестве антигипоксического компонента в состав препарата введена натриевая соль меглумина сукцината, получаемая в процессе приготовления препарата растворением в 1 л - 5 г янтарной кислоты, 8,26 г N-метилглюкамина (МГА) и 1,7 г натрия гидроксида. Концентрации данных компонентов установлены по результатам скрининговых исследований, проведенных в институте ток-сикологии МЗ РФ.

3.1.1 Выбор гемодинамического компонента Плазмозамещающие растворы гемодинамического действия предназначены для длительного пребывания в кровяном русле, что обеспечивается введением высокомолекулярного компонента. Выбор высокомолекулярного вещества осуществляли исходя из оценки (литературного обзора) их биологического действия, количества неблагоприятных эффектов и маркетингового исследования данной группы инфузионных растворов.Растворы на основе декстрана обладают хорошим плазмозамещающим эффектом, но основным их недостатком является большое число анафилактических реакций при введении. Инфузионные растворы на основе декстрана широко представлены на Российском рынке, как отечественными, так и зарубежными препаратами. В данном сегменте рынка нет острой ценовой конкуренции и возможно создание и продвижение современных препаратов, но высокое количество анафилактических реакций делает данный шаг нецелесообразным.Растворы на основе оксиэтилированного крахмала являются наиболее перспективными, так как по гемодинамическому действию сравнимы с препаратами декстрана, а в связи со сходством оксиэтилированного крахмала с молекулой гликогена имеют высокий уровень переносимости и практическое отсутствие побочных реакций. Препараты данного класса представлены на рынке только иностранными производителями. Невозможность разработки препарата на основе оксиэтилированного крахмала объясняется отсутствием в России производства данного вещества, иностранный оксиэтилированный крахмал изготавливают только производители препаратов на его основе, поэтому регистрация ОЭК в РФ в качестве субстанции для производства лекарственных препаратов очень сложна.Препараты на основе модифицированного желатина имеют самую маленькую длительность волемического введения по сравнению с другими препаратами этой группы. Преимуществом при их использовании является практическое отсутствие побочных эффектов и влияния на систему гемостаза. На рынке РФ представлены только два препарата на основе желатина, что делает этот сегмент рынка перспективным для внедрения нового препарата. Недостатком желатина в качестве гемодинамического компонента является необходимость модифицировать исходный желатин, так как в РФ нет модифицированного желатина, используемого в качестве субстанций для производства лекарственных препаратов.Препараты на основе полиэтиленгликоля-20 000 самые "молодые" на рынке плазмозамещающих препаратов комплексного действия. Для данных препаратов не зарегистрировано побочных эффектов. В 2001 году они были представлены только одним препаратом, который в настоящее время не производится ни одним предприятием в РФ, по этой причине разработка препарата на основе полиэтиленгликоля-20 000 является перспективной при возможности активного продвижения на рынок новой группы растворов. Полиэтиленгликоль-20 000 для медицинского применения производится в РФ в соответствии с техническими условиями и за рубежом в соответствии с Европейкой фармакопеей.На основании сравнительного анализа гемодинамических компонентов для изучения были выбраны желатин и полиэтиленгликоль-20 000 [19]. Данные полимеры имеют низкую токсичность, доступны и относительно дешевы.Для исключения одного из этих высокомолекулярных веществ были проведены работы по разработке состава, технологии, методик стандартизации и изучению стабильности препаратов на основе, как желатина, так и полиэтиленгликоля-20 000. В качестве рабочих названий для двух составов были приняты Реоплазмин-G и Реоплазмин-PEG.3.1.1.1 Выбор концентрации желатина В известных препаратах концентрации желатина составляют: 4 % в гелофузине, 5 % в плазможеле и геможеле и 8 % в желатиноле [29, 43, 46, 62]. Выбор концентрации проводили исходя из динамической вязкости, биологического действия и температуры застывания препарата.Состав, содержащий 5 % модифицированного желатина, имеет вязкость близкую вязкости плазмы крови, что может обеспечить изовязкостность препарата.Для оценки влияния концентраций желатина на объем циркулирующей плазмы (ОЦП) после острой кровопотери и лечения препаратом, в институте токсикологии МЗ РФ были проведены скрининговые биологические исследования, результаты которых представлены на рисунке 3.1. мл/кг 35 30 25 20 15 5 0 0 0,5 1 1,5 2 2,5 Т, ч • 5% желатина —В— 8% желатина -А—без лечения Рисунок 3.1 Объем циркулирующей плазмы после острой кровопотери и лечения препаратом Реоплазмин с различным содержанием желатина Обе концентрации желатина в составе препарата показали высокую эффективность. Состав с концентрацией желатина равной 5 % немного уступает концентрации 8 %, что объясняется механизмом действия модифицированного желатина, гемодинамический эффект которого создается за счет осмотического давления модифицированного желатина.

ВЫВОДЫ

1. Экспериментально установлен качественный состав и оптимальные концентрации компонентов изучаемых составов Реоплазмин-G и Реоплазмин-PEG, обеспечивающие изоионичность, изовязкостность и изогидричность;

2. Впервые установлен качественный и количественный ионный состав примесей неорганических солей, содержащихся в желатине, что обусловливает введение дополнительных показателей качества при стандартизации субстанции;

3. Для введения в инфузионный препарат желатина разработаны методика его модификации с использованием в качестве гидролизующего агента N — метилглюкамина и методика удаления из гидролизата желатина избыточного количества ионов магния и кальция, влияющих на безопасность препарата;

4. Установлено что натриевые и натрий-меглуминовые соли янтарной кислоты влияют на величину осмолярности инфузионного препарата, уменьшая значение экспериментальной осмолярности по сравнению с теоретическим значением показателя;

5. Экспериментально обоснована технология производства препаратов, содержащих в качестве гемодинамических компонентов модифицированный желатин и полиэтиленгликоль-20 ООО;

6. Для стандартизации состава, содержащего желатин: разработана методика определения молекулярной массы модифицированного желатина методом вискозиметрии; разработана и валидирована методика количественного определения желатина с применением метода колориметрии. Для стандартизации обоих составов разработана и валидирована методика количественного определения янтарной кислоты и N-метилглюкамина методом ион-парной обращенно-фазовой ВЭЖХ с применением рефрактометрического детектора;

На основании сравнительной оценки результатов изучения свойств исходных компонентов, стабильности, биологического действия, технологичности препаратов на основе модифицированного желатина и полиэтиленгли-коля-20 ООО, экономических аспектов их производства в качестве гемоди-намического компонента выбран полиэтиленгликоль-20 ООО.

включения

BP 1 Санитарная обработка производства

1

ТП 2 Кт.Ех Приготовление гидролизата желатина 10%

1 ■

ТПЗ Кт,Кх Приготовление раствора препарата отходы потери

ТП 4 Кт, Кмбл Фильтрация, асептический розлив и укупорка

1

УМ О Маркировка, э упаковка

Кт,Кх потерн

Готовая продукция

Рисунок 3.6 Рекомендуемая технологическая схема производства препарата

Реоплазмин-G

3.3.2 Технология состава содержащего ПЭГ-20 ООО 3.3.2.1 Порядок загрузки компонентов

При приготовлении раствора многокомпонентного препарата важен порядок загрузки компонентов. Компоненты загружаются исходя их количеств и растворимости в воде. Рекомендуемый порядок загрузки компонентов состава Реоплазмин - PEG для приготовления 1 л раствора препарата.