Автореферат и диссертация по фармакологии (15.00.02) на тему:Разработка методов контроля качества препарата цинарозид

РГ5 оа

2 у МАГ

Министерство здравоохранения Республики Узбекистан ТАШКЕНТСКИЙ ФАРМАЦЕВТИЧЕСКИЙ ИНСТИТУТ

На правах: рукописи МАКСУМОВА Нодира Саидовна

РАЗРАБОТКА МЕТОДОВ КОНТРОЛЯ КАЧЕСТВА ПРЕПАРАТА ЦННАРОЗИД

15.00.02 — Фармацевтическая химия и фармакогнозия

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата фармацевтических наук

Ташкент —1995 г.

Работа выполнена в Институте химии растительных веществ Академии наук Республики Узбекистан.

Научный руководитель:

— доктор фармацевтических наук, Г. Л. Генкина

Официальные оппоненты:

Ведущая организация:

доктор фармацевтических наук, А. А. Тулаганов кандидат фармацевтических наук М. У. Абдуллаева

Узбекский научно - исследовательский институт химической технологии и катализа имени А. Султанова

Защита состоится , " " ' с— 1995 года в / Y часов

на заседании специализированного Совета К-087. 12. 21. при Ташкентском фармацевтическом институте (700015, г. Ташкент, ул. Айбек, 45).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Ташкентского фармацевтического института.

Автореферат разослан ^ ^^'г.л/^ 1995 года.

Учений, секретарь специализированного Совета К -087,12. 21, доктор фармацевтических наук. ^ X. М. КОМИЛОВ

Ш"

общая характеристика работы

АКТУАЛЬНОСТЬ ТЕМЫ. Анализ и стандартизация лекарственного растительного сырья и фитопрепаратов является важнейшей задачей Фармации. Фундаментом для решения этой задачи служит химико-аналитическая база, основанная на современных физико-химических методах. Не решая этих проОлем нельзя обеспечить здравоохранение высококачественными лекарственными средствами.

В Институте химии растительных веществ АН ГУз проводится систематическое комплексное исследование флоры Средней Азии для выявления биологически активных веществ различных классов природных соединений. В результате этих изысканий был создан ряд лекарственных препаратов, в том числе и на основе Флавоноидов. Одним из них является цинарозид (нефроцизин), выделяемый из прикорневых листьев эндема Средней Азии - ферулы изменчивой Ferula varia (Schrenk) Trautv., семейство сельдерейных - Aplaceae, Он обладает выраженным гипоазотемическим действием. Разработка и внедрение лекарственных средств для профилактики и лечения болезней почек и нарушений обмена веществ имеет важное значение.

В последние годы наряду с интенсивно развивающимися исследованиями по изучению биологически активных органических соединений, входящих в состав лекарственных растений, важное значение приобретает установление в них ряда химических элементов. Это обусловлено не только биологической ролью многих микроэлементов, но и экологическими факторами.

Ш1Ь И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ. Целью настоящей работы явилась разработка научно обоснованных методов стандартизации и контроля качества нового гипоазотемического средства цинарозид на основании комплексного химико-фармацевтического исследования. Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие основные задачи:

1. Разработать унифицированную методику идентификации цикаро-зида и определения его чистоты в субстанции и лекарственной форме на основании изучения хромагографической подвидоюсти цинарозида в тонком слое сорбента (ТСХ).

2. Разработать метод количественного определения цинарозида о субстанции, лекарственной Форме и лекарственном растительном сырье.

3. Разработать метод постадийного контроля технологической схемы производства субстанции цинарозида.

4. Изучить хроматографические свойства субстанции цинарозида

методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ):

- выявить оптимальные условия разделения основных компонентов субстанции цинарозида и идентифицировать их;

- разработать методики количественного определения компонентов субстанции.

5. Исследовать микроэлементный состав субстанции цинарозида и растительного сырья.

6. Апробировать разработанные методики на сзрийных образцах субстанции, лекарственной формы и растительном сырье. Разработать соответствующую НТД ь объеме требований Фармакопейных комитетов Министерств здравоохранения Российской Федерации и Республики Узбекистан.

Работа выполнена в соответствии с научным планом Института химии растительных веществ (ИХРВ) АН РУз (составная часть проблемы 2.29.6 "Химическое изучение природного сырья растительного и синтетического происхождения для изыскания биологически активных веществ") и научно-техническим планом Государственного комитета по науко и технике "Разработка, создание и выпуск новых 5-ти высокоэффективных препаратов для лечения заболеваний сердечно-сосудистой системы, желудочно-кишечного.тракта и хронической почечной недостаточности", К госрегистрации 01.93.С001240.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА. С целью создания научно обоснованной НТД на новый препарат цииарозкд

- установлена оптимальная температура сушки субстанции цинарозида дериэатограФическим методом;

- изучен микроэлементный состав субстанции цинарозида и источника ее получения - прикорневых листьев ферулы изменчивой атомно-эмис-снонной спектроскопией;

- разработана качественная и количественная оценка субстанции и таблеток цинарозида 0.05 г о использованием методов ТСХ и Уф-спектрофотометрии:

- разработан хрокато-спзктрофотометрический метод количественного определения цинарозида в прикорневых листьях ферулы изменчивой, на основе' которого проведен контроль производства данного препарата;

- исследованы условия хроматографического разделения компонентов субстанции цинарозида методом ВЭЖХ. Оптимальное деление достигнуто в обращен.чс-фазном варианте ВЭЖХ на сорбенте Сепарон С18 в ступенчатом режиме элаирования путем использования подвижной фазы ацето-нитрил - фосфатно-ецетатный буфер в различных соотношениях, дифференцированно элнирующих группы гликозидов и агликонов, при анали-

тических длинах волн 330 и 352 нм;

- методом ВЭЖХ установлено наличие двух ранее не описанных для субстанции цинарозида флавоноидных гликозидов: одни из них выделен из прикорневых листьев ферулы изменчивой в индивидуальном виде и идентифицирован с использованием физических методов анализа (ПМР-, УФ-спектроскопии);

- разработаны методы внешнего и внутреннего стандарта количественного определения компонентов субстанции цинарозида методом ВЭЖХ.

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ РАБОТЫ. На основании проведенных исследований разработаны и внедрены:

- методики качественного и количественного определения цинарозида в субстанции (проект ВФС на субстанцию цинарозида);

- методики качественного и количественного определения цинарозида в лекарственной форкз (проект ВФС на таблетки цинарозида 0,05 г);

- метод количественного определения цинарозида в прикорневых листьях ферулы•изменчивой (проект ВФС на прикорневые листья ферулы изменчивой);

- постадийный контроль технологической схемы производства субстанции цинарозида (опытно-проншленный регламент на производство субстанции цинарозида).

Таблетки цинарозида 0,05 г разрешены Фармакологическим комитетом МЗ Российской Федерации к клиническим испытаниям в качестве гипоаэотемического средства и приняты к рассмотрению Фармакологическим комитетом МЗ Республики Узбекистан.

ференции молодых ученых ИХРВ АН РУз (Ташкент. 1992 г.), научно-практической конференции "Приоритетные направления фармацевтической науки и практики" (Ташкент,1993 г.).

ПУБЛИКАЦИИ. По теме диссертации опубликовано 4 работы.

- метод идентификаций и определения чистоты цинарозида а субстанции и таблетках;

- способы количественного определения цинарозида в субстанции, таблетках и растительном сырье;

- способ постадийного контроля технологической схемы прозводсгва субстанции цинарозида;

- идентификация ранее не описанного для ферулы изменчивой 'флавоно-идного гликозида, выделенного из прикорневых листьев растения:

- микроэлементный состав субстанции цинарозида и растительного сырья.

исследования докладывались на кон-

ОБЪЕМ и структура диссертации._Диссертация изложена на 124

страницах машинописного текста и состоит из введения, 3 глав, общих выводов, списка литературы и приложения. Работа иллюстрирована 21 таблицами и 12 рисунками. Библиографический указатель включает 157 литературных источников, в том числе 68 на иностранных языках. В приложение вынесены копии документов о внедрении.

Во введении сформулированы актуальность, научная новизна и практическая значимость работы, определены цель и задачи исследования.

В первой главе приведен обзор литературы, включающий сведения о физико-химических свойствах, биологической активности и методах анализа флзвоноидных соединений. Основное внимание уделено способам разделения флавоноидов и оптическим методам их количественного определения.

Вторая глава посвящена обоухшени» результатов собственных исследований. В ней представлены химико-аналитические подходы к комплексному изучению препарата цииарозид (нефроцизин).

В третьей главе освещена экспериментальная часть работы с детальным описанием использованных материалос, объектов, аппаратуры к методик анализа.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ. Объектами исследования служили образцы производственных партий субстанции и таблеток цинарози-да; растительное сырье; набор объектов, отобранных с отдельных звеньев технологической цепи производства субстанции цинарозида; образцы почвы, взятые с мест сбора растительного сырья.

Работа выполнена с использованием ТСХ и инструментальных методов анализа: ВЭКХ с УФ-детектором с переменной длиной волны; УФ-. ПМР-, атоино-эмиссионной спектроскопии; дериватографии.

Статистическая обработка результатов количественных определений произведена с помощью компьютерной программы "Supercalc 4". характеристики калибровочных графиков . рассчитаны с помощь» "Statgraf" на персональном компьютере IBM AT.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ.

Дерившпогрсдоическое исследование субстанции цинарозида. Субстанция цинарозида характеризуется высокой потерей массы (более 5%) при высушивании. Перед нами стояла задача выяснить характер этих потерь и оптимальную температуру изотермической сушки. Для этого были применены три метода определения: изотермическая сушка, титрование реактивом К.Фишера к дериватографическое определение.

Было выявлено, что потеря в массе при высушивании субстанции

m-150 мг. ДТА-1/5, ДТ1М/10. ТГ-200 мг.

Рис.1. Дериватограима субстанция цинарозида. цикарозида связана с водой. Характер этсй воды определяли дерива-тографическим методом. Из рис. 1. видно, что парный эндоэффект на кривой ДТЛ отмечается б интервале 80-105 °С с максимумом при 95 °С. Он сопровождается поторей наосы, тач как минимумы на кривнх ЛТА к ДТГ совпадают. Данный эндотермический процесс связан с потерей гигроскопической влаги. На характер этого указывает низкая температура (85 °С) и особенности химической структуры: наличие карбонильной *н гидроксильных групп, легко образующих водородные связи с молекулами поды, а также способ кристаллизации из 70 % этилового спирта. Это также было подтверждено изучением адсорбции воды высуженной субстанцией цинарозида во времени с гтоследугащкм ¡засушиванием над концентрированной серной кислотой. Дальнейшее нагревание образца от 105 до 225 °С не приводит к изменениям в структуре препарата, а при 248 ®С отмечается второй четко Быраяенный эффект и масса образца плавно уменьшается, составляя 35 % от навески. Это свидетельствует о деструкции цинарозида. Дальнейшее повышение температуры приводит к полному вмгоранию и испарению продуктов термического разложения препарата.

Таким образом, результаты дериватографического исследования субстанции цинарозида показали, что при температуре от 00 до 105 "С наблюдается потеря в массе, связанная с наличием гигроскопической влаги, в интервале температур от,225 до 260 °С происходит быстрая деструкция вещества. Оптимальная температура изотермической сушки

100 - 105 °С.

Микроэлемекгшй соств субстанции цинарозида и прикорневых листьев ферулы изменчивой. ГФ XI предусматривает для сырья определение среди прочих числовых показателей общей золы и золы, нерастворимой в хлористоводородной кислоте, а для препаратов - золы, нерастворимой в концентрированной серной кислота и примесей тяжелых каталлоа. Однако это дает только общее .представление о возможном содержании металлов в объекте.

Мы свои исследования проводили используя, атомно-змиссионнук спектроскопию. Результаты определений содержания микроэлементов представлены в таблице 1.

Таблица 1

Содержание микроэлементов (в рри') в прикорневых листьях ферулы изменчивой и субстанции цинарозида

' ЭЛЕМЕНТ ЗЕМЛЯ ПРИКОРНЕВЫЕ ЛИСТЬЯ СУБСТАНЦИЯ

Fe 8000-8900 510-540 2,0-2,5

Мп 4.00-534 108-126 0,75 - 1.16

Ti 750-390 54-63 '0.93 - 3,00

СГ 25-28 1,7-2,7 0,166 - 0,670

Си 5.00-7.12 2,7-5,1 0,033 - 0,135

РЬ 8,9-11.0 0,68-0,90 0,033 - 0,116

Zn 40,1-53,4 5.23-13.6 0.21 - 2.00

N1 24. 3-26. 7 0.81-1,19 ' 0.14 - 0,30

Но 0,30-0,89 0.17-0.54 0,0023 - 0,0033

Sr 100-133 51-108 не обнаружен '

Со 4, 55-5,34 не обнаружен не обнаружен

V 20,2-35,6 не обнаружен не обнаружен

Zr 44,1-62,3 не обнаружен не обнаружен

'ррт - частей на миллион

Содержание металлов в прикорневых листьях ферулы изменчивой не превышает ПДК. принятых в СНГ для овощей и фруктов. Общее содержание тяжелых металлов в субстанции цинарозида (0,00092 %), даже при их максимальных значениях, не превышает предельно допустимое

- 9 -

(0,001 %). предусмотренное фармакопеей.

Определение посторонни* примесей в препарате иинарозиО. Основным действующим веществом препарата цинарозид (нефроцизин) является лютеолин-7-0-р-0-гликопиранозид. В качестве примеси из аглико-нов возможно наличие лютеолина. Для идентификации препарата и определения посторонних примесей нами разработан метод хроматографии в тонком слое сорбента. В качестве неподвижных фаз были опробованы пластинки "ЭПиГоГ (ЧСФР) и "ЗогЬШ" (Краснодар, Россия); в качестве подвижной фазы исследовали ряд систем растворителей, деление в которых основано как на адсорбционном, так и распределительном механизме. Критериями оптимизации служили величина Ш". размер пятен, чувствительность обнаружения, время анализа.

Наилучшее деление гликозида от агликона было получено на пластинках "БогЬГП" в системе хлороформ-метанол-уксусная кислота (4:2:2) при насыщении камеры в течение 30 мин. Обнаружение пятен на хроматограммах проводили после обработки их парами концентрированного раствора аммиака. Предел обнаружения цинарозида -0,5 мкг, лютеолина -0,2 мкг. Анализ производственных партий субстанции цинарозида методом ТСХ показал наличие в них лютеолина от 1 до 3 55.

Разработка метода количественного опреЭелгиия цинарозиЗа а субстанции и шблеппсаг. В УФ-спектре растворов субстанции и таблеток цинарозида в 80 Я этиловом спирте имеется два максимума поглощения: в длинноволновой области при 352 ± г нм и коротковолновой при 256 ± 2 нм, что характерно для флавоноидов, а таюке плечо при 268 ± 2 нм (рис. 2).

Пии.

Рис.2. УФ спектры растворов лютеолина (1), цинарозида (2), таблеток цинарозида (3). плацебо (4) в 80 X этиловом спирте.

Характеристика УФ-спектра раствора препарата в 80 % этиловом спирте предложена нами для идентификации субстанции и таблеток цинарозида.

Наличие максимумов в УФ-снектре раствора цикарозида предопределило разработку ышктрофотометрнчоского метода его количественного определения. В качестве аналитической нами выбрана длинноволновая полоса поглощения. Ее высокая интенсивность е « 4.44) обеспечивает большую чувствительность метода. Кроме того, при данной длине волны менее выражены сольватохрсмные эффекты . Все это позволяет проводить измерения с наименьшей ошибкой. Поглощение спиртовых растворов цинарозида при этой длине волны в области рабочих концентраций 2,5-10 мкг/мл (Б-0.15-0,60. 1-10 мм) подчиняется закону Бугера-Ламберта-Бера.

Для определения содержания цинарозида в субстанции поглощение раствора последней сравнивают с поглощением в тех же условиях раствора ГС0 лютеолина (ВФС 42-1709-87) известной концентрации, для которого при этой же длине волны поглощение раствора прямо пропорционально концентрации (1.5-7,0 мкг/мл: 0-0,15-0,60.1-10 мм).

В формулу расчета содержания цинарозида вводят коэффициент перерасчета, учитывающий отношение молекулярной массы цинарозида (448,4) к молекулярной массе ГСО лютеолина (286,25) и равный 1,566. Это возможно, так как коэффициент экстинции агликона и его гликозида при одинаковых УФ-спектрах и при одной и той же длине волны совпадает в пределах ошибки опыта (2-3 К).

Для оценки возможности применения данного метода для определения цинарозида в лекарственной форме проьереио влияние наполнителей на спектральные свойства препарата. Исследования показали, что указанные вещества не изменяют положения максимума и оптическую плотность растворов (рис.2). Результаты анализа модельных смесей состава таблеток подтвердили отсутствие систематической ошибки определения. В качестве рабочего стандартного образца (РС0) в случае количественного определения цинарозида в таблетках использовали субстанции цинарозида, отвечающую требованиям проекта ВФС.

Метрологические характеристики методов приведены в таблице 2.

Обязательным требованием при оценке качества таблеток являются испытание однородности дозирования. Основными критериями, которым должен отвечать метод, используемый для анализа таблеток с малкм содержанием действующих веществ, являются высокая чувствительность и точность.

Разработанный нами спектрофотометрический метод контроля одно-

- И -

родности дозирования вднарозида в таблетках вполне отвечает этим требованиям.

Таблица 2.

Метрологические характеристики методов количественного определения цинарозида в субстанции и таблетках. (Р - 95%. п = 2.57, п - 6)

СУБСТАНЦИЯ

X Б ДХ Е

99,45 0,8468 ±0,9202 ±2. 3649 ±2, за

ТАБЛЕТКИ

X Бг Б ДХ Е

0,050В 0,7* 10"Г" ±0,81»10"3 ±2, 07«10"3 ±4. 08

Примечание: Значение X для субстанции в процентах: для таблеток -количество граммов цинарозида в одной таблетке.

Разрабсша метода количественного определения цинарозида в растительном сирье. Для количественного определения цинарозида в прикорневых листьях ферулы изменчивой был разработан хрома-то-спектрофотометрический метод, включающий стадии экстракции, хроматографическоо отделение флавоноидов от сопутствующих веществ с помощью ТСХ. элюирование и спектрофотокотрическое определение.

Изучение различных способов экстракции цинарозида из растительного сырья показмо. что оптимальной является экстракция 30 % этиловым спиртом при кипячении с обратным холодильником в течение 1 часа. Удовлетворительное отделение цинарозида от сопутствующих веществ, содержащихся в растительном сырье, было достигнуто на пластинках "БогЬШ" в системе хлорсформ-кетанол-уксусная кислота (4:2:2). Время насыщения камера - 30 мин.

Отсутствие посторонних примесей в зоне препарата цинарозид было доказано путем сравнения УФ-спектров и хроматограмм. полученных при анализе методом ВЭЯХ, эляатов соответствующих зон при хрома-тографировании экстракта из сырья и субстанции препарата.

Условия элвирования цинарозида с сорбента установили изучением десорбции заведомо чистого образца его 30 % этиловым спиртом путем непрерывного встряхивания. Исследовано влияние температуры и времени нагревания на процесс элюирования. Экспериментальные данные показали, что полная десорбция цинарозида с хроматограмм достигается при 60 "С в течение 30 мин. Десорбция при данных условииу

идет в среднем на 85 35.

Метрологическая характеристика метода приведена в таблице 3.

Таблица 3.

Метрологическая характеристика метода количественного определения цинарозида в растительном сырье

X S2 S ЛХ Е

1.65 0.00159 iO.003986 10.10244 ±6,22

Опыты с добавками ползали отсутствие систематической ошибки.

Контроль производства субстанции цикарозиЗа. В основу разработанного метода положено количественное определение цинарозида в сырье.

В соответствии с технологией, предлоненной к.т.н. Маматханозым А. У. с соавторами, разработаны методы определения цинарозида в экстрактах на всех стадиях очистки, маточных растворах и шроте. В каадом случае индивидуально подбирали количество наносимого на хроматографу раствора с тем, чтобы содержание цинарозида соответствовало чувствительности метода.

Таблица 4

Динамика извлечения цинарозида 60 % этиловым спиртом кз прикорневых листьев ферулы изменчивой.

Анализируемый • объект Количество экстракта, Содержание цинарозида, Ж

Ьешосимого на хроматограыму,мл к весу • сырья к количеству цинарози-зида в сырье

Прикорневые листья Ферулы изменчивой 100

Извлечение 1 0,05 0.597 50.27

- . - 2 0,05 0.229 19. 24

- - - 3 0,1 0.160 13, 49

- . - 4 0,15 0.060 5, 45

- . - 5 0,2 0,037 3,14

- . - 6 0,5 0.019 1,63

- . - 7 0,6 0. 012 1,01

ИТОГО 1.12 94,23

Изучали динамику извлечения цинарозида 80 55 этиловым спиртом

из прикорневых листьев ферулы изменчивой с содержанием 1.19.x ци-иарозида на пилотной установке ИХРВ. В каждом сливе определяли количество цинарозида (таОл.4). Суммарное содержание вещества, извлеченное за семь сливов, составило 1.12 % от веса абсолютно сухого сырья или 94.23 X от колнчйст&з цинарозида, содержащегося в листьях.

Таблица 5

Количественные показатели контроля производства цинарозида по стадиям технологического процесса

Количество экстракта, наносимого на хрома-тограмму. мл Содержание цинарозида.%

Анализируемый обьокт к весу сырья к количеству цинарозида з сырье

Исходное сырье 0.05 1.19 100

Суммарный спиртовый экстракт 0,05 ■ 1.12 94,23

Шрот 1.5 0,064 5.4

Хлороформное извлечение 1.0 0,12 9,3

Цинарозид технический - 0,86 72.57

Маточный раствор после фильтрации Цинарозид после перекристаллизации Маточный раствор после перекристаллизации Неучтенные потери 1.2 1,2 0.097 0,77 0,03 8.26 64,5 7.1 5

Анализ данных таблицы 5 показывает, что осноаннз (учтенные) потери цинарозида происходят при промывании хлороФч<исм (удаление дипсфнльиых веществ) и составляют 9,8 %, в маточном растворе после Фильтрации - 8,26 %, кристаллизационных маточниках -7.1%. Неучтенные потери составили 5 %. Выход цинарозида-фабриката. отвечающего требованиям НТД, составил 64,5 % от содержания цинарозил". 1 сырье.

Анализ цшшрозш?а методом ВЗНОС. В связи с возрастанием т<ч -ваниЛ к объективности оценки качества лекарственных средств вех большее значение, особенно в области фитопрепаратов приобретает метод ВЭЯХ. Поэтому о нашей работе была предусмотрена разработка методик, способствующих повышению эффективности стандартизации субстанции цинарозида.

Полярные свойства цинарозида предопределили целесообразность использования обращенно-фазного варианта ВЭЖХ.

В качестве стационарной фазы был использован сорбент с привитыми октадецилсилаиовыми группами Сепарон С18 ("Tessek".ЧСФР) и размером частиц 5 мкй. Основываясь на том, что в случае обращенно-фазного варианта ВЭЖХ применяют водосодержащие смеси, в состав которых входят один или несколько различающихся по полярности органических растворителей, нами был опробован ряд элюентных систем.

Для подавления диссоциации фенольных гидроксильных групп и уменьшения "tailing effect", т.е. улучшения формы хроматографичес-ких пиков, в состав элюентных систем включали фосфатно-ацетатный буфер (рН-2,7-2,8). Все эксперименты по подбору ПФ проводились при одной и тий яе скорости потока элюента - 50 мкл/мин.

Критериями оптимизации служили: число пиков на хроматограмме, коэффициент разделения, время анализа.

При выборе оптимальной элюентной системы в качестве мертвого объема использовали пик растворителя (0) - метанола.

Как видно из табл.6 и рис.3, наилучшей ПФ для разделения гли-козидов субстанции цинарозида оказалась смесь ацетонитрил-фосфат-но-ацетатный буфер (25:75).

Таблица 6

Результаты оптимизации хроматографического разделения флавоноидных гликозидов субстанции цинарозида

Компоненты

Соотношение ацетонитрил-фосфатно-ацетатный

буфер (рН-2.8)__„——----

---параметры оптимизации

30:70 25:75 20:80

t tf-t, s ta t 1г-Ц s tn t 4 S

лютеолин-7-0-глвкозид 3.9 5 4,07 1.23 0,13 7.2 5,71 3.55 0.24 11.5

глюкозид 2 _ 5,30 0,60 0,05 9.26 1,69 0.03

глюкозид 3 - 5,9 10,9

Из-за резкого различия в полярности гликозидов и агликонов наблюдалось сильное увеличение времени удерживания и размывание пика лютеолина в изократическом режиме. Применение градиентного элюирования было нежелательно, так как перед нами стояла задача

J

^—/

< г s 4

4У,-

о 2 4 е л « пм

Рис.3. ВЭЖХ флавоноидных гликозидов субстанции цинарозида при использовании ПФ ацетонитрил - фосфатно-ацетатный буфер в различных соотношениях.' Сорбент: Сепарон С18

ПФ: ацетонитрил - фосфатно-ацетатный буфер (рН-2.8) а. 30:70. об.; б. 25:85. об.; в. 20:80. об. Скорость потока элюента: 50 мкл/мин Аналитическая длина волны: 352 им скорость двиаения бумага: а и б. 0.2 мм/с; в. 0.1 мм/с.

г

VJ

я».«

"1—I !-Г—J-)-1-J-J.

Рис.4. Разделение искусственной снеси цинарозида (1). лвтеоли-на (2). апигенина (3) методом ВЭЯХ. Сорбент: Сепарон С18

ПФ: ацетонитрил - фосфатно-ацетатный буфер (рН-2,8)

25:75.06. (фаза А). 50:50,об. (фаза Б) Профиль элюирования: Фаза А - 270 мкл, фаза Б - 230 мкл Скорость потока плюента: 50 мкл/мин Аналитическая длина волны: 352 нм Скооость движения бумаги: 0.5 мм/с

разработки метода количественного определения. Поэтому, наиболее приемлемым оказалось дифференцированное изократическое разделение агликонов и гликозидоп внутри каждой из групп, т.е. использование ступенчатого режима.

Оптимальной ПФ длй.отделения лютеолина от другого наиболее распространенного производного флавона - апигенина оказалась ПФ . ацетонитрил-фосфатно-ацэтатный буфер (50:50) (рис.4).

Профиль элюирования при использовании метода внешнего стандарта количественного определения: фаза А - 270 мкл: фаза Б -230 мкл. В случае применения метода внутрзнного стандарта (ВС) не наблюдается четкого деления ВС от компонентов цинарозида (рис.5,б). Поэтому применили профиль: фаза А - 310 мкл; фаза Б - 200 мкл. ^лцкозцды (шщшш< „

1 I гЦп

> агликон i,

1._J

^Шкоя \J-

tTTTTTTTTl®""' ГТТТТТТТ!

1 Щ А ОН

f

04 23430769 10

Рис.5. Разделение компонентов субстанции цинарозида методом ВЭЖХ. Сорбент: Сепарон С18

ПФ: ацетонитрил - фосфатно-ацетатный буфер (рН-2,8)

25:75.об (фаза А). 50:50,об (фаза Б) Профиль элюирования: а. и б. Фаза А - 270 мкл, фаза Б - 230 мкл

в. фаза А - 310 мкл, фаза Б - 200 мкл Скорость потока элвента: 50 мкл/мин Аналитическая длина волны: а. 352 нм, б. и в. 330 нм Скооость движения бумаги: 0.2 мм/с

Флавоноидкые соединения имеют сильные хромофоры. Поэтому для их обнаружения было целесообразно использовать УФ-спектрофото-метрическоа детектирование. Выбор аналитической длины волны проводился с учетом УФ-поглощения важнейших компонентов исследуемого препарата в диапазоне длин волн от 256 до 360 нм через каждые 2 нм. Наилучшими оказались области от 256 до 280 нм и от 330 до 352 им. Мы остановили сзой выбор на 330 им при применении ВС. поскольку максимум поглощения ВС близок к данной длина волны, и 352 нм при применении мотода внешнего стандарта. В этих случаях наблюдаются сопоставимое поглощение и выполнение закона Буге-ра-Ламберта-Бера для всех компонентов в интервале рабочих концентраций.

Таким образом, в качестве факторов типового режима использовали сорбент: Сепарон С18; системы элвирования: •ацетонитрил-Фос-Фатно-ацетатный буфер (25:75) - для гликозидов; ацетонитрил-Фос-Фатно-ацетатний буфер (50:50) - для агликонов; аналитические длины волн: з:;с к 352 нм.

По данным 2jäX анализа в субстанции цинарозида установлено наличие 4-х компонентов: 3-х гликозидов и лютеолина (рис.5).

Для идентификации пиков были использованы следующие приемы: сравнение относительных времён удерживания, кохроматографирование о аутентичными образцами, спектральное сканирование, гидролитическое раецзплеиие субстанции цинарозида с последующим хронатографи-рованлем полученных агликонов методом ВЭЖХ и Сахаров - методом БХ.

Наряду q экспериментальными приемами в кашей работе был использован путь корреляции хроматографических параметров компонентов с возмозшэд набором структурных Фрагментов в сосиеетг.тмч с известными закономерностями.

Все эти приемы позволили отнести пик 1 к лютеолин-7-0-Д-0-г^;г." копиранозиду. пик 2 к лютеолин-4'-0-|$-0-глюкозиду. пик S к латео-лину. Переы;! и последний ранее были описаны для надземной части Ферулы изменчивой, второй рв был известен для данного растения. Дальнейшие исследования подтвердили правильность предварительной идентификации.

Покомпонентный количественный анализ препарата цинарозид осуществляли как методом внешнего стандарта, так и методом внутреннего стандарта (ВС). В качестве ВС была использована салициловая кислота. При анализе одних и тех же сорий субстанции цинарозида двумя разработанными методами получены сопоставимые результаты.

Метрологические характеристики методов приведены в таблице 7.

Таблица 7

Метрологические характеристики методов компонентного анализа субстанции цинарозида (Р = 95%. ЦР Г) = 2.78, п - 5)

Компоненты Метрологические характеристики

X Бг Б дх Е

Метод внешнего стандарта

1 2 3 5 В сумме 84,01 3.02 6,34 2,05 95, 42 0.8243 0,0040 0. 0036 0,0022 ± 0,9079 ± 0,0636 ± 0,0602 ± 0.0456 ± 2,5240 + 0,1767 ± 0,1673 ¿0,1295 ± 3.01 ± 5, 84 ± 2.64 ± 6,32

Метод внутреннего стандарта

1 2 3 5 В сумме 86,66 3,23 5. 99 2,41 98,29 1.4569 0.0012 0, 0182 0,0019 ± 1,2070 ± 0,0340 ± 0, 1347 + 0.0432 ± 3,3555 ± 0,0944 ± 0.3749 ± 0,1202 ± 3,87 ± 2,92 ± 6,25 ± 4.99

В результате проведенных определений было выявлено достаточное постоянство состава от серии к серии, что свидетельствует о хорошо отлаженной технологии. Количественный анализ показал, что содержание суммы флавеноидных соединений в исследуемых образцах субстанции цинарозида лежит в пределах 95 %, что согласуется с требованиями предлагаемого нами проекта ВФС. Завышенные результаты анализа этих же серий субстанции цинарозида спектрофотоматрическим методом связаны с тем. что присутствие более 1 % примесей агликонов в гли-козидах или анализируемых смесях вызывает завышение результатов в среднем на 1.5Х - 2Х % (X - примеси агликонов). Гликозкдк в субстанции цинарозида являются преобладающей группой соединений (94 %). Основным из них является лютеолин-7-о-р-1»-птокопиранозид (85 %).

Быделсшг и исслебоешше ранее не описанного комитент сцбс-танции цикарозцЭа.' С цглью выделения обнарценных гликозидов лы-теолина осуществляли экстракцию воздушно-сухого сырья 80 % этиловым спиртом при комнатной температуре. Сгущенный этанолышй экстракт разбавили водой, липофильные вещества удаляли промыванием хлороформом. Из очищенного экстракта при охлаждении выпал осадок Флазо-ноидов. Его хроматографировали на колонке с силикагелем в градиен-

' Работа выполнена совместно с д.х. н. Батировым Э.Х., к. х.н. Юл-дашевам М.П.

тной системе хлороформ - метанол. При этом кроме лютеолин-7-0-глю~ козида (собственно цинарозида) выделили еще один гликозид.'

Флавоноил I состава Сг1Н2О0,1 - кристаллическое вещество светло-желтого цвета. На основании положения максимумов з УФ-спектро и данных ПНР-спектроскопии вещество I отнесено к группе флавоновых гликозидоб. В спектре ПМР I, снятом в дейтеропири-дине, проявляются сигналы протонов 5.7,3',4'- тетразамещенного флавонового ядра, сигнал (5-шгомерного протона при 5.51 м. д. Об, 5 Гц) и других протонов мэнссахаридного остатка при 3.80-4,57 м.д.

Кислотный гидролиз I привел к образованию эквимолекулярных количеств глюкозы и агликона с т.пл. 329-330 °С, М* 286, идентнфициро санного с лютеолином (5, 7,3'4' -тетрао.чскфлаволом).

Глюкоза была идентифицирована с помощью БХ.

Соединение I, как показывают результаты изучения УФ-спектров с диагностическими добавками (табл.8), содержит свободные гидроксиль-ные группы в положениях С-5,7,3'флавонового ядра. Из этого следует, что местом присоединения углеБсдногс остатка является С-4'.

Таблица 8

Данные УФ-спектроскопии флавоноида I

Вещество Хйах,НМ

в метаноле +СН3С00Ма +А1С13 +А1С13/НС1 +СН3ОНа

X X ДХ X ДХ X ДХ X ДХ

лютеолик-4'-О-р-Э-глюко-пиранозид 271 290 ПЛ 337 273 +2 353 +16 275 +4 351 382 +45 277 +6 340 37 Э +42 263 -3 374 +37

На основании результатов наших исследований и сравнения Физико-химических свойств флавоноида I с литературными данными ои отовдествлен с лютеолнн-4'-0-(5-Ю-глкжопиранозидом.

выводы

1. Изучен микроэлементкый состав субстанции цинарозида и источника его получения-прикориевых листьев ферулы 'изменчивой; установлено наличие в них таких микроэлементов, как: железо, марганец, титан, хром, никель, цинк, медь; в следовых количествах свинец и молибден. Показана экологическая чистота этих объектов в отношении

тяжелых металлов.

2. Установлена термическая стабильность субстанции цинарозида до 225 °С и оптимальная температура иб сушки 100-105 °С.

3. Разработана унифицированная методика идентификации и определения посторонних примесей в субстанции и лекарственной форме цинарозида, основанная на результатах изучения хроматографического поведения цинарозида в тонком слое сорбента. Выбраны следующие оптимальные условия: пластинки для ТСХ "БогМ 11" (Краснодар, Россия), система растворителей - хлороформ-метанол-уксусная кислота (4:2:2).

4. Разработаны спектрофотометрические методы количественного определения цинарозида в субстанции и таблетках с содержанием 0,05 г действующего вещества, а также однородности их дозирования.

Относительная ошибка единичного определения с 95 5 вероятностью для субстанции составляет ± 2,38 %; для лекарственной формы - 1 4,08 35.

5. Разработан хромато-сг.ектрофотометрический метод количественного определения цинарозида в прикорневых листьях фэрулы изменчи-' вой.

относительная ошибка единичного определения о 95 % вороят-ностьв составляет * 6,22 х.

6. Разработан мэтод постадийного контроля получения субстанции цинарозида. который включен в опытно-промышленный регламент получения данного препарата.

7. Впервые в результате комплексного аналитического подхода к исследованию субстанции цинарозида методом ВЭЖХ оптимизирован хро-матографический процесс, произведена идентификация компонентов субстанции и определено содержание каждого из них. обнаружены два Флавономдных гликозида ранга на описанных для субстанции цинарозида. Один из них выделен из прикорневых листьев ферулы изменчивой в индивидуальном виде и идентифицирован как лютеолин-4'-0-р-0-глкжо-пиранозид.

8. С помощью предложенных способов количественного анализа методом . ВЭЖХ субстанция цинарозида охарактеризована как многокомпонентная смесь. 95-93 % которой составляют флавоноидные соединения. Основная доля приходится на гликозиды (94 X), орсди которых преобладает лвтеолик-7-О-глюкозид (собственно цинарозид) (85 %).

9. Составлены и представлены для рассмотрения в Фармакологические комитеты КЗ Российской Федерации и Республики Узбекистан проекты ВФС на субстанцию и лекарственную форму.

Таблетки цинарозида 0,05 г разрешены к клиническим испытани-

- 21 -

км Фармакологическим комитетом МЗ Российской Федерации.

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ

1. Максумова И.С., Генкина Г.Л. Разработка методики количественного определения нефроцизина (лютеолин-7-0-р-П-глгакопиранозида) в листьях Ferula varia // Химия природ, соедин. - 1993. - N2. -С.217-220.

2. Максумова Н.С., Ботникова Ф. Ш.. Иаматханов А.У. Контроль производства нефроцизина // Химия природ, соедин. - 1993. - Н5. -С. 757-758.

3. Максумова Н.С., Генкина Г.Л., Пак А.П. Фармакопейный анализ нефроцизина (субстанция, таблетки нефроцизина 0,05 р. сырье - Ферула изменчивая) // Тез. докл. Конференции молодых ученых Института химии растительных веществ. - Ташкент. 1992. - С.38-39.

4. Максумова Н.С., Генкина Г.Л., Батиров Э.X. Качественная оценка препарата нефроцизина методом ВЭЯХ П Тез. докл. Конференции молодых ученых Института химии растительных оещеото. - Ташкент. 1992. - С.65.

МАКСУМОВА ПОЛИРА САКДОВНА "Цинарозид дорисики сифат назоратини яратиш усуллари" маззуидага диссартациясини кисщнча мазмуни.

Узгарупчан ферула усимлиги илдиз олди бергларидан олиигаи. ги-поазотемик хусусиятига эга булган цинарозид субстанциясини ва укинг таблеткасшги стандартлаш ва сифатини назорат зтиш усуллари яратилди. Ц!шарозид субстанцияси па узгарувчан ферула усимлиги-нинг илдиз олди баргляршш микроэлемент таркиби урганилди ва ДФси талаблари даражасидан ошмаслиги курсатилди.

Цинарозид субстанциясини ва таблеткасини ми^дорий тахлили учуй спектрофотсметрмк, хом ашёси учун эса хромато-спектрофотомет-ри¡с усуллари игалаб чш^илди. Цинарозид субстанцияси учун эса иксах унумди сую^лнк хроматография (ЮУСХ) усули яратилди. Цинарсзнд субстанцияси твркпбида илгари баён этилкаган 2-та Флавоноид гли-козид мавжудлиги анш[лан:?б, улардан Снри 4-0-{5-0-глюкопиргнозид исботланди.

Цинарозид субстанциясини ишлзб чикариш учун аналитик назорат усули яратилди.

Олннгэк натизсалар асоснда цинарозид субстанцияси ва таблетка-си учун вактинча Фармакопея рисоласи (ВФР) ишлаб чицилди.

- 22 - - '

Ушбу хужжатлар Россия Соглицни Caiyiaui Рлзирлигига топширилди. Цинарозид дориси клиник синовларга рухсат этилди.

Ушбу норматив-техник хужжатлар Узбекистан Республикаси Сог-ликни 'caiyiaui Базирлигига тасдицлаш учун топширилди.

Цинарозид дорисининг ишлаб чицаришнинг боскинлар аро назорат тахлили танриба-саноат норматив-техник хужжатига киритилган.

SUMMARY of U.S. Maksumova's dissertation work on the theme "Elaboration of quality control methods of cynarozld preparation"

The investigations In elaboration of standardization methods of new hypoazotemlc preparation of cynarozld (substance and medicinal form) and №0 source of Its obtaining - near root leaves of Ferula varla (Schrenk) Trautv. are presented In this work.

Derlvatographlc researches of cynarozld substance were carried out. Microelement composition of cynarozld substance and near root leaves of Ferula varla were studied. It was shown their ecologlc purity In attitude to heavy metals. Spectrophotome trie method of quantitative determination of cynarozld In substance and tablets, chroroato-spectrophotometrlc method of Its quantitative determination in raw material were elaborated. The substance of cynarozld was studied by high performance liquid chromatography method (HPLC). The presence of two new fiavonoid glucosldes was established In substance; one of thein was determined as luteolln-4'-0~(5-D-glucopy-ranoslde.

The analytical control method of technological scheme of cynarozld production was suggested.

On the base of carried Investigations the projects of Temporary Pharmacopelal articles for cynarozld substance and 0,05 g tablets were composed and then accepted by Russia Ministry of Health. Cynarozld was allowed for clinical experiments. This scientific technological documentation was also presented to Uzbekistan Ministry of Health for confirmation. The method of quantitative determination of cynardzld In near root leaves of Ferula varla was Included Into project of Temporary Pharmacopelal Article for Indicated raw material. The studial control of substance cynarozld production was Included Into model-industrial reglamerit~for~obtalnlng this preparation.