Автореферат и диссертация по фармакологии (15.00.02) на тему:Фармакогностическое и фармакологическое изучение надземной части шалфея сухостепного Salvia tesquicola Klok. et Pobed

На правах рукописи

ШЕШЕГОВА Елена Викторовна

ФАРМАКОГНОСТИЧЕСКОЕ И ФАРМАКОЛОГИЧЕСКОЕ ИЗУЧЕНИЕ НАДЗЕМНОЙ ЧАСТИ ШАЛФЕЯ СУХОСТЕПНОГО SALVIA TESQUICOLA KLOK. et POBED.

15.00.02 - фармацевтическая химия, фармакогнозия 14.00.25 - фармакология, клиническая фармакология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата фармацевтических наук

Санкт-Петербург 2004

Диссертационная работа выполнена на кафедрах фармакогнозии и фармакологии Санкт-Петербургской государственной химико-фармацевтической академии Министерства здравоохранения Российской Федерации.

Научные руководители:

доктор медицинских наук, профессор Е.Е. Лесиовская кандидат фармацевтических наук, доцент Л.С. Теслов

Официальные оппоненты:

доктор фармацевтических наук, профессор Е.И. Саканян доктор медицинских наук, профессор В.В. Чельцов

Ведущая организация: Ботанический институт им В.Л. Комарова РАН.

Защита состоится «е^/» ¿ре/^я2004 г. в ^Р^на заседании Диссертационного Совета Д 208.088.01 при Санкт-Петербургской государственной химико-фармацевтической академии по адресу: 197376, г. Санкт-Петербург, ул. Профессора Попова, д. 14.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке академии по адресу: Санкт-Петербург, ул. Профессора Попова, д. 4/6.

Автореферат разослан

Ученый Секретарь Диссертационного Совета, кандидат фармацевтических наук, * доцент

М.В. Рыжкова

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. В современной медицине лекарственные растения продолжают оставаться одним из перспективных источников получения эффективных лекарственных препаратов. Препараты растительного происхождения обладают более мягким действием, менее токсичны и проявляют широкий спектр фармакологического действия (Соколов, Замотаев, 1990).

Некоторые виды рода шалфей Salvia L. флоры России используются в народной медицине при различных заболеваниях, a S. aethiopis L. и S. officinalis L являются официнальными растениями. Шалфей лекарственный в диком виде на территории России не произрастает, но культивируется в специализированных хозяйствах на юге европейской части страны. Потребности в листьях шалфея удовлетворяются не полностью. Поиск заменителя этого сырья во флоре России достаточно актуален. Изучаемый нами вид - шалфей сухостепной Salvia tesquicola Klok. et Pobed. - распространен в европейской части бывшего СССР, во всех районах Кавказа, в Западной Сибири и в северо-западной части Средней Азии, что делает его перспективным в ресурсоведческом отношении.

Анализ данных литературы показал, что, несмотря на популярность этого вида шалфея в народной медицине, сведения о химическом составе и биологических свойствах его ограничены. Поэтому фармакогностическое и фармакологическое изучение надземной части шалфея сухостепного представлялось актуальным.

Диссертационная работа выполнена на кафедрах фармакогнозии и фармакологии Санкт-Петербургской государственной химико-

фармацевтической академии в соответствии с научным направлением «Изыскание и изучение биологически активных веществ растительного, микробного и синтетического происхождения» и тематическим планом научно-исследовательских работ СПХФА по теме «Исследование лекарственных растений, перспективных для создания фитопрепаратов». Изучение антимикробного действия выполнено на кафедре микробиологии СПХФА под руководством зав. лаборатории биотехнологии к.б.н. Л.А. Коссиор, исследования с использованием методов газовой и высокоэффективной жидкостной хроматографии выполнены в лаборатории аналитических методов НИУ академии.

Цель и задачи исследования

Целью настоящего исследования являлось фармакогностическое и фармакологическое изучение надземной части шалфея сухостепного.

В задачи исследования входило:

1. Проведение общего фотохимического анализа надземной части шалфея сухостепного с целью выявления основных групп действующих веществ.

2. Изучение компонентного состава доминирующих групп биологически активных соединений.

3. Определение острой токсичности и фармакологических эффектов сухих экстрактов из надземной части шалфея сухостепного в сравнении с экстрактами из листьев шалфея лекарственного.

4. Изучение антимикробной активности сухих экстрактов из надземной части шалфея сухостепного в сравнении с экстрактами из листьев - шалфея лекарственного.

5. Определение нормативов качества изученного сырья и разработка проекта нормативной документации (ФСП) на сырье.

6. Рекогносцировочная ресурсоведческая оценка данного вида.

Научная новизна. Из надземной части 1вздшсо1а были впервые

выделены и идентифицированы 4 флавоноидных соединения - гликозиды лютеолина и хризоэриола: цинарозид, сколимозид, 7-О^-глюкуронид лютеолина и 7-О^-глюкуронид хризоэриола. Установлено присутствие в траве шалфея сухостепного водорастворимых полисахаридов, определено их содержание, а также изучен мономерный состав. Определены качественный состав и содержание фенольных кислот и аминокислот надземной части шалфея сухостепного. В экспериментах на животных установлено, что сухие водные и спиртовые экстракты из надземной части шалфея сухостепного обладают низкой токсичностью, выраженными антигипоксическим, противовоспалительным, ранозаживляющим, анальгезирующим и седативным эффектами. В сравнении с экстрактами из листьев шалфея лекарственного они показали более выраженный антиэкссудативный, иммуномодулирующий и муколитический эффекты. В результате сравнительного изучения антимикробной активности сухих экстрактов из надземной части шалфея сухостепного и листьев шалфея лекарственного установлено сходство по бактерицидной и бактериостатической активности в отношении грамположительных и грамотрицательных микроорганизмов. Разработана методика количественного определения суммы флавоноидов в траве шалфея сухостепного.

Практическая значимость. Определены характеристики подлинности, показатели качества и их нормативы для сырья шалфея сухостепного. Результаты исследования использованы при разработке проекта ФСП на новый вид лекарственного сырья «Шалфея сухостепного трава», который рекомендуется для внедрения в медицинскую практику в качестве противовоспалительного и антимикробного средства. Составлена карта ареала шалфея сухостепного и проведено определение урожайности в естественных условиях произрастания в Волгоградской области (Жирновский район). Полученная ресурсоведческая характеристика вида свидетельствует об обеспеченности его сырьевой базы.

Апробация работы. Основные положения диссертации доложены на 67-ой научной сессии КГМО отделения медико-биологических наук ЦентральноЧерноземного научного центра РАМН (Курск, 2002 г.); IX Российском национальном конгрессе: «Человек и лекарство» (Москва, 2002 г.); 60-ой Юбилейной открытой итоговой научной конференции студентов и молодых ученых Волгоградской медицинской академии: «Медицина в начале нового

века: достижения и перспективы» (Волгоград, 2002); VI Международном Съезде «Актуальные проблемы создания новых лекарственных препаратов природного происхождения» (Санкт-Петербург, 2002); VII Международном Съезде «Актуальные проблемы создания новых лекарственных препаратов природного происхождения» ФИТОФАРМ 2003 (Санкт-Петербург - Пушкин, 2003).

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Компонентный состав основных групп биологически активных соединений: флавоноидов, фенольных кислот, аминокислот и полисахаридов надземной части шалфея сухостепного, а также их количественная оценка.

2. Сравнительная характеристика острой токсичности и фармакологических эффектов сухих экстрактов из надземной части шалфея сухостепного и листьев шалфея лекарственного.

3. Сравнительная характеристика антимикробной активности сухих экстрактов из надземной части шалфея сухостепного и листьев шалфея лекарственного.

4. Обоснование методов стандартизации и нормативов качества сырья «Шалфея сухостепного трава».

Публикации. Основное содержание диссертации отражено в 10 научных статьях и тезисах.

Объем и структура диссертации. Работа изложена на 175 страницах машинописного текста, иллюстрирована 39 рисунками и 33 таблицами. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, главы, характеризующей материалы и методы исследований; а также 3 глав результатов собственных экспериментальных исследований, выводов, списка литературы, включающего 152 источника, из них 47 на иностранных языках, и 2 приложений.

В первой главе (обзор литературы) приведены сведения о систематическом положении, ботанической характеристике шалфея сухостепного, рассмотрены химический состав и биологическая активность видов рода Salvia. Вторая глава содержит описание объектов и используемых методов фармакогностического и фармакологического исследований. В третьей главе приведены результаты изучения состава биологически активных соединений надземной части шалфея сухостепного. Четвертая глава посвящена сравнительному изучению фармакологических эффектов сухих экстрактов (водных и спиртовых) из надземной части шалфея сухостепного и листьев шалфея лекарственного. Пятая глава посвящена стандартизации сырья «Шалфея сухостепного трава» и определению его урожайности.

Приложения включают перечень гербарных образцов S. tesquicola и проект ФСП на сырье «Шалфея сухостепного трава».

Материалы и методы исследования. Материалом для исследования служила надземная часть шалфея сухостепного Salvia tesquicola Klok et Pobed, собранная на территории Ростовской и Волгоградской областей в 2000-2003 гт в фазы бутонизации, цветения и плодоношения; а также листья шалфея лекарственного S. officinalis L, собранные в питомнике лекарственных растений

Санкт-Петербургской государственной химико-фармацевтической академии (пос. Лемболово, Ленинградская обл.) в июле 2001-2002 гг. в фазу цветения. Обнаружение основных групп биологически активных веществ и изучение компонентного состава флавоноидов, фенольных кислот, аминокислот и полисахаридов надземной части шалфея сухостепного проводила с помощью общепринятых химических реакций и современных физико-химических методов: УФ- и ИК-спектроскопии, адсорбционной и аффинной колоночной хроматографии, ВЭЖХ, ГЖХ, хроматографии на бумаге (БХ) и в тонком слое сорбента (ТСХ). Фармакологические исследования проводили параллельно с фитохимическими. Были получены извлечения (условно нами названы, для краткости, сухие экстракты) из надземной части шалфея сухостепного и листьев шалфея лекарственного: водные (экстрагент - вода очищенная) и спиртовые (экстрагент - 70%-ный этиловый спирт) способом мацерации с последующим фильтрованием, концентрированием и сушкой под вакуумом. Изучали острую токсичность экстрактов и влияние их на устойчивость животных к острой гипобарической, острой гемической и острой гистотоксической гипоксии. Ta^e оценивали влияние экстрактов на процесс воспаления (антиэксудативные свойства - на модели формалинового отека лапы крысы; антипролиферативные -на модели «ватной гранулемы»; ранозаживляющее действие - на модели «линейной кожной раны»); анальгезирующий эффект на модели «уксуснокислых корчей» и в тесте «tail-flick». Проводили исследование влияния экстрактов :на гуморальный иммунитет в луночной реакции гемагглютинации и клеточный иммунитет в реакции торможения миграции лейкоцитов периферической крови в присутствии антигена. Оценивали изменения психофизиологического статуса животных под влиянием экстрактов, изучали влияние экстрактов на снотворный эффект гексенала, их муколитическое действие и антимикробную активность. Проект нормативной документации (ФСП) на сырье составляли в соответствии с ОСТом 91.500.05.001-00. Статистическую обработку результатов проводили общепринятыми методами (Беленький, 1963). Различия по сравнению с контролем считали статистически существенными при Р<0,05. Вероятность различий оценивали с помощью критерия Даннета и критерия Стьюдента с поправкой Бонферрони.

2. ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

2.1. Испытания на присутствие основных групп действующих веществ.

Предварительная фотохимическая оценка надземной части шалфея сухостепного показала, что основными действующими веществами изучаемого вида являются флавоноиды, фенольные кислоты, аминокислоты и полисахариды. Определение содержания эфирного масла проводили методами 2 и 3, описанными в ГФ XI, вып. 1. Общее количество эфирного масла в надземной части шалфея сухостепного, собранного в фазу цветения, составила 0, 05% в высушенном образце и 0,15% в свежем образце сырья. Не обнаружены сердечные гликозиды, иридоиды, антраценпроизводные, дубильные вещества, хиноны, кумарины, сапонины и азотсодержащие вещества.

сердечные гликозиды, иридоиды, антраценпроизводные, дубильные вещества, хиноны, кумарины, сапонины и азотсодержащие вещества.

2.2. Изучение основных групп биологически активных веществ

2.2.1. Флавоноиды

Методом двумерной БХ в образцах шалфея сухостепного было обнаружено не менее 8 соединений, которые по характеру свечения в УФ свете, окрашиванию пятен после обработки спиртовым раствором 10% гидроксида калия, 5% спиртовым раствором хлорида алюминия, 2% спиртовым раствором хлорокиси циркония и по значениям Яг отнесены к флавоноидам (Бандюкова, 1965).

С помощью колоночной хроматографии этилацетатного извлечения и водного остатка были выделены индивидуальные вещества Б], Бг, Бз и Бл и на основании цветных реакций, значений Яг и характерных полос поглощения в ИК- и УФ-областях спектра была установлена их принадлежность к флавоновым гликозидам (табл. 1). Идентификацию выделенных веществ проводили по данным ИК- и УФ-спектроскопии, а также на основании изучения продуктов их кислотного и ферментативного гидролиза.

Для определения строения выделенных гликозидов проводили полный кислотный гидролиз 10% раствором серной кислоты на кипящей водяной бане в течение 4-х часов - для вещества Б], 2-х часов - для вещества Бг и 3-х часов -для веществ Бз и Б4 до агликонов. При гидролизе Бь Бг и Бз было получено одно и то же вещество в виде желтых игл с температурой плавления 326-330°С. По результатам качественных реакций, бумажной хроматографии со свидетелем и по физико-химическим свойствам подтверждена идентичность полученного агликона лютеолину (5,7,3',4'-тетрагидроксифлавону). Агликон вещества Б4 по значениям на хроматограммах при сравнении с достоверным образцом, а также специфическому окрашиванию после обработки 2% метанольным раствором хлорокиси циркония и парами аммиака идентифицирован с хризоэриолом (3'-метокси, 5,7,4'-тригидроксифлавоном). Гидролизаты для удаления сульфат-ионов пропускали через колонку с анионитом АВ-17 (ОН_), концентрировали и исследовали методом БХ и ГЖХ в присутствии достоверных образцов моносахаридов. В результате установили, что углеводные компоненты вещества Б1 представлены Б-глюкозой, вещества Бг -Б-глюкозой и Ь-рамнозой, а веществ Бз и Б^- Б-глюкуроновой кислотой.

По данным УФ-спектров с использованием комплексообразующих и ионизирующих добавок углеводные компоненты в молекуле каждого гликозида присоединяются к положению С7 агликоиа (табл. 1).

Для установления характера гликозидной связи вещества Б| был проведен гидролиз с помощью фермента эмульсина, стереоспецифического на Р — связь. Исследуемый гликозид легко расщеплялся ферментом, что позволяет судить о наличии - гликозидной связи между углеводным заместителем и агликоном.

Вещество при гидролизе 10% раствором серной кислоты в течение 1 часа расщеплялось с образованием агликона лютеолина и промежуточного продукта, который по значениям в сравнении со свидетелем оказался идентичным цинарозиду.

Таблица 1

Свойства флавоноидных соединений, выделенных из надземной части 1езцшсо\а

Показатели Цинарозид (80 Сколимозид (ва) Лютеолин-7-глюкуронид (вз) Хризоэриол-7-глюкуронид (Б4)

Температура плавления,0 С 254-256 184-187 - -

Окраска пятен на хроматограммах в УФ-свете до проявления темно-коричневая

- то же после обработки щелочью (10%-ным спиртовым раствором КОН) желтая

- то же после обработки 2% спиртовым раствором хлорокиси циркония + пары аммиака желто-оранжевая желто-зеленая

Значения в системах: БУВ (4:1:5), 15%-ная уксусная кислота и вода (БХ) 0,43; 0,16; 0,01 0,32; 0,30; 0,03 0,36; 0,15; 0,07 0,5; 0,24; 0,07

УФ-спектр поглощения (Хщах, нм): - спиртовый раствор (в МеОН) 348, 254 348,256 349,256 330,267

-Тоже + СНзСООЫа 405,258 375,260 340,259 390,339,266

-Тоже + СНзОКа 396,263 385,273 404,267 387,273

- То же + Н3В03 + СНзСООЫа 371,259 366,261 366,256 329,266

- То же + А1С13 426,332, 272 422,331, 271 421, 269 345,299,264

- То же + А1С1з + НС1 385,362 265 389, 347, 272,260 353,260 342,299,264

По результатам БХ, изучения продуктов кислотного и ферментативного гидролиза и сравнению значений R& УФ- и ИК-спектров со стандартными образцами вещество Si было охарактеризовано нами как 7-О- ß-D-глюкопиранозид лютеолина (цинарозид), вещество S2 как 7-О- ß-D-глюкопиранозил-6"-0-а-Ь-рамнопиранозил лютеолина, или 7-О-рутинозид лютеолина (сколимозид). Принадлежность соединений S3 и уронидам была подтверждена также данными, полученными при их выделении методами колоночной хроматографии на полиамиде и азоадсорбенте аффинного типа. В первом случае эти соединения в процессе хроматографии элюировались медленно и длительно, а во втором — наоборот, выходили из колонки в первых фракциях (Теслов и др., 2001). Таким образом, вещество S3 представляет собой 7-0-В-глюкуронид лютеолина, а S4 - 7-0-В-глюкуронид хризоэриола. Доминирующими соединениями являются сколимозид и 7-О^-глюкуронид хризоэриола.

2.2.2. Фенольные кислоты

Изучение качественного состава фенольных кислот надземной части S. tesquicola проводили методами двумерной БХ в системах растворителей БУВ 4:1:5 и 2% уксусная кислота с использованием проявляющих реактивов (3% спиртовой раствор железа (III) хлорида, 10% раствор гидроксида калия в этаноле и диазотированную сульфаниловую кислоту), по характеру флюоресценции в УФ-свете при 254 и 360 нм и при воздействии паров аммиака, а также методом ВЭЖХ на колонках с обращенно-фазовым сорбентом Silasorb SPH (С18) в присутствии набора достоверных образцов.

Для анализа фенольных кислот были получены водное, 40%, 70% и 95% спиртовые извлечения. В результате проведенного анализа было установлено, что в надземной части S. tesquicola содержится 10 фенольных кислот, среди которых идентифицировали галловую, гентизиновую, хлорогеновую, ванилиновую, кофейную, сиреневую, вератровую, салициловую, n-кумаровую и n-гидроксибензойную кислоты. Количественное определение кислот методом ВЭЖХ показало, что доминирующими кислотами являются, сиреневая, хлорогеновая, кофейная, салициловая и n-кумаровая кислоты, а гентизиновая и n-гидроксибензойная кислоты содержатся в следовых количествах (табл. 2). Общее содержание перечисленных фенольных кислот составило 4,8 % в пересчете на абсолютно-сухое сырье.

Методом ВЭЖХ была проведена также оценка полноты экстракции некоторых фенолокислот из сырья различными растворителями (рис. 1).

Так, наиболее полная экстракция галловой, гентизиновой, салициловой и вератровой кислот достигается водой; n-гидроксибензойная, ванилиновая и n-кумаровая кислоты из сырья лучше извлекаются 40% этиловым спиртом. В извлечениях 70% спиртом регистрировалось максимальное содержание кофейной, сиреневой и хлорогеновой кислот. Установлено, что в 95% спирт основные фенольные кислоты переходят труднее, чем в водно-спиртовые извлечения.

0041 0000 0022 00240

Гаглсам кислота Гаитммюмд ПвдрожиСакхЛиап Хицткан Кислота шалота

□ Вода ■ 40% этанол а 70% этанол ■ 95% этанол

Рис. 1. Содержание фенольных кислот в извлечениях из надземной части 5.1ездшсо1а в пересчете на абсолютно-сухое

сырье

Таблица 2

Содержание фенольных кислот в надземной части ВЛе$цшсо1а в пересчете на абсолютно сухое сырье (по результатам ВЭЖХ анализа)

Компонент Содержание кислот, % Содержание кислот, % от общего количества

Галловая кислота 0,15 3,1

Гентизиновая кислота 0,04 0,85

и-Гидроксибензойная кислота 0,03 0,5

Хлорогеновая кислота 1,08 22,4

Ванилиновая кислота 0,12 2,4

Кофейная кислота 0,53 11

Сиреневая кислота 1,78 37

Вератровая кислота 0,08 1,75

Салициловая кислота 0,45 9,3

и-Кумаровая кислота 0,56 11,7

Итого 4,8 100

2.2.3. Аминокислотный состав

В результате бумажно-хроматографического исследования в системе БУВ (4:1:2) качественного состава аминокислот в надземной части 1ездшсо1а обнаружены лейцин, фенилаланин, валин, метионин, тирозин, пролин, аланин, аспарагиновая и глутаминовая кислоты, лизин и цистеин. Методом ВЭЖХ с предколоночной дериватизацией в виде дансил-производных с флуорометрической детекцией было подтверждено наличие вышеперечисленных аминокислот и, кроме того, идентифицированы еще 7 соединений: серии, аргинин, треонин, глицин, изолейцин, триптофан и гистидин.

Доминирующими соединениями являются тирозин, гистидин, пролин, глутаминовая кислота и триптофан. Общее содержание аминокислот в надземной части шалфея сухостепного составило 0,12% в пересчете на абсолютно-сухое сырье (табл.3).

Таблица 3

Содержание аминокислот в надземной части 5. ге^шео/а (по результатам ВЭЖХ-анализа)

Компонент Содержание, % в пересчете на абсолютно-сухое сырье Содержание, % от общего количества

Аспарагиновая кислота 0,0058 4,85

Глутаминовая кислота 0,007 5,85

Серин 0,0018 1,5

Аргинин 0,0042 3,5

Треонин 0,0018 1,5

Глицин 0,0022 1,85

Алании 0,0051 4,3

Пролин 0,0142 11,85

Валин 0,0042 3,5

Метионин 0,0027 2,3

Изолейцин 0,0013 1,1-,---

Лейцин 0,0022 1,85

Фенилаланин 0,0013 1,1

Цистеин 0,002 1,7

Лизин 0,0048 4,0

Гистидин 0,0069 5,75

Тирозин 0,033 27,5

Триптофан 0,0168 14,0

Итого 0,12 100

2.2.4. Полисахариды

Общее содержание полисахаридов в надземной части шалфея сухостепного определяли гравиметрическим методом по модифицированной методике, основанной на схеме Н.К. Кочеткова, и включающей стадию очистки от белка по методу Севага. Определение суммарного содержания углеводов в полученном полисахаридном комплексе проводили спектрофотометрическим методом по реакции с фенол-серным реактивом. Концентрацию рассчитывали с помощью кривых, построенных по галактозе, арабинозе, глюкозе при следующих значениях длин воли: для гексоз - 490 нм, для пентоз - 480 нм. Содержание уроновых кислот определяли по реакции с концентрированной серной кислотой и 3,5-диметилфенолом с использованием калибровочной кривой, построенной по галактуроновой кислоте. Общее содержание углеводов в полисахаридном комплексе составило 70,0%, содержание белка - 22,61%, влажность - 6,97%. Отмечено высокое содержание уроновых кислот- 15,37 %.

В результате проведенных расчетов установлено, что содержание полисахаридов в надземной части составляет 1,97 %. При этом, по органам они распределены неравномерно, в листьях их содержится 3,12 %, в стеблях - 0,61 %, в цветках - 0,5 %.

Мономерный состав полисахаридов определяли после полного гидролиза 1М раствором трифторуксусной кислоты методом нисходящей хроматографии на бумаге в системе растворителей н. бутанол - пиридин - вода (6:4:3). В качестве проявителей использовали раствор кислого анилинфталата. При полном гидролизе были обнаружены арабиноза, галактоза, глюкоза, рамноза и ксилоза, а также глюкуроновая и галактуроновая кислоты.

Моносахариды, содержащиеся в свободном виде, определяли в супернатанте после осаждения полисахаридов 96 %-ным этанолом методом БХ, используя ту же систему растворителей. В свободном виде в надземной части шалфея сухостепного содержится глюкоза, а из сахаров-кетоз обнаружены фруктоза и сахароза (проявитель - спиртовой фосфорнокислый раствор резорцина).

Для детального изучения полисахаридной фракции проводили определение динамики гидролиза полисахаридов трифторуксусной кислотой в течение 15 часов с определением состава моносахаридов и их количественной оценкой в гидролизатах. В результате проведенного анализа было установлено, что полное расщепление полимерных молекул до мономеров происходит в течение 7 часов. Общее содержание углеводов при этом уменьшается, что свидетельствует об их деструкции. После 15 часов нагревания в гидролизате обнаруживаются только основные сахара: галактоза, рамноза, арабиноза и глюкоза.

Определение соотношения мономеров в полисахаридном комплексе проводили методом ГЖХ после его гидролиза трифторуксусной кислотой в течение 7 часов. Основными компонентами водорастворимых полисахаридов надземной части шалфея сухостепного являются галактоза, рамноза, арабиноза, глюкоза и глюкуроновая кислота (табл. 4).

Для предварительной характеристики полисахаридов шалфея сухостепного был проведен ферментативный гидролиз полисахаридной фракции пектиназой а-1,4 D-полигaлaктуронaзой. Хроматографирование проводили методом нисходящей бумажной хроматографии в системе бутанол - пиридин - вода (6:4:3), проявителем служил кислый анилинфталат с последующим выдерживанием при температуре 100-105°С. В качестве контрольного опыта использовали гидролиз полигалактуроновой кислоты. На хроматограммах были обнаружены пятна галактуроновой кислоты, что свидетельствует о возможном наличии в составе полисахаридов шалфея сухостепного фрагментов, сходных по структуре с пектиновыми веществами.

Таблица 4

Количественное содержание компонентов в гидролизате

полисахаридного комплекса из надземной части 5. tesquicola

Компонент Количественное содержание,% от общего содержания компонентов в гидролизате

Арабиноза 16

Гшокоза 13

Галактоза 37

Рамноза 16,25

Ксилоза 5,45

Глюкуроновая кислота 2,3

Галактуроновая кислота 13

2.3. Сравнительное изучение фармакологической активности сухих экстрактов из надземной части S. tesquicola и из листьев S. officinalis.

Изучение острой токсичности. ЛД50 при внутри брюшинном введении для водного экстракта шалфея сухостепного, собранного в Ростовской и Волгоградской обл. составили 1720+120 и 1630+100 мг/кг, соответственно, а для

спиртового экстракта из этого же сырья - 2820+250 и 1960+170 мг/кг, соответственно. ЛД50 водного и спиртового экстрактов шалфея лекарственного составили 1960+190 и 2610+230 мг/кг, соответственно. Все изучаемые экстракты можно отнести к малотоксичным.

Изучение противогипоксического действия проведена на 260 белых беспородных мышах самцах массой тела 18-20 г.

Анализ результатов оценки влияния экстрактов на продолжительность жизни мышей самцов в условиях острой гипобарической гипоксии (ОГБГ) представлен на рис. 2. Максимальный антигипоксический эффект на модели ОГБГ экстрактов шалфея сухостепного был выявлен при введении их в дозах, составляющих 1/30 от ЛДзо, а экстрактов шалфея лекарственного в дозах, составляющих 1/50 от ЛД50 (выживаемость животных составила 60%). Эти дозы и были выбраны для дальнейших исследований.

При моделировании гемической гипоксии после введения изучаемых экстрактов увеличения продолжительности жизни животных по сравнению с контролем не наблюдали.

В условиях острой гистотоксической гипоксии (ОГТГ) максимальный эффект был получен при введении водного экстракта шалфея сухостепного (рис.

Анализируемые образцы

Рис. 3. Влияние экстрактов на продолжительность жизни мышей самцов в

условиях ОПТ

Обозначения: 1 - контроль (вода очищенная); 2 - гутимин; 3 - водный экстракт шалфея лекарственного; 4 - спиртовой экстракт шалфея лекарственного; 5 - водный экстракт шалфея сухостепного; 6 - спиртовой экстракт шалфея сухостепного; отличия от контроля во всех группах статистически значимы (р<0,05).

Таким образом, было установлено, что изучаемые экстракты проявляют противогипоксическое действие на моделях ОГБГ и ОПТ и могут представлять интерес для дальнейшего углубленного изучения.

Изучение противовоспалительного действия проводили в опытах на 120 половозрелых крысах самцах массой тела 160-180 г. Анализ результатов изучения антиэкссудативных свойств на модели формалинового отека лапы крысы представлен на рисунке 4.

1 2 3 4 5 6

Анализируемые образцы

Рис. 4. Влияние экстрактов на экссудативную фазу воспаления (формалиновый отек лапы крысы) Обозначения: 1 - контроль (вода очищенная); 2 - диклофенак, 3-6 - то же, что и на рис. 3; отличия от контроля во всех группах статистически значимы (р<0,05).

Все изучаемые экстракты, кроме сухого водного экстракта шалфея лекарственного, обладали выраженной антиэкссудативной активностью, сопоставимой с препаратом сравнения диклофенаком.

Результаты изучения антипролиферативных свойств на модели «ватной гранулемы» представлены на рисунке 5.

Рис.5. Лнтипролиферативная активность исследуемых экстрактов на модели «ватной гранулемы» Обозначения те же, что и на рис. 4; отличия от контроля во всех группах статистически значимы (р<0,05).

Под влиянием экстрактов масса грануляционно-фиброзной ткани уменьшалась на 40-76% по сравнению с контролем. Диклофенак вызывал уменьшение образования грануляционной ткани на 49%. Эффекты водного экстракта шалфея лекарственного и спиртового экстракта шалфея сухостепного были сопоставимы с действием препарата сравнения диклофенака, а другие экстракты уступали ему по активности.

Ранозаживляющее действие экстрактов изучали на модели «линейной кожной раны». Опыты поставлены на 60 половозрелых крысах самцах массой тела 180-200 г. Анализ результатов представлен на рисунке 6.

Рис. 6. Результаты оценки ранозаживляющей активности исследуемых экстрактов на модели «линейной кожной раны» Обозначения те же, что и на рис. 4; * - отличия от контроля статистически не существенны (р>0,05).

Наиболее эффективно проходило заживление ран при введении водного экстракта шалфея лекарственного и обоих экстрактов шалфея сухостепного.

Обезболивающее действие экстрактов исследовали на 60 белых беспородных мышах самцах массой тела 18-20 г и 60 половозрелый крысах самцах массой тела 180-200 г. Результаты изучения анальгезирующей активности экстрактов на модели «уксуснокислых корчей» представлены на рисунке 7.

Наиболее выраженный анальгезирующий эффект выявлен у обоих экстрактов шалфея сухостепного.

Исследование болеутоляющей активности изучаемых экстрактов по влиянию на латентный период отдергивания хвоста (тест «tail-flick») показало, что все экстракты превосходили по этой активности препарат сравнения метамизол, но наиболее выраженное обезболивающее действие оказывал спиртовый экстракт шалфея лекарственного (рис. 8).

Изучение иммунотропных свойств экстрактов проводили на 60 мышах самцах линии СВА массой тела 18-20 г и 60 половозрелых крысах самцах массой тела 180-200 г. Влияние исследуемых экстрактов на гуморальный иммунитет изучали в луночной реакции гемагглютинации. В контрольной группе животных положительная реакция агглютинации наблюдалась в среднем в 4-м разведении, а у животных, получавших сухой спиртовой экстракт из листьев шалфея лекарственного - в 5-м, сухой водный экстракт из листьев шалфея лекарственного - в 6-7-м разведениях. При введении сухого водного экстракта из надземной части шалфея сухостепного положительная реакция агглютинации наблюдалась в среднем в 9-10-м разведениях, а при введении сухого спиртового экстракта из надземной части шалфея сухостепного - в 8-м разведении. Таким образом, можно сделать заключение, что наиболее выраженное иммуномодулирующее действие оказывал сухой водный экстракт из надземной части шалфея сухостепного.

Определение влияния на клеточное звено иммунитета проводили методом реакции торможения миграции лейкоцитов (РТМЛ) периферической крови в присутствии антигена. Под микроскопом с помощью измерительного окуляра определяли длину зоны миграции основной массы лейкоцитов от границы эритроцитарного осадка в контроле и опыте. Результаты реакции выражали в виде индекса миграции (рис.9).

Наибольшее угнетение РТМЛ наблюдали у животных, получавших водный экстракт шалфея сухостепного. При этом подвижность лейкоцитов в присутствии митогена снижалась на 60% по сравнению с контролем и была сопоставима с препаратом сравнения левамизолом.

Оценку влияния исследуемых экстрактов на психофизиологический статус животных проводили на 50 крысах самцах массой тела 180-200 г. Анализ результатов оценки психотропного действия экстрактов показал, что все экстракты проявляли в эксперименте выраженную анксиолитическую

активность, стабилизировали эмоциональную лабильность животных, снижали поисковую активность животных, оказывали выраженное седативное действие.

Изучение влияния исследуемых экстрактов на снотворный эффект гексенала проводили в опытах на 50 белых беспородных мышах самцах массой тела 18-22 г. Результаты представлены на рисунке 10.

Все изучаемые экстракты увеличивали продолжительность сна у мышей, вызванного введением гексенала, что говорит о наличии у них седативного эффекта. При этом наиболее выраженный эффект отмечен для спиртового экстракта шалфея лекарственного.

Рис. 10. Влияние экстрактов на продолжительность сна, вызванного введением гексенала мышам самцам • Обозначения: 1 - контроль (вода очищенная); 2-5 - то же, что и 3-6 на рис. 3; отличия от контроля во всех группах статистически значимы (р<0,05).

Оценку муколитического действия экстрактов проводили в экспериментах на изолированном пищеводе лягушки. Результаты экспериментов представлены на рисунке 11.

Рис. 11. Результаты изучения муколитической активности экстрактов Обозначения: 1- контроль (вода очищенная); настои: 2 - корня алтея; 3 - листьев мать-и-мачехи; 4 - травы душицы; 5 - 8 - то же, что и 3-6 на рис. 3; отличия от контроля во всех группах статистически значимы (р<0,05).

Анализируемые образцы

о

О

2 3 4 5 6 Г 8 Дотируемые образу

Наиболее выраженным муколитическим эффектом обладали экстракты шалфея сухостепного, близкие по эффекту к настою корня алтея лекарственного и превосходившие эффект настоев листьев мать-и-мачехи и травы душицы обыкновенной.

Антимикробную активность экстрактов определяли в отношении тест-микроорганизмов, рекомендованных ГФ XI (1987). Анализ результатов представлен в таблице 5.

Таблица 5

Антимикробная активность сухих экстрактов из надземной части Salvia tesquicola и листьев S. officinalis

Staphylococcus aureus Bacillus cereus Pseudomonas aeruginosa Escherichia coli Candida albicans

Экстракты Бс Бц Бс Бц Бс Бц Бс Бц Бс Бц

S. tesquicola

Водный 5 15 5 15 20 - 15 20 - -

Спиртовый 5 15 10 20 15 20 10 15 - -

S. officinalis

Водный 5 15 5 15 15 20 10 5 - -

Спиртовый 5 15 10 15 10 15 10 5 - -

Примечание. Минимальные концентрации (мг/мл) экстрактов, проявляющие активность: Бс - бакгериостатическую, Бц - бактерицидную. Прочерк означает отсутствие активности.

При микробной нагрузке 2000 клеток/мл в отношении грамположительных бактерий было выявлено бактерицидное действие экстрактов в разведениях 15 и 20 мг/мл, а бактериостатическое действие - в разведениях 5 мг/мл. В отношении грамотрицательных микроорганизмов минимальная ингибирующая рост концентрация для шалфея сухостепного составила 15 мг/мл, а для шалфея лекарственного - 10 мг/мл. Исследованные экстракты не проявляли антифунгальной активности в отношении Candida albicans при данных разведениях.

Сравнение фармакологических эффектов сухих экстрактов из надземной части шалфея сухостепного и листьев шалфея лекарственного представлено в таблице 6.

Таблица 6

Фармакологические эффекты сухих экстрактов из надземной части _Salvia tesquicola и листьев S. officinalis_

Эффекты Выраженность эффектов

Сухие экстракты из надземной части S. tesquicola Сухие экстракты из листьев S. officinalis

водный спиртовый водный спиртовый

Антигипоксический ++ + + +

Антиэкссудативный . ++ ++ + ++

Антипролиферативный. + ++ ++ +

Ранозаживляющий -н- ++ ++ +

Анальгезирующий (модель «уксуснокислых корчей») ++■ ++ + +

Анальгезирующий (тест «tail-flick») + + + ++

Влияние на гуморальный иммунитет ++ + + +

Влияние- на клеточный иммунитет ++ + + +

Влияние на снотворный эффект гексенала + + + ++

Муколитический ++ ++ + +

Примечание. + означает наличие слабовыраженного эффекта, ++ означает наличие сильно выраженного эффекта

2.4. Разработка методов стандартизации сырья «Шалфея сухостепного трава»

При разработке проекта ФСП на новый вид сырья «Шалфея сухостепного трава» по разделам «Внешние признаки цельного сырья», «Внешние признаки измельченного сырья» и «Микроскопия» проведен макро- и микроскопический анализ и выделены диагностические признаки сырья. Для установления нормативов качества сырья по разделу «Числовые показатели» разработана методика количественного определения суммы флавоноидов - и определены основные товароведческие показатели.

Для идентификации цельного и измельченного сырья диагностическое значение имеют следующие анатомические признаки: клетки эпидермиса верхней стороны листа - многоугольные и прямостенные, нижней стороны -более вытянутые; устьица диацитного и аномоцитного типов, в большем количестве на нижней стороне листа; волоски простые одноклеточные и многоклеточные, гладкие и с бородавчатой поверхностью; головчатые волоски с одно-трехклеточной ножкой и шаровидной одно-двухклеточной головкой; эфиромасличные железки с восьмиклеточной головкой, крупные, типичного

строения для яснотковых; для чашечки и венчика характерны многоугольные клетки эпидермиса с извилистыми стенками; волоски и эфиромасличные железки, подобные элементам листа; мелкие сосочковидные волоски. В мезофилле чашечки заметны мелкие призматические кристаллы оксалата кальция.

Для определения подлинности сырья предложены цветные качественные реакции на флавоноиды: цианидиновая проба и реакция с 2% спиртовым раствором хлорида алюминия.

Для количественного определения флавоноидов нами был использован метод дифференциальной спектрофотометрии с использованием комплексообразующего реактива - алюминия хлорида. Присутствие в надземной части шалфея сухостепного производных флавона, среди которых идентифицирован 7-0- Р^- глюкозид лютеолина (цинарозид), дало основание использовать при разработке методики ГСО этого соединения (ФС 42-3150-95). Проведено сравнительное изучение спектров поглощения водного и спирто-водных извлечений из надземной части шалфея сухостепного, а также спиртового раствора ГСО цинарозида в УФ и видимой областях с добавками хлорида алюминия. Продукты реакции водного, 40%, 70% и 95% спиртовых извлечений с хлоридом алюминия имели максимумы поглощения в области 400-455 нм. Спиртовой раствор комплекса стандартного образца цинарозида с хлоридом алюминия имел максимум поглощения при длине волны 425 нм, которая была взята в качестве рабочей.

При разработке методики количественного определения из травы шалфея сухостепного определяли значения следующих параметров: тип экстрагента (вода, 40% этиловый спирт, 70% этиловый спирт, 95% этиловый спирт); измельченность сырья (1, 2, 3, 5 мм); соотношение сырья и экстрагента (гидромодуль) (1:10,1:20,1:30,1:50,1:100); температурный режим (20 °С, 40°С, кипящая водяная баня); время экстракции (15, 30, 45, 60, 90, 120 минут); кратность экстракции (одно-, двух-, трех-, четырехкратная). Предложено два типа расчета содержания суммы флавоноидов - по калибровочному графику и с использованием раствора ГСО цинарозида в концентрации 10 мкг/мл.

Разработанная методика является воспроизводимой и достаточно простой в исполнении. Относительная ошибка методики составила 0,32%. Она включена в проект фармакопейной статьи предприятия (ФСП) на новое сырье «Шалфея сухостепного трава» и рекомендована для его стандартизации.

Для разработки проекта нормативной документации на сырье «Шалфея сухостепного трава» были изучены следующие показатели качества для 10 образцов сырья, собранных в 1999 - 2003 гг на территории Ростовской и Волгоградской областей: содержание суммы флавоноидов в пересчете на цинарозид, потеря в массе при высушивании, содержание золы общей и золы, нерастворимой в 10% кислоте хлористоводородной, измельченность сырья, наличие специфических (стеблей, частиц сырья, изменивших окраску и поврежденных вредителями) и неспецифических (минеральной и органической) примесей. Для определения рациональных способов заготовки и сроков

годности сырья было проведено сравнительное изучение содержания основной группы действующих веществ - флавоноидов - в образцах, собранных в разные годы и фазы развития растений. Наибольшее содержание флавоноидов отмечено в сырье, заготовленном в фазу бутонизации и цветения, которые и могут быть оптимальными сроками заготовки. В сырье, хранившемся более 3-х лет содержание флавоноидов наиболее низкое и составляет менее 3%, что позволяет установить срок хранения сырья - 3 года.

2.5 Определение ареала tesquicola и ресурсоведческая оценка вида

Для определения ареала tesquicola были использованы коллекции гербария Ботанического института им. В.Л. Комарова РАН и Санкт-Петербургского государственного университета, а также материалы, собранные во время экспедиций. Составлена точечно-контурная карта ареала 5. tesquicola на территории России и сопредельных государств бывшего СССР (рис. 12).

Рис. 12. Точечно-контурная карта ареала 5. tesquicola

Определение урожайности 5. tesquicola проводили методом модельных экземпляров на конкретной заросли в естественных условиях произрастания в Жирновском районе Волгоградской области на каменистых обнажениях, близ р. Медведица. Урожайность надземной части шалфея сухостепного составила

2933,3+372 кг/га в пересчете на воздушно-сухое сырье. Выход воздушно-сухого сырья из свежесобранного составляет 30%.

ВЫВОДЫ

1. В результате общего фотохимического анализа установлены основные группы действующих веществ надземной части Salvia tesquicola Klok. et Pobed., к которым относятся флавоноиды, фенолъные кислоты, аминокислоты и полисахариды.

2. Из надземной части S. tesquicola впервые выделены и идентифицированы 4 флавоноидных соединения: 7-О- p-D-глюкозид лютеолина (цинарозид), 7-О-рутинозид лютеолина (сколимозид), 7-О^-глюкуронид лютеолина и 7-О^-глюкуронид хризоэриола. Содержание суммы флавоноидов в фазы бутонизации и цветения является максимальным и составляет более 3,7%.

3. В составе комплекса фенольных кислот надземной части S. tesquicola содержится 10 фенольных кислот, среди которых методами хроматографии на бумаге и ВЭЖХ идентифицировали галловую, гентизиновую, хлорогеновую, ванилиновую, кофейную, сиреневую, вератровую, салициловую, n-кумаровую и n-гидроксибензойную кислоты. Установлено, что основными кислотами являются сиреневая, хлорогеновая, кофейная, салициловая и n-кумаровая кислоты. Общее содержание фенольных кислот составило 4,8 % в пересчете на абсолютно-сухое сырье.

4. Методами хроматографии на бумаге и ВЭЖХ-анализа идентифицированы 18 аминокислот: лейцин, фенилаланин, валин, метионин, тирозин, пролин, аланин, аспарагиновая и глутаминовая кислоты, лизин, цистеин, серии, аргинин, треонин, глицин, изолейцин, триптофан и гистидин. Причем, доминирующими являются тирозин, гистидин, пролин и триптофан. Общее содержание аминокислот в надземной части шалфея сухостепного составило 0,12% в пересчете на абсолютно-сухое сырье.

5. С помощью разработанного способа выделения полисахаридного комплекса из надземной части S. tesquicola установлено, что их содержание составляет 1,97 %. При этом, по органам полисахариды распределены неравномерно, в

листьях их содержится 3,12 %, в стеблях - 0,61 %, в цветках - 0,5 %. Основными мономерными единицами полисахаридного комплекса являются галактоза, рамноза, арабиноза, глюкоза и глюкуроновая кислота. Полисахариды шалфея сухостепного относятся к классу сложных галактанов, в составе которых присутствуют фрагменты, близкие по структуре к пектиновым веществам.

6. ЛД50 сухих водных и спиртовых экстрактов из надземной части шалфея сухостепного при внутрибрюшинном введении составляет от 1630+100 до 2820+250 мг/кг, что позволяет считать их малотоксичными.

7. В экспериментах на животных установлено, что сухие водные и спиртовые экстракты из надземной части шалфея сухостепного обладают выраженными

антигипоксическим, противовоспалительным, ранозаживляющим,

анальгезирующим и седативным эффектами. По сравнению с экстрактами из листьев шалфея лекарственного экстракты из надземной части шалфея сухостепного обладают более выраженными антигипоксическим, антиэкссудативным, иммуномодулирующим и муколитическим эффектами.

8. Установлены минимальные концентрации сухих экстрактов из надземной части шалфея сухостепного и листьев шалфея лекарственного, оказывающие бактерицидное и/или бактериостатическое действие на грамположительные и грамотрицательные микроорганизмы при микробной нагрузке 2000 клеток/мл. Антифунгальная активность экстрактов в отношении Candida albicans не обнаружена.

9. Разработаны методики качественного и количественного анализа суммы флавоноидов травы шалфея сухостепного, установлены основные макро- и микроскопические признаки подлинности сырья, а также показатели качества и нормативы для сырья. Результаты исследования использованы при разработке проекта ФСП на сырье «Шалфея сухостепного трава».

10. На основании составленной карты ареала S. tesquicola на территории России и сопредельных государств бывшего СССР возможна организация ресурсоведческих исследований по выявлению потенциально продуктивных угодий для организации промышленных заготовок сырья. Урожайность надземной части шалфея сухостепного в естественных условиях произрастания в Жирновском районе Волгоградской области составила 2933,3+372 кг/га в пересчете на воздушно-сухое сырье, а выход воздушно-сухого сырья из свежесобранного составил 30%.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Хайдукова Е.В. Антимикробная активность препаратов из надземной части шалфея сухостепного // 60-я Юбилейная открытая итоговая научная конференция студентов и молодых ученых Волгоградской медицинской академии: «Медицина в начале нового века: достижения и перспективы». Волгоград, 2002

2. Хайдукова Е.В., Коссиор Л.А., Теслов Л.С. Антимикробная активность экстрактов из надземной части шалфея сухостепного // Тез. докл. IX Российского национального конгресса «Человек и лекарство». М., 2002 г. С. 715.

3. Хайдукова Е.В., Лесиовская Е.Е., Теслов Л.С. Фармакологическое изучение сухих экстрактов из надземной части шалфея сухостепного // Тр. 67-ой научной сессии КГМО. Отд. мед.-биол. наук Центрально-Черноземного науч. центра РАМН. 2002.4.2. с. 131.

4. Хайдукова Е.В., Теслов Л.С. Изучение аминокислотного состава надземной части шалфея сухостепного // Тез. докл. IX Российского национального конгресса «Человек и лекарство». М., 2002 г. С. 715.

5. Хайдукова Е.В., Теслов Л.С. К определению подлинности надземной части шалфея сухостепного - Salvia tesquicola Klok. et Pobed. // Материалы -VI-Международного Съезда «Актуальные проблемы создания новых лекарственных препаратов природного происхождения». СПб., 2002. С. 318321.

6. Хайдукова Е.В., Теслов Л.С., Алифанов А.А. Фармакологическое изучение надземной части шалфея сухостепного - Salvia tesquicola Klok. et Pobed. // Материалы VI Международного Съезда «Актуальные проблемы создания новых лекарственных препаратов природного происхождения». СПб.,

2002. С. 528-531.

7. Адамова И.О., Хайдукова Е.В., Теслов Л.С. Изучение водорастворимого полисахаридного комплекса из надземной части шалфея сухостепного - Salvia tesquicola Klok. et Pobed. // Материалы VII Международного Съезда «Актуальные проблемы создания новых лекарственных препаратов природного происхождения» ФИТОФАРМ 2003. Санкт-Петербург - Пушкин, 2003. С. 497500.

8. Хайдукова Е.В., Лесиовская Е.Е., Теслов Л.С. Сравнительное фармакологическое исследование сухих экстрактов из надземной части Salvia tesquicola Klok. et Pobed. и из листьев S. officinalis L. // Растительные ресурсы,

2003. T.XXXIX, вып. 3. С. 122-133.

9. Хайдукова Е.В., Надеждин Д.В., Коссиор Л.А., Теслов Л.С. Антимикробная активность сухих экстрактов из надземной части Salvia tesquicola Klok. et Pobed. и из листьев S. officinalis L. // Растительные ресурсы, 2003. Т. XXXIX. вып. 3. С. 134-136.

10. Шешегова Е.В., Теслов Л.С. Флавоноиды надземной части шалфея сухостепного Salvia tesquicola Klok. et Pobed. // Растительные ресурсы, 2004. Т. ХХХХ. вып. l.C. 57-61.

Направахрукописи

ШЕШЕГОВА ЕЛЕНА ВИКТОРОВНА

ФАРМАКОГНОСТИЧЕСКОЕ И ФАРМАКОЛОГИЧЕСКОЕ ИЗУЧЕНИЕ НАДЗЕМНОЙ ЧАСТИ ШАЛФЕЯ СУХОСТЕПНОГО SALVIA TESQUICOLA

KLOK. et POBED.

15.00.02 — фармацевтическая химия, фармакогнозия 14.00.25 — фармакология, клиническая фармакология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата фармацевтических наук

ЛР № 021251 от 23.10.97. Подписано к печати 17.12.2003.

_Печать ризограф. Тираж 100. Заказ 497._

Санкт-Петербургская государственная химико-фармацевтическая академия Издательство СПХФА — член Издательско-полиграфической ассоциации вузов

Санкт-Петербурга 197376, Санкт-Петербург, ул. Профессора Попова, 14, тел. 234-15-23

Р - - 1 5 О

РНБ Русский фонд

2004-4 19332

Актуальность темы. В современной медицине лекарственные растения продолжают оставаться одним из перспективных источников получения эффективных лекарственных препаратов. Препараты растительного происхождения обладают более мягким действием, менее токсичны и проявляют широкий спектр фармакологического действия (Соколов, Замотаев, 1990).

Различные виды рода шалфей Salvia L. флоры России используются в народной медицине при различных заболеваниях, а S. aethiopis L. и S. officinalis L являются официнальными растениями. Шалфей лекарственный в диком виде на территории России не произрастает, но культивируется в специализированных хозяйствах на юге европейской части страны. Потребности в сырье этого растения удовлетворяются не полностью. Поиск заменителя этого сырья во флоре России достаточно актуален. Изучаемый нами вид - шалфей сухостепной Salvia tesquicola Klok. et Pobed. — распространен в европейской части бывшего СССР, во всех районах Кавказа, в Западной Сибири и в северозападной части Средней Азии, что делает его перспективным в ресурсоведческом отношении.

Несмотря на популярность этого вида шалфея в народной медицине, анализ данных литературы показал, что сведения о химическом составе и биологических свойствах его ограничены. Поэтому фармакогностическое и фармакологическое изучение надземной части шалфея сухостепного представлялось актуальным.

Диссертационная работа выполнена на кафедрах фармакогнозии и фармакологии Санкт-Петербургской государственной химико-фармацевтической академии в соответствии с научным направлением «Изыскание и изучение биологически активных веществ растительного, микробного и синтетического происхождения» и тематическим планом научно-исследовательских работ СПХФА по теме «Исследование лекарственных растений, перспективных для создания фитопрепаратов». Изучение антимикробного действия выполнено на кафедре микробиологии СПХФА под руководством заведующей Лаборатории биотехнологии к.б.н. Л.А. Коссиор, исследования с использованием методов газовой и высокоэффективной жидкостной хроматографии выполнены в лаборатории аналитических методов НИУ академии. Цель и задачи исследования

Целью настоящего исследования является фармакогностическое и фармакологическое изучение надземной части шалфея сухостепного. В задачи исследования входило:

1. Проведение общего фитохимического анализа с целью выявления основных групп действующих веществ.

2. Изучение компонентного состава доминирующих групп биологически активных соединений.

3. Определение острой токсичности и фармакологических эффектов сухих экстрактов из надземной части шалфея сухостепного в сравнении с экстрактами из листьев шалфея лекарственного.

4. Изучение антимикробной активности сухих экстрактов из надземной части шалфея сухостепного в сравнении с экстрактами из листьев шалфея лекарственного.

5. Определение нормативов качества изученного сырья и разработка проекта нормативной документации (ФСП) на сырье.

6. Рекогносцировочная ресурсоведческая оценка данного вида. Научная новизна. Из надземной части б*. 1е8цшсо1а были впервые выделены и идентифицированы 4 флавоноидных соединения - гликозиды лютеолина и хризоэриола: цинарозид, сколимозид, 7-0-Б-глюкуронид лютеолина и 7-0-0-глюкуронид хризоэриола. Установлено присутствие в траве шалфея сухостепного водорастворимых полисахаридов, определено их содержание, а также изучен мономерный состав. Определены качественный состав, а также содержание фенольных кислот и аминокислот надземной части шалфея сухостепного. В экспериментах на животных установлено, что сухие водные и спиртовые экстракты из надземной части шалфея сухостепного обладают низкой токсичностью, выраженными антигипоксическим, противовоспалительным, ранозаживляющим, анальгезирующим и седативным эффектами. В сравнении с экстрактами из листьев шалфея лекарственного они показали более выраженный антиэкссудативный, иммуномодулирующий и муколитический эффекты. В результате сравнительного изучения антимикробной активности сухих экстрактов из надземной части шалфея сухостепного и листьев шалфея лекарственного установлено сходство по бактерицидной и бактериостатической активности в отношении грамположительных и грамотрицательных микроорганизмов. Разработана методика количественного определения суммы флавоноидов в траве шалфея сухостепного.

Практическая значимость. Определены характеристики подлинности, показатели качества и их нормативы для сырья шалфея сухостепного. Результаты исследования использованы при разработке проекта ФСП на новый вид лекарственного сырья «Шалфея сухостепного трава», который рекомендуется для внедрения в медицинскую практику в качестве противовоспалительного и антимикробного средства. Составлена карта ареала шалфея сухостепного и проведено определение урожайности в естественных условиях произрастания в Волгоградской области (Жирновский район). Полученная ресурсоведческая характеристика вида свидетельствует об обеспеченности его сырьевой базы.

Основные положения, выносимые на защиту. 1. Компонентный состав основных групп биологически активных соединений: флавоноидов, фенольных кислот, аминокислот и полисахаридов надземной части шалфея сухостепного, а также их количественная оценка.

2. Сравнительная характеристика острой токсичности и фармакологических эффектов сухих экстрактов из надземной части шалфея сухостепного и листьев шалфея лекарственного.

3. Сравнительная характеристика антимикробной активности сухих экстрактов из надземной части шалфея сухостепного и листьев шалфея лекарственного.

4. Обоснование методов стандартизации и нормативов качества сырья «Шалфея сухостепного трава».

Апробация работы.

Основные положения диссертации доложены на:

• 67-ой научной сессии КГМО отделения медико-биологических наук Центрально-Черноземного научного центра РАМН (Курск, 2002 г.);

• IX Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 2002 г.).

• 60-ой Юбилейной открытой итоговой научной конференции студентов и молодых ученых Волгоградской медицинской академии: «Медицина в начале нового века: достижения и перспективы» (Волгоград, 2002).

• VI Международном Съезде «Актуальные проблемы создания новых лекарственных препаратов природного происхождения» (Санкт-Петербург, 2002).

• VII Международном Съезде «Актуальные проблемы создания новых лекарственных препаратов природного происхождения» ФИТОФАРМ 2003 (Санкт-Петербург - Пушкин, 2003).

Публикации. Основное содержание диссертации отражено в 10 научных статьях и тезисах.

Объем и структура диссертации. Работа изложена на 175 страницах машинописного текста, иллюстрирована 39 рисунками и 33 таблицами. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, главы, характеризующей материалы и методы исследований; а также 3 глав

выводы

1. В результате общего фитохимического анализа установлены основные группы действующих веществ надземной части Salvia tesquicola Klok. et Pobed., к которым относятся флавоноиды, фенольные кислоты, аминокислоты и полисахариды.

2. Из надземной части S. tesquicola впервые выделены и идентифицированы 4 флавоноидных соединения: 7-0-Р-0-глюкозид лютеолина (цинарозид), 7-О-рутинозид лютеолина (сколимозид), 7-O-D-глюкуронид лютеолина и 7-0-0-глюкуронид хризоэриола. Содержание суммы флавоноидов в фазы бутонизации и цветения является максимальным и составляет более 3,7%.

3. В составе комплекса фенольных кислот надземной части S. tesquicola содержится 10 фенольных кислот, среди которых методами хроматографии на бумаге и ВЭЖХ идентифицировали галловую, гентизиновую, хлорогеновую, ванилиновую, кофейную, сиреневую, вератровую, салициловую, гс-кумаровую и гс-гидроксибензойную кислоты. Установлено, что основными кислотами являются сиреневая, хлорогеновая, кофейная, салициловая и гс-кумаровая кислоты. Общее содержание фенольных кислот составило 4,8 % в пересчете на абсолютно-сухое сырье.

4. Методами хроматографии на бумаге и ВЭЖХ-анализа идентифицированы 18 аминокислот: лейцин, фенилаланин, валин, метионин, тирозин, пролин, аланин, аспарагиновая и глутаминовая кислоты, лизин, цистеин, серин, аргинин, треонин, глицин, изолейцин, триптофан и гистидин. Причем, доминирующими являются тирозин, гистидин, пролин и триптофан. Общее содержание аминокислот в надземной части шалфея сухостепного составило 0,12% в пересчете на абсолютно-сухое сырье.

5. На основании разработанного способа выделения полисахаридного комплекса из надземной части S. tesquicola установлено, что содержание полисахаридов составляет 1,97 %. При этом, по органам они распределены неравномерно, в листьях их содержится 3,12 %, в стеблях - 0,61 %, в цветках - 0,5 %. Основными мономерными единицами полисахаридного комплекса являются галактоза, рамноза, арабиноза, глюкоза и глюкуроновая кислота. Полисахариды шалфея сухостепного относятся к классу сложных галактанов, в составе которых присутствуют фрагменты, близкие по структуре к пектиновым веществам.

6. ДЦ5о сухих водных и спиртовых экстрактов из надземной части шалфея сухостепного при внутрибрюшинном введении составляет от 1630+100 до 2820+250 мг/кг, что позволяет считать их малотоксичными.

7. В экспериментах на животных установлено, что сухие водные и спиртовые экстракты из надземной части шалфея сухостепного обладают выраженными антигипоксическим, противовоспалительным, ранозаживляющим, анальгезирующим и седативным эффектами. В сравнении с экстрактами из листьев шалфея лекарственного экстракты из надземной части шалфея сухостепного обладают более выраженными антиэкссудативным, иммуномодулирующим и муколитическим эффектами.

8. Установлены минимальные концентрации сухих экстрактов из надземной части шалфея сухостепного и листьев шалфея лекарственного, оказывающие бактерицидное и/или бактериостатическое действие на грамположительные и грамотрицательные микроорганизмы при микробной нагрузке 2000 клеток/мл. Антифунгальная активность экстрактов в отношении Candida albicans не обнаружена.

9. Разработаны методики качественного и количественного анализа суммы флавоноидов травы шалфея сухостепного, установлены основные макро- и микроскопические признаки подлинности сырья, а также показатели качества и нормативы для сырья. Результаты исследования использованы при разработке проекта ФСП на сырье «Шалфея сухостепного трава».

10. На основании составленной карты ареала & {еядшсо1а на территории России и сопредельных государств бывшего СССР возможна организация ресурсоведческих исследований по выявлению потенциально продуктивных угодий для организации промышленных заготовок сырья. Урожайность надземной части шалфея сухостепного в естественных условиях произрастания в Жирновском районе Волгоградской области составила 2933,3+372 кг/га в пересчете на воздушно-сухое сырье, а выход воздушно-сухого сырья из свежесобранного составил 30%.

4.10. Заключение

Сравнительное фармакологическое изучение сухих экстрактов (водных и спиртовых) из надземной части шалфея сухостепного S. tesquicola и из листьев шалфея лекарственного S. officinalis позволяют отметить следующее. Все изучаемые экстракты обладали низкой токсичностью, выраженными антигипоксическим, противовоспалительным, ранозаживляющим, анальгезирующим и седативным эффектами. В сравнении с сухими экстрактами из листьев шалфея лекарственного сухие экстракты из надземной части шалфея сухостепного обладали более выраженными антиэкссудативным, иммуномодулирующим и муколитическим эффектами. Сравнительное изучение антимикробной активности сухих экстрактов, полученных на основе водных и спиртовых (70%-ный этанол) извлечений, из надземной части S. tesquicola и из листьев S. officinalis в отношении Staphylococcus aureus, Bacillus cereus, Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli не выявило у них значительных различий. Не обнаружена бактерицидная активность в отношении Р. aeruginosa у сухого экстракта (водного) из надземной части S. tesquicola. Исследованные сухие экстракты не проявляли антифунгальной активности в отношении тест-культуры Candida albicans. Перспективно дальнейшее изучение экстрактов из надземной части шалфея сухостепного в качестве заменителя препаратов из листьев шалфея лекарственного.

ГЛАВА 5. Разработка методов стандартизации «Шалфея сухостепного трава», составление карты ареала и определение урожайности шалфея сухостепного

5.1. Разработка методов стандартизации сырья При разработке проекта ФСП на новый вид сырья «Шалфея сухостепного трава» по разделам «Внешние признаки цельного сырья», «Внешние признаки измельченного сырья» и «Микроскопия» проведен макро- и микроскопический анализ и выделены диагностические признаки сырья. Для установления нормативов качества сырья по разделу «Числовые показатели» разработана методика количественного определения суммы флавоноидов и определены основных товароведческие показатели.

5.1.1. Морфологические диагностические признаки сырья При анализе образцов сырья шалфея сухостепного, собранных в фазу цветения на территории Волгоградской и Ростовской областей, установлены следующие внешние признаки сырья:

Цельное сырье. Сырье представлено цельными и частично измельченными облиственными цветущими цветоносными стеблями длиной до 40 см, а также листьями, стеблями, цветками и бутонами. Стебель четырехгранный, опушенный. Листья простые, яйцевидно-продолговатые, 3-7 см длиной и 1-3 см шириной, морщинистые, густо опушенные; верхние стеблевые нередко очень широкие, округлые, длинно заостренные на верхушке и крупно острозубчатые по краям. Нижняя поверхность листа мелкоячеистая из-за густой сети мелких жилок, среди которых выделяют 3-4 крупные боковые жилки. Прицветные листья длинно заостренные, но нередко встречаются округлые, с коротким заострением, по краям длинно белореснитчатые, длиннее чашечки, фиолетовые, редко нижние зеленые. Соцветия прямые, с короткими или длинными ветвями, часто доходящие до верхушки, состоящие из мутовок

14 - 30). Цветки на белоопушенных цветоножках. Чашечка двугубая, рассечена на 1/2 или 1/3 длины, опушена длинными волосками; нижняя губа длиннее верхней, ворсинчато опушенная, верхняя губа округлая, с тремя сближенными зубчиками, средним более коротким, нижняя с двумя продолговатыми, заостренными, прямо торчащими зубцами; венчик — 8-12 мм длиной, двугубый; верхняя губа слабо серповидно изогнутая, с короткими белыми волосками на спинке и на верхушке; средняя лопасть нижней губы венчика округлая, слабо чашевидно углубленная; столбик немного выдается из верхней губы, лопасти рыльца почти одинаковые; тычинки 2, передние. Сверху листья светло-зеленого цвета, снизу -серовато-зеленого, окраска стеблей серовато-зеленая; чашечка - светло-зеленого, а венчик - сине-фиолетового цвета. Запах слабо ароматный. Вкус горьковато-пряный.

Измельченное сырье. Кусочки листьев, стеблей, цветков, цветоносов и бутонов, проходящих сквозь сито с отверстиями диаметром 7 мм. Окраска серовато-зеленая с вкраплениями сине-фиолетового цвета. Запах ароматный. Вкус горьковато-пряный.

5.1.2. Анатомические диагностические признаки сырья При рассмотрении листа с поверхности видны клетки эпидермиса верхней стороны - многоугольные и прямостенные (рис. 24), нижней стороны - более вытянутые (рис. 25). Устьица диацитного и аномоцитного типов, более многочисленные на нижнем эпидермисе.

Рис. 25. Эпидермис нижней стороны листа

Примечание. 1 - простые волоски, 2 - устьица, 3 - эфиромасличные железки, 4 - головчатые волоски, 5 - клетки эпидермиса.

На обеих сторонах листа характерно наличие трихом. Встречаются простые волоски одноклеточные с утолщенными стенками и многоклеточные, толстостенные двух-трехклеточные волоски с бородавчатой поверхностью, часто изогнутые. Простые волоски в основании не имеют розетки. Головчатые волоски состоят из одно-трехклеточной ножки и шаровидной одно-двухклеточной головки, лучше заметны по краю и по жилкам листа. Эфиромасличные железки с восьмиклеточной головкой, крупные, типичного строения для яснотковых.

Клетки эпидермиса стебля имеют вытянутую форму с прямыми стенками. Встречаются в основном короткие двухклеточные простые волоски и головчатые волоски с одноклеточной головкой на короткой одноклеточной ножке (рис. 26).

Примечание. 1 - простые волоски, 2 - головчатые волоски, 3 - клетки эпидермиса.

На поперечном срезе стебля в его верхней и средней частях обнаружено, что он имеет пучковое строение (рис. 27). Пучки открытые коллатеральные, располагаются по кругу. В ребрах стебля — пучки больших размеров. В основании (на расстоянии 3 см от земли) стебель имеет непучковое строение (рис. 28). Уголковая колленхима в ребрах стебля ярко выражена, состоит из нескольких рядов клеток. Первичная кора имеет трехслойное строение (состоит из экзодермы, мезодермы и эндодермы). Под эндодермой расположена склеренхима перициклического происхождения, которая окрашивается реактивом на одревеснение (флороглюцином). Лубяная часть представлена ситовидными трубками с клетками-спутницами и клетками лубяной паренхимы. Камбий имеет четкую линию клеток, вытянутых в тангентальном направлении. Сосудистые элементы древесины располагаются правильными рядами, чередуясь с рядами клеток либриформа. Сердцевина состоит из крупных живых паренхимных клеток и занимает 2/3 объема поперечного среза стебля.

Рис. 27. Поперечный срез верхней и средней части стебля Примечание. 1 - уголковая колленхима, 2 — эндодерма, 3 - склеренхима, 4 -пучки, 5 - флоэма, 6 - камбий, 7 - ксилема, 8 - сердцевина. 2 3 4 5

Рис, 28. Поперечный срез основания стебля

Примечание. 1 - уголковая колленхима, 2 - эндодерма, 3 - склеренхима, 4 флоэма, 5 - камбий. 6 - ксилема, 7 - сердцевина.

При микроскопическом исследовании внешней и внутренней поверхности чашелистиков обнаружено, что клетки эпидермиса имеют извилистые стенки. Встречаются короткие одноклеточные и многоклеточные простые и головчатые волоски, эфиромасличные железки, подобные элементам листа, а также сосочковидные волоски. В мезофилле заметны мелкие призматические кристаллы оксалата кальция (рис. 29).

Ж-- 1

Рис. 29. Эпидермис зубца чашечки

Примечание. 1 - простые волоски, 2 - головчатые волоски, 3 - клетки эпидермиса, 4 - сосочковидные волоски, 5 - эфиромасличные железки, 6 -призматические кристаллы оксалата кальция.

Клетки верхнего и нижнего эпидермиса венчика имеют сходное строение, они - многоугольные, с извилистыми стенками. Встречаются многоклеточные гладкие простые волоски, головчатые волоски, состоящие из одно-трехклеточной ножки и шаровидной одно-двухклеточной головки, мелкие сосочковидные волоски и эфиромасличные железки (рис. 30).

Рис. 30. Эпидермис венчика

Примечание. 1 - простые волоски, 2 - эфиромасличные железки, 3 - клетки эпидермиса, 4 - головчатые волоски, 5 - сосочковидные волоски.

Таким образом, для идентификации сырья травы шалфея сухостепного диагностическое значение имеют следующие анатомические признаки: клетки эпидермиса верхней стороны листа - многоугольные и прямостенные, нижней стороны - более вытянутые; устьица диацитного и аномоцитного типов, в большем количестве на нижней стороне листа; волоски простые одноклеточные и многоклеточные, гладкие и с бородавчатой поверхностью, в основании не имеют розетки; головчатые волоски из короткой одно-трехклеточной ножки и шаровидной одно-двухклеточной головки; эфиромасличные железки с восьмиклеточной головкой, крупные, типичного строения для яснотковых; для элементов цветка характерны многоугольные клетки эпидермиса с извилистыми стенками; волоски и эфиромасличные железки, подобные элементам листа; сосочковидные волоски, а также мелкие призматические кристаллы оксалата кальция в мезофилле чашечки.

5.1.3. Разработка методики количественного определения суммы флавоноидов в надземной части S. tesquicola

По результатам фитохимического анализа установлено, что одной из основных групп биологически активных веществ в надземной части шалфея сухостепного являются флавоноиды. Они переходят в полиэкстракты, для которых выявлена фармакологическая активность. Кроме того, эта группа соединений удобна для стандартизации сырья.

Для количественного определения флавоноидов нами был использован метод дифференциальной спектрофотометрии, который в настоящее время чаще всего применяется при анализе флавоноидсодержащего сырья (Государственная Фармакопея СССР., 1989). Присутствие в надземной части шалфея сухостепного производных флавона, среди которых идентифицирован 7-0-(3-D- глюкозид лютеолина (цинарозид), дало основание при разработке методики определения содержания суммы флавоноидов в сырье использовать ГСО этого соединения (Фармакопейная., 1995).

На первом этапе было проведено сравнительное изучение спектров поглощения водного и спирто-водных извлечений из надземной части шалфея сухостепного, а также спиртового раствора ГСО цинарозида в УФ и видимой областях с добавками хлорида алюминия. Растворами сравнения служили исходные извлечения. Продукты реакции водного, 40%, 70%) и 95% спиртовых извлечений с хлоридом алюминия имели максимумы поглощения при 425, 440, 455 и 400 нм соответственно. Спиртовой раствор комплекса стандартного образца цинарозида с хлоридом алюминия имел максимум поглощения при 425 нм (рис. 31). В качестве рабочей была выбрана длина волны 425 нм.

360 375 390 405 420 435 450 465 480 495 510 525

Длина волны, нм

-♦-1 -л-2 -*-3 4 —5 Рис. 31. Дифференциальные УФ-спектры различных извлечений из надземной части Salvia tesquicola и раствора ГСО цинарозида

1 - спектр раствора ГСО цинарозида в 95% этаноле,

2 - спектр водного извлечения,

3 -спектр 40% спиртового извлечения,

4 - спектр 70% спиртового извлечения,

5 — спектр 95% спиртового извлечения.

Определение концентрации суммы флавоноидов в сырье проводили по калибровочной кривой, построенной с использованием стандартного образца цинарозида в концентрации от 1 до 20 мкг/мл (рис. 32).

1,0 2,5 5,0 7,5 10,0 12,5 15,0 17,5 концентрация ГСО цинарозида, мкг/мл

20,0

Рис. 32. Калибровочный график для определения концентрации флавоноидов в пересчете на цинарозид методом дифференциальной спектрофотометрии.

Построение калибровочного графика. 0,025 г (точная навеска) ГСО цинарозида, предварительно высушенного до постоянной массы при температуре 100-105 °С, помещали в мерную колбу вместимостью 25 мл, растворяли в небольшом количестве 40% этанола и доводили до метки тем же растворителем - раствор А. 5 мл раствора А переносили в мерную колбу вместимостью 200 мл и доводили 40% этанолом до метки — раствор Б. Отбирали по 1; 2,5; 5; 7,5; 10; 12,5; 15; 17,5; 20 мл раствора Б в мерные колбы вместимостью по 25 мл, прибавляли по 0,5 мл 2% раствора хлорида алюминия в 95% спирте и доводили до метки 40% этанолом. Смеси выдерживали при комнатной температуре в течение 30 мин, после чего определяли оптическую плотность растворов на спектрофотометре при длине волны 425 нм в кювете с толщиной слоя 10 мм. В качестве раствора сравнения использовали 40% этиловый спирт.

При подборе условий экстракции суммы флавоноидов из травы шалфея сухостепного определяли значения следующих параметров:

- экстрагент (вода, 40% этиловый спирт, 70% этиловый спирт, 95% этиловый спирт);

- измельченность сырья (1, 2, 3, 5, 7 мм);

- соотношение сырья и экстрагента (гидромодуль) (1:10, 1:20, 1:30, 1:50, 1:100);

- температурный режим (20 °С, 40°С, кипящая водяная баня);

- время экстракции (15, 30, 45, 60, 90, 120 минут);

- кратность экстракции (одно-, двух-, трех-, четырехкратная);

Результаты экспериментов по подбору параметров экстракции проведены в трехкратной повторности и представлены на рисунках 33-38 и в таблицах 25-30.

При экстрагировании травы шалфея сухостепного различными растворителями максимальное содержание суммы флавоноидов отмечали при использовании в качестве экстрагента 40% этилового спирта, минимальный - при экстракции 96% этиловым спиртом (табл. 25, рис. 33).

Поэтому в последующей серии экспериментов в качестве экстрагента был выбран 40% этанол.

При исследовании степени измельченности сырья наибольшее содержание флавоноидов в извлечениях установлено при размере частиц, проходящих сквозь сито с отверстиями диаметром 1 мм (табл. 26, рис. 34). Исходя из этого, для количественного определения суммы флавоноидов выбран именно этот размер частиц сырья.