Автореферат и диссертация по фармакологии (15.00.02) на тему:Разработка методов анализа с стандартизация новых соединений, производных гамма-аминомасляной кислоты

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ И МЕДИЦИНСКОМ ПРОЛШШЛЕННОСТИ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

Пермский фармацевтический институт

На правах рукописи

Для служебного пользования Экз. №_2 О

ДУБОВИК Вера Александровна

РАЗРАБОТКА МЕТОДОВ АНАЛИЗА И СТАНДАРТИЗАЦИЯ НОВЫХ СОЕДИНЕНИЙ, ПРОИЗВОДНЫХ ГАММА-АМИНОМАСЛЯНОЙ КИСЛОТЫ

15.00.02 — фармацевтическая химия и фармакогнозия

Автореферат диссертации на соискание ученой степенл кандидата фармацевтических паук

Пермь — 1994

Работа выполнена на кафедре фармацевтической химии Пермского фармацевтического института

Научный руководитель: кандидат фармацевтических наук, доцент Г.И.Ярыгина

Официальные оппоненты: доктор фармацевтических наук, Профессор А.И.Сичко

кандидат фармацевтических наук, доцент Ю. А.Хомов

Ведущая организация: Санкт-Петербургский химико-фармацевтический институт

Защита диссертации состоится 31 января 1995 года на заседании специализированного совета К 084.70.0Г при Пермском фармацевтическом институте по адресу: 614600 г.Пермь, ул.Ленина,48

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Пермского фармацевтического института

Автореферат разослан 30 декабря 1994 г.

Ученый секретарь специализированного совета К 084.70.01

кандидат фармацевтических наук

Е.В.Метелева

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА Р;\БОТЫ

Актуальность теш. Одной из главных задач в фармации является создание и освоение производства новых высокоэффективных лекарственных средств, в том числе я различных психотропных препаратов. В последние года большой интерес вызывает группа ноотропов. Это вещества, активирующие высшую интегративную деятельность мозга, восстанавливающие нарушенные мнестические (т.е связанные с памятью) и мыслительные функции, снияающие неврологические дефициты, повышающие резистентность организма к экстремальным воздействиям, оказывающие анткгяпоксичесхое действие. Ноотропше средства широко используются в разных областях медицины, в том числе в гериатрической и педиатрической практике. Однако, препаратов, отвечающих перечисленным вше требованиям, не существует. Они обладают лишь отдельными элементами ноотропной активности. Поэтому поиск и внедрение новых эффективных средств данной группа остается актуальной проблемой.

В этой связи значительный интерес исследователей занимают производные гамма-аминомасляной кислота (ГАЧК), обладающие не только ноотропкым, но и седативннм, гипотензивным, противосудорокным, мио-релаксантннм, анальгетическим и некоторыми другими ввдами действия. Как препараты метаболической природы производные ГАМК характеризуются безвредностью, малой выраженностью побочных эффектов, отсутствием аллергизируюшего влияния.

Сотрудниками кафедры органической химии Санкт-Петербургского педагогического университета им. А.И.Герцена под руководством заслуженного деятеля науки России проф.Перекалила В.В. и лаборатории органического синтеза НИИ лекарственных средств г.Купавна Московской области под руководством зав.лаб.органического синтеза к.х.н. Плешакова М.Г., а также кафедры фармакологии Волгоградской меди-

шшской академии под руководством заслуженного деятеля науки России, проф. Ковалева Г.В. в результате многолетней совместной работы были найдены новые лекарственные вещества - гаадюхсин, мефе-бут, карфвдон и пикамклон-кислота, обладающие оригинальным фармакологическим действием.

Целью работы было проведение исследований, направленных на разработку способов опенки качества и стандартизации новых активных соединений ноотропного и гипотензивного действия и создание на этой основе проектов Временных фармакопейных статей. Для этого необходимо было решить следующие задачи: ,

- изучить физико-химические свойства гаммоксина, мефебута, карфедона и пикамилон-кислоты,

- разработать методики их идентификации,

- разработать способы оценки чистоты соединений,

- разработать методики количественного определения гаммоксина, мефебута, карфедона и пикамилон-кислоты в субстанции и в лекарственных формах, а также в сыворотке крови,

- изучить устойчивость субстанции и лекарственных форм при хранении, установить сроки годности.

Научная новизна. Впервые проведено комплексное изучение физико-химических свойств новых соединений ноотропного и гипотензивного действия - гаммоксина, мефебута, карфедона и пшсамилон-кисло-ты.

Исследована возможность использования ряда химических и современных инструментальных методов для доказательства подлинности и количественного определения данных соединений в субстанции и в лекарственных формах.

Установлено ;'роматографическое поведение веществ в тонких

слоях сорбента, в условиях газожвдкостной,высокоэффективной жидкостной хроматографии.

Изучена стабильность субстанций и лекарственных форм соединений в процессе хранения в естественных условиях и при повышенной температуре.

Выявленные физико-химические свойства веществ, предложенные способы анализа способствуют дальнейшему развитию химии производных гамма-аминоиасляной кислоты.

Практическая значимость. На основе комплекса химических и инструментальных методов разработаны методики доказательства под-, лииности гаммоксина, мефебута, карфедона и пикамнлон-кислоты в субстанции и в лекарственных формах.

Стандартизированы показатели и нормы качества данных соединений.

Предложены методики определения посторонних примесей с использованием методов ТСХ и ГОН.

Разработаны методики тигриметрнческого, спакгрофотомвтркчес-кого определения соединений в субстанции и в лекарственных формах.

• Определены условия выделения мефебута и пихамилон-кислоты из плазмы крови и предложены методики их количественной оценки в плазме с использованием газожидкостной и высокоэффективной жидкостной хроматографии.

Установлены сроки годности мефебута, гаммоксина, карфедона и пикамилон-кислоты в субстанции и в таблетках в условиях естественного хранения и методом "ускоренного старения" при повышенных температурах.

Внедрение результатов работы. Разработаны и представлены в Фармакологический комитет ИЗ и Ш РФ проекты Временных фармакопейных статей на гаммоксин, таблетки гаммоксина 0,25, покрытые обо-

лочксй (письмо фк мз и ш Pi> а х-ч - ziaiitmo cm се.a.so); карфедон, таблетки карфодона 0,25 (письмо ФК МЗ и МП РФ J6 21115/413 от 08.04.94).

Подготовлены к представлении проекты ВФС на мефебут, таблетки мефебута 0,3, пикамилон-кислоту, таблетки пикамилон-кислоты

0.05..

Апробация работы. Результаты и основные положения работы доложены и обсуждены на 47-48-ой научной конференции Пермского фармацевтического института (1990-91 г.г.), межкафедральном семинаре Пермского фарминститута (1991 г.), межвузовской научно-практической конференции, г.Пермь (1993 г.).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 5 работ.

Предложения, выдвигаемые на защиту.

1. Использование комплекса химических и инструментальных методов для подтверждения подлинности мефебута, гамыоксина, карфедона и пикамилон-киолотц.

2. Применение разработанного варианта хроматографии в тонких слоях сорбента для определения чистоты данных соединений.

3. Методики титриштрического определения мефебута, гаммоксина, карфедона и ликакилон-кислоты в субстанции и в лекарственных формах.

4. Методики спектрофотометрического определения соединений в таблетках.

5. Возможность использования ВЭЖХ для определения чистоты мефобу-та и карфедона, пикам¡шок-кислоты в плазме крови и в таблетках.

G. Методика определения мефебута в плазме крови газохроматографи-ческим методом.

7. Результаты исследований по установлении сроков годности субстанций и .лекарственных форм мефебута, гаммоксина, карфедона и

пикамилон-кислотн.

Объем и структура диссертация. Диссертация изложена на страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, четырех глав экспериментальных исследований, общях выводов, списка литературы и приложения. Работ содержит 43 таблицы, 23 рисунка. Список литературы включает 152 источника, из них 41 на иностранных языках.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Гаммокспн представляет собой гидрохяорид 4-ашно-З-гидрокси-

3-фенилбутановой кислоты; мефебут - гидрохлорид метилового эфира

4-амино-3-фенилбутановой кислота; карфедон - 1-(4-<ренш1-2-пирро-лидон) ацетамиц. Пикамилон-кислота - это // -(ниютиноил)-4-а.мино-бутановая кислота.

Изучаема соединения отличаются друг от друга по структуре и физико-химическим свойствам, что позволило выявить некоторые закономерности "структура-свойство" в ряду производных ГАМК.

Физические и химические свойства соединений., способы идентификации

Исследование физических свойств соединений показало, что по внешнему виду они представляют собой белые кристаллические порошки, гаммоксин и карфедон могут иметь слегка желтоватый, а пикамилон-кислота сероватый оттенок, без запаха, горького вкуса.

Растворимость соединений проверяли в 13-ти различных по природе растворителях. Полученные результаты показали, что все вещества линейной структуры (гаммоксин, мефебут, пикамилон-кислота) лучшо растворим в диголярша растворителях с высоким значением диэлектрической проницаемости (£.> 20): воде, этаноле, ДМФА.что

свидетельствует о полярном характере соединений, причем растворимость падает в раду мефебут-гаммоксин-пшсачилон-кислота. Вещества линейной структуры хуже растворимы в хлороформе, ацетоне, эфире. В этих растворителях лучке растворяется пикамилон-кислота, что полностью согласуется со строением соединений: мефебут и гаммоксин являются солями, а пикамвлон-кислота - свободной кислотой.

Карфедон, имевший циклическую структуру, легче растворим в ДМ5А, хлороформе, там в воде и в спиртах, что, предположительно, можно объяснить образованием водородных связей мевду амвдными группами молекул вещества.

Все-соединения практически нерастворимы в аполярных, апротон-ных растворителях: бензоле, толуоле, циклогексане.

Температура плавленая препаратов различна и падает в ряду пикач илон-кисло та, мефебут, гаммоксин, карфедон (табл.1).

Реакция среды водных растворов соединений также обусловлена их строением: у гаммоксина (2,0-2,3) ионизацией карбоксильной группы и гидролизом соли, мефабута (3,5-4,0) - гидролизом соли, образованной слабым органическим основанием и хлористоводородной кислотой, пикамилон-кислоты (4,7-4,8) ионизацией по карбоксильной группе и третичному атому азота, у карфедона реакция среды нейтральная, т.к. соединение не содержит групп кислотного или основного характера.

Предложен ряд других показателей, нормирующих качество соединений: прозрачность и цветность раствора, потеря в массе при высушивании,.предельное содержание общих примесей (табл.1), которые определялись по общим методикам, описанным в ГФ XI, вып.1.

Показатели качества субстанций исследуемых соединений

Показатель качества Гаммоксин Мефебут Карфедон Пшсамилон-кислота

Температура плавления,°С 168-172 с 170-172 130-133 209-211

разложени-

ем

р£Г, 1% водный раствор 2,0-2,3" 3,5-4,0 5,0-6,8 4,7-4,8

Потеря в массв при

высушиваний не бол е е 0,5%

Сульфатная зола и тя- не более должна выдерживать испы-

желые металлы тание на тяжелые металлы (не более

О.ООЙ в препарате)

Обше примеси

хлориды - не более не более

0,02$ 0,02£

сульфаты ■ - не более

0,1%

В качественном анализе исследуемых соединений использованы свойства функциональных груш: карбоксильной, амвдной, сложно-эфирной, первичной алифат;пескоЯ аминогруппы, феншгвного радикала, пиридинового цикла. Для доказательства подлинности соединений в субстанция и в таблетках предложены реакции:

- окислительного дезачинированкя нингвдрином (мефебут, гашок-син, пика'лило¡г-хислота);

- солеобразования с меди (П) сульфатом (гаммоксин, пккамилон-кислота);

- гвдролсамсзая реакция (мефебут, карфедон);

- реакция щелочного гидролиза (карфедон);

- электрофильного замещения о формальдегидом в среда концентрированной серной кислоты (гаммоксин, мэфебут, карфедон);

- с лимонной кислотой в уксусном ангидриде (пикамилон-кисло-

та);

- комплексообраэования с меди (П) сульфатом и аммония роданидом (пикамилон-кислота);

- доказательство хлорид-иона (гаммоксин, мефебут).

Получены и проанализированы Ж- и УФ-спектры исследуемых соединений.

В ИК-спектре мефебута присутствует интенсивная широкая полоса поглощения в области 3000-2900 см-1, обусловленная валентными

колебаниями -А/Нз группы, голоса поглощения в области 1620 см ,

+

обусловленная деформационными колебаниями -МН^ группы, а также полоса поглощения сложно-эфирного карбонюа в области 1715

В ИК-спектре гаммоксина наблвдается полоса поглощения малой интенсивности ассоциированного спиртового гидроксила в области-3325 сы"^. В отличие от мвфебута валентные колебания группы проявляются совместно с валентными колебаниями гидроксила карбоксильной группы в виде уширенной полосы в области 3200-3000 см"*, что, по-видимому, связано с наличием меж- или внутримолекулярных водородных связей между карбоксильной и аминогруппами. В спектре сохраняется полоса поглощения в области 1610 см-*, обусловленная деформационными колебаниями группы - ЯНд, а полоса поглощения карбоксильной группы наблвдается в низкочастотной области 1720см-} что также свидетельствует об ее участии в образовании водородных связей.

В ИК-спектре карфедона присутствует две полосы поглощения в области 3480 см-"'' и 3420 см~^, обусловленные валентными колебания-

ми незамеченной аминогруппы к ушярвшая полоса поглощения в области 1680-1700 см-1, обусловленная валентными колебаниями двух амвд-ных карбонилов.

КК-сгоктры соединений однозначно определяют их индивидуальность и могут быть рекомендованы для идентификации препаратов.

УФ-спектрн снята в диапазоне 200-280 нм; в качестве растворителя использовали воду, этанол, растворы хлористоводородной кислоты {0,01 ыожъ/л) и натрт гадроксгща' (0,01 моль/л),.

Поглощение гаммоксияа, мефебута, карфедояа в УФ-области обусловлено «Я1"-» У* переходами бензольного хромофора; в спектрах имеются четко выраженные экстре;луш в области длин волн 250-258 нм. Растворители не оказывают существенного влияния на характер спектра.

УФ-спектр пикамилон-кислоты связан с 3 —<57'* переходами пиридинового цикла и характеризуется наличием полосы средней интенсивности в более длинноволновой части спектра (Лщдх = 262 нм), которая в водном и щелочном растворах наблюдается в вадв плеча. В растворе хлористоводородной кислоты (0,01 моль/л) происходит протони-рование азота пиридинового цикла, при этом наблвдается сильный гиперхромный эффект с сохранением Ашд* и появление четко выраженного экстремума.

По УФ-спектрам соединений рассчитаны оптические характеристики: удельный и молярный коэффициенты поглощения, полуширина полосы поглощения, фактор асимметрия, интегральная интенсивность, сила осциллятора, момент электронного перехода, дающие более полное представление о поглощении веществ и позволяющие различать вещества с близкой химической структурой.

Титрит'отрические методы анализа

Псе изучаемые соединения, кроме карфедона, обладают достаточ-

но выраженными кислотно-основными свойствами, поэтому представляло интерес определить константы их ионизации. С этой целью использовали лотенциометрическое титрование по известным методикам. Полученные результаты показали, что гаммокскн ведет себя, как типичная аминокислота, иыэет две константы ионизации рк| = 3,67 и

о

рКд = 8,99, но его кислотные и основные свойства немного снижены по сравнении с другими алифатическими аминокислотами, что монет быть объяснено влиянием фенильного радикала и оксигруппы.

о

Пикамилон-кислота проявляет слабые основные (рК^ = 5,08) и средние кислотные (рК* = 3,50) свойства, ведет себя как амфотерное соединение.

рКа мефабута (9,23) объясняется ионизацией аминогруппы, которая проявляет достаточно сильные основные свойства.

Поскольку все соединения содержат группы основного характера, была исследована возможность применении метода неводного титрования в среде ледяной уксусной кислоты.

Анализ полученных данных (табл.2) позволяет сделать вывод, что метод дает достаточно правильные и воспроизводимые результаты при титровании мефебута и пикамилон-кислоты, ошибка определения различных серий соединений не превышает - 0,55^. Титрование мефе-бута необходимо проводить по методике с добавлением раствора ртути (П) ацетата, т.к. определение в среде уксусного ангидрида невозможно из-за адаптирования соединения по аминогруппе.

Заниженные результаты при анализе гаммоксина можно объяснить осаждением вещества, вероятно,в ввде ртутного соединения, т.к. после добавления раствора ртути (П) ацетата выпадает осадок.Титрование карфедона не представляется возможным: изменение окраски индикатора наблвдаатся при добавлении первых капель титранта.

Результаты количественного определения изучаемых соединений методом негодного титрования

Вещество № серии %% «X и

Гаммоксин 26.10.90 82,91 1,750 4,87 ± 5,88?

Мефебут 03.10.90 99,27 0,089 ' 0,25 £ 0,25$

06.11.90 99,84 0,093 0,26 £ 0,26$

09.12.90 99,51 0,148 0,41 £ 0,41$

Пикамилон- 20.01.92 99,50 0,065 0,18 £ 0,18$

кислота 18.02.92 99,49 0,117. 0,33 £ 0,33$

18.03.92 99,61 0,198 0,55 ± 0,55$

Карфедон 20.05.92 - - - -

Наличие групп кислотного характера позволило использовать алкалиметрическкй метод. Первоначально проводили титрование о по-тенциометрическим определением точки эквивалентное™, используя систему электродов: стеклянный - хлорсерабряный. Как показали результаты титрования, гаммоксин имеет два скачка рН, один из которых лежит в области 5,5-7,0 и соответствует отщеплению протона от карбоксильной группы; при этом образуется цвиттер-ион аминокислоты. Второй скачок в области рН 9,5-11,0 соотвэтствует отщеплению протона от аммонийной группы цвиттер-ионкой формы соединения.

На кривой титрования мефебута наблюдается один скачок в области рН 9,8-11,5, пшсамшгон-хислота - 7,3-9,2.

Расчет содержания действующи веществ {!,%) проводили по общепринятым формулам, но в случае гаммоксина использовали два варианта: в первом - учитывали объем титранта, соответствующий эквивалентной точке во втором скачке рН (им ЭДС) (У4),считая

фактор эквивалентности вещества равным 1/2; во втором - опрадэля-ли разность между к объемом натрия гидроксида, соответствующим эквивалентной точке в первом скачке рН (ЭДС) ( V, ), фактор эквивалентности соединения в данном случае равен единица.

Правильные, хорошо воспроизводимые результаты достигаются при определении пикамилон-нислоты, а также гаммоксина, но при использовании расчетов по второму варианту, т.е. когда учитывается расход натрия гидроксида только на нейтрализацию карбоксильной группы (табл.3). Заниженные результата при расчетах по варианту I и при титровании мефебута можно объяснить неэквивалентным содержанием хлористоводородной кислоты в молекулах соединений.

Таблица 3

Результаты потенциометрического определения различных серий гаммоксина

Серия Рас чет по варианту

1,% 2,%

14.11.90 97,60 ± 0,46 99,63 £ 0,51

15.11.90 97,59 ± 0,31 100,01 £ 0,43

16.12.90 97,60 £ 0,92 99,89 £ 0,75

17.12.90 97,31 £ 0,86 -99,59 ±0,92

18.12.90 97,85 £ 0,55 100,03 £ 0,47

- Проведенные исследования позволили рекомендовать методику готенциометрического титрования для количественной оценки гаммоксина (с расчетами по варианту 2) в субстанции и в таблетках по 0,25 г, покрытых оболочкой (наполнители, как установлено не мешают).

Для алкалиметрического определения пикамилсн-кислоты были

подобраны оптимальные условия титрования с визуальной фиксацией .точки эквивалентности: водная среда, температура 90°С, индикатор-фонолфталоин. Оетбка определения субстанции пккамклон-кислоты не превысила - 0,34?, таблеток по 0,05 г - - 0,50%.

Количественный анализ карфедона предложено проводить "видоизмененным" методом Кьвльдаля, используя свойство вещества подвергаться щелочному гидролизу с выделением эквивалентного количества аммиака. Погрешность определения субстанции карфедона - 0,70%, таблеток карфедона 0,25 г - ± 0,485?.

Инструментальные мэтоды анализа

Анализ электронных спектров гаммоксяна, мефебута, карфедона я шясамилон-кислоты показал наличие максимумов поглощения в их водных растворах или в растворах хлористоводородной кислоты в доступной области измерений, что позволило нам использовать собственное поглощение соединений в спектрофэтометричэском методе количественного определения.

Построение калибровочных графиков показало наличие линейной зависимости оптической плотности в интервале изучаемых концентраций. Калибровочные графики были аппроксимированы линейными уравнениями с помотаю метода наименьших квадратов на ЛМ РС АТ. Полученные уравнения описывают экспериментальные данные с высоким уровнем достоверности и адекватности, коэффициент корреляции во всех случаях составил 0,99.

У дальнейшем установлено отсутствие поглощения вспомогательных ввгоств, входящих в состав таблеток гаммоксина, мефебута, карфедона и пикакилон-кислоты, в области аналитических длин волн.

Полученные результаты позволили разработать методики спектро-фотометрического определения исследуемых соединений в таблетках,

которые были включены в проекты М>С (табл.4).

Результаты анализа таблеток изучаемых -соединений спектрофотометрическим методом

Лекарственная форма * . г £ отн.

Габлетки гаммоксина 0,25, покрытые оболочкой 0,2491 0,00094 0,0026 ± 1,0455

Таблетки мефебуга 0,3 0,2981 0,00078 0,0022 ± 0,74$

Таблетки карфедона 0,25 0,2478 0,00087 0,0024 ± 0,97?

Таблетки шасамилон-кислота 0,05 0,04966 0,00020 0,0006 ± 1,09?

В целях болев полной характеристики свойств новых производных ГАМК и разработки способов обнаружения в них специфических примесей изучена хроматогрвфическая подвижность соединений на пластинках' "Силуфол УФ-254" в 15-ти различных системах растворителей. Детектирование пластинок проводили известными способами: УФ-светом, 0,5% раствором нгнгидрша в ацетоне, парами йода.

Анализ полученных данных показал, что изучаемые соединения обладалт большей подвижностью в присутствии полярных растворителей, обладающих высокой элюируюией силой - метанола, этанола,изо-пропанола, воды. Подвижность веществ уменьшается или сводится к нулю в присутствии малополярных растворителей - хлороформа, толуола, бензола. Системы основного характера позволяют получить более четко выракэнныэ пятна, в некоторых нейтральных ели слабо-кислых смесях пятна соединений растянуты.

Проведены исследования по подбору оптимальных условий разде-

ления основных веществ и ах возможных примесей и разработке способа испытания на "посторонние пригласи;". Полученные результаты позволили рекомендовать для обнаружения гвдрохлорвда ачиноацето-фенона в гаммоксине систему растворителей этанол-25$ раствор аммиака 7:3, в которой гаммоксина 0,74, примеси 0,90. Дня обнаружения гкцрохлорвда 4-амино-З-нфенилбутановой кислоты в мефе-буте и 1-фонилпирролидона-2 в карфедоне универсальной является система хлороформ-н-бутанол-25^ раствор аммиака 40:70:5 (мефе-бута = 0,68, примеси = 0; карфедона = 0,50, примеси = 0,82). В анализе карфедона возможно использование и системы бен-зол-диоксак. 1:1, в которой карфедон располагается вблизи линии старта, а 4-феншишрролидона-2 = 0,40.

Анализ лабораторных образцов соединений показал отсутствие примесей в гаммоксине и карфедоне, но во всех образцах мефебута идентифицировалась примесь гидрохлорида 4-ашно-З-фенилбутановой кислоты, полуколичественная оценка которой показала содержание , примеси от 0,50 до 5,0/».

В дальнейших исследованиях изучена хроматографическая подвижность пикамилон-кислоты, а также мефобута, карфедона и юс возможных примесей в условиях высокоэффективной жидкостной хроматографии. Найдены оптимальные условия разделения веществ. В качестве . элюента для разделения мефебута и гшцгахлорида 4-амино-З-фенилбу-тановой кислоты, карфедона и 4-фенилпирролидона-2 предложена смесь ацетонитрил-водный раствор ашония дигидрофосфата (0,05 моль/л) в соотношении соответственно 50:50 и 35:65.

Полученные результаты позволили разработать методику количественного определения гвдрохлорида 4-амино-З-фенилбутановой кислоты, по которой определено содержание примеси в мефебуте от 0,23 до 3,50$ (табл.5). Количественную оценку примеси проводили методом

абсолютной калибровки, расчет вали по линейному уравнению, полученному в результате обработки калибровочных графиков на ЗИЛ с помощью метода наименьших квадратов.

Таблица 5

Результаты количественного определения примеси гидрохлорида 4-амто-З-фенилбутановой кислоты в мефебуте

Зерия мефебута Содержание примеси,$ Я* £от Н.

01.11.90 3,52 . 0,015 0,063 £ 1,80$

01.Н.90 (перекр.) 0,29 0,004 0,018 ± 6,54$

05.05.94 2,01 0,014 0,060 ± 2,99$

15.06.94 0,77 0,012 0,053 £ 6,84$

20.06.94 1,01 0,020 0,086 ± 8,50$

20.06.94 (перекр.} 0,23 - 0,003 . 0,015 £ 6,24$

Удовлетворительная подвижность пикамилон-жислоты ---7.74) позволила использовать метод высокоэффективной жидкостной хроматографии для анализа соединения в таблетках по 0,05 г и в плазме крови. Изолирование вещества из плазмы проводили путем осаждения белковых элементов ацетонитрилом при центрифугировании в течение 35 минут со скоростью 7000 об/мин. Ошибка определения пикамилон-кислоты в таблетках составила £ 2,76$, в плазме крови £ 10,83,С Необходимость проведения фармакокинетических исследований мефебута поставила'задачу по разработке высокочувствительного метода анализа соединения в плазме крови, в связи с чем изучено га-зохроматографяческое поведение мефебута. Экспериментально уставов-

лэно, что гвдрохлорвд вещества обладает очень малой летучестью, которая значительно увеличивается у основания. Поэтому при подготовке пробы проводили изолирование мефебута из плазмы крови в виде основания путем экстракции в хлороформ.

Найденные оптимальные условия экстракции и газохроматографи-ческого анализа позволили разработать методику определения мефебута в плазме крови с использованием газожидкостной хроматографии. Количественную оценку соединения проводили по методу внутреннего стандарта, в качестве которого использовали анестезин. Предал обнаружения мефебута 5 мкг/мл, относительная погрешность - 1,33$ (табл.6).

Таблица 6'

Результаты газохроматографического определения мефебута в плазме крови

Взято мефебута мкг/мл Определено мефебута, % 5* ^огн.

150 98,65 0,47 1,31 ± 1,335?

320 98,69 0,33 0,92 :£ 0,93$

460 99,30 0,17 0,48 ± 0,49£

Изучение стабильности и установление сроков годности

Для изучения стабильности и установления сроков годности исследуемых соединений в субстанции и в таблетках использовали метод "ускоренного старения", по которому хранили вещества и их лекарственные формы при температуре" 40,50,60°С согласно инструкции. Все образцы снимались с хранения по причине истечения экспе-

риментального срока.

Параллельно проводили нзучзниэ стабильности веществ при хранении в естественных условиях.

Полученные данные свидетельствует об устойчивости соединена в процессе хранения и позволяют нормировать их срок хранения не менее 3-х лет. Работы в этой направлении продолжаются.

основные вывода

1. На основании изучения физико-химических свойств гаммокси-на, мефебута, карфедона и пякамилон-кислоты разработаны методики их идентификации, которые характеризуются достаточной специфичностью и чувствительностью. Стандартизированы основные показатели и нормы качества.

2. Определены константы ионизации гаммоксина, мзфебута и пи-камилон-кислоты, обоснована возможность использования в их анали- . зе методов кислотно-основного титрования. Разработаны методики определения мефебута и пикамилон-кислоты методом неводного титрования в среде безводной уксусной кислоты, алкалиметричэского определения гаммоксина (погенциометрическое титрование) и пикамилок-кислоты (визуальное титрование) в субстанции и в таблетках, яблочного гидролиза карфедона для анализа соединения б субстанции и в таблетках.

3. Изучены возможности спектрофотометрии в анализе исследуемых соединений. Предложены методики спектрофотометрического определения гаммоксина, мефебута, карфедона и пикамилон-кислоты в таблетках.

4. Проведены исследования по хроматографическому поведению новых производных rif.CC в тонком слов сорбента. Разработаны методики определения возможных примесей гаммоксина, мефебута и карфе-

г;ова в субстанции методом тонкослойной хроматографии.

5. Найдены оптимальные условия обнаружения и количественной оценки примесей в ь»ефебуте и карфедоне, проведения анализа пика-милон-кислоты в таблетках по 0,05 г и в плазме крсви методом высокоэффективной жидкостной хроматографии.

6. Изучена подвижность гдафебута в условиях газо-жщцсостной хроматография, разработана методика газохроматографического определения мофебута в плазме крови.

7. Установлены сроки годности исследуемых соединений в субстанции и в таблетках в условиях естественного хранения и методом "ускоренного старения" при повышенной температуре.

.3. Разработаны проекты Временных фармакопейных статей на субстанции гаммоксияа, "Таблетки гаммоксияа 0,25, покрытые оболочкой", субстанцию карфздона, "Таблетки карфедона 0,25",которые приняты к рассмотрению в Фармакологическом комитете МЗ и Ш РФ. Составлены проекта ЮС на субстанцию пикамилон-кислоты, "Таблетки пикамилоя-кислоты 0,05", субстанции мефебута, "Таблетки мефе-буга 0,3" для представления в Фармакологический комитет.

По теме диссертации опубликованы работы:

1. Семакова С.А., Вдовяна Г.П., Дубовик В.А. Технология и биофармацевтическое исследование лекарственного вещества Л-49 и комбинированного препарата с Л0С-7-78/Деп.в ВИНИТИ }ё 547-В 92.1992.- 7 с.

2. Биофармацовтическое исследование таблеток вйщества Л-49/Сема-кова С.А., Дубовик В.А., Вдовина Г.П., Гайсинович М.С., Гребешок Л.А.//Деп.в ВИНИТИ И 14Э7-В 92.-1992.- 7 с.

3. Яубовик В.А., Семакова С.А., Вдовина Г.П. Спектрофотометричос- " кое определение таблеток мефебута //Научи, практ.конф.: Тезисы докл.- г.Ирнутск,1992.- I с.

4. Определение мефебута в плазме крови методом ГЕХ /Дубовик В.А., Гребенш Л.А., Гайсинович М.С., Дцовина Г.¡¡.//Межвузовская научн.-практ.конф.-.Тезисы докл.-Пермь, 1Э93.- С.46.

5. Разработка технологии и методов анализа препаратов из группы производных гамма-амингаласляной кислоты /Вдовина Г.П., Яковлева Я.<Ф., Ярыгина Г.И., Одегова Т.Ф., Дубовик В.А., Ганичева Л.М. //Межвузовская "яучн.-практ.конф.:Тезисы докл.-Пермь,1993.-С.28

К печати 27.IE.94 ' Фовд.бум. 60x34 1/16 Печ.л.1,25 Тираж 50 экз. ' Зак. I"

Типография ГШЗКИУ