Автореферат и диссертация по фармакологии (15.00.01) на тему:Разработка инъекционного лекарственного препарата соли N(4)-пропилаймалина

На правах рукописи

Ермакова Марина Владимировна

РАЗРАБОТКА ИНЪЕКЦИОННОГО ЛЕКАРСТВЕННОГО ПРЕПАРАТА СОЛИ ^4)-ПРОПИЛАЙМАЛИНА

15.00.01 - Технология лекарств и организация фармацевтического дела

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата фармацевтических наук

у

Санкт-Петербург 2005

Работа выполнена в ГОУ ВПО Санкт-Петербургская государственная химико-фармацевтическая академия Федерального Агентства по здравоохранению и социальному развитию Российской Федерации на кафедре технологии лекарств и фитопрепаратов.

Научный руководитель: кандидат химических наук, доцент Громова Лидия Ивановна

Официальные оппоненты: доктор фармацевтических наук, профессор Молдавер Бенюмен Лейбович доктор фармацевтических наук, профессор Манойлова Любовь Михайловна

Ведущая организация: ФГУ Российский НИИ гематологии и трансфузиологии.

Защита состой гея "ЯЬ" скТь^а. 2005 г. в {?_ часов на заседании Диссертационного Совета Д. 208.088.01 при Санкт-Петербургской государственной химико-фармацевтической академии (197376, Санкт-Петербур!, ул. Проф. Попова, 14).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Санкт-Петербур1 ской государственной химико-фармацевтической академии (197376, Санкт-Петербург, ул. Проф. Попова, 4/6).

Автореферат разослан г.

Учёный секретарь Диссертационного Совета,

доктор фармацевтических наук, доцент Рыжкова М.В.

¿006 -f /Х'24

ß/2f??£

Общая характеристика работы

Актуальность темы. Болезни сердечно-сосудистой системы занимают одно из первых мест в структуре заболеваемости населения России. При этом около трети всех кардиологических больных страдает нарушениями ритма сердца. Нарушения ритма сердца остаются одной из основных причин кардиальных смертей, а их лечение - одной из наиболее сложных задач кардиологии (Дощицын B.JL, 1993; Метелица.В-И., 1987). В настоящее время используется как лекарственная терапия, так и немедикаментозные методы лечения аритмий. Фармакотерапия является одним из наиболее доступных и распространенных методов (Мешков А.П., 1998). К числу узко специализированных и, следовательно, наиболее эффективных антиаритмических препаратов, находящих применение только в аритмологии, относятся не более 10% препаратов, показанных для лечения сердечных аритмий. Большинство препаратов этой группы обладает рядом серьезных побочных эффектов, и доля отечественных препаратов, представленных на российском рынке, весьма незначительна.

Исследования отечественных и зарубежных авторов показали, что четвертичные производные аймалина алкалоида растений рода Rauwolfm, в частности, соли Ы(4)-пропилаймалина, относятся к числу высокоэффективных и перспективных антиаритмических средств. С точки зрения баланса эффективности и безопасности, четвертичные производные аймалина выгодно отличаются от большинства других узко специализированных антиаритмических средств (Шпектор A.B. и др., 1987; Янушкевичюс З.И. и др., 1984). В Санкт-Петербургской государственной химико-фармацевтической академии (СПХФА) уже длительное время проводятся исследования по созданию противоаритмических препаратов на основе солей >1(4)-пролил аймалина (Минина С.А. и др., 1986; Минина С.А. и др., 1987; Минина С.А. и др., 1994; Сергеева Е.М. и др., 1997). В частности, разработан состав и технология таблеток М(4)-пропилаймалина бромида, покрытых оболочкой. Однако данное соединение практически нерастворимо в воде, что сильно ограничивает возможности получения инъекционного препарата на его основе. Для оказания экстренной помощи в случае угрожающих жизни аритмий, особенно желудочковых, которые являются одним из основных показаний к применению препаратов солей К(4)-пропилаймалина, незаменимы инъекционные лекарственные средства. На отечественном рынке лекарственных средств в настоящий момент отсутствуют инъекционные препараты на основе производных аймалина.

Ранее в СПХФА был осуществлен синтез, исследование биологической активности и физико-химических свойств некоторых водорастворимых солей 1Ч(4)-пропилаймалина с ароматическими сульфокислотами (М(4)-пропилайма-лина бензолсульфонат) (Сергеева Е.М., 1993) и карбоновыми кислотами (Шебатин Р.В. и др., 2002). Обнаружено, что максимальной терапевтической

действия. Растворимость Ы(4)-пропилаймалина гидромалоната в воде позволяет получать его растворы с концентрацией до 6% (Шебатин Р.В., 2002). Таким образом, сделан вывод, что данное соединение наиболее перспективно в ряду рассмотренных солей 1\Г(4)-пропилаймалина для разработки отечественного высокоэффективного парентерального препарата, предназначенного для лечения нарушений ритма сердца. Поэтому создание препарата на основе N(4)-пропилаймалина гидромалоната является актуальным.

Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы являлась разработка лекарственного препарата 1\Г(4)-пропилаймалина гидромалоната (ПАГМ) в виде раствора для инъекций. Задачи исследования:

1. Изучить стабильность водного раствора ПАГМ, влияние физических и химических факторов на стабильность раствора и определить комплекс мер по его стабилизации;

2. Обосновать состав и разработать технологию лекарственного препарата ПАГМ;

3. Разработать методики анализа лекарственного препарата;

4. Провести фармакологическое исследование лекарственного препарата;

5. Установить первоначальный срок годности лекарственного препарата;

6. Составить проект фармакопейной статьи предприятия на препарат "N(4)-пропилаймалина гидромалоната раствор для внутривенного введения 10 мг/мл".

Научная новизна

1. Обоснован состав лекарственного препарата ПАГМ в виде раствора для инъекций, стабильного в течение 2 лет хранения. Показано, что применение в качестве антиоксидантов только солей кислоты сернистой мало влияет на устойчивость ПАГМ в растворе. Установлено, что для получения стабильного раствора необходимо совместное введение в его состав 0,2% натрия метабисульфита и 0,05% кислоты аскорбиновой.

2. Впервые разработана методика ТСХ-денЬйтометрии для количественного определения ПАГМ в 1% растворе в присутствии продуктов разложения. Показано, что по метрологическим характеристикам данный метод не уступает ВЭЖХ применительно к исследуемому объекту.

3. Предложена оригинальная хроматографическая система для разделения продуктов разложения ПАГМ методом ТСХ. Показано различие в качественном составе продуктов разложения при изменении факторов, влияющих на стабильность раствора, получены УФ спекпры некоторых продуктов разложения.

4. Исследовано влияние физических и химических факторов на стабильность раствора ПАГМ. Определена область рН наибольшей устойчивости ПАГМ. Впервые рассчитаны некоторые кинетические характеристики процесса разложения ПАГМ в водном растворе.

Практическая значимость. Разработаны состав, технология и методы стандартизации высокоэффективного антиаритмического препарата. По разработанной технологии получены опытные партии препарата в условиях опытного цеха ФГУП ГосНИИ особо чистых биопрепаратов. По результатам

хранения опытных партий препарата установлен его первоначальный срок годности. Составлен проект ФСП на препарат ,гМ(4)-пропилаймалина гидромалоната раствор для внутривенного введения 10 мг/мл".

Апробация работы. Основные результаты диссертационной работы доложены на IV Международной научно-практической конференции "Здоровье и образование в XXI веке" (Москва, 2003), научно-методической конференции "Состояние и перспективы подготовки специалистов для фармацевтической отрасли" (Санкт-Петербург, 2004), XI Российском национальном конгрессе "Человек и лекарство" (Москва, 2004), Международной научно-практической конференции "Выпускник фармацевтического вуза (факультета) в прошлом, настоящем и будущем" (Санкт-Петербург, 2004).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 9 научных работ, в том числе две научных статьи в журналах "Фармация" и "Химико-фармацевтический журнал", три научных статьи в сборниках научных трудов, из них в одном международном, и четыре публикации в сборниках материалов и тезисов научных конференций и конгрессов, из них в двух международных. Положения, выносимые на защиту

1. Результаты изучения стабильности водного раствора ПАГМ в ампулах и определение ключевых факторов стабильности;

2. Разработка состава лекарственного препарата ПАГМ в виде раствора для инъекций;

3. Разработка и обоснование технологии лекарственного препарата;

4. Разработка методик анализа лекарственного препарата, сравнительная оценка методик количественного определения по валидационным параметрам.

Объем и структура диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы (глава 1), экспериментальной части (главы 2-5), общих выводов, списка литературы и 4-х приложений. Работа изложена на /^Устрадицах машинописного текста, содержит у5£ таблиц, // рисунков. Список литературы включает /^¿'источника, в том числе ¿"¿?на иностранных языках.

Основное содержание работы

Во введении изложены актуальность, цель и задачи исследования, научная новизна, практическая значимость работы.

Обзор литературы (глава 1)

Рассмотрен отечественный рынок антиаритмических средств. Приведена химическая и фармакологическая характеристика аймалина и препаратов на его основе. Наибольшее внимание уделено обзору отечественных и зарубежных исследований, посвященных четвертичным производным аймалина, а именно, солям К(4)-пропилаймалина. Описана схема получепия М(4)-пропилаймалина гидромалоната и дана его характеристика как перспективного антиаритмического средства.

Приведена общая характеристика лекарственных средств для парентерального применения. Рассмотрена проблема стабильности

лекарственных веществ в водных растворах для инъекций. Описаны способы стабилизации инъекционных растворов аймалина, его производных и близких по строению соединений.

Представлена общая характеристика методов количественного определения лекарственных веществ в парентеральных препаратах, область применения количественной высокоэффективной тонкослойной хроматографии (ТСХ-денситометрии, ТСХ-ДМ). Рассмотрены особенности валидации хроматографических методик применительно к фармацевтическому анализу. Материалы и методы экспериментальных исследований (глава 2)

Для приготовления растворов использовали субстанцию ПАГМ, полученную по усовершенствованной трехстадийной схеме синтеза солей N(4)-пропилаймалина с карбоновыми кислотами (Шебатин Р.В. и др., 2002). Партии субстанции ПАГМ соответствовали требованиям проекта ФСП "N(4)-пропилаймалина гидромалонат - субстанция".

Вспомогательные вещества отвечали требованиям соответствующих ФС или применялись квалификации х.ч. и ч.д.а. Для приготовления растворов ПАГМ использовали воду для инъекций (ФС 42-2620-97). Фильтрование растворов проводили под вакуумом через мембранный фильтр на установке "Millipore" (США), наполнение ампул осуществляли с помощью шприца. Для осуществления "газовой защиты" из приготовленного раствора удаляли воздух барботированием аргона, фильтровали такие растворы под давлением аргона через мембранный фильтр на установке "Millipore" (США). Наполнение ампул осуществляли шприцевым способом в токе аргона на полупромышленной установке "Rota" тип R910/41 (Германия) в условиях опытного цеха ФГУП ГосНИИ особо чистых биопрепаратов (Санкт-Петербург). Растворы стерилизовали паром под давлением (температура (121±1) С, избыточное давление 0,11 ±0,02 МПа, время стерилизации 8 мин.). Отдельные опытные партии раствора приготовлены в асептических условиях.

Качество растворов при изучении их стабильности оценивали каждые 6 мес. в течение 2 лет хранения (или эквивалентное время в случае хранения при повышенной температуре) по показателям: pH (потснциометрически), цветность (с использованием эталонов желтых, коричневых и зеленых оттенков согласно ГФ XI), отсутствие или наличие взвеси или эмульсии (визуально, согласно Инструкции по контролю на механические включения инъекционных лекарственных средств РД 42-501-98), посторонние примеси (ТСХ, ВЭЖХ, одновремешю с количественным определением), количественное содержание (ТСХ-ДМ, ВЭЖХ). Анализ методом ТСХ-ДМ проводили с использованием видеоденситометра для ТСХ "ДенСкан-04" (Россия), анализ методом ВЭЖХ - с помощью микроколоночного хроматографа "Милихром А-02" (Россия). В качестве стандартного образца для количественного и качественного анализа (PCO ПАГМ) использовали субстанцию ПАГМ, отвечающую требованиям проекта ФСП.

Статистическую обработку результатов экспериментов проводили согласно ГФ XI. Валидационные параметры определяли согласно проекту ОФС "Валидация фармакопейных методов" и ГОСТ Р ИСО 5725-1-2002. Также

пользовались рекомендациями других отечественных и зарубежных источников (Носырев П. и др., 2003; Ferenczi-Fodor К. et. al., 2001; Green J.M., 1996; ICH-Q2A, 1995).

Оценку острой токсичности и антиаритмической активности препарата проводили в сравнении с показателями субстанции ПАГМ, определенными в тех же условиях эксперимента по общепринятым методикам (Беленький M.JL, 1963; Каверина Н.В. и др., 2000). Эксперименты проводили на белых нелинейных мышах-самцах массой тела 18-22 г и белых нелинейных крысах-самцах массой тела 180-220 г.

Изучение стабильности 1% водного раствора ПАГМ в ампулах

(глава 3)

Ранее установлено (Шебашн Р.В., 2002), что терапевтическая доза ПАГМ для однократного внутривенного применения человеком составляет 10 mi. Таким образом, для исследований был выбран 1% водный раствор ПАГМ в ампулах вместимостью 1 мл. Разработка методик количественного определения ПАГМ (3.1.)

Основным критерием оценки стабильности лекарственных препаратов является количественное содержание лекарственного вещества. Проводили выбор специфичных методов и разработку правильных и воспроизводимых методик количественного определения ПАГМ в растворе, которые в дальнейшем могут быть применены для анализа разрабатываемого лекарственного препарата. Сравнительная оценка по валидационным параметрам осуществлялась для трех методов - СФ, ВЭЖХ, ТСХ-ДМ.

Первоначально для каждого из методов определяли линейность, выбирали аналитическую концентрацию и предварительно оценивали аналитическую область, затем оценивали специфичность, правильность и воспроизводимость Результаты определения линейносш, аналитической концентрации и аналитической области приведены в табл. I.

Таблица 1

Линейность, аналитическая облас1ь, аналитическая концентрация методик

Метод Область линейности Аналитическая концентрация Аналитическая область

СФ* 10-60 мкг/мл (R4),9997) 35 мкг/мл 20-42 мкг/мл

ВЭЖХ 1-500 мкг/мл (R2-0,9996) 100 мкг/мл 50-150 мкг/мл

ТСХ-ДМ 10-220 мкг (R'"0,9922) 60 мкг 40-72 ми

*Для метода СФ в качестве аналитической выбрана длина волны 245 нм, соответствующая максимуму в УФ спектре ПАГМ с наибольшим удельным показателем поглощения (Е™, =169±2).

Специфичность разработанных методик изучали по их способности достоверно определять ПАГМ в присутствии специфической примеси -изоаймалина (Шебатин Р.В., 2002) и возможных продуктов разложения, образование последних инициировали термическим воздействием. Как изоаймалин, так и продукты разложения (что показано нами далее) имеют полосы поглощения в области тех же длин волн, что и ПАГМ. Таким образом, метод прямой СФ не является специфичным ни по отношению к изоаймалину, ни по отношению к продуктам разложения, образующимся в растворе. При хроматографировании методом ВЭЖХ в выбранных условиях проведения анализа наблюдается разделение ПАГМ, изоаймалина и продуктов разложения с разрешением, значительно большим минимального допустимого разрешения, указываемого в литературе (Стыскин Е.Л. и др., 1986) - рис. 1,2.

Г-

Рис.1. ВЭЖХ-хроматограмма свежеприготовленного 1% раствора ПАГМ

Условия анализа:

обращенно-фазовый сорбент Silasorb 5 SPIT CI8, 72x2 мм (размер частиц 5 мкм); подвижная фаза: фосфатный буфер (рН 2,4±0,2) - аиетоиитрил; режим элюирования изократический (40% ацетонитрила); температура колонки 35°С; объем инжекции 4 мкл; детектирование при 254 нм (постоянная времени 0,34 с); расход подвижной фазы 200 мкл/мин.

1 2

JU-

S 3 45

в 1

Рис.2. ВЭЖХ-хромаюграмма 1% раствора ПАГМ после 11 сут. хранения при (60±1)°С (эквивалентно 6 мес хранения при комнатной температуре)

Условия анализа: см. рис.1.

Условные обозначения: 1-8 - продукты разложения ПАГМ.

При хроматографировании методом ТСХ наблюдается разделение ПАГМ, изоаймалина и посторонних примесей, считающееся достаточным для количественной оценки с помощью денситометрии (НТЦ "Ленхром", 2002) -рис.3. Таким образом, специфическая примесь и продукты разложения не мешают количественному определению ПАГМ рассмотренными хроматографическими методами.

Сравнительную оценку меюдик ВЭЖХ и ТСХ-ДМ проводили по показателям правильность и воспроизводимость. В качестве критерия правильности методики использовали рассчитанное отклонение среднего значения концентрации ПАГМ, определенной согласно методике, от ее истинного значения. Расчет количественного содержания ПАГМ в образцах проводили по методу внешнего стандарта (абсолютной калибровки).

Условия анализа: пластина "Сорбфил" ("ПТСХ-П-В-УФ"), 100x150 мм; хроматографи-ческая система хлороформ-ацетон-диэтиламин (15:12:3); детектирование при 254 им.

Условные обозначения: калибровочные растворы: 1-2-40 мкг ПАГМ, 3-4-60 мкг ПАШ, 5-6-72 мкг ПАГМ; анализируемый раствор: 7-9-60 мкг ПАГМ.

пагм • ♦ •

юоаймалин

®

I -I--г---1-1-1-

12 3 4 5 6 7 8 9

Рис.3 ТС-хроматотрамма, полученная для количественного определения ПАГМ в 1% растворе методом ТСХ-ДМ после 44 сут. хранения при (60±1)°С (эквивалентно 24 мес хранения при комнатной температуре)

Правильность методик, рассчитанная для аналитических концентраций, составляет (99,1010,66)% для ВЭЖХ и (98,60±1,68)% для ТСХ-ДМ. В качестве критерия воспроизводимости принимали относительную ошибку определения. Результаты оценки воспроизводимости приведены в табл.2.

Показано отсутствие систематической ошибки в результатах анализа, полученных данными методами. Установлено, что различие дисперсий двух рассмотренных методов не является статистически значимым. Следовательно, наряду с ВЭЖХ, для количественного определения ПАГМ может использоваться метод ТСХ-ДМ. Таким образом, разработаны две специфичные методики количественного определения ПАГМ, которые могут применяться для изучения стабильности растворов ПАГМ и могут быть включены в проект ФСП на разрабатываемый препарат.

Таблица 2

Метрологические характеристики методов анализа

Метод и, М1/МЛ £ Сер, мг/мл 52 э Р, % 1 (РД> ^выч ДСср, мг/мл е Р Рцыч

вэжх 10,00 8 10,13 0,04 0,19 95 2,36 2,05 0,14 1,38

6,03 5,00

тсх-ДМ 10,00 8 9,82 0,20 0,44 95 2,36 1,23 0,34 3,47

Исследование разложения ПАГМ в 1% водном растворе (3.2.)

При изучении стабильности раствора ПАГМ нами первоначально использовался метод "ускоренного старения" или так называемые стресс-условия при температуре (60±1)°С (Мешковский А.П., 2000), температурный коэффициент принят равным 2 (Временная инструкция по проведению работ с целью определения сроков годности лекарственных средств, 1983) - состав 1 Качество раствора оценивали каждые 11 дней (эквивалентно 6 мес. при 20°С).

Таблица 3

Изменение показателей качества 1 % раствора ПАГМ в процессе хранения

при (60±1)°С

Срок хранения, дни рН Цветность Наличие взвеси или эмульсии Количественное содержание, % относительно исходного Е>245/О290

0* 3,75±0,04 бесцветный - 100 2,84±0,02

0** 3,79±0,03 76 - 99,85±1,10 2,82±0,02

11 3,86±0,03 36 85,82±1,40 2,78±0,02

22 3,97±0,04 26 + 75,15±1,20 2,68*0,01

33 4,15±0,03 16 + 66,71±0,90 2,60±0,02

44 4,25±0,05 16 + 60,05±1,10 2,57±0,01

* - в момент приготовления ** - после стерилизации

О значительном разложении ПАГМ свидетельствует уменьшение количественного содержания в среднем на 40% от исходного за все время

хранения (габл.З). Расчет отношения оптических плотностей в максимумах и минимумах поглощения обнаружил изменение указанных величин в процессе хранения (рис.4). Это может свидетельствовать об образовании соединений, имеющих полосы поглощения в той же области, что и ПАГМ. Наблюдается также появление желтой окраски раствора. Таким образом, можно предположить, что важную роль в процессе разложения соединения играет окисление. Это заключение подтверждается данными литературы (Минина С. А. и др., 1986; Сергеева Е.М., 1993) о подверженности окислению аймалина и его производных.

Длина волны,нм

В литературе не было найдено публикаций, посвященных подробному изучению механизма процесса разложения аймалина или его производных. Поэтому эта задача представляется достаточно сложной для решения.

Нами была предпринята попытка определить порядок реакции разложения ПАГМ дифференциальным методом (метод Вант-Гоффа) и графическим способом (Денисов Е.Е., 1988). Обнаружено, что порядок реакции разложения составляет около 1,6, а процесс разложения ПАГМ в водном расгворе при температуре 60°С может быть описан уравнением второго порядка. Константа скорости реакции разложения, рассчитанная по кинетическому уравнению реакции второго порядка, составляет 1,1х10"7

лх(молъхмин)"1. Рассчитанное значение порядка реакции может косвенно свидетельствовать о протекающих процессах окисления.

Проводили разделение, оценку количества и предварительную характеристику продуктов разложения ПАГМ. Для этих целей использовали метод ТСХ, являющийся одним из наиболее простых и наглядных способов, имеющий большие возможности для варьирования хроматографических систем разделения и химической детекции. Экспериментально были подобраны две системы, последовательное использование которых (метод двумерной ТСХ) позволило достичь приемлемого разделения: спирт этиловый 96%-кислота уксусная ледяная (10:1) и бензол-н-бутанол-спирт этиловый 96%-диэтиламин (15:7:2:2). В среднем наблюдалось около 9 дополнительных зон как обладающих собственной флюоресценцией - зоны 3-8 и 10-11, так и

Условия анализа: пластина "Сорбфил"

("ПТСХ-П-А-УФ"), ЮОх 150 мм; система 1 (—>)• спирт этиловый 96% -кислота уксусная ледяная (10:1); система 2 (—>): бензол - н-бутанол - спирт этиловый 96%-диэтиламин (15:7:2:2); детектирование при 254 нм.

Условные обозначения: 1 - ПАГМ, 2 - изоаймалин, 3-11 - продукты разложения.

Рис.5. ТС-хроматограмма 1% раствора ПАГМ после 44 сут. хранения при (60±1)°С (эквивалентно 24 мес. хранения при комнатной температуре)

Используя препаративную ТСХ (метод хроматоспектрофотометрии) были сняты УФ спектры зоны 5, как одной из наиболее значительных по объему, а также зон 3 и 9, наиболее близких к основному компоненту по подвижности, проявлению в УФ свете и различными реагентами. Спектры зон 3 и 9 характеризуются максимумами и минимумами при длинах волн, близких к длинам волн полос поглощения ПАГМ (рис,6). Это свидетельствует о том, в данных продуктах хромофорная структура ПАГМ сохраняется с некоторыми изменениями, что подтверждает неспецифичность метода прямой СФ для количественного определения ПАГМ. Спектр зоны 5 не имеет выраженных полос поглощения, так как, скорее всего, это продукт более глубоко разложения

поглощающих в УФ области - зона 9 (рис.5).

фронт 1

точка нанесения

ПАГМ. На данном этапе работы идентифицировать отмеченные продукты не удалось в связи с их малым количеством и сложностью разделения.

210 220 230 240 250 260 270 280 290 300 Длина волны, нм

Рис.6. УФ спектры ПАГМ (зона 1, рис.5) и продуктов разложения (зоны 3,5,9, рис.5), растворитель спирт этиловый 96%: 40 мл для зоны 1; 5 мл для зон 3,5,9

Таким образом, ПАГМ нестабилен в водном растворе. Вероятнее всего, важную роль в процессе разложения играет окисление. Изучение влияния некоторых физических и химических факторов на стабильность раствора ПАГМ (3.3.)

Рассматривали следующие основные факторы, которые могут повлиять на устойчивость ПАГМ к процессам окисления и гидролиза: температура, срок хранения субстанции, свет, примеси металлов переменной валентности, рН, растворитель, кислород воздуха.

При изучении влияния температурного фактора оценивали стабильность трех опытных составов 1% водного раствора ПАГМ, отличающихся температурой хранения: состав 1 - (60±1)°С (стресс-условия, исследован ранее, п.3.2.), состав 2 - комнатная температура (контрольный раствор для дальнейших исследований), состав 3 - (40±1) С (ускоренные испытания стабильности). Показано, что так же, как и при (60±1)°С, разложение ПАГМ при комнатной температуре может быть описано уравнением второго порядка. Величина константы скорости составляет 4,0x10"9 лх(мольхмин)"1. С использованием констант скорости реакции для составов 1 и 2 рассчитан температурный коэффициент реакции, который составил 2,3. Сравнение показателей качества растворов составов 2 и 3, определенных через эквивалентные промежутки времени с учетом уточненного температурного коэффициента, подтвердило правильность его расчета (рис.7). Однако на основании результатов исследования методом двумерной ТСХ растворов, которые хранились при температурах комнатной и 40°С, можно предположить,

что роль температуры заключается не только в ускорении процессов разложения ПАГМ, но и во влиянии на состав продуктов разложения. Поэтому для исключения влияния температурного фактора все дальнейшие исследования проводили при комнатной температуре.

Срок ранения, мес

Рис.7. Изменение количественного содержания ПАГМ в его 1% растворах при различных условиях хранения

Условия хранения: -о - температура(60Н)°С; -А- контрольный раствор*; -а - температура (40±1) С;

- • - срок хранения субстанции ПАГМ

12 мес.;

- О - лабораторное освещение.

* Условия хранения контрольною раствора, комнатная температура, в защищенном от света месте, ампулы НС-3, без применения стабилизаторов и "газовой защиты"

Известно, что срок хранения субстанции может оказать большое влияние на стабильность препарата. Установленный срок годности субстанции ПАГМ 2 года. Однако при увеличении срока хранения субстанции на 6 мес., в частности, с 6 до 12 мес. (состав 4), стабильность раствора значительно уменьшается (рис.7). При этом субстанция удовлетворяла требованиям проекта ФСП по всем показателям. Таким образом, в дальнейшем для приготовления растворов использовали субстанцию ПАГМ, срок хранения которой не превышал 6 мес.

Светочувствительность ПАГМ изучали, сравнивая стабильность составов 1% раствора ПАГМ, отличающихся световым режимом хранения: в условиях лабораторного освещения (состав 5), в защищенном от света месте (состав 2). Установлено, что воздействие света играет значительную роль в разложении ПАГМ, в большей мере проявляясь после 12 мес. хранения (рис.7).

Попыткой уменьшить возможное влияние ионов металлов переменной валентности на стабильность было включение комплексообразова гелей в состав раствора. На основании данных литературы, в качестве комплексообразователя использовали трилон Б в концентрации 0,05% (состав 6). Оказалось, что использование трилона Б уменьшает стабильность раствора (рис.8) и не является целесообразным.

Для изучения влияния рН на стабильность раствора диапазон его варьирования выбрали от 3,0 до 5,0 относительно рН 1% исходного раствора,

близкого к 4,0. Наиболее целесообразным посчитали понижать рН добавлением одноименного аниона - то есть кислоты малоновой, для чего использовали ее 2% раствор (состав 7). Повышение рН проводили раствором натрия гидроксида (состав 8), цитратным и ацетатным буферами (концентрация 0,02 моль/л) -составы 9-10. Установлено, что понижение рН отрицательно влияет на стабильность раствора (рис.8). Повышение рН добавлением натрия гидроксида г несколько увеличивает стабильность раствора (рис.8). Повышение рН с

помощью буферов приводит к быстрому и, по всей видимости, глубокому, разложению ПАГМ (рис.8). Таким образом, введение в состав раствора * регуляторов рН не оказывает явного положительного эффекта.

Срок ранения, мес.

Рис.8. Изменение количественного содержания ПАГМ в его 1% растворах в зависимости от способа стабилизации

Способ стабилизации:

- □ - контрольный раствор; ■ - 0,05% трилона Б;

- 0 - кислота малоновая до рН 3;

- А-натрия гидроксид до рН 5;

- • - цитратный буфер (рН 5);

- о - ацетатный буфер (рН 5);

- ♦ - 40% пропиленгликоля

Условия хранения: комнатная температура, в защищенном от света месте, ампулы НС-3

Известно, что заменой части воды на менее полярный растворитель в растворах для инъекций иногда удается повысить устойчивость препарата к гидролитическому разложению. На основании данных литературы (Акеге МЛ., 2002; РаЬо!^ М., 1993), в качестве сорастворителей использовали пропиленгликоль в количестве 40% (состав 11) и полиэтиленоксид-400 в том же количестве (состав без номера). Присутствие пропиленгликоля ускорило разложение ПАГМ (рис.8) с быстрым появлением окраски раствора, добавление полиэтиленоксида-400 привело к появлению интенсивной желтой окраски уже в процессе термической стерилизации.

С целью исследования влияния ампульного стекла проведено сравнение стабильности растворов в ампулах из отечественного стекла марки НС-3 (состав 2) и в зарубежных ампулах типа Б из боросиликатного стекла 1-го гидролитического класса (состав 12). Установлено, что стабильность растворов данных составов очень близка (рис.9), и ампулы, изготовленные из стекла обоих типов, можно рекомендовать для ампулирования растворов ПАГМ. Как оказалось, светозащитное стекло СНС-1 (состав 13) не повышает устойчивость исследуемого раствора (рис.9). К тому же к его недостаткам относят

затрудненность контроля на механические включения. Поэтому при дальнейшем выборе типа ампул не предусматривали их светозащитную функцию. Однако хранить ампулы с раствором следует в защищенном от света

Рис.9. Изменение количественного содержания ПАГМ в его 1% растворах в зависимости от способа стабилизации

Способ стабилизации:

- □ - контрольный раствор;

- ■ - ампулы СНС-1; -А- ампулы 1-го гидролитического класса;

- - А - "газовая защита" Условия хранения: комнатная

температура, в защищенном от света месте.

Срок ранения, мес.

Для изучения влияния кислорода воздуха сравнительному анализу подвергали стабильность растворов двух составов. Заполнение и запайку ампул одного из них (состав 14) проводили в токе инертного газа. Составом сравнения являлся состав 2. Для осуществления "газовой защиты" нами был выбран аргон, который позволяет наиболее полно вытеснять воздух из раствора и пространства над ним, не изменяя при этом его рН (Francois D., 2004; Waterman К.С. et al., 2002). Уменьшение содержания кислорода воздуха путем применения "газовой защиты" позволяет значительно увеличить усюйчивость раствора ПАГМ (рис.9). Однако предотвратить процессы разложения с получением стабильного препарата, используя только "газовую защиту", не представляется возможным.

Таким образом, установлено, что на стабильность раствора ПАГМ в значительной мере влияет кислород воздуха, а комплекс мер по его удалению будет способствовать получению стабильного препарата. Введение в состав раствора регуляторов рН нецелесообразно. В процессе получения препарата особое внимание следует обращать на температурные режимы. В качестве материала первичной упаковки рекомендуется использовать ампулы, изготовленные из химически стойкого бесцветного отечественного стекла марки НС-3 или зарубежного боросиликатного стекла 1-го гидролитического класса. При этом ампулы с раствором следует хранить в защищенном от света месте.

месте.

Разработка состава и технологии препарата ПАГМ в виде инъекционного раствора (глава 4)

Разработка состава препарата ПАГМ (4.1.)

Исходя из предварительных исследований, сделан вывод, что важную роль в разложении ПАГМ играют процессы окисления. Антиоксиданты являются наиболее широко используемыми веществами, позволяющими стабилизировать растворы легкоокисляющихся соединений. Исследование стабильности растворов различных составов проводили в сравнении с составом 2, в который антиоксиданты не вводились.

12

Срок храпения, мес.

1$

24

Рис.10. Изменение количественного содержания ПАГМ в его 1% растворах, содержащих натрия метабисульфит, натрия сульфит В составе раствора;

- А - контрольный раствор;

-Ж- 0.05% натрия метабисульфита; -■ - 0,1% натрия метабисульфита;

- □ - 0,2% натрия метабисульфита;

- • - 0,2% натрия сульфита

Условия хранения: комнатная температура, в защищенном от света месте, ампулы НС-3

• Наиболее распространенными антиоксидантами, разрешенными большинством фармакопей мира, являются соли кислоты сернистой (натрия метабисульфит, натрия гидросульфит, натрия сульфит). Как оказалось, введение 0,2% (0,010 моль/л) натрия метабисульфита в состав раствора ПАГМ (состав 17) практически не изменяет стабильность по сравнению с контрольным (рис.10). При уменьшении концентрации антиоксиданта от 0,2% до 0,05% (от 0,010 до 0,0025 моль/л, составы 16, 15) стабильность растворов даже уменьшается (рис.10).

Также обнаружено, что присутствие натрия метабисульфита вызывает образование большего числа продуктов разложения (рис.11) но сравнению с контрольным раствором (рис.5).

Установлено, что натрия сульфит (состав 18) понижает устойчивость ПАГМ в растворе в еще большей степени по сравнению с натрия метабисульфитом (рис.10).

44-

2 «жпи»лзшшгдов*-

\ ■■•'3 фронт 2 12

,10

т 9

6 § * *8 |

5 ,

7

Условия анализа: те же, что и рис.5.

Условные обозначения: зона 1 - ПАГМ, зона 2 -изоаймалин, зоны 3-13 -продукты разложения.

фронт 1

точка нанесения

Рис 11. ТС-хроматограмма 1% раствора ПАГМ состава 17 (0,2% натрия метабисульфита) после 24 мес. хранения при комнатной температуре

Описано, что антиоксиданты проявляют стабилизирующее действие по нескольким механизмам: восстанавливают кислород, растворенный в воде; безрадикально разрушают гидропероксиды; взаимодействуют со свободными радикалами (Валевко С.А., 1992; Георгиевский В.П. и др., 1996; Громовая В.Ф. и др., 1996). Поэтому для дальнейших исследований выбирали антиоксиданты, которые, согласно данным литературы, обладают различающимся механизмом. Нами были использованы кислота аскорбиновая и метионин Первоначально их включали в состав в наиболее часто упоминаемых в литературе концентрациях.

Рис.12. Изменение количественного содержания ПАГМ в его 1% растворах, содержащих метионин, кислоту аскорбиновую В составе раствора: -А- контрольный растаор;

- Д - 0,2% метионина;

- ■ - 0,05% кислоты

аскорбиновой;

- и - 0,1% кислоты аскорбиновой;

- • - 0,2% кислоты аскорбиновой.

Срок хранения, мес.

Готовили составы растворов, содержащих 0,2% метионина (0,013 моль/л, состав 19) и 0,05% кислоты аскорбиновой (0,0028 моль/л, состав 20).

Установлено, что в выбранных концентрациях метионин практически не изменяет, а кислота аскорбиновая значительно уменьшает устойчивость ПАГМ в растворе (рис.12). Увеличение концентрации кислоты аскорбиновой до 0,1% (0,0056 моль/л, состав 21) и 0,2% (0,011 моль/л, состав 22) приводит к еще более быстрому ухудшению качества раствора (рис.12).

Известно, что в сочетаниях кислоты аскорбиновой с другими антиоксидантами часто наблюдается эффект синергизма (Башикова Г.Х. и др., 1984; Парфенов Э.А. и др., 1992). Исследовали влияние на стабильность раствора ПАГМ совместного присутствия в его составе натрия метабисульфита и кислоты аскорбиновой в различных концентрациях: 0,2% натрия метабисульфита и 0,05% кислоты аскорбиновой (состав 23), 0,125% натрия метабисульфита и 0,125% кислоты аскорбиновой (состав 24), 0,05% натрия метабисульфита и 0,2% кислоты аскорбиновой (состав 25). Во всех случаях суммарная молярная концентрация антиоксидантов оставалась постоянной (0,013 моль/л).

Установлено, что сочетание указанных антиоксидантов повышает устойчивость раствора во всех случаях по сравнению с контрольным раствором и использованием данных антиоксидантов по отдельности (рис.13). Наиболее стабильным оказался раствор, в который вводили 0,2% натрия метабисульфита и 0,05% кислоты аскорбиновой (состав 23).

Введение в состав раствора кислоты аскорбиновой несколько понижает его рН. Повышение рН состава 23 с помощью натрия гидроксида (состав 26) привело к значительному уменьшению стабильности раствора не только по сравнению с составом 23, но и с контрольным раствором (рис.13).

Рис.13. Изменение количественного содержания ПАГМ в его 1% растворах, содержащих натрия мстабисульфит и кислоту аскорбиновую

В составе раствора: о- контрольный раствор; -А- 0,2% патрия метабисульфита, 0,05% кислоты аскорбиновой;

- □ - 0,125% натрия метабисульфита,

0,125% кислоты аскорбиновой;

- ■ - 0,05% натрия метабисульфита,

0,2% кислоты аскорбиновой;

- • - 0,2% натрия метабисульфита,

0,05% кислоты аскорбиновой, натрия гидроксид до рН 5;

- Д - 0,2% натрия метабисульфита,

0,05% кислоты аскорбиновой, "газовая защита" аргоном.

Срок хранения, мсс

Поскольку на предварительных этапах исследования обнаружено, что решающую роль в процессе разложения играет присутствие кислорода воздуха, приготовлен состав раствора, в который входили 0,2% натрия метабисульфита и 0,05% кислоты аскорбиновой, заполнение и запайка проводились в токе инертного газа (аргон) - состав 28. Установлено, что раствор данного состава стабилен в течение 2 лет хранения при комнатной температуре (рис.13).

Таким образом, на основании полученных результатов, в состав разрабатываемого препарата включены натрия метабисульфит и кислота аскорбиновая в концентрациях 0,2% и 0,05% соответственно. При этом заполнение и запайка ампул должна проводиться в токе инертного газа (аргона). Раствор, разлитый в ампулы из отечественного стекла марки НС-3 или боросиликатного стекла 1-го гидролитического класса, необходимо хранить в защищенном от света месте при температуре от 15°С до 25°С.

Состав препарата "Ы(4)-пропилаймалина гидромалоната раствор для внутривенного введения 10 мг/мл": Ы(4)-пропилаймалина гидромалоната (ФСП42- )

Натрия метабисульфита (ФС(т) 42-0107-03)

Кислоты аскорбиновой (ФС 42-2668-95)

Воды для инъекций (ФС 42-2620-97)

Заполнение и запайка в токе аргона

Разработка технологии препарата ПАГМ (4.2.)

Поскольку ПАПУ! является легкоокисляющимся веществом (п.3.2.-3.3.), технология его инъекционного раствора должна иметь ряд особенностей, что в первую очередь связано с предотвращением взаимодействия с кислородом воздуха на стадиях приготовления, подготовки раствора и ампулирования. Термолабильность ПАГМ необходимо учитывать при выборе и обосновании метода стерилизации. Остальные операции технологического процесса, а именно, подготовку ампул, контроль на герметичность и механические включения, маркировку и упаковку, следует проводить с учетом современных требований к технологии препаратов для инъекций.

Исследовали возможность стерилизации раствора выбранного состава термическим способом (паром под давлением при температуре (121±1)°С). Для этого определяли изменение количественного содержания ПАГМ в растворе после стерилизации и влияние термической стерилизации на стабильность в процессе хранения.

Обнаружено, что содержание ПАГМ в результате термической стерилизации уменьшается в среднем на 0,5% от исходного, принятого за 100% (табл.4). Проводили сравнение стабильности термически стерилизованного

- Юг

- 2 г

- 0,5 г

- до 1 л

раствора и раствора, приготовленного с применением стерилизующего фильтрования с последующим заполнением и запайкой ампул в асептических условиях. Показано, что термическая стерилизация незначительно (в среднем на 1,5%) уменьшает стабильность раствора ПАГМ в процессе хранения (табл.4).

Таким образом, учитывая более высокий уровень надежности термической стерилизации (8АЬ=10'6) в сравнении с асептической технологией (8ЛЬ=10"3), целесообразно в технологии препарата использовать стерилизацию паром под давлением.

Таблица 4

Изменение количественного содержания ПАГМ в растворе выбранного состава после стерилизации и в процессе хранения при комнатной температуре

Срок хранения, мес. Способ стерилизации раствора

термический фильтрование

исходный принято за 100%

после стерилизации 99,5110,90 99,89±1,30

6 99,15±1,10 99,50±1,00

12 98,80±1,10 99,14±1,40

18 97,89±1,30 98,52±1,10

24 96,51±1,00 97,99±1,10

На основании современных исследований (01еШп Б. е1 а1., 2000; Р1еШп Б. ег а1., 2004) наиболее рациональным посчитали предотвращать взаимодействие ПАГМ с кислородом воздуха путем барботирования аргона через раствор, последующим фильтрованием под давлением аргона, заполнением и запайкой в токе аргона. Выбор аргона в качестве инертного газа обоснован ранее (п.3.3.). Выбор технологических параметров данных процессов проводили с учетом полноты удаления кислорода воздуха из системы и временного фактора.

Ниже приведено описание опытно-промышленной технологии раствора ПАГМ для инъекций, согласно которой в условиях опытного цеха ФГУП ГосНИИ особо чистых биопрепаратов приготовлены партии раствора ПАГМ выбранного состава. Полученные партии использовались для фармакологических исследований и установления первоначального срока годности препарата.

Опытно-промышленная технология препарата "Щ4)-пропилаймалина гидромалоната раствор для внутривенного введения 10 мг/мл" Для приготовления раствора использовали воду для инъекций, через которую предварительно барботировали аргон через в течение 15 мин. 2 г натрия метабисульфита и 0,5 г кислоты аскорбиновой растворяли в 600 мл воды для инъекций в аппарате с механической мешалкой, вносили 10 г N(4)-

пропилаймалина гидромалоната и перемешивали при комнатной температуре до полного растворения. Доводили объем раствора до 1 л водой для инъекций, перемешивали в течение 5 мин. Дополнительно барботировали аргон через раствор в течение 15 мин. Раствор фильтровали последовательно через мембранные фильтры с диаметром пор 1 мкм и 0,22 мкм на установке фирмы "Millípore" (США) под давлением аргона. Ампулы заполнялись раствором автоматически шприцевым способом и запаивались способом оттяжки капилляра на полупромышленной установке "Rota" тип R910/41 (Германия). При этом в каждую ампулу из боросиликатного стекла 1-го гидролитического класса (тип D, ISO 9187) вместимостью 1 мл перед наполнением и после него подавался аргон. Запаянные ампулы с раствором стерилизовали насыщенным паром при температуре (121±1)°С и избыточном давлении (0,11±0,02) МПа в течение 8 мин. в стерилизаторе паровом типа ГК-100-2 (Россия). Ампулы проверяли на герметичность погружением в раствор метиленового синего. Контроль на механические включения осуществляли визуально на установке УК-2 (Россия) согласно РД 42-501-98 (Инструкция по контролю на механические включения инъекционных лекарственных средств). Затем ампулы этикетировали и упаковывали. Технологический процесс проводили в соответствии с ГОСТ Р 52249-2004 "Правила производства и контроля качества лекарственных средств".

Разработка методик анализа препарата ПАГМ и его фармакологическое исследование (глава 5) Разработка методик анализа препарата (5.1.)

При разработке методик анализа раствора ПАГМ выбранного состава руководствовались требованиями ГФ XI, ОСТ 91500.05.001-00 "Стандарты качества лекарственных средств. Основные положения". Результаты проведенных исследований использовали при составлении проекта ФСП "N(4)-пропилаймалина гидромалоната раствор для внутривенного введения 10 мг/мл". 1. Идентификация ПАГМ и вспомогательных веществ

Проводили обнаружение как ПАГМ (катионного и анионного фрагментов), так и вспомогательных веществ (антиоксидантов).

Идентификацию ПАГМ (катионного фрагмента) осуществляли с помощью цветной реакции и хроматографическими методами. Использовали цветную реакцию, включенную в раздел "Подлинность" в проект ФСП на препарат "Ы(4)-пропилаймалиния гидромалонат" (субстанция) и ФСП на препарат "Промалин таблетки 20 мг, покрытые оболочкой". При добавлении кислоты азотной концентрированной к препарату появлялось вишнево-красное окрашивание, исчезающее в течение нескольких секунд. Идентификацию хроматографическими методами проводили одновременно с количественным определением. Время удерживания основного пика (ПАГМ) на хроматограмме испытуемого раствора препарата совпадало со временем удерживания основного пика (ПАГМ) на хроматограмме PCO ПАГМ с точностью не менее 98% (время удерживания 5,80±0,05 мин). Также сравнивали положение основных зон анализируемого раствора и раствора PCO ПАГМ на хроматограмме, полученной для количественного определения методом ТСХ-

ДМ (Rf 0,64±0,02). Условия количественного определения приведены ранее (рис.1-3). В проект ФСП на препарат включили метод ВЭЖХ.

Определение малонат-аниона проводили методом ТСХ по модифицированной нами методике, предложенной ранее в проекте ФСП на субстанцию ПАГМ. Отличие заключается в замене метанола на спирт этиловый 96% в хроматографической системе и использовании СОВС кислоты малоновой. Пятно препарата, окрашенное в желтый цвет, находилось на уровне пятна раствора СОВС кислоты малоновой (Рис. 14).

Подтверждение наличия вспомогательных веществ (антиоксидантов) проводили с помощью качественных реакций: натрия метабисульфит -реакцией на сульфиты согласно ГФ XI (вып. 1, стр. 164); кислота аскорбиновая - реакцией с серебра нитратом. При проведении последней (так называемая "реакция серебряного зеркала") использовали аммиачный раствор серебра нитрата.

Рис.14. ТС-хроматограмма 1% раствора ПАГМ (1) и раствора СОВС кислоты малоновой (ТУ 6-09-2608) (2)

Условия анализа: пластина "Сорбфил" ("ПТСХ-П-А-УФ"), 100x100 мм; хроматографическая система спирт этиловый 96%-вода-раствор аммиака 25% (10:1,2:1,6); проявление обработкой 0,2% спиртовым раствором бромтимолового синего, детекция в видимом свете.

Условные обозначения: а - катионный компонент ПАГМ (проявляется синим); б анионный компонент ПАГМ (проявляется желтым).

2. Обнаружение посторонних примесей

Использовали ВЭЖХ или ТСХ в зависимости от метода количественного определения (ВЭЖХ или ТСХ-ДМ). Содержание посторонних примесей определяли с помощью внутренней нормализации. Оценивали содержание примесей по совокупности величины и интенсивности окраски пятен на хроматограмме исследуемого раствора в сравнении с пятнами свидетеля (PCO ПАГМ) - метод ТСХ-ДМ и по соотношению суммы площадей дополнительных пиков и суммы площадей всех пиков на хроматограммах, полученных для количественного определения - метод ВЭЖХ. Содержание единичной примеси не превышало 3%, суммарное содержание посторонних примесей - не более 4%. Нормы установлены на основании результатов наблюдения за препаратом в течение 2,5 лет с учетом требований, предъявленных в проекте ФСП на субстанцию ПАГМ. В проект ФСП на препарат включили метод ВЭЖХ.

3. Количественное определение

Определение количественного содержания ПАГМ проводили методами ВЭЖХ и ТСХ-ДМ по разработанным нами методикам. В проект ФСП на

препарат включили метод ВЭЖХ с использованием субстанции ПАГМ в качестве PCO. Содержание ПАГМ в 1 мл препарата находилось в пределах от 0,0095 до 0,0105 г.

В проект ФСП на препарат включены также показатели: "описание" (прозрачная бесцветная или слепса желтоватая жидкость), "прозрачность" (должен быть прозрачным по сравнению с водой), "цветность" (бесцветный или не интенсивнее окраски эталона №76), "pH" (от 3,5 до 4,5), "механические включения" (соответствие требованиям РД 42-501-98), "номинальный объем" (соответствие требованиям), "пирогенность" (препарат должен быть апирогенным), "стерильность" (препарат должен быть стерильным). Указанные разделы проекта ФСП составлены в соответствии с современными требованиями по результатам исследования препарата в процессе хранения. Фармакологическое исследование препарата (5.2.)

Проводили сравнительную оценку острой токсичности и антиаритмической активности инъекционного раствора и субстанции ПАГМ по методам, описанным в литературе.

Острую токсичность препарата и субстанции ПАГМ определяли при однократном внутрибрюшинном введении (мыши). Для расчета ЛД5о использовали графический метод Литчфилда и Уилкоксона в модификации Рота. Рассчитанные значения ЛД50 составляют: 33,5 (25,0+45,5) мг/кг для препарата и 34,5 (25,4-47,0) мг/кг для субстанции ПАГМ при Р=0,05. Определено, что различие ЛД50 не является статистически значимым. Таким образом, можно заключить, что при введении в состав раствора ПАГМ выбранных вспомогательных веществ его токсичность не увеличивается.

Для оценки антиаритмической активности использовали модель хлоридкальциевой аритмии. Антиаритмическую активность определяли при однократном струйном внутривенном введении по способности предупреждать развитие характерной аритмии. Для расчета ЭД50 использовали графический метод Литчфилда и Уилкоксона в модификации Рота. На данной модели инъекционный раствор ПАГМ показал высокую антиаритмическую активность, величина ЭД50 составила 0,74 (0,54-1,01) мг/кг. Величина ЭД5о субстанции ПАГМ равна 0,79 (0,54-1,14) мг/кг. Максимальная переносимая доза кальция хлорида составила 1000 мг/кг (четырехкратное введение по 250 мг/кг). Определено, что различие ЭД50 не является статистически значимым. Таким образом, установлено, что введение выбранных вспомогательных веществ в состав раствора не уменьшает антиаритмическую активность ПАГМ. Об этом свидетельствует также близкая способность обеспечивать переносимость животными больших доз кальция хлорида и время восстановления ритма после однократного введения аритмогена.

Определение первоначального срока годности препарата (5.3.)

Проводили исследование стабильности партий препарата в предполагаемых условиях хранения (в защищенном от света месте при температуре от 15°С до 25°С). Партии получены в условиях опытного цеха ФГУП ГосНИИ особо чистых биопрепаратов. Анализ растворов осуществляли каждые 6 мес. по показателям, описанным ранее и включенным в проект ФСП

(приложение). По результатам исследования стабильности можно заключить, что первоначальный срок годности 1% раствора ПАГМ для инъекций составляет 2 года.

Выводы

1. Определены ключевые физические и химические факторы, влияющие на устойчивость ПАГМ в водном растворе. Изучено влияние температуры, света, рН, качества субстанции, растворителя, кислорода воздуха на стабильность раствора.

Установлено, что на стабильность раствора ПАГМ в значительной мерс влияет кислород воздуха, а комплекс мер по его удалению способствует получению стабильного препарата. Введение в состав раствора регуляторов рН нецелесообразно. В процессе приготовления раствора ПАГМ особое внимание следует обращать на качество субстанции и температурные режимы процесса. В качестве материала первичной упаковки следует использовать ампулы, изготовленные из бесцветного отечественного или зарубежного химически стойкого стекла (1-го гидролитического класса).

Установлено изменение качественного состава продуктов разложения в зависимости от вариации факторов, воздействующих на стабильность.

2. Определены некоторые кинетические характеристики процесса разложения ПАГМ. Дифференциальным и графическим способами определен ориентировочный порядок реакции разложения, который близок к 1,6. Рассчитанные нами значения констант скорости реакции разложения позволили уточнить температурный коэффициент реакции, который составил около 2,3.

3. Разработан состав стабильного препарата ПАГМ, в который включены натрия метабисульфит в концентрации 0,2% и кислота аскорбиновая в концентрации 0,05%. Установлено, что в составе раствора недостаточно присутствие только одного из данных антиоксидантов. Заполнение и запайку ампул необходимо проводить в токе инертного газа, в качестве которого рекомендован аргон.

4. Обоснована и экспериментально подтверждена технология препарата ПАГМ в виде инъекционного раствора для внутривенного введения. Экспериментально обосновано и признано целесообразным применение термической стерилизации паром под давлением. Согласно разработанной технологии в условиях опытного цеха ФГУП ГосНИИ особо чистых биопрепаратов получены партии раствора ПАГМ выбранного состава.

5. Разработаны методики анализа препарата: методики определения подлинности, в том числе для вспомогательных веществ, методики определения посторонних примесей (ВЭЖХ, ТСХ-денситометрия) и количественного содержания (ВЭЖХ, ТСХ-денситометрия). Сравнительная оценка методик по валидационным параметрам и ряду других критериев показала, что метод ТСХ-денситометрии может служить альтернативным методом ВЭЖХ.

6. Проведены фармакологические исследования препарата. Определено, что различия острой токсичности и антиаритмической активности препарата и субстанции ПАГМ не являются статистически значимыми. То есть введение в

состав раствора выбранных вспомогательных веществ не влияет на острую токсичность и антиаритмическую активность ПАГМ.

7. По результатам проведенных исследований составлен проект ФСП на препарат "Н(4)-пропилаймалина гидромалоната раствор для внутривенного введения 10 мг/мл", стабильный в течение 2 лет хранения.

Список публикаций

1. Шебатин Р.В., Ермакова М.В. Применение электрометрических методов для контроля кислотно-основного взаимодействия слабых природных азотистых оснований с дикарбоновыми кислотами в неводных средах // Молодая фармация. Сборник научных трудов студентов и аспирантов СПХФА. Вып. 3. - Санкт-Петербург, 2000. С. 15-20.

2. Ермакова М.В., Громова Л.И. Изучение стабильности инъекционного раствора соли Ы(4)-пропилаймалина // Здоровье и образование в XXI веке. Тезисы докладов IV международной научно-практической конференции. -Москва, 2003. С. 229.

3. Ермакова М.В., Громова Л.И., Березина B.C. Изучение стабильности инъекционного раствора нового антиаритмического средства // Актуальные проблемы создания новых лекарственных препаратов природного происхождения. Сборник научных статей VII международного съезда. - Санкт-Петербург, 2003. С. 37-38.

4. Ермакова М.В. Разработка состава и технологии нового парентерального антиаритмического препарата // Состояние и перспективы подготовки специалистов для фармацевтической отрасли. Материалы научно-методической конференции. - Санкт-Петербург, 2004. С. 64-65.

5. Ермакова М.В., Громова Л.И., Шебатин Р.В. Разработка состава нового антиаритмического препарата // Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции. Сборник научных трудов. Вып. 59. — Пятигорск, 2004. С. 163.

6. Шебатин Р.В., Ермакова М.В. Стандартизация новой антиаритмической субстанции на основе соли М(4)-пропилаймалиния // Человек и лекарство. Тезисы докладов XI Российского национального кошресса. Москва, 2004. С. 401.

7. Ермакова М.В., Громова Л.И., Петухова Н.М., Березина B.C. Изучение влияния солей кислоты сернистой на стабильность инъекционного раствора соли М(4)-пропилаймалина // Выпускник фармацевтического вуза (факультета) в прошлом, настоящем и будущем. Ма1ериалы международной научно-практической конференции, посвященной 85-летию академии. - Санкт-Петербург, 2004. С. 221-223.

8. Ермакова М.В., Громова Л.И. Влияние некоторых факторов на стабильность инъекционного раствора соли М(4)-пропилаймалина // Фармация. 2004. №4. С. 27-29.

9. Ермакова М.В., Березина B.C., Громова Л.И., Петухова Н.М. Разработка методов количественного определения соли ТЧ(4)-пропилаймалина в растворе в присутствии продуктов разложения // Хим.-фарм. журн. 2005. №4. С. 85-88.

Приложение

Результаты анализа по проекту ФСП партий препарата 1Ч(4)-пропилаймалина гидромалоната раствор для внутривенного введения 10 мг/мл при изготовлении и в процессе хранения

№ партии Требования проекта ФСП, результаты анализа

Описание Подлинность Прозрачность Цветность рН Механ. 1 Посто- Стерильность Содержа "ние ПАГМ (г/мл препарата)*

ВЭЖХ (ПАГМ) тех (анион) Кач р-ия (метаби-сульфит) Кач. реакция (кислота аскорбинов.) чения примеси сумма, %

1 2 3 4 5 6 7 8 ] 9 1 10 -11 12 13

В момент приготовления (24.01.03)

10103 Соотв. Соотв. Соотв. Соотв. Соотв. Прозр. Бесцв. 3,8 Соотв. 0,8 Стерильн. 0.0102

20103 Соотв. Соотв. Соотв. Соотв. Соотв Прозр. Бесцв. 3,7 Соотв. 0,9 Стерильн. 0,0099

30103 Соотв. Соотв. Соотв. Соотв. Соотв. Прозр, Бесцв 3,7 Соотв. 0,8 Стерильн 0,0100

40103 Соотв. Соотв. Соотв. Соотв. Соотв. Прозр. Бесцв. 3,8 Соотв. 0,9 Стерильн. 0,0101

50103 Соотв. Соотв. Соотв. | Соотв. Соотв. Прозр. Бесцв 3,7 Соотв. 0,9 Стерильн. 0,0100

6 мес. хранения (23.07.03)

10103 Соотв. Соотв. Соотв. Соотв. Соотв. Прозр. Бесцв. | 3,7 Соотв. 1,1 Стерильн. 0,0101

20103 Соотв. Соотв. Соотв. Соотв. Соотв. Прозр. Бесцв. 3,6 Соотв. 1,4 Стерильн. 0,0099

30103 Соотв. Соотв. Соотв Соотв. Соотв. Прочр. Бесцв 3,6 Соотв. 1,4 Стерильн. 0,0099

40103 Соотв. Соотв. Соотв. Соотв. Соотв. Прозр. Бесцв. 3,7 Соотв. 1,3 Стерильн 0,0099

50103 | Соотв. Соотв. Соотв Соотв. Соотв. Прозр. Бесцв. 3,6 Соотв. 1.3 Стерильн. 0,0099

12 мес. хранения (24.01.04)

10103 Соотв. Соотв. Соотв. Соотв. Соотв. Прозр. 76 3,7 Соотв. 1,2 Стерильн. 0,0100

20103 Соотв. Соотв. Соотв. Соотв. Соотв. Прозр. 76 3,6 Соотв. 1,5 Стерильн. 0,0099

30103 Соотв Соотв. Соотв. Соотв. Соотв. Прозр. 76 3,7 Соотв. 1,4 Стерильн. 0,0099

40103 Соотв. Соотв. Соотв. Соотв. Соотв. Прозр. 76 3,7 Соотв. 1,5 Стерильн. 0,0098

50103 Соотв. Соотв. Соотв. Соотв. Соотв Прозр. 76 3,7 Соотв. 1,5 Стерильн 0,0099

1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 12 | 13

18 мес. хранения (24.07.04)

10103 Соотв Соотв. Соотв Соотв Соотв. | Прозр. 76 3,8 Соотв 1,5 Стерильн. 0,0099

20103 Соотв Соотв. Соотв. Соотв Соотв. Прозр. 76 3,7 Соотв. 1,6 Стерильн. 0,0097

30103 Соотв. Соотв Соотв. Соотв Соотв. Прозр. 76 3,7 Соотв. 1,5 Стерильн. 0,0099

40103 Соотв Соотв. Соотв. Соотв Соотв. Прозр. 76 3,7 Соотв. 1,6 Стерильн. 0,0097

50103 Соотв. Соотв. Соотв. Соотв. Соотв. Прозр. 76 3,7 Соотв. 1,7 Стерильн. 0,0099

24 мес. хранения (25.01 05)

10103 Соотв. Соотв. Соотв. Соотв Соотв. Прозр. 76 3,9 Соотв. 1,9 | Стерильн. 0,0098

20103 Соотв Соотв Соотв. Соотв Соотв. Прозр. 76 3,9 Соотв. 2,0 Стерильн. 0,0097

30103 Соогв. Соотв. Соотв. Соотв Соотв. Прозр. 76 3,8 Соотв. 1,9 , Стерильн. 0,0097

40103 Соотв. Соотв. Соотв. Соотв. Соотв. Прозр. 76 3,8 Соотв. 2,0 1 Стерильн. 0,0096

50103 Соотв. Соотв. Соотв. Соотв. Соотв. Прозр. 76 3,8 Соотв. 2,1 | Стерильн. 0,0097

30 мес. хранения (26.07.05)

10103 Соотв. Соотв. Соотв. Соотв. Соотв. Прозр. 76 3,8 Соотв. 2,2 , Стерильн. 0,0098

20103 Соотв. Соотв. Соотв. Соотв. Соотв. Прозр. 76 3,8 Соотв. 2,6 Стерильн. 0,0096

30103 Соотв. Соотв. Соотв. Соотв. Соотв. Прозр. 76 3,7 Соотв. 2,0 Стерильн. 0,0097

40103 Соотв. Соотв. Соотв. Соотв. Соотв. Прозр. 76 3,7 Соотв. 2,4 Стерильн. 0,0096

50103 Соотв. Соотв. Соотв. Соотв. Соотв. Прозр. 76 3,8 Соотв. 2,4 Стерильн. 0,0095

Примечания:

опредечение первоначального срока годности проводили при хранении партий в защищенном от света месте при температуре от 15°С до 25°С;

* - результаты приведены как среднее из трех определений.

Юля Заметок-

Юлл Заметок>•

На правах рукописи

Ермакова Марина Владимировна

Разработка инъекционного лекарственного препарата соли 1М(4)-пропилаймалина

Специальность 15 00.01-"Технология лекарств и организация фармацевтического дела

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата фармацевтических наук

Печать Н.В. Андриановой

Подписано к печати 21 09.2005. Формат 60 х 90/16. Бумага гип. Печагь ризограф

Гарнитура «Тайме». Печ. л. 1,5. Тираж 100 экз. Заказ 570 _Санкт-Петербург 2005_

Р176 18

РИБ Русский фонд

2QQ6-4 18124

*

Болезни сердечно-сосудистой системы занимают одно из первых мест в структуре заболеваемости населения России. При этом около трети всех кардиологических больных страдает нарушениями ритма сердца. Нарушения ритма сердца остаются одной из основных причин кардиальных смертей, а их лечение — одной из наиболее сложных задач кардиологии [27,39,68]. В настоящее время используется как лекарственная терапия, так и немедикаментозные методы лечения аритмий. Фармакотерапия является одним из наиболее доступных и распространенных методов [24,71]. К числу узко специализированных и, следовательно, наиболее эффективных антиаритмических препаратов, находящих применение только в аритмологии, относятся не более 10% препаратов, показанных для лечения сердечных аритмий. Большинство препаратов этой группы обладает рядом серьезных побочпых эффектов, и доля отечественных препаратов, представленных на российском рынке, весьма незначительна [56,72].

Исследования отечественных и зарубежных авторов показали, что четвертичные производные аймалина - алкалоида растений рода ИлтуоШа, в частности, соли N(4)-пропилаймалина, относятся к числу высокоэффективных и перспективных антиаритмических средств. С точки зрения баланса эффективности и безопасности, четвертичные производные аймалина выгодно отличаются от большинства других узко специализированных антиаритмических средств [76,65]. В Санкт-Петербургской государственной химико-фармацевтической академии (СПХФА) уже длительное время проводятся исследования по созданию противоаритмических препаратов па основе солей К(4)-пропилаймалина [41-44,59-60]. В частности, разработан состав и технология таблеток М(4)-пропилаймалина бромида, покрытых оболочкой. Однако данное соединение практически нерастворимо в воде, что сильно ограничивает возможности получения инъекционного препарата на его основе. Для оказания экстренной помощи в случае угрожающих жизни аритмий, особенно желудочковых, которые являются одним из основных показаний к применению препаратов солей К(4)-пропилаймалина, незаменимы инъекционные лекарственные средства. На отечественном рынке лекарственных средств в настоящий момент отсутствуют инъекционные препараты на основе производных аймалина.

Ранее в СПХФА был осуществлен синтез, исследование биологической активности и физико-химических свойств некоторых водорастворимых солей М(4)-пропилаймалина с ароматическими сульфокислотами (Ъ1(4)-пропилаймалина бензолсульфонат) [59-60] и карбоновыми кислотами [71,73-74]. Обнаружено, что максимальной терапевтической широтой обладает М(4)-пропилаймалина гидромалонат, для которого также определены наибольшие выраженность и длительность антиаритмического действия. Растворимость М(4)-пропилаймалина гидромалоната в воде позволяет получать его растворы с концентрацией до 6% [71]. Таким образом, сделан вывод, что данное соединение наиболее перспективно в ряду рассмотренных солей М(4)-пропилаймалина для разработки отечественного высокоэффективного парентерального препарата, предназначенного для лечения нарушений ритма сердца. Поэтому создание препарата на основе N(4)-пропилаймалина гидромалоната является актуальным. Цель и задачи исследования

Целью настоящей работы являлась разработка лекарственного препарата N(4)-пропилаймалина гидромалоната (ПАГМ) в виде раствора для инъекций. Задачи исследования:

1. Изучить стабильность водного раствора ПАГМ, влияние физических и химических факторов на стабильность раствора и определить комплекс мер по его стабилизации;

2. Обосновать состав и разработать технологию лекарственного препарата ПАГМ;

3. Разработать методики анализа лекарственного препарата;

4. Провести фармакологическое исследование лекарственного препарата;

5. Установить первоначальный срок годности лекарственного препарата;

6. Составить проект фармакопейной статьи предприятия на препарат "N(4)-пропилаймалина гидромалоната раствор для внутривенного введения 10 мг/мл".

Научная новизна

1. Обоснован состав лекарственного препарата ПАГМ в виде раствора для инъекций, стабильного в течение 2 лет хранения. Показано, что применение в качестве антиоксидантов только солей кислоты сернистой мало влияет на устойчивость ПАГМ в растворе. Установлено, что для получения стабильного раствора необходимо совместное введение в его состав 0,2% натрия метабисульфита и 0,05% кислоты аскорбиновой.

2. Впервые разработана методика ТСХ-денситометрии для количественного определения ПАГМ в 1% растворе в присутствии продуктов разложения. Показано, что по метрологическим характеристикам данный метод не уступает ВЭЖХ применительно к исследуемому объекту.

3. Предложена оригинальная хроматографическая система для разделения продуктов разложения ПАГМ методом ТСХ. Показано различие в качественном составе продуктов разложения при изменении факторов, влияющих на стабильность раствора, получены УФ спектры некоторых продуктов разложения.

4. Исследовано влияние физических и химических факторов на стабильность раствора ПАГМ. Определена область рН наибольшей устойчивости ПАГМ. Впервые рассчитаны некоторые кинетические характеристики процесса разложения ПАГМ в водном растворе.

Практическая значимость

Разработаны состав, технология и методы стандартизации высокоэффективного антиаритмического препарата. По разработанной технологии получены опытные партии препарата в условиях опытного цеха ФГУП ГосНИИ особо чистых биопрепаратов. По результатам хранения опытных партий препарата установлен его первоначальный срок годности. Составлен проект ФСП на препарат "Н(4)-прогшлаймалина гидромалоната раствор для внутривенного введения 10 мг/мл".

Выводы

1. Определены ключевые физические и химические факторы, влияющие на устойчивость ГТАГМ в водном растворе. Изучено влияние температуры, света, рН, качества субстанции, растворителя, кислорода воздуха на стабильность раствора.

Установлено, что на стабильность раствора ПАГМ в значительной мере влияет кислород воздуха, а комплекс мер по его удалению способствует получению стабильного препарата. 'Введение в состав раствора регуляторов рН нецелесообразно. В процессе приготовления раствора ПАГМ особое внимание следует обращать на качество субстанции и температурные режимы процесса. В качестве материала первичной упаковки следует использовать ампулы, изготовленные из бесцветного отечественного или зарубежного химически стойкого стекла (1-го гидролитического класса).

Установлено изменение качественного состава продуктов разложения в зависимости от вариации факторов, воздействующих на стабильность.

2. Определены некоторые кинетические характеристики процесса разложения ПАГМ. Дифференциальным и графическим способами определен ориентировочный порядок реакции разложения, который близок к 1,6. Рассчитанные нами значения констант скорости реакции разложения позволили уточнить температурный коэффициент реакции, который составил около 2,3.

3. Разработан состав стабильного препарата ПАГМ, в который включены натрия метабисульфит в концентрации 0,2% и кислота аскорбиновая в концентрации 0,05%. Установлено, что в составе раствора недостаточно присутствие только одного из данных антиоксидантов. Заполнение и запайку ампул необходимо проводить в токе инертного газа, в качестве которого рекомендован аргоп.

4. Обоснована и экспериментально подтверждена технология препарата ПАГМ в виде инъекционного раствора для внутривенного введения. Экспериментально обосновано и признано целесообразным применение термической стерилизации паром под давлением. Согласно разработанной технологии в условиях опытного цеха ФГУП ГосНИИ особо чистых биопрепаратов получены партии раствора ПАГМ выбранного состава.

5. Разработаны методики анализа препарата: методики определения подлинности, в том числе для вспомогательных веществ, методики определения посторонних примесей (ВЭЖХ, ТСХ-денситометрия) и количественного содержания (ВЭЖХ, ТСХ-денситометрия). Сравнительная оценка методик по валидационным параметрам и ряду' других критериев показала, что метод ТСХ-денситометрии может служить альтернативным методом ВЭЖХ.

6. Проведены фармакологические исследования препарата. Определено, что различия острой токсичности и антиаритмической активности препарата и субстанции ПАГМ не являются статистически значимыми. То есть введение в состав раствора выбранных вспомогательных веществ не влияет на острую токсичность и антиаритмическую активность ПАГМ.

7. По результатам проведенных исследований составлен проект ФСП на препарат "N(4)-пропилаймалина гидромалоната раствор для внутривенного введения 10 мг/мл", стабильный в течение 2 лет хранения.