Автореферат и диссертация по фармакологии (15.00.02) на тему:Разработка и стандартизация лекарственных препаратов Тыквеол и Тыквит, изготавливаемых из семян тыквы по безотходной технологии

Мб ол

На правах рукописи

9 Ц ДОИ и

Михалёв Владимир Юрьевич

"РАЗРАБОТКА И СТАНДАРТИЗАЦИЯ ЛЕКАРСТВЕННЫХ ПРЕПАРАТОВ ТЫКВЕОЛ И ТЫКВИТ, ИЗГОТАВЛИВАЕМЫХ ИЗ СЕМЯН ТЫКВЫ ПО БЕЗОТХОДНОЙ ТЕХНОЛОГИИ"

15.00.02-Фармацевтическая химия и фармакогнозия Автореферат

диссертации на соискание учёной степени кандидата фармацевтических наук

Москва -1997 г.

Работа выполнена в Московской медицинской академии имени И. М. Сеченова

Научные руководители:

Член-корреспондент РАО, доктор фармацевтических наук, профессор В. А. Попков

Доктор фармацевтических наук, профессор И. А. Самылина Официальные оппоненты:

Член-корреспондент МАИ, доктор фармацевтических наук, профессор Д. М. Попов

Доктор фармацевтических наук, профессор В. С. Бабаскин Ведущая организация: Государственный научно-исследовательский институт по стандартизации и контролю лекарственных средств

Защита состоится "_"_199_ г. в_часов

На заседании диссертационного совета Д 074.05.06 при Московской медицинской академии им. И. М. Сеченова (г. Москва, Никитский бульвар, 13)

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке Московской медицинской академии им. И. М. Сеченова по адресу: г. Москва, Зубовская площадь, дом 1. Автореферат разослан "_"_ 1997 г.

Ученый секретарь

Диссертационного совета Д 074.05.06 Кандидат фармацевтических наук, доцент

Н. П. Садчикова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

Актуальность темы. Одно» из основных проблем при создании фитопрепаратов остается высокая их себестоимость, что обусловлено низкой утилизацией перерабатываемого лекарственного растительного сырья. Примеры комплексного использования лекарственного растительного сырья по принципу безотходной технологии, к сожалению, немногочисленны. Вместе с тем, использование большого количества групп биологически-активных веществ, с учетом создания рациональных технологических процессов , позволяющих извлекать из растительного объекта максимальное число фракции разнообразной фармакологической направленности, позволит значительно расширить область их терапевтического применения.

Семена тыквы традиционно используются в медицинской практике в качестве антпгельминтного средства. Антигельминтные свойства обусловлены наличием в них редкой аминокислоты кукурбптнн. Протпвоцестодная активность данного лекарственного растительного сырья ниже, чем у синтетических препаратов, что во многом обусловлено низкой биологической доступностью вследствие высокого содержания в семенах тыквы лппидного комплекса, оказывающего противовоспалительное действие.

Учитывая вышеизложенное, изучение п анализ семян тыквы в качестве источника биологпчески-актпвпых веществ гидрофильной н гидрофобной природы с целью создания безотходной технологии переработки данного лекарственного растительного сырья является весьма актуальной задачей.

Настоящее исследование позволит расширить ассортимент

отечественных лекарственных средств растительного происхождения с параллельным созданием экологически чистой технологии.

Цель и задачи исследования. Основная цель данной работы - создание безотходной технологии переработки семян тыквы с параллельной разработкой новых и унификацией существующих методов стандартизации получаемых препаратов.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить

следующие задачи:

1. Разработать и обосновать условия выделения лппидного комплекса семян тыквы, обеспечивающие выход и экологическую чистоту получаемого продукта, так же как и всего технологического процесса в целом.

2. Изучить фармакологическую активность лнпидного комплекса, именуемого в дальнейшем "Тыквеол".

3. Изучить фармакологическую активность обезжиренных измельченных семян тыквы именуемых, в дальнейшем "Тыквит".

4. Разработать методики для стандартизации "Тыквеола" и "Тыквита", позволяющие надежно контролировать их качество.

5. Разработать технологический регламент производства названных препаратов по принципу безотходной технологии.

6. Обобщить полученные данные и разработать проекты Временных Фармакопейных Статей (ВФС) на препараты "Тыквеол" и "Тыквит".

Научная новизна. На основании комплексных фармакологических исследований на лабораторных животных, а так же биохимических тестов впервые доказана высокая гепатопротекторная активность липидного комплекса семян тыквы ("Тыквеола"). Впервые установлено наличие репара-тивного действия "Тыквеола" в деструктивно измененных

тканях желудочно-кишечного тракта, а с целью максимального сохранения биологически-активных веществ в липндном комплексе семян тыквы впервые предложен способ "мягкого" прессования в щадящем температурном решении.

Разработаны методы стандартизации "Тыквеола" и "Тыквита", включающая определение физико-химических констант, жирнокислотного состава, количественное определение каротиноидов и токоферолов в "Тыквеоле", а так же определение специфической аминокислоты кукурбитин в "Тыквите". Предложены характеристики подлинности препарата

"Тыквит", включающие микроскопическое исследование порошка обезжиренного жмыха семян тыквы.

Впервые проведено исследование стабильности в процессе хранения препаратов "Тыквеол" и "Тыквит". Изучена микробиологическая чистота препаратов "Тыквеол" и "Тыквит". Впервые предложена технологическая схема производства фитопрепаратов из единого лекарственного растительного сырья (семена тыквы) по принципу безотходной технологии, позволяющая осуществлять практически полную утилизацию растительного сырья.

Степень новизны проведенных исследований подчеркивается положительными рекомендациями ВНИИГПЭ о выдаче патентов РФ N 2001620 " Гепатопротекторное средство " ; N 2001623 "Регенеративное средство

Таблица 1.

Показатели функционального состояния печени крыс притоксическом поражении четыреххлористым углеродом. (3 суток.)

+------------------------------------------------------------------+

I Исследуемые пока-! Беэ лечения! На фоне лечения } Контроль

I затели и единицы ! н-------------------------!

I измерения ! | Тыквеол ! Эссенциале |

¡Общий белок, г/л ! -П,94±3,29! 74.9+2,86 ! 75,42+3,96 ¡80,5414,09

1Альбумины, г/л 141,12+3,33 ¡34,47+2,13 ¡39,17+1,85 !42,99+3,24

{а!а2-глобулины,г/л!10,57±1, 43 ¡8,31±0,94 !9,24±0,81 '9,68±1,44

}р2 -глобулины, г/л!8,55+2,09 12,62±1,25 ¡12,49+1,13 ¡12,83+0,96

} у -глобулины, г/л|14,б1±2,43 21,44+1,95 17,40+1,14 19,80±1, 89

|Аспарагиновая Iтрансаминаза, ! ммоль (ч л) |4,23±0,18 1 1 '4,26+0,26 1 !3,94±0,10 1 1 ¡2,86+0,14 1 1

{Щелочная фосфатаза\2,45±0,18 ' ммоль/л 2,27+0,19 1 ¡2,36+0,12 ¡2,48+0,14 1

{Общие липиды г/л 1 1 ¡1,62+0,11 1 ¡1,32+0,11 1 ¡1,75+0,15 1 {2,16±0,22 ■

} р-липопротеиды ! г/л ¡0,230+0,036 1 1 0,268+0,11 . ¡0,288+0,063 1 1 0,465 + 1 0,058

|Альдолаза ммоль/л ¡0,080+0,006 0,081+0,009 ¡0,090+0,076 {0,120±0,01

(Холинэстераза } ммоль/л ¡0,7910,10 1 0,99+0,11 0,92+0,11 1 1 !0,96±0,14 1 1

{Каталаза мкат/л !8,35±1,31 6,13+0,52 6,00+0,82 !6,85±1,05

{Мочевина крови, }• ммоль/л 15,93±0,23 ( 4,95+0,26 5,17+0,19 1 ¡5,01+0,22 1 1

Таблица 2.

Показатели активности ферментов печени животных контрольной и подопытных групп по данным гистохимического исследования (3 суток с начала интоксикации четыреххлористым углеродом). +------------------------------------------------------------------+

J Исследуемые! Контроль | Без лечения ! На фоне лечения

! ферменты J +---------------ь----------------------------

,' | Jабсол. J в % к} Тыквеолом ' Эссенциале

I J I звачен. 1 контр. +--------------+--------------

! ! II!абсол. j в % к!абсол. ! в % к

! | ! ! !значен.j контр.!значен.|контр.

+-

Пероксидаза} 0, ,041 1 t 0, ,048 1 1 +17 : о, ,045 ! +9 ! 0, ,048 \ +17

Лактатдегид! рогеназа { 0, , 408 1 1 1 0, ,342 1 1 1 -16 i ,316 i -22 1 ! 0, 1 1 ,293 1 1 1 -28

НАДФ-диафо-} раза 0, ,256 1 1 1 0, .258 j - 1 о, 1 ,263 ! +3 1 1 0, 1 1 ,235 ! i i -8

Сукциыатде-| гидрогеназа1 0, ,181 ! 1 о, . 1*75 < 1 1 -3 i о, i i ,150 j -17 ! 0, 1 ,138 ! 1 -23

! ос-глицеро- | ! фосфатдегид 1 ¡рогеназа i

¡Глжжозо-6- J

¡фосфатаза ! +-------------

0,155 | 0,167 1 +8 ! 0,161 | +4 | 0,152 ! -1 I I ! _ 1 __ I I

0,106 | 0,137 ! +29 ! 0,135 ! +27 [ 0,135 ! +27

Таблица 3.

Показатели функционального состояния печени крыс притоксическом поражении четыреххлористым углеродом. (7 суток.)

+------------------------------.------------------------------------+

| Исследуемые пока-¡Без лечения' На фоке лечения ! Контроль !

1 затели и единицы .{ +------------------------} !

! измерения | | Тыкв со л ! Эссегщиале |

¡Общий белок, г/л ¡79,5911,07 ¡71,61+1,67 ¡76,0011,94 } 76,72+1, 67 ¡'

+------------------+-----------+-----------------------+----------I

¡Альбумины, г/л ¡39,73+2,12 ¡39,57+4,06 +------------------+-----------+----------

¡а1а2-глобулины,г/л!6,6311,01 ¡9,38+1,82 +------------------+-----------+----------

! Р -глобулины, г/л116, 79+1,54 +------------------+-----------

1 у-глобулины, г/л!19,42+1,87 +------------------+----------

'Аспарагиновая ¡4,55+0,016

Iтраксаминаза, !

! ммоль (ч л) J +------------------+----------

¡Щелочная фосфатаза!1,34+0,26

| ммоль/л i +------------------+----------

¡Общие липиды г/л ¡1,49+0,40

¡38,52+2,42 I5,12±1,10 !10,75±2,02 ¡12,52+1,55 i17,57±2,10 ¡18,69+2,10

¡34,02+1,95)

-+----------!

¡9,97+0,72 j

{3,88±0,11 13,96±0,027

¡10,37±1,24!

_ J___________ |

! 21,89±2,39 I' _ 1. _ _________(

¡3,76+0,16 I

■+-------

!1,58±0,

Р -липопротеиды г/л

¡1,77+0

• I

I I

+-----------+------

¡0,35+0,007 '0,4510

33 05

! 1,12±0,21 I

¡1,7610,12

¡Альдолаза ммоль/л ¡0,1610,008 +------------------+-----------

¡Холинэстераза ¡0,8810,11

! ммоль / л ! +------------------+-----------

¡Каталаза мкат/л +----------------

¡Мочевина крови,

' ммоль/л +----------------

¡0,1810 ¡0,5810

016 015

078

¡0,3710,008 t I

•+-----------

¡0,1610,012 ¡0,6010,10

¡1,27+0,43

I

¡2,1110,08 I

¡0,4510,008

1 0,2110,017 ¡0,86+0,14

¡3,6110,56 ¡3,6210,25

¡7,8810, ¡3,20+0,

99 22

¡8,6411,67 ¡3,3710,16

I6,7712,22 ¡3,4610,29

Таблица 4

Показатели активности ферментов печени животных контрольно» и подопытных групп по данным гистохимического исследования (7 суток с начала интоксикации четырех-хлористым углеродом).

¡Исследуемые¡ Контроль ¡ферменты ¡

!Пероксидаэа j 0,028 +-----------+------

¡Лактатдегид]0,330 ¡рогеназа ¡

¡НАДФ-диафо-¡0,192 ¡раза !

Сукцинатде- J 0 ,142 ¡гидрогеназа¡

! а-глицеро- ! 0,252 J фосфатдегид ¡ ¡рогеназа ¡

!Глюкозе-6- |0,122 ¡фосфатаэа ¡ 4-------------------

Без лечения

абсол. ! в % к значен.¡контр.■

0,025 ¡-10 0,337 ¡+2

0,220 1+14

0,158 ¡+11 0,057 ¡+9

0,118 ¡-2

На фоне лечения

Тыквеолом

абсол. значен.

0, 026

0,275 0,197

0,140 0,061

0,111

в % к контр.

-6

-16 +2

-1

+17

Эссенциал©

абсол. I в % к значен.¡контр.

0,025 ¡-10 0,263 ¡-20

I

0,183 ¡-4

0,138

0,055 ¡+5

0,105 ¡-14

2

8

Таблица 5.

Показатели функционального состояния печени крыс притокснческом поражении четыреххлорпстым углеродом. 14 суток.)

¡ Исследуемые пока-i Без лечения¡ На фоне лечения ¡ Контроль ¡

¡ зателн и единицы ¡ ч-------■------------------{ {

{ измерения | ¡ Тыквеол ' Эссенцияле ¡ I +------------------+-----------+-----------+------------+----------1

¡Общий белок, г/л ¡93,31±2,07 ¡94,82±2,23 ¡ 96,29+2,24 ¡91,13+3,961 +------------------+-----------+-----------+------------+----------¡

¡Альбумины, г/л ¡42,11±3,46 ¡43,82+1,94 ¡ 43,43+2,97 ¡46,37+3,491

+------------------+-----------+-----------+------------+----------I

!а1а2-глобулины,г/л!9,48+0,93 ¡10,6611,23 ¡ 10,24+0,79 ¡7,30+1,30 ! +-------------------h-----------+-----------+-------------h----------¡

¡ ß—глобулины, г/л',16,66±1,54 ¡14,96+1,32 ¡ 17,07+0,97 ¡16,28+1,87! +------------------+-----------+-----------+------------+----------¡

¡ у-глобулины, г/л¡22,89+0,79 ¡24,43+1,34 ¡ 25,9511,59 ¡23,16+1,59!

+------------------+-----------+-----------+-------------и----------¡

¡Аспарагиновая ¡2,48+0,10 ¡2,4 3+0,053 ¡ 2,40+0,095 ¡2,61+0,155 1

¡трансаминаза, ! ! ¡ ! !

¡ ммоль (ч л) ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ +------------------+-----------+------------------------+----------¡

¡Щелочная фосфатаза! 1,65+0,78 ',1,63+0,12 ¡ 1,2810,73 ',1,7010,19 ¡

¡ ммоль/л !!! ! ! +------------------+-----------+-----------+------------+----------¡

¡Общие липиды г/л ¡1,51+0,17 ¡1,56+0,12 ¡ 1,25±0,077 ¡1,88±0,22 ¡ i til*«

■ i i i i < +------------------+-----------+-----------+------------+----------¡

¡ ß-липопротеиды ¡0,93+0,013 ¡0,67+0,12 ¡ 0,8110,088 ¡0,4010,0461

! г/л ! ! ! i ! +------------------+-----------+.-----------+------------+----------¡

,'Альдолаэа ммоль/л ¡0,26±0,007 ¡0,26+0,008 ¡ 0,24+0,007 ¡0,2710,0151 +------------------+-----------+-----------+------------+----------,

¡Холинэстераза ¡0,9910,11 ¡0,92+0,064 ¡ 1,2510,12 ¡1,05±0,064¡

¡ ммоль/л ! ! ¡ i¡ +------------------+-----------+-----------+------------+----------¡

¡Каталаза мкат/л ¡6,78+1,34 ¡4,67±0,60 ¡ 6,66±0,93 ¡ 5,91+0,91¡ +------------------+-----------+-----------+---------.---+----------i

¡Мочевина крови, ¡4,28+0,26 ¡3,6910,25 ¡ 3,90+0,24 ¡4,2810,31 ¡

¡ ммоль/л ¡ ¡ ¡ I ¡ +------------------------------------------------------------------+

Таблица 6.

Показатели активности ферментов печени животных контрольной и подопытных групп по данным гистохимического исследования (14 суток сначала интоксикации четыреххлористым углеродом).

Исследуемые! Контроль) Без лечения ' ферменты {

На фоне лечения

+-------

!абсол. !значен.

в % к 1 Тыквеолом

контр.+--------------

!абсол. ! в % к

I {значен. контр.

1Пероксидаза' 0,032 | 0,032

0,031 | -3

)Лактатдегид,1 0,292 1рогеназа !

0,247 ! -15 I

0,262 ) -10

!НАДФ-диафо-! 0,127 ¡раза !

0,115

-9

0,126

!Сукцинатде-| 0,086 Iгидрогеназа)

0,088

+3

0,100

+16

-------------|

Эссендиале {

абсол. I в % к значен.|контр.

0,032 |

0,217 I -25

0,103 ', -18

0,081

! а-глицеро-! 0,081 !фосфатдегид1 !рогеназа I

0,087

+8

0,088

+9 | 0,086 | +6

IГлюкоэо-б-

|фосфатаза +-----------

0,091

0,100

+ 9

0,096

+6

0,091

Было установлено, что через трое суток у всех групп животных происходило нарушение функционального состояния печени. Наблюдали (таблица 1) резкое повышение активности аспарагиновои ( Р<0,001 ) и аланн- новой ( Р<0,001 ) амшготрансфераз. Кроме того, у крыс 1 и 2 групп отметили снижение общих липидов в плазме крови, что является показателем нарушения жирового обмена. Активность альдолазы достоверно была снижена (Р<0,01 ;<0,02;0,05 соответственно по группам животных ). При гистологическом исследовании через трос суток с начала интоксикации у животных всех групп наблюдали жировую дистрофию печени, однако у крыс,, леченных "Тыквеолом" , она была менее выражена. Сопровождалось это ( таблица 2. ) угнетением в ткани печени гликолитических процессов ( лактатдегидрогеназы-ЛДГ и сукцииатде-гидрогеназы - СДГ) и повышением глюкозо-6-фосфатазы.

Биохимические исследования крови на 7-е сутки эксперимента показали, что токсический гепатит у нелеченных крыс оставался ярко выраженным по сравнению с животными, получавшими препараты. У крыс II группы отмечали нормализацию практически всех показателей функционального состояния печени, за исключением лишь общих липидов, которые были достоверно снижены (Р<0,01),

5

(таблица 3), но в меньшей степени, чем у нелеченных крыс к крыс, получавших эссенциалле. При гистохимическом исследовании печени группы крыс, получавших " Тыквеол", была устаиовлеина тенденция снижения реакции на ЛДГ(па 16% от контроля), в отличие от животных, получавших эссенциале ( таблица 4). Таким образом, через 7 суток после введения 4 ХУ в дозе 1/10 ЛД50 начинается спонтанное восстановление структуры печени. Следует отметить, что терапия "Тыквеолом" способствовала практически полной нормализации как структуры печени, так и функционального ее состояния.

По результатам исследований, проведенных в конце эксперимента ( 14-ые сутки опыта), было установлено, что произошло полпое восстановление функционального состояния печени крыс, леченных "Тыквеолом".

Повышение уровня р -липопротеидов в их крови, хотя и было достоверным , но не превышало физиологического колебания контроля ( таблицы 5; б ). Более существенно этот показатель изменялся у нелеченных животных ( Р<0,002 ) и животных, леченных эссенциале (Р<0,001). На основании проведенных исследований установлено, что "Тыквеол" оказывает выраженное гепатопротекторное действие и может быть применен для лечения токсического поражения печени.

Учитывая, что препарат "Тыквит" представляет собой обезжиренный жмых семян тыквы, мы сочли целесообразным изучить его специфическую антигельмшггпую активность. Антигельмннтные свойства "Тыквита" изучали на мышах, зараженных карликовым цепнем ( Нутепо1ер15 папа ). Штамм получали от мышей, зараженных пшенолелпсами. Мышиная модель гельминтоза как адекватная широко используется в России и за рубежом для хранения противоцестодных препаратов н разработки терапии таких гельминтозов как гименолеппдоз, тениарннхоз, дпфнллоботриоз. Молодым мышам весом 8 г вводили орально 110-150 яиц карликого цепня. На 13-ый день мышей лечили, а по истечении суток от момента назначения аптигельминтака вскрывали и подсчитывали цестод в кишечнике. Контрольная группа мышей не получала препарата. Активность каждой серии жмыха семян тыквы определяли па группах из 20 мышей. Жмых семян тыквы ("Тыквит") вводили в виде водной суспензии в объёме 0,5 мл. Для удаления открепившихся паразитов назначали слабительное (касторовое масло). В результате проведенных исследований установлено, что все образцы препарата "Тыквит" оказывают противоцестодное действие, обеспечивающее излечение мышей на 76,1%.

Изучение безвредности препаратов "Тыквеол" и "Тыквит". Острую токсичность определяли на 130 белых беспородных мышах-самцах одного

возраста ( масса 18-20 г ) и 120 крысах обоего пола ( масса 120-170 г ). " Тыквит " в виде водной суспензии и " Тыквеол" вводили животным внутрижелудочно. Вводимые дозировки 5 г/кг, Юг/кг, 15,20,50 г/кг. Наблюдение за животными проводили в течение 10 дней - гибели не было.

Хроническую токсичность " Тыквита " и " Тыквеола" изучали в тече- ние 6 месяцев на крысах, которых разделили на опытные и контрольные группы. Животным опытной группы вводили ежедневно внутрижелудочно суспепзшо "Тыквита" и " Тыквеола " в дозе 20 г/кг. За животными наблюдали в течение 7 месяцев - гибели не было.

Проведенные исследования позволили сделать вывод об отсутствии токсического влияния препаратов "Тыквит" и "Тыквеол" па организм.

Разработка методов стандартизации препарата "Тыквеол". Препарат "Тыквеол", представляющий собой лппидный комплекс семян тыквы, полученный методом прессования, представляет собой маслянистую жидкость бурого цвета с зеленоватым оттенком, с характерным запахом и вкусом.

Анализ препарата " Тыквеол " проводили согласно требованиям общей статьи ГФ X "Масла жирные" и соответствующих методик ГФ XI, пере-кнсиое число определяли нозиметричеекп в соответствии с ГОСТ 8285-74.

"Тыквеол" практически нерастворим в этиловом спирте, воде, легко растворяется в хлороформе, гексане, дпэтнловом эфире. Значения показателен качества препарата " Тыквеол " при анализе различных серии колебались следующим образом (таблнца7).

Учитывая, что жнрнокнелотиын состав липндиых комплексов растительных объектов часто является специфическим, подлинность препарата "Тыквеол" устанавливали по содержанию жирных кислот.

" Тыквеол " подвергали гидролизу и этерефпцировали по известной методике. Полученные метиловые эфпры жирных кислот анализировали с использованием метода газо-жидкостпои хроматографии ( ГЖХ ). Анализ проводился на приборе "Биохром-1" с пламенно-ионизационным детектором ( 1x10А), колонка кварцевая капиллярная длиной 30 м, диаметром 0,25 мм с ДВ-WAX ( 0,25 мкм ) температура колонки 200°С, температура испарителя 280°С, газ-носитель - гелий,

'Гиблнии 7.

!<=(« ж х Й b

if ^ 1; S е в

IÏI

Ь t fc

Ш

ё е f:

о о о о о

О О О О О

frí.^ trtrtr^

SOGE С-; H H ë H H

! '■■

i „' il •

¡T

is i

ГЧГЧПГЧП ISÏIÏ

£ s t С с

EE G EG i; i; ;; ¡; CBf t¡ ft

O O O O L O O O O C.

R g R g P

5. u. £ >. i;.

ü Í: U r.

O O O O O

GGGI-G

U. U. U

M V\ 'Л f-

! o wi V"» ч

z: ä S

h-

ú¡

1ШШМ

Й-

ñ à Mü=

T> '' " s S 'J ■i 5 s il S. ? ^ s 'я : а

ст> «г <л ^

^ Oí Я

О ö о о —

RRRR!

р. е с с с

о о О о о

3 S 2 3 S

• >r w, V

•л\0г«01 ^ «*> ю fi n Kl Os (74 ON СЛ <7ч О o cío О

G G G Й e

£ fc V,

О it о о

t^r» Ю (WO ОЧ Оч <л сгч </•> ооооо

О с* о о о о

q q s ñ :

Ç. .fc ?; с

RRERI

IUI"'

PCCC.

о о о о о

3 3 3 s s

ч er» U* Us VV J •— о — о

RRRRR

С 14'

с к e e

ооооо

3 3 3 3 2

ППЧЧГ,

sc а: а sc х ststt

í; Ó' S f: G

ß с ë £ f:

ЧЧЧЧЧ s X s: a: a:

H I- И t* J- J

f; G G G Gj H й В p pi

о о о о о I

О О О О О !

» СО ЬО injOi «

О) A (D » »

t S С Е Е >. •>. S\ t. f.

Г» rx —•

R R R R R §

ÜJCCC

liffi e r- e r. fi

о о P о о

3 3 3 3 s

о — о — о

j г; с e pi

Е- H- & & b'i t- » -О <J O O o I

Р=15 ( 0,9 атм ), самопишущий потенциометр - 10 лев, скорость диаграммной ленты 0,5 см/мин, объём вводимой пробы 3 мкл.

Последовательность выхода пиков на хроматограмме: 1. метиловый эфир пальмитиновой кислоты, 2. метиловый эфир стеариновой кислоты, 3. метиловый эфир олеиновой кислоты, 4. метиловый эфир лннолевой кислоты, 5. метиловый эфир ли- ноленовой кислоты. Параллельно в тех же условиях проводилось хрома- тографирование стандартных растворов жирных кислот . Общий вид хроматограммы метиловых эфиров жирных кислот препарата " Тыквеол ", представлен на рисунке 1.

Таким образом, в "Тыквеоле" идентифицировано и количественно определено 5 жирных кислот (таблица 8).

Таблица 8.

Качественный и количественный состав жирных кислот

препарата "Тыквеол" различных серий. +-----------------------------------------------------------------+

¡Качественный состав 1 Содержание жирных кислот <%) !

¡жирных кислот. ¡в "Тыквеоле" различных серий. |

> у---------------------------------------------1

! ! N серии ¡К серии !N серии ¡И серии ¡Ы серии !

| | 50694 | 60794 | 71094 | 81194 | 10195 I

¡Пальмитиновая ! 8,5 7,0 | 7,1 ! 7,0 | 8,0 1

+-------------------+---------+--------+--------+--------+--------I

¡Стеариновая | 6,3 ! 5,4 | 5,4 ! 6,2 | 6,1 |

+-------------------+—,------+--------+--------+--------+--------I

¡Олеиновая | 25,5 1 28,9 ! 26,0 27,6 1 27,6 |

+-------------------4---------4---------+--------+--------+--------|

¡Линолевая 1 51,7 | 55,3 1 56,5 ! 55,2 | 55,2 |

¡Линоленовая | 5,0 ! 3,3 | 4,0 | 4,0 ! 5,3 | +-----------------------------------------------------------------+

В " Тыквеоле " всех серий преобладает линолевая кислота ( до

56,5% ), что позволяет отнести препарат к категории полувысыхающих масел.

С целью разработки показателей качества " Тыквеола " по содержанию действующих веществ нами предложены методики количественного определения каротиноидов и а-токоферола.

Количественное определение суммы каротиноидов проводили

спектрофотометрическим методом при длине волны 450+2 им в кювете с толщиной слоя 10 мм. В качестве раствора стандартного образца использовали раствор бихромата калия, 1 мг, которого соответствует 0,00208 мг Р -каротина. Содержание суммы каротиноидов в препарате должно быть не менее 6 мг%.

Рис. 1 Газожидкостная хроматограмма смеси метиловых эфиров жирных кислот препарата '' Тыквеол ".

3,4,9 - неидентифицированные примеси (нумерация по компьютерному графику).

С целью количественного определения а - токоферола нами предложен метод ВЭЖХ.

Разработка методов стандартизации препарата "Тыквит". В медицинской практике семена тыквы издавна применяли в качестве антигельминтно-го средства. Антигельмннтная активность семян тыквы обуславливается наличием редкой аминокислоты "кукурбитнн", представляющей собой 3-амино, 3-карбоксипирроледин. Целесообразным представляются исследования по разработке методов анализа с последующей стандартизацией препарата " Тыквит ", представляющего собой обезжиренный жмых семян тыквы.

Учитывая особенности технологического режима производства " Тыквита ", можно предположить сохранение в нем микродиагностнческнх признаков, характерных для порошка семян тыквы, что может использоваться для разработки показателя подлинности препарата.

Микроскопические исследования были выполнены в соответствии с требованиями ГФ XI, предъявленными к технике микроскопического исследования порошков плодов и семян.

При рассматривании порошка под микроскопом видны обрывки эпидермиса с волосковнднымл у толшениями клеточной оболочки; сетчатые и пористые клетки; редко встречаются каменистые клетки ; обрывки полуразрушенной тонкостенной паренхимы с зеленым содержимым; обрывки внутреннего эппдермиса семенной кожуры, обычно сопровождаемые клетками с зеленым содержимым; толстостенные грубые эпидермальные клетки, характерные для тыквы большой, имеющие сходство с лестничными сосудами, обрывки эндоспермы и клетки семядолей зародыша с алейроновыми зернами и каплями жирного масла, отдельно алейроновыми зернами и каплями жирного масла.

Порошок дает микроскопическую реакцию с Суданом III в следствии высокого содержания жирного масла. Поскольку фармакологическая активность разрабатываемого препарата связана с аминокислотным комплексом, мы сочли целесообразным подлинность препарата доказывать по наличию свободных аминокислот, н в том числе, кукурбитпна.

Присутствие аминокислот определяется в водном извлечении из препарата " Тыквпт " реакцией с 0,4% водным раствором нипурина в кислой среде прп нагревании (сине-фиолетовое окрашивание). Присутствие аминокислоты кукурбитнн доказывали методом тонкослойной хроматографии на пластинке "Силуфол" в системе метанол- вода - пиридин-10 м НС1 (80:11,5:10:2,5),

поскольку данная система имеет наибольшую эффективность при разделении аминокислот гидрофильной фракции семян тыквы.

Депротеинизированное водное извлечение из препарата " Тыквит " содержит значительное количество нингидрин-положительных соединений, проявляющихся в виде сине-фиолетовых пятен.

Аминокислота кукурбитин ( ИТ-0,46 ) окрашивается в характерный оливковый цвет, что достоверно доказывает ее присутствие.

Качественный и количественный анализ аминокислотного состава водорастворимой фракции из жмыха семян тыквы ("Тыквита") мы проводили на аминокислотном анализаторе " Хитачи" (Япония) в 2-х колоночном режиме работы. Условия анализа стандартные, обычно применяемые для анализа белковых гидролнзатов.

Для анализа основных аминокислот использовали колонку 0,6 хЮ см, со смолой марки 2611, для кислых и нейтральных - 0,9x50 см, заполненную ка-тионообменником марки 2612. Элюцию основных аминокислот проводили 0,35 н Ш-цитратным буфером рН=5,28, элюцию кислых и нейтральных в ступенчатом градиенте 0,2 л Иа-цитратных буферных растворов рН=3,25-4,25.

В результате аминокислотного анализа в составе водорастворимой , депротеилпдпрованной фракции препарата " Тыквит " установлено наличие следующих аминокислот: аспарагиновая, треошш, серии, глутаминовая кислота, глицин, аланин, цистнн, валин , метионнн, нзоленцин, лейцпн, тирозин, феннллалаиин, гистедин, кукурбитин, лизин, аргинин.

Определение числовых показателей проводилось согласно

требованиям соответствующих методик ГФ XI. Анализу были подвергнуты образцы препарата различных серий. Результаты исследования числовых показателей препарата " Тыквит " содержатся в таблице 9. Поскольку микродиагно-стпческий анализ препарата " Тыквит " показал наличие в нем жирного масла, остающегося в следствии неполного обезжиривания в процессе производства " Тыквеола ", мы сочли целесообразным регламентировать данный показатель, поскольку наличие остаточных количеств лпппдов в порошкованном препарате растительного происхождения может значительно снизить его качество в процессе хранения.

Количественное определение остаточных количеств липндного

комплекса проводили по методике включающей извлечение масла хлороформом из препарата в течение 6 часов, в аппарате типа Сокслет с последующим отгоном растворителя и гравиметрическим определением жирного масла в пересчете на абсолютно сухое сырье.

Таблица 9.

Результаты исследования стабильности препарата "Тыквит". ____

№ серии Дата Описание Подлинность Содержание Содержа Влага Зола Зола в Содер- Закл

анализа частиц не ние ли- общая 10% жание ючен

проходящих пидного НС1 кукур- ие

сквозь сито с комплекс битина

диаметром а не

отверстий более

2 мм и более 18%

Гомогенный поро- Водное извлечение из препарата даёт с нин-

шок светло-зелёного гидриновым реактивом сине-фиолетовое ок-

цвета, проходящий рашивание (аминокислоты). Время удержива-

сквозь сито с диамет- ния метиловых эфиров жирных кислот в пре-

ром отверстий парате соответствует временам удерживания 3% не более не более не более не более не ме-

2 мм стандартов метиловых эфиров 18% 9% 5% 1% нее соотв

жирных кислот. 0,3 %

1.06.94 соотв. соответствует соответствует 2,15 16,0 7,8 4,3 0,90 0,37 соотв

2,15 16,0 7,8 4,3 0,90 0,37

2,25 15,5 7,8 4,3 0,90 0,37

2,25 15,5 8,1 4,3 0,90 0,36

2,30 15,0 8.5 4,3 0,90 0,36

2.06.94 СООТВ. соответствует соответствует 2,75 17,0 6,4 3,8 0,50 0,44 соотв

2,75 17,0 6,4 3,8 0,50 0,44

2,75 17,0 6,4 3,8 0,50 0,44

2.80 15,9 6,8 3,8 0,50 0,42

2.80 15,5 7,2 3,8 0,50 0.42

3.06.94 соотв. соответствует соответствует 2,05 15,0 8,4 4,5 0,90 0,49 соотв

2,05 15,0 8,4 4,5 0,90 0,49

2,05 15,0 8,4 4,5 0,90 0,49

2,25 15,0 8,7 4,5 0,90 0,46

2,25 14,3 8.8 4,5 0,90 0,46

4.06.94 соотв. соответствует соответствует 2,80 17,5 6,5 3,2 0,40 0,38 соотв

2,80 17,5 6,5 3,2 0,40 0,38

2,80 17,5 6,5 3,2 0,40 0,38

2,85 16,0 6,9 3,2 0,40 0,36

2.90 16,0 7,0 3, 0,40 0,36

6.06.94 соотв. соответствует соответствует 2,05 14,0 8,7 4,7 0,80 0,45 соотв

2,05 14,0 8,7 4,7 0,80 0,45

2,05 14,0 8,7 4,7 0,80 0,45

2,20 13,5 8,8 4,7 0,80 0,43

2.25 13,0 9,0 4,7 0,80 0,43

Метрологические характеристики разработанной методики составили: х-22,3207; 5-0,055099; Бх-0,01519; Е-0,153177; А %-0,293578. Содержание лнпндного комплекса в препарате должно составлять не более 20%.

Для количественного определения кукурбитина в препарате " Тыквит " нами предложены методики спектрофотометрического определения. Из литературных источников известно, что вторичные алифатические амины специфически реагируют с питропрусснд-ацетальдегпдпым реагентом в щелочной среде, с образованием продукта реакции сине-

фиолетового цвета. Эту реакцию обычно используют для качественной идентификации в торнчпых аминов в хроматограммах. Поскольку кукурбнтнн (3 - амиио, 3 - карбокси пирролидин) содержит аминогруппу ( т.е. относится к вторичным аминам ), нами разработан специфический метод количественного определения данной аминокислоты в составе препарата "Тыквит".

Нами был проведен ряд экспериментов с чистыми образцами кукурбитина, полученными методом препаративного электрофореза на бумаге и идентифицированного с помощью масс-спектроскоппн и анализа

функциональных групп, в которых изучали условия реакции, ее специфичность и чувствительность. На рисунке представлены типичные спектры поглощения окрашенных продуктов реакции различных аминов и иптропруссид-ацетальдегндиого реактива, (рис.2)

В предыдущих работах было показано, что хотя максимум поглощения продукта реакции при длине волны 350 нм выше,чем при длине волны 590 нм, однако он менее стабилен.

Все количественные определения кукурбитина мы проводили при длине волны 590 нм в боратно-карбоиатном буфере, с последующим расчетом его концентрации в пределах (0,1-0,8 мкмоль/мл ). Интенсивность окраски рабочих растворов кукурбитина с реагентом в боратно-карбонатном буфере усиливается в течение пяти минут, а затем остается стабильной в течение тридцати минут.

Рисунок 2

Спектр поглощения продуктов реакции различных аминов с нитропруссид-ацетальдегидным реагентом.

400 450 500 550 600 650 700 750

-.- 1,0 мкмоль метилаланииа;

— 0,4 мкмоль оксипролина;

— 2 мкмоль аланина;

-х-х- 0,4 мкмоль З-амииоЗ-карбокси-пирролндина;

Спектры метилаланина, оксипролина, аланина даны по Лину и Вагнеру.

Учитывая отсутствие коммерческого кукурбитина, который можно было бы использовать в качестве стандарта, признали целесообразным использовать при расчетах значения удельного коэффициента поглощения, вычисленного для индивидуального вещества. Результаты представлены в таблицею. Содержание кукурбитина должно составлять не менее 0,3%.

Таблица 10.

Результаты количественного определения кукурбитина в препарате "Тыквит" разных серий.

N серии Содержание кукурбитина% Метрологические характеристики методики (Р=0,95; п=6).

060496 0,345 5х=0,009027

090896 0,408 5хгр=0,003685

101096 0,329 = 0.000081

111296 0,356 ДХ=0,00094

010197 0,384 А%=3,7313

020297 0,340

Разработка технологического регламента производства препаратов "Тыквеол" и "Тыквит" по принципу безотходной технологии. Перед нами стояла задача разработать технологию комплексного исследования семян тыквы. Анализ литературных данных и изучение технологических регламентов получения жирного масла в пищевой промышленности показали достаточную эффективность метода прессования в случае использования высокомасличных ( до 40% жирного масла) видов сырья.

Метод прессования экономически выгоден, экологичен, позволяет избежать наличия в получаемом масле остаточных количеств растворителя. Сущность способа переработки семян тыквы заключается в следующем. Для проведения денатурации содержимого ядра при температуре не выше 60°С семена измельчают на молотковых дробилках до размера фракций 0,1-3,0 мм. Измельченная масса подается на разогретые до 80° С жаровни с мешалками слоем 40-60 мм, где она увлажняется до 14-16% подогретой водой. Масса при этом подогревается до 60° С при непрерывном помешивании в течение 40-50 минут. Температура поддерживается в указанном интервале регулировкой заслонок жаровень. Масса

подсушивается при таком режиме до влажности 3-5%, подаётся на шнековый пресс. Пресс регулируется так, что температура массы шрота при прессовании не превышала 60° С. Шрот выходит в виде легко рассыпающейся пластины темно-серого цвета с легким светло-коричневым оттенком. Он повторно подается на пресс. Выходящее масло имеет темно-красный цвет, в тонком слое с зеленым оттенком. Масло фасуется в стеклянные флаконы по 100 мл. Отработанный жмых семян высушивается при 70° С и фасуется в полиэтиленовые пакеты. Технологическая схема производства препаратов " Тыквеол " и " Тыквит " представлена на рисунке 3.

Технологическая схема производства препаратов "Тыквеол'

Рисунок 3. [" и "Тыквит".

Таким образом, разработанная лекарственного растительного сырья -получать препараты " Тыквеол " и механические потери.

нами технология переработки семена тыквы, позволяет

" Тыквит ", имея лишь минимальные

Изучение микробиологической чистоты препаратов "Тыквеол" и "Тыквит". Лекарственное растительное сырьё и получаемые на его основе лекарственные препараты, как правило, не стерилизуемые в процессе производства, наиболее подвержены микробной контаминации и поэтому должны пройти контроль па микробиологическую чистоту. При определении уровня микробных контаминации " Тыквеола " и " Тыквита " учитывали общее число аэробных бактерий и общее число грибов в одном грамме препаратов, а так же наличие патогенных и условнопатогенных микроорганизмов (бактерии семейства Enterobacteriaceae, Pseudomonas aeroginosa, Staphylococcus aurus). Результаты бактериологического анализа показали наличие аэробных бактерий, не превышающее нормативов обшей статьи ГФ XI "Испытания на микробиологическую чистоту". Грибы и патогенные организмы не выявлены.

Таким образом инфицирование больных при лечении "Тыквеолом" и "Тыквитом" маловероятно.

ВЫВОДЫ.

1. Проведено фармакологическое исследование специфической активности препаратов " Тыквеол " н " Тыквит ". Доказано наличие гепатопротекторного действия препарата " Тыквеол " и антигельмнптиого действия препарата "Тыквит" при инвазиях ленточными гельминтами.

2. На основании изучения острой и хронической токсичности препаратов " Тыквеол " и " Тыквит" установлено, что данные объекты являются практически безвредными.

3. Разработаны показатели качества препарата " Тыквеол ". В составе " Тыквеола " идентифицировано и количественно определено 5 жирных кислот ( пальмитиновая , стеариновая, олеиновая, лннолевая, линолеиовая).

4. Предложено спектрофотографическое определение содержания каро-тиноидов в " Тыквеоле ". Установлено содержание суммы каротиноидов в пересчете на ß-каротнн не менее 6 мг%. Предложено определение а -токоферола в " Тыквеоле" методом ВЭЖХ. Содержание а -токоферола не менее 4 мг% .

5. На основании микродиагностических признаков разработаны характеристики подлинности препарата " Тыквит".

6. Предложена методика и определено содержание аминокислоты кукурбитин в препарате "Тыквит". Относительная ошибка методики при проведении анализа в 6 повторностях с 95% вероятностью составляет +4%. 7. Исследована стабильность препаратов " Тыквеол " и " Тыквит " в процессе хранения. Установлены сроки хранения "Тыквеола" - 2 года, "Тыквита" - 2 года

8. Разработан технологический регламент переработки семян тыквы по принципу безотходной технологии.

9. Разработан ВФС " Тыквеол " N 42-2405-94. Подготовлен проект ВФС " Тыквит " .

Публикации.

Получены патенты РФ на:

• Патент № 2001623 "Регенеративное средство при воспалительных и атрофических процессах желудочно-кишечного тракта от 23.07.92;

• Патент № 2000798 "Способ получения биологически активных веществ из масличных культур, преимущественно тыквенных" от 24.09.92;

• Патент № 2001620 "Гепатопротекторное средство" от 10.06.93;

• Патент № 2008912 "Средство для стимуляции фильтрационной и выделительной функции почек при токсической нефропатологин" от 15.03.94;

• Разработан и утвержден промышленный регламент на производство препарата "Тыквеол", согласованный с зам. генерального директора НПО ВИЛАР В.И. Глызи-ным 25.01.95;

• Зарегсстрированы технические условия на масло из семян тыквы ТУ-9141-001-10516176-96 от 17.11.96;

• Положительное решение о выдаче патента на изобретение от 01.04.97 по заявке № 97104638 "Гепатопротекторное, желчегонное, противоязвенное, антисептическое, антисклеротическое и снижающее пролиферацию клеток простаты средство "Тыквеол";

• Положительное решение о выдаче патента на изобретение от 12.05.97 по заявке № 97106923 "Гепатопротекторное, желчегонное, антигельминтное средство "Кумивит";