Автореферат и диссертация по фармакологии (15.00.01) на тему:Разработка и стандартизация иммобилизованных лекарственных форм на основе биологически активных веществ побегов и коры облепихи крушиновидной и энтеросорбента СУМС-1

СУХОТЕРИНА НАДЕЖДА ВИТАЛЬЕВНА

РАЗРАБОТКА И СТАНДАРТИЗАЦИЯ ИММОБИЛИЗОВАННЫХ ЛЕКАРСТВЕННЫХ ФОРМ НА ОСНОВЕ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ ВЕЩЕСТВ ПОБЕГОВ И КОРЫ ОБЛЕПИХИ КРУШИНОВИДНОЙ И ЭНТЕРОСОРБЕНТА СУМС-1

15.00.01 - технология лекарств и организация фармацевтического дела

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата фармацевтических наук

003053520

СУХОТЕРИНА НАДЕЖДА ВИТАЛЬЕВНА

РАЗРАБОТКА И СТАНДАРТИЗАЦИЯ ИММОБИЛИЗОВАННЫХ ЛЕКАРСТВЕННЫХ ФОРМ НА ОСНОВЕ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ ВЕЩЕСТВ ПОБЕГОВ И КОРЫ ОБЛЕПИХИ КРУШИНОВИДНОЙ И ЭНТЕРОСОРБЕНТА СУМС-1

15.00.01 - технология лекарств и организация фармацевтического дела

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата фармацевтических наук

Диссертационная работа выполнена в Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Алтайский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию».

Научный руководитель:

доктор фармацевтических наук, профессор

Научный консультант:

доктор медицинских наук, профессор

Турецкова Вера Феопеновна

Брюханов Валерий Михайлович

Официальные оппоненты:

доктор фармацевтических наук, профессор

Петриченко Василий Михайлович

доктор фармацевтических наук, профессор

Бекетов Борис Никандрович

Ведущая организация: Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Башкирский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию»

Защита состоится «27» февраля 2007 года в Ц часов на заседании диссертационного совета Д 208.068.01. при Пермской государственной фармацевтической академии по адресу: 614990, г. Пермь, ул. Ленина, 48.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Пермской государственной фармацевтической академии по адресу: 614070, г. Пермь, ул. Крупской, 46

Автореферат разослан «19» января 2007 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат фармацевтических наук

Е.В. Метелева

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Одним из перспективных источников биологически активных веществ (БАВ), является уникальное растение Сибирского региона - облепиха крушино-видная ШррорЬаё гЬатпо1ёез Ь., сем. лоховые (Elaeagnaceae), традиционным сырьем которой являются плоды. В последние годы сотрудниками кафедры фармацевтической технологии АГМУ, НИИ фармакологии г. Томска и ЗАО «Алтайвитамины» в качестве источников получения препаратов противоопухолевого и противоязвенного действия предложены кора и побеги указанного растения. В ходе экспериментальных исследований был разработан ряд жидких и сухих экстракционных препаратов, в основе которых лежат вещества, содержащие в своей структуре свободные фенольные гидроксилы, такие как алкалоид серотонин и конденсированные дубильные вещества [Турецкова В.Ф., Зуева Е.П. с соавт., 2001].

Установлено, что выраженным противоопухолевым действием обладает только жидкий экстракт побегов и коры облепихи Включение стадии сушки в технологическую схему получения экстракционных препаратов из данных видов сырья приводит к потере противоопухолевого действия при сохранении противоязвенной активности [Турецкова В.Ф. с соавт., 2001], что, по-видимому, обусловлено разрушением нативного комплекса БАВ. Вместе с тем, жидкий экстракт побегов и коры облепихи, несмотря на высокую эффективность действия, как и все жидкие экстракты, имеет ряд недостатков: непортативность и трудность использования в процессе изготовления дозированных лекарственных форм; выпадение осадка при длительном хранении ввиду большой насыщенности БАВ и сопутствующими веществами; недостаточно приятный вяжущий и горьковатый вкус.

Из данных литературы известно, что современное развитие фармацевтической технологии позволяет устранить перечисленные недостатки различными способами. Так, одним из перспективных направлений в настоящее время является использование процесса иммобилизации БАВ на сорбентах разнообразной химической природы в процессе изготовления различных, в том числе и твердых, лекарственных форм Иммобилизация БАВ не только повышает стабильность препарата за счет включения в разветвленную структуру полимера или в результате адсорбции на носителе, но и в значительной мере увеличивает эффективность препарата за счет возможности потенцирования действия активных компонентов и носителя.

Наличие в побегах и коре облепихи комплекса соединений, содержащих в своей структуре свободные фенольные гидроксилы, позволяет предположить в отношении экстракта побегов и коры облепихи крушиновидной жидкого и другие виды фармаколо-

гической активности, так как одним из механизмов действия фенольных соединений является способность ингибировать свободнорадикальные реакции в организме. Обращает на себя внимание тот факт, что антиоксидантные свойства являются предпосылкой разнообразных видов действия, в том числе и гепатопротекторного, и то, что многие энтеросорбенты, в том числе СУМС-1 и'полифепан [Поспелова Т.И. с соавт., 1999; Чучалин B.C. с соавт., 2003], используются в комплексном лечении токсических повреждений печени.

Учитывая широкое распространение в настоящее время заболеваний, вызванных токсическими поражениями печени, проведение исследований по разработке гепатопротекторного препарата в виде твердых лекарственных форм за счет использования процесса иммобилизации БАВ побегов и коры облепихи крушиновидной на энтеросорбенте, является актуальной проблемой.

Цель и задачи исследования. Целью настоящего исследования является создание оригинального иммобилизованного препарата с гепатопротекторной активностью на основе биологически активных веществ побегов и коры облепихи крушиновидной и энтеросор-бента.

Для реализации поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

1. Изучить кинетику сорбции и десорбции БАВ побегов и коры облепихи крушиновидной на эптеросорбентах СУМС-1 и полифепан.

2. Выбрать оптимальный носитель для иммобилизации БАВ побегов и коры облепихи крушиновидной.

3. Разработать оптимальную технологию иммобилизованного препарата БАВ побегов и коры облепихи крушиновидной, а также его таблетированной и капсулированной лекарственных форм с высокой фармацевтической и биологической доступностью

4. Провести стандартизацию, изучить стабильность иммобилизованного препарата и разработанных лекарственных форм.

5. Изучить антиоксидантную и гепатопротекторную активность иммобилизованного препарата.

6. Разработать проекты нормативной документации на иммобилизованный препарат и лекарственные формы.

Научная новизна работы. Теоретически обоснована и экспериментально подтверждена целесообразность использования коры и побегов облепихи крушиновидной как источника БАВ с антиоксидантной и гепатопротекторной активностью.

Впервые проведены исследования по иммобилизации алкалоида серотонина, суммы конденсированных дубильных веществ и катехинов на сорбентах СУМС-1 и полифепан. Выявлено, что сорбция изучаемых БАВ возможна в обоих случаях.

Установлено, что процесс сорбции на сорбенте СУМС-1 подчиняется мономолекулярной теории Ленгмюра, на сорбенте полифепан - полимолекулярной теории БЭТ. Изучены процессы десорбции БАВ коры и побегов облепихи с сорбентов СУМС-1 и полифепан в кислую, щелочную и нейтральную среды. Доказано, что практически полная десорбция иммобилизованных БАВ с сорбента СУМС-1 осуществляется только в кислую среду. Установлено, что оптимальным носителем для БАВ побегов и коры облепихи крушиновидной является гранулированная фракция энтеросорбента СУМС-1.

Теоретически и экспериментально обоснованы оптимальный состав и технология получения таблеток «ЭкоСорб» методом прямого прессования. Установлены оптимальные технологические параметры для получения капсулированной лекарственной формы, обеспечивающие высокие показатели фармацевтической доступности.

Впервые разработаны методики качественного и количественного определения алкалоида серотонина методом ВЖХ в гранулах, таблетках и капсулах «ЭкоСорб».

Выявлены антиоксидантная и гепатопротекторная активность разработанного препарата «ЭкоСорб». Установлено, что иммобилизация БАВ побегов и коры облепихи приводит к повышению их антиоксидантного и гепатопротекторного действия.

Практическая значимость. Разработана рациональная технология получения гранул «ЭкоСорб» способом пропитки, в основе которой лежит иммобилизация БАВ побегов и коры облепихи крушиновидной на энтеросорбенте СУМС-1.

Выявлен способ повышения антиоксидантного и гепатопротекторного действия БАВ побегов и коры облепихи за счет их иммобилизации на энтеросорбенте СУМС-1.

В результате проведенных экспериментов созданы стабильные иммобилизованные препараты на основе БАВ коры и побегов облепихи и энтеросорбента СУМС-1 в виде капсулированной и таблетированной лекарственных форм, которые после дополнительных доклинических и клинических испытаний могут быть предложены в качестве гепатопро-текторных средств.

По результатам исследований разработаны следующие проекты ФСП: «ЭкоСорб гранулы», «ЭкоСорб капсулы 500 мг», «ЭкоСорб таблетки 500 мг» и проекты лабораторных регламентов. «ЭкоСорб гранулы», «ЭкоСорб капсулы 500 мг», «ЭкоСорб таблетки 500 мг». В ЦЗЛ ЗАО «Алтайвитамины» проведена апробация предлагаемых технологий гранул, капсул и таблеток «ЭкоСорб» по схемам лабораторных регламентов. Установлена стабильность показателей качества гранул в течение 3,5 лет, таблеток и капсул «ЭкоСорб» -2,5 лет.

Результаты исследований по разработке технологии и стандартизации гранул, капсул, таблеток «ЭкоСорб» используются в лекционном курсе, на лабораторных занятиях по фармацевтической технологии и фармацевтической химии (акты внедрения)

На защиту выносятся результаты экспериментального и теоретического обоснования получения иммобилизованного препарата «ЭкоСорб» на основе БАВ коры и побегов облепихи, изучения его антиоксидантной и гепатопротекторной активности и разработки таблетированной и капсулированной лекарственных форм.

Апробация работы. Основные положения диссертации обсуждались на Городской конференции «Молодежь-Барнаулу», медицинский раздел (Барнаул, 2003, 2004, 2005), Всероссийской конференции «Молодые ученые-медицине» (Самара, 2003); 59-й, 61-ой региональной конференции по фармации и фармакологии (Пятигорск, 2004, 2006); Конференции студентов и молодых ученых «Международный форум молодых ученых и студентов» (Ан-талия (Турция), 2004); Научной конференции, посвященной 50-летию Алтайского государственного медицинского университета (Барнаул, 2004); II конференции студентов, молодых ученых и специалистов «Современные проблемы науки и образования» (Хургада (Египет), 2005); Всероссийской научно-практической конференции «Современные проблемы фармакологии и фармации» (Новосибирск, 2005); Юбилейной научной конференции, посвещенной 30-летию фармацевтического факультета АГМУ (Барнаул, 2005); Всероссийской научно-практической конференции «Современные принципы и технологии разработки лекарственных средств» (Москва, 2006).

Связь задач исследования с проблемным планом фармацевтических наук. Работа выполнена в соответствии с планом научно-исследовательских работ ГОУ ВПО «Алтайский государственный медицинский университет Росздрава» по медико-биологическим проблемам, раздел «Фармация» (№ Гос регистрации 01200301413).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 16 печатных работ, в том числе 2 - в зарубежной (Турция, Египет) и 1 статья в ведущем рецензируемом журнале.

Автор выражает благодарность сотрудникам Сибирского государственного медицинского университета (г. Томск), в частности зав кафедрой фармацевтической технологии, доктору фарм наук, профессору B.C. Чучалину, за содействие в проведение фармакологических испытаний разработанных иммобилизованных препаратов, сотрудникам кафедры фармакологии АГМУ (доктору мед. наук, профессору, Я.Ф. Звереву) за помощь в проведении фармакологических исследований, а также сотрудникам ООО «Сорби-Фарм», г. Новосибирск (И.И. Фроловой) за помощь в проведении некоторых физико-химических исследований.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 176 страницах машинописного текста, содержит 28 таблиц и 28 рисунков. Работа состоит из введения, обзора литературы, 3 глав экспериментальных исследований, выводов, списка литературы и приложения. Список литературы включает 169 источников, из которых 21 на иностранных языках.

Во введении изложены актуальность, цель и задачи исследования, научная новизна, практическая значимость работы.

В первой главе представлен обзор литературы по теме диссертации, включающий общие сведения о процессе иммобилизации; приведена характеристика основных типов медицинских энтеросорбентов, на которых возможна адсорбция БАВ; представлены данные о лекарственных препаратах, полученных путем иммобилизации лекарственных средств и БАВ на энтеросорбентах.

Вторая глава посвящена характеристике объектов и методов исследования.

В третьей главе приводятся данные по изучению процессов сорбции и десорбции БАВ побегов и коры облепихи крушиновидной на сорбентах различной химической природы, а также изложена технология и приведены результаты исследований по стандартизации иммобилизованного препарата «ЭкоСорб» на основе БАВ побегов и коры облепихи крушиновидной и энгеросорбента СУМС-1 в виде гранул

Четвертая глава посвящена разработке состава и технологии таблеток и капсул «ЭкоСорб».

В пятой главе приведены результаты по изучению антиоксидантной и гепато-протекторной активности иммобилизованного препарата «ЭкоСорб» по сравнению с его составляющими компонентами (экстрактом побегов и коры облепихи жидким и энтеросор-бентом СУМС-1).

В приложение включены материалы, подтверждающие практическую значимость проведенных исследований проекты ФСП, лабораторные регламенты на получение разработанных препаратов и акты их апробации в ЦЗЛ ЗАО «Алтайвитамины».

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

1. Объекты и методы исследования (Глава 2)

Объектами исследований явились экстракт побегов и коры облепихи крушино-видной жидкий, изготовленный по технологии, разработанной В Ф. 'Гурецковой с соавторами, и отвечающий требованиям проекта ФСП 42- [В.Ф. Турецкова, 2001], энтеросорбент СУМС-1 (ФС 42-3283-96) и полифепан (ФСП 42-0085-1858-01).

В качестве вспомогательных веществ использовали вещества, разрешенные к применению в медицине и отвечающие требованиям соответствующей нормативной документации

Для качественного анализа входящих групп БАВ использовали традиционные химические методы исследования, а также методы ТСХ и ВЭЖХ Для количественного определения БАВ при разработке оптимальной технологии и стандартизации изготовленных лекарственных форм были применены УФ - спектрофотометрия и метод ВЭЖХ.

Результаты, полученные в опытах на животных, обработаны методами вариационной статистики с использованием критериев Стьюдента; данные технологических, физико-химических и биофармацевтических методов - по фармакопейным методикам с использованием стандартной компьютерной программы Ехе1.

2. Экспериментальное обоснование технологии и стандартизация

иммобилизованного препарата «ЭкоСорб» на основе БАВ побегов и коры

облепихи крушиновидной (Глава 3)

Важнейшей характеристикой сорбционного процесса является графическая зависимость количества сорбированного вещества от равновесной концентрации при постоянной температуре, или изотерма адсорбции.

Адсорбционную способность сорбентов СУМС-1 и полифепан по отношению к сумме БАВ побегов и коры облепихи осуществляли по методике построения изотермы адсорбции, разработанной в Институте катализа им Г.К. Борескова Сибирского отделения СО РАН (г Новосибирск). Растворы адсорбатов, представляющих собой смеси экстракта побегов и коры облепихи жидкого с экстрагентом в различных концентрациях, смешивали с сорбентами в соотношении 1:10 Полученную смесь выдерживали на встряхивателе АВУ- 6с в течение 24 часов до установления равновесия сорбент-раствор Оптическую

плотность осветлённого раствора определяли на спектрофотометре СФ-46 при длине волны 276 нм - максимуме поглощения серотонина и полифенояьных соединений коры и побегов Облепихи. 11о разнице между исходной концентрацией адсорбата (С|1И) й равновесной концентрацией адсорбата в осветлённом растворе (Ср) определяли количество адсорбированных веществ А (мг/г сорбента). Па основании полученных результатов строили графическую зависимость в координатах (А : С'р). Полученные кривые, представляющие собой изотермы адсорбции bAiï экстракта побегов и коры облепихи жидкого па сорбентах СУМС-1 {микрогранулированном и гранулированном) и полифепан, характеризуют максимальные количество веществ, которые способны адсорбировать сорбенты из раствора до установления равновесной концентрации (рис. 1 и 2).

01 2345678

Ср, мг/мл

Рис. 1 Изотермы адсорбции ]>АВ побегов и коры облепихи на сорбенте СУ M С- ! I - и и кро грану л ированном, 2-грану л ированном

С 0.5 1 1.5 1 25 3 3,5 1 4.5

Ср. мгУыл

Рис.2 Изотерма адсорбции БАИ побегов и коры облепихи на сорбенте подифепан

Анализ полученных изотерм адсорбции на микрогранулированком и гранулированном энтеросорбенте СУМС-1 показы наст, что они удовлетворительно описываются уравнением Лснгмюра, что i! сво10 Очередь свидетелю шуст об обрывании молоацсорбниот го-го слоя и об отсутствии конкуренции с молекулами растворителя. Изотерма сорбции на по.шфепапе свидетельствует о полимолекулярном характере сорбции БАВ коры м побегов облепихи, так как изотерма имеет S-образную форму с максимумом адсорбции и подчиняется ПСшимодекулярной ссор ли БЭТ fli.ll. Захар1 ген ко. J989J.

Установление величшШ монос.гоя (Amas) БАИ коры и побегав облепихи на поверхности сорбента СУМС-1 и полислоя на сорбенте полифенам проводили путем построения анаморфозы изотермы адсорбции, т.е. определения зависимости отношения равновесной концентрации (С„) к концентрации сорбированного к тест на (А) от равновесной концентрации, Монослой и полислой определяли как тангенс острого угла, образованного анаморфозом и прямой, параллельной оси абсцисс. Установлено, что наименьшую величину мопослоя 22,0 мг\г сорбента имел гранулированный энтеросорбент СУМС-1 (Рис. 3).

012345678

Ср. мг/мл

Рис. 3 Анаморфоза изотермы адсорбции ЬАВ побегов и коры облепихи на грану-лиронапном сорбенте СУМС-1 Аналогичные исследования с другими исследуемыми эктср оси ростам и показали, что но сравнению с гранулированной фракцией монослой микрогранулированиного энте-росорбента СУМС-1 был в два раза выше и составил 48,6 мг/г сорбента, полислой полифенами значительно превышал значения монослоя в обеих фракциях энгеросорбеята СУМС-1 и составил 300.0 мг\г сорбента.

При теоретическом расчете необходимого количества БАВ коры и побегов облепихи для нанесения на 1 г изучаемых сорбентов исходили из того, что монослой и поли слой характеризуют количество веществ, которое прочно удерживается сорбентом, и их десорбция во многих случаях невозможна или затруднена. Учитывая вышеизложенное, количество БАВ коры и побегов облепихи для нанесения на ¡ г изучаемых сорбентов рассчитывали как сумму БАВ монослоя и фармакологически активной дозы ЬАВ экстракта побегов и коры облепихи крушиновидной (50 мг) [1!.Ф. Турецкова. 2001]. Расчеты показали, что количество БАВ для нанесения на 1 г сорбента составило: для микрогранулирован! юго СУМС-1 98,6 мг/г; для гранулированного СУМС-1 - 72,0 мг/г; для полифепана 350,0 мг/г. Для нанесения рассчитанного количества БАВ на сорбенты был иыбран метод нропшки. Рассчитанное количество пропиток составляло соответственно семь, дать; и двенадцать. Сушку осуществляли? в сушильном шкафу с принудительной циркуляцией воздуха при температуре 25Г|С,

/%1Я установления групп ВДВ, которые были иммобилизованы па изучаемых сор-бетах. нами был применён комплекс химических реакций на характерные группировки основных БАВ побегов и коры облепихи и метод ТСХ. При этом в ре:экстрактах из полу-

ченных экспериментальных препаратов (на всех трех сорбентах) обнаружен алкалоид серо-тонин, дубильные вещества и флавоноиды группы катехина Методом ТСХ на пластинке «Сорбфил ПТСХ-П-А-УФ» в системеБУВ (5:1:4) было выявлено одно пятно с Rf около 0,6, приобретающее синюю окраску после обработки специфическим реактивом п-диметиламинобензальдегидом. что соответствовало рабочему стандартному образцу (PCO) серотонина. Хроматографическое исследование дубильных веществ на пластинках «Силу-фол УФ-254» в системе растворителей БУВ (40.12.28), выявило наличие четырех веществ, которые после обработки хроматограмм 1 % раствором ванилина окрашивались в розовый, 1 % раствором натрия персульфата - красно - фиолетовый, раствором п-диметиламинобензальдегида - малиновый цвет Последнее свидетельствует о том, что в основе танинов побегов и коры облепихи крушиновидной лежат катехины и (или) лейко-цианидины

Изучение процесса десорбции суммы иммобилизованных БАВ проводили в различные среды: нейтральную, кислую и щелочную в плоскодонной конической колбе вместимостью 1 л с механическим перемешиванием на магнитной мешалке при t° = 37°С Концентрацию суммы БАВ в пересчете на катехин определяли методом прямой спектрофото-метрии при длине волны 276 нм.

Исследования показали, что десорбция БАВ, входящих в монослой или полислой изучаемых сорбентов, практически не происходит во все исследуемые среды. Основная масса БАВ (до 70 % от фармакологической дозы - 50,0 мг) с сорбентов СУМС-1 десорби-руется более быстро - в течение первых пяти минут, а с сорбента полифепан - только в течение 20 минут. При этом десорбция БАВ независимо от применяемого сорбента в значительной мере зависит от значения pH среды: минимальное высвобождение БАВ происходит в щелочную среду, максимальное высвобождение - отмечается в кислую среду При этом высвобождение БАВ в 0,1 М раствор кислоты хлористоводородной с изучаемых сорбентов идет с различной скоростью, в течение 75 мин с 1 г микрогранулированного сорбента СУМС-1 десорбируется 49,51 мг БАВ; с 1 г гранулированного сорбента СУМС-1 - 50,00 мг (рис 4), с 1 г сорбента полифепан сопоставимая доза веществ (49,40 мг) высвобождается только в течение 300 мин.

t. мин

—•—Нейтральная среда —Я—Кислая среда —А—Щелочная среда

Рис.4 Кинетика высвобождения ЬАВ побегов и коры облепихи с гранулированного сорбента СУМС-1

Суммируя данные проведенных экспериментов; был сделан вывод, что оптимальным носителем для иммобилизации КАВ побегов и коры Облепихи крушиновшш&й является фанулированныЙ сорбент СУМС-1, гак как практически несмываемый моносдор БАВ по сравнению с яругами изучаемыми сорбентами имеет наименьшую величину (22,0 мг/г сорбента), и при этом полнота и скорость десорбции фармакологически активной дозы БАВ е данного сорбента сопоставима е микрогранулированноЙ фракцией сорбента СУМС-1, а гю скорости десорбции к четыре раза превышает данный показатель лпероеорбента поли-фепаи. В связи е чем нами было наработано 5 серий препарата па гранулированном -дперо-сорбеите СУМС-1. которому дали условное наименование «ЭкоСорб»,

Стандартизация гранул «ЭкоСорб» была проведена по следующим показателя^ описание, подлинность, количественное содержание серогонина, микробиологическая чистота. Для определения подлинности и количественного содержания серо гонина, иммобилизованного на гранулах «ЗкоСпрб» был применен метод ВЭЖХ. Хроматограф иро вани е осуществляли в градиентной режиме при использований эШоентов - 100% ацехо нитрила и фосфатного буферного раствора в концентрации 0,025 VI в соотношении 1 ; 1. Идентификацию серочонина, дссорбированпого с 1ранул «ЭкоСорб», проводили по времени удерживания (рис. 5) и характеру У ф-спектр а. снятого н процессе xj) о м aro граф и ро ва 11 и Я. в сравнении с РСО серого нина-креати ни на сульфата. Время удерживания серогонина в обеих случаях составляло 6 мин

Рис.5 Хроматограмма серотонина гранул «ЭкоСорб»

Сопоставление характера УФ-спектров PCO серотонина и вещества, десорбирован-ного с гранул «ЭкоСорб», позволяет сделать заключение об их идентичности, гак как имеются максимумы поглощения при длинах волн 200 и 276 нм, минимумы - при 245 нм и площадки в интервалах длин волн 288 - 300 нм (рис 6)

Рис 6 УФ-спектр серотонина Количественное содержание серотонина, определенное методом калибровки в автоматическом режиме, составило 0,0011 ± 0,000022 г, считая на 1,0 г гранул «ЭкоСорб»

Вышеприведенные данные были положены в основу разработки технологической схемы получения гранул иммобилизованного препарата «ЭкоСорб» (рис 7).

ВР-1.1. Обработка производственных помещений

ВР-1.2. Санитарная обработка оборудования

ВР-1.3. Санитарная обработка технологической одежды персонала

ВР-1.4. Подготовка технологического воздуха

ВР-2.1. Отвешивание сорбента СУМС-1

ВР-1. Санитарная подготовка производства

ВР-2. Подготовка компонентов

Потери механические

ВР-2.2.0тмеривание экстракта побегов и коры облепихи жидкого

ТП-3.1. Пропитка сорбента СУМС-1 экстрактом побегов и коры облепихи жидким

ТП-3.2. Сушка при 25°С +

ТП-3 3. Обкатывание гранул

ТП-3.4. Отсеивание пылевидной фракции

ТП-3. Получение гранул «ЭкоСорб»

Потери механические

ТП-4. Стандартизация

УМО-5. Фасовка и упаковка го-

тового продукта

г

ПО-6. Переработка отхо-

дов

Рис 7 Технологическая схема производства гранул «ЭкоСорб»

3. Разработка таблетированной и капсулированной лекарственных форм иммобилизованного препарата «ЭкоСорб» (Глава 4)

Известно, что наиболее технологичным и экономичным способом получения таблеток является прямое прессование Изучение технологических свойств гранул «ЭкоСорб» показало, что они имеют плохую прессуемость (2,0 Н), хорошую сыпучесть (16,670 + 0,017 г/сек), большую насыпную массу (918,0 кг/м1), невысокую влажность (2,50 + 0,03 %), но при этом способны поглощать значительное количество влаги (до 12,17 ± 0,07 %).

Для улучшения технологических свойств гранул «ЭкоСорб» были исследованы 17 прописей таблетируемых масс с различными вспомогательными веществами (пропись № 1 содержит «ЭкоСорб»-0,5 без вспомогательных веществ). Выявлено, что оптимальные значения прочности на сжатие (прессуемость) имеют таблетки, спрессованные при давлении 100 МПа из смесей- № 7 («ЭкоСорб»-0,5, ПВП-0,05, ЫаКМЦ-0,05), № 8 («ЭкоСорб»-0,5, ПВП-0,03, МакМЦ-0,02); № 12 («ЭкоСорб»-0,5, ПВП-0,04, КаК.МЦ-О.ОЗ); № 13 («ЭкоСорб»^,5, ПВП-0,03, КтаКМЦ-0,03), № 15 («ЭкоСорб»-0,5, ПВП-0,04, лактоза-0,03), но при этом лучшими показателями обладают таблетки, изготовленные по прописи № 12 (рис. 8).

¡Ц - прописи, удовлетворяющие требованию прочности на сжатие - прописи, не удовлетворяющие требованию прочности на сжатие

Рис 8 Прочность таблеток «ЭкоСорб» различного состава Выдерживание указанных смесей в камере со 100 % влажностью показало, что все использованные вспомогательные вещества снижают количество поглощаемой влаги по

40/ 35'

ш

сравнению с гранулами «ЭкоСорб» (пропись № 1), так, для таблеток, изготовленных по прописи № 7, влажность снижалась на 3,03 %; № 8 - на 3,07 %, № 12 - на 3,01 %; № 13 - на 2,08 %; № 15 - на 3,85 % (рис. 9).

1 7 6 12 13 15

№ прописи

Д - исходная влажность

Ц - влажность после выдерживания во влажной камере в течение 24 часов Рис 9 Гигроскопичность гранул «ЭкоСорб» и его смесей со вспомогательными веществами Сравнительная оценка таблеток, спрессованных из смесей № 7, 8, 12, 13, 15, позволила сделать заключение, что по таким показателям, как прочность на истирание, распа-даемость и растворение, всем предъявляемым требованиям соответствуют только таблетки, полученные по прописям № 7 и № 12 (табл 1)

Таблица 1

Показатели прочности на истирание и фармацевтической доступности таблегок «ЭкоСорб» различного состава

№ прописи Прочность на истирание, % Распадаемость, мин. Растворение через 45 мин., %

7 97,69 ± 3,76 10,1 ±0,5 76,61 ± 1,24

8 60,01 ± 4,45 3,3 ±0,5 83,53 ± 1,49

12 97,57 ± 2,22 8,2 ±0,5 77,57 ±1,12

13 76,64 +3,86 5,2 ±0,5 78,71 ± 1,05

15 76,46 +2,11 4,1 ±0,5 78,87 ± 1,09

Учитывая данные вышеприведенных экспериментов и меньшее содержание вспомогательных веществ, в качестве оптимальной была выбрана пропись № 12.

По указанной прописи были спрессованы 5 серий таблеток, стандартизацию которых проводили по следующим показателям: описание, подлинность, средняя масса, растворение, однородность дозирования, количественное определение, микробиологическая чистота.

Учитывая хорошую сыпучесть и большую насыпную массу исследуемых гранул (стр. 16), капсулы «ЭкоСорб» было решено изготавливать без добавления вспомогательных веществ. При этом было изготовлено 5 серий капсул «ЭкоСорб» 0 номера с использованием настольного полуавтомата для наполнения твердых желатиновых капсул. Стандартизацию капсул проводили по показателям: описание, подлинность, средняя масса, растворение, однородность дозирования, количественное определение, микробиологическая чистота. Все серии изготовленных таблеток и капсул отвечали предъявляемым требованиям, причём высокие показатели фармацевтической доступности изготовленных таблеток (рас-падаемость 5,05 ± 0,03 - 6,07 + 0,08 мин, растворение 75,66 ± 1,04 - 79,98 ± 1,68 %) и капсул (распадаемость 2,47 + 0,01 - 3,07 ± 0,03 мин, растворение 80,88 ± 1,63 - 83,09 + 1,02 %) свидетельствовали о рациональном подборе фармацевтических факторов. Полученные данные положены в основу технологических схем получения таблеток «ЭкоСорб» и капсул «ЭкоСорб».

Установлена стабильность всех исследуемых показателей для гранул «ЭкоСорб» в течение трех с половиной лет хранения в естественных условиях, для таблеток и капсул - в течение двух с половиной лет.

4. Оценка фармакологической активности и безвредности препарата

«ЭкоСорб» (Глава 5)

Оценка острой токсичности гранул «ЭкоСорб» была проведена на крысах-самцах при однократном введении исследуемого экспериментального препарата в желудок через зонд в виде водной суспензии. В результате проведенных экспериментов было выявлено, что гранулы «ЭкоСорб» согласно ГОСТ 121007-76 (Государственный стандарт на вредные вещества) можно отнести к 4 классу: «вещества малоопасные».

Исследования по изучению антиоксидантной и прооксидантной активности препарата и его составляющих проводили методом m vivo на базе кафедры фармакологии АГМУ. В качестве модели воспаления использовали методику экссудативного воспалительного отека обеих задних лап крыс в результате субплантарного введения флогогенного агента формалина [Арбузова Я.С., Тихомирова C.B. с соавт., 2004]. Антиоксидантную активность оценивали как баланс прооксидантного и оксидантного статуса организма

О прооксидантной активности судили по содержанию тиобарбитуратреактивных продуктов плазмы (ТБРП) и общей прооксидантной активности (ОПА) (табл. 2).

Таблица 2

Показатели оксидантного статуса крови крыс в условиях длительного введения экспери-

ментальных препаратов на основе БАВ побегов и коры облепихи и СУМС -1

Группы животных, вводимый препарат Доза на одно животное (1 раз в сутки) ТБРП (мкМ) ОПА (%)

1. Контроль 0,76 мл/кг (0,19мл) 2,50 ±0,18 45,10 ±1,06

2. «ЭкоСорб», вода 430 мг/кг (0,10 г) 4,00 ±0,10* 36,20 ±1,77*

3. «ЭкоСорб», 1%р-р кислоты лимонной 430 мг/кг (0,10 г) 3,30 ±0,14* 22,00 ± 1,48*

4. СУМС-1, вода 320 мг/кг (0,08 г) 2,00 ±0,18 48,90 ± 1,74

5. Экстракт побегов и коры облепихи крушиновидной жидкий 0,76 мл/кг (0,19мл) 3,00 ±0,18 57,70 ± 2,04 *

Примечание: звездочками обозначены достоверные изменения к контролю

Исследования показали, что на фоне длительного введения компонентов иммобилизованного препарата «ЭкоСорб» или не происходило эффективного снижения показателей ТБРП и ОПА (экстракт побегов и коры облепихи), или наблюдалось лишь падение показателя ТБРП (СУМС-1) В отличие от этого гранулы «ЭкоСорб», независимо от рН среды, прямо подавляли показатель ОПА, который в некоторых случаях снижался вдвое с 45,10 ± 1,06 % до 22,00 ± 1,48 % по сравнению с контрольной группой, что свидетельствует об уменьшении содержания свободных радикалов, а следовательно, и о подавлении свободно-радикального окисления.

В качестве показателей антиоксидангного статуса крови крыс было определено содержание ферментов, каталазы (КАТ), супероксиддисмутазы (СОД), глутатионпероксидазы (ГПО) и интегративного показателя общей антиоксидантной активности (ОАА), отражающего активность не только внутриклеточных антиоксидантных энзимов, но и пеферменг-ных антиоксидантов организма (табл. 3)

Таблица 3

Показатели антиокеидантного статуса крови крыс в условиях длительного введения экспе-

риментальных препаратов на основе БАВ коры и побегов облепихи и СУМС -1

Группы животных, вводимый препарат Доза на одно животное (1 раз в сутки) КАТ (%) СОД (%) ГПО (ЕД/мгНЬ) ОАА (%)

1. Контроль, вода 0,76 мл/кг (0,19мл) 12,20±1,27 16,90±0,82 233,20±7,25 73,8±0,5

2. «ЭкоСорб», вода 430 мг/кг (0,10 г) 24,50±0,55* 22,00±0,64* 163,00±5,46* 83,5±0,6*

3. «ЭкоСорб», 1% р-р кислоты лимонной 430 мг/кг (0,10 г) 18,00±1,30* 17,50±1,49 167,40±9,87* 81,8±0,4*

4. СУМС-1, вода 320 мг/кг (0,08 г) 15,90±0,65* 19,80±1,21 193,70±5,73* 75,3±1,0

5. Экстракт побегов и коры облепихи жидкий 0,76 мл/кг (0,19мл) 14,00±0,68 25,90±1,20* 184,30±8,93* 80,9±0,7*

Примечание звездочками обозначены достоверные изменения к контролю.

Исследования показали, что значительное снижение показателей оксидантной активности при введении иммобилизованного препарата «ЭкоСорб» сопровождалось уменьшением расходования основных ферментов антиоксидантной защиты и обусловило увеличение показателя ОАА при применении гранул «ЭкоСорб», по сравнению с контрольной группой, на 8-10 %. Данный рост обеспечивался повышением показателей активности фермента КАТ до 24,50±0,55 % и фермента СОД до 22,00±0,64 %. Активность фермента ГПО снижалась, что, по-видимому, обусловлено его активным расходованием в процессе развития воспалигельной реакции При этом гранулы «ЭкоСорб» по сравнению не только с контрольной группой животных, но и животными, получавшими компоненты, входящие в состав иммобилизованного препарата, способствовали более значительному повышению антиокеидантного и снижению проокевдантного статуса организма

Исследования по изучению гепатопротекторного действия проводили на базе кафедры фармацевтической технологии Сибирского государственного медицинского университета (г. Томск). В качестве модели токсического повреждения печени использовали методику острого гепатита печени при внутрижелудочном введении крысам тетрахлорметана. У подопытных животных оценивали следующие показатели: выживаемость, измените массы тела, удельную массу печени, длительность гексеналового сна, биохимические показатели сыворотки крови и гистологическое строение печени.

Установлено, что все исследуемые препараты (гранулы «ЭкоСорб» и их составляющие: сорбент СУМС-1 и экстракт побегов и коры облепихи жидкий) ослабляли повреждающее действие тетрахлорметана и сохраняли жизнь животным на фоне экспериментального СС14-гепатита в 100 % случаев. Гранулы «ЭкоСорб» наиболее существенно стимулировали выведение из крови конъюгированного билирубина (в 3,92 раза) и в большей степени (более чем в 1,5 раза) уменьшали продолжительность гексеналового сна в сравнении с кошрольной группой животных.

Сравнительная оценка гистологической структуры печени крыс с острым гепатитом и крыс, получавших гранулы «ЭкоСорб» и их составляющие, позволила сделать заключения о том, что гранулы «ЭкоСорб» оказывают лечебное действие на некротические, дистрофические и инфильтрационные изменения в печени, вызванные тетрахлорметаном

Общие выводы

1. Изотермы сорбции БАВ побегов и коры облепихи крушиновидной на микрогранулиро-ванном и гранулированном энтеросорбенте СУМС-1 удовлетворительно описываются уравнением Ленгмюра, что свидетельствует об образовании моноадсорбционного слоя; изотермы сорбции на полифепане характерны, согласно теории БЭТ, для полимолекулярной адсорбции БАВ.

2 Практически не смываемый монослой БАВ побегов и коры облепихи крушиновидной на микрогранулированнном энтеросорбенте СУМС-1 составил 48,6 мг/г сорбента, гранулированном энтеросорбенте СУМС-1 - 22,0 мг/г сорбента; полислой полифепана был значительно выше (300 мг\г сорбента), в связи с чем количество БАВ (с учетом фармакологически активной дозы БАВ побегов и коры облепихи 50 мг) для нанесения на 1 г сорбента методом пропитки соответствовало. 98,6 мг/г, 72 мг/г и 350 мг/г сорбентов.

3. Десорбция фармакологически активной дозы БАВ побегов и коры облепихи крушиновидной (50 мг) со всех изучаемых сорбентов полностью происходит только в кислую среду (0,1 М раствор кислоты хлористоводородной)' за первые 5 минут с энтеросорбентов СУМС -1 и за 20 мин с энтеросорбента полифепан высвобождается более 75 % БАВ

4. Для иммобилизации БАВ коры и побегов облепихи методом пропитки возможно использование сорбентов СУМС-1 и полифепан, но, учитывая меньшую величину монослоя и полную десорбцию фармакологически активной дозы БАВ, целесообразно использование гранулированной фракции энтеросорбента СУМС-1.

5. При количественном определении серотонина в гранулах, таблетках и капсулах «ЭкоСорб» предпочтительно применение метода ВЭЖХ, который более прост в исполнении,

занимает меньшее количество времени и имеет незначительную ошибку опыта - 1,007 %, по сравнению со спектрофотометрическим методом.

6. В результате комплекса технологических и биофармацевтических исследований выбран оптимальный состав, разработаны рациональные технологии, проведена стандартизация, определены сроки годности (3, 2 и 2 года соответственно) и составлены технологические схемы получения иммобилизованного препарата «ЭкоСорб» в виде гранул и его таблетиро-ванной и капсулированной лекарственных форм с высокими показателями фармацевтической доступности.

7. В фармакологических экспериментах установлена антиоксидантная и гепатопротектор-ная активность гранул «ЭкоСорб» и его составляющих (экстракт побегов и коры облепихи крушиновидной и энгеросорбент СУМС-1) и при этом выявлено, что иммобилизация Б AB побегов и коры облепихи повышает эффективность указанных видов действия. Выявлено, что исследуемый препарат - гранулы «ЭкоСорб» практически не токсичен (4 класс - «вещества малоопасные»).

8 Результаты исследований положены в основу создания проектов ФСП на гранулы, таблетки и капсулы «ЭкоСорб».

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ

1. Сухотерина, Н.В. Изучение процессов сорбции и десорбции БАВ побегов и коры облепихи крушиновидной на энтеросорбенте СУМС-1 / Н.В. Сухотерина // Сборник тезисов докладов Всероссийской конференции «Молодые ученые — медицине». - Самара, 2003. - С. 280-281.

2. Сухотерина, Н.В. Изучение процессов сорбции биологически активных веществ побегов и коры облепихи крушиновидной на сорбенте полифепан / Н.В. Сухотерина, В.Ф. Турецкова // Молодежь - Барнаулу: Материалы пятой городской науч.-пракг. конф. молодых ученых. - Барнаул, 2003. - С. 262-263.

3. Сухотерина, Н.В. Сравнительная оценка процесса сорбции биологически активных веществ коры и побегов облепихи крушиновидной на энтеросорбен-тах СУМС-1 и полифан / Н.В. Сухотерина, В.Ф. Турецкова, ОБ. Гузеева// Разработка, исследование и маркетинг повой фармацевтической продукции: сб. науч. тр. -Вып. 59.-Пятигорск, 2004. -С. 219-221.

4. Боярина, Н.В. Изучение антиоксидантной активности извлечений коры и побегов облепихи / Н.В. Боярина, Н.В. Сухотерина, C.B. Тихомирова // Акту-

альные проблемы фармации: ежегодный сборник научных работ преподавателей, молодых ученых и студентов фармацевтического факультета. - Вып. I. - Барнаул, 2004. - С. 8-10.

5. Гуляева, М.Г. Изучение технологических свойств «ЭкоСорба» и выбор вспомогательных веществ в процессе его таблетирования / МГ. Гуляева, Н.В. Сухотерина, В.Ф. Турецкова // Актуальные проблемы фармации: ежегодный сборник научных работ преподавателей, молодых ученых и студентов фармацевтического факультета - Вып. I. - Барнаул, 2004. -С. 29-32.

6. Сухотерина, Н.В. Качественный анализ серотонина в жидких экстракционных препаратах из побегов и коры облепихи методом ВЭЖХ / Н.В. Сухотерина, В.Ф. Турецкова, Л.Е. Кудрикова// Лекарственные растения в фармакологии и фармации: Тез. док. науч. конф., посвященной 50-летию АГМУ. - Барнаул, 2004. - С. 237-238.

7. Сухотерина, Н.В. Исследования по разработке таблеток «ЭкоСорб» / Н.В. Сухотерина, В.Ф. Турецкова, М.Г. Гуляева// Фундаментальные исследования: Международный форум молодых ученых и студентов. Фармацевтические науки.—М., 2004. - № 4.-С. 85.

8. Сухотерина, Н.В. Разработка технологии и стандартизация капсул «ЭкоСорб»/ Н.В. Сухотерина, ОБ. Гузеева, В.Ф. Турецкова // Молодежь - Барнаулу: Материалы шестой науч.-пракг. конф. - Барнаул, 2004. - С. 198 -199.

9. Сухотерина, Н.В. Сравнительная оценка гранул, таблеток и капсул «ЭкоСорба» с биофармацевтических позиций / Н.В. Сухотерина, В.Ф. Турецкова // Современные наукоемкие технологии. Фармацевтические науки. - М., 2005. - № 1.—С. 76.

10. Сухотерина, Н.В. Ангиоксидангаая активность экспериментального препарата «ЭкоСорб» / Н.В. Сухотерина, В.Ф. Турецкова, Я.Ф. Зверев, О.В. Бухгамер, Я.С. Арбузова, С.В. Тихомирова // Современные проблемы фармакологии и фармации. - Новосибирск, 2005. - С. 29-31.

11. Бухгамер, О.В. Сравнительная оценка антиоксидантной активности комплексного экспериментального препарата «ЭкоСорб» и его составляющих / О.В. Бухгамер. Н.В. Сухотерина, Я.Ф. Зверев, В.Ф. Турецкова, Я.С. Арбузова, СВ. Тихомирова // Актуальные проблемы фармации: ежегодный сборник научных работ преподавателей, молодых ученых и студентов фармацевтического факультета. - Выпуск И. -Барнаул, 2005.-С. 28-31.

12. Сухотерина, Н.В. Изучение гепатопротекшвного действия экспериментального препарата «ЭкоСорб» / Н.В. Сухотерина, С.В. Чучалин, В.Ф. Турецкова // Юбилейный сборник научных статей «Фармацевтическому факультету АГМУ - 30 лет». - Барнаул,

2005.-С. 121-129.

13. Сухотерина, Н.В. Изучение процессов десорбции БАВ побегов и коры облепихи крушиновидной с сорбентов СУМС-1 и полифепан / Н.В. Сухотерина, В.Ф. Турецкова // Молодежь - Барнаулу: Материалы седьмой науч.-пракг. конф. -Барнаул, 2006. - С. 310 - 311.

14. Сухотерина, Н.В. Использование ВЭЖХ для идентификации и количественного определения серотонина в иммобилизованном препарате «ЭкоСорб» / Н.В. Сухотерина, А.Ю. Жариков, В.Ф. Турецкова // Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции: сб науч. тр. - Вып. 61. - ГЬпигорск,

2006.-С. 303 - 305.

15. Турецков^ В Ф. Некоторые методологические аспекты разработки суммарных экстракционных препаратов и лекарственных форм на их основе / В.Ф. Турецкова, Н.В. Сухотерина, Я.Ф. Зверев // Новые достижения в создании лекарственных средств растительного происхождения: Материалы Всероссийской науч.-пракг. конф. - Томск, 2006.-С. 332-336.

16. Турецкова В.Ф. Валидационная оценка методик количественного определения серотонина в экспериментальном иммобилизованном препарате «ЭкоСорб» / В.Ф. Турецкова, Н.В. Сухотерина, А.Ю. Жариков // Фармация. - 2006. - № 6. - С. 13-14.

СУХОТЕРИНА НАДЕЖДА ВИТАЛЬЕВНА

РАЗРАБОТКА И СТАНДАРТИЗАЦИЯ ИММОБИЛИЗОВАННЫХ ЛЕКАРСТВЕННЫХ ФОРМ НА ОСНОВЕ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ ВЕЩЕСТВ ПОБЕГОВ И КОРЫ ОБЛЕПИХИ КРУШИНОВИДНОЙ И ЭНТЕРОСОРБЕНТА СУМС-1

15.00.01 - технология лекарств и организация фармацевтического дела

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата фармацевтических наук

Подписано в печать 11.01.07. Тираж 100 экз. Формат 90x60/16. Заказ №11.

Отпечатано в типографии ГОУ ВПО Алтайский государственный медицинский университет Росздрава г. Барнаул, пр. Ленина, 40

Актуальность проблемы. Одним из перспективных источников биологически активных веществ (БАВ) является уникальное растение Сибирского региона - облепиха крушиновидная (Hippophae rhamnoides L.), сем. лоховые (Elaeagnaceae). традиционным сырьем которой являются плоды. В последние годы сотрудниками кафедры фармацевтической технологии АГМУ. НИИ фармакологии г. Томска и ЗАО «Алтайвитамины» в качестве источников получения препаратов противоопухолевого и противоязвенного действия предложены кора и побеги указанного растения (приложение I). В ходе экспериментальных исследований был разработан ряд жидких и сухих экстракционных препаратов [62. 135], в основе которых лежат вещества, содержащие в своей структуре свободные фенольные гидроксилы, такие как алкалоид серотонин и конденсированные дубильные вещества (Турецкова В.Ф., Зуева Е.П. с соавт.) [133. 136].

Установлено, что выраженным противоопухолевым действием обладает только жидкий экстракт. Включение стадии сушки в технологическую схему получения экстракционных препаратов из данных видов сырья приводит к потере противоопухолевого действия при сохранении противоязвенной активности (Турецкова В.Ф., с соавт.) [134, 135]. что, по-видимому, обусловлено разрушением нативного комплекса БАВ. Вместе с тем, жидкий экстракт побегов и коры облепихи, несмотря на высокую эффективность действия, как и все жидкие экстракты, имеет ряд недостатков: непортативность и трудность использования в процессе изготовления дозированных лекарственных форм; выпадение осадка при длительном хранении ввиду большой насыщенности БАВ и сопутствующими веществами; недостаточно приятный вяжущий и горьковатый вкус.

Из данных литературы известно. что современное развитие фармацевтической технологии позволяет устранить перечисленные недостатки различными способами. Так. одним из перспективных направлений в настоящее время является использование процесса иммобилизации БАВ на сорбентах разнообразной химической природы в процессе изготовления различных, в том числе и твердых, лекарственных форм, что в значительной мере повышает их стабильность за счет включения в разветвленную структуру полимера или в результате адсорбции на носителе, но и в значительной мере увеличивает эффективность препарата за счет возможности потенцирования действия активных компонентов и носителя. [29, 58, 59, 68. 106].

Наличие в побегах и коре облепихи комплекса соединений, содержащих в своей структуре свободные фенольные гидроксилы, позволяет предположить в отношении экстракта побегов и коры облепихи крушиновидной жидкого и другие виды фармакологической активности, так как одним из механизмов действия фенольных соединений является способность ингибировать свободнорадикальные реакции в организме [18, 22, 51, 52]. Обращает на себя внимание тот факт, что антиоксидантные свойства являются предпосылкой разнообразных видов действия, в том числе и гепатопротекторного [7. 118], и то, что многие энтеросорбенты, в том числе СУМС-1 и полифепан, используются в комплексном лечении токсических повреждений печени [34, 102, 103, 145].

Принимая во внимание вышеизложенное, а также учитывая широкое распространение в настоящее время заболеваний, вызванных токсическими поражениями печени, проведение исследований по разработке гепатопротекторного препарата в виде твердых лекарственных форм за счет использования процесса иммобилизации БАВ побегов и коры облепихи крушиновидной на энтеросорбенте является актуальной проблемой.

Цель и задачи исследования. Целью настоящего исследования является создание оригинального иммобилизованного препарата с гепатопротекторной активностью на основе биологически активных веществ побегов и коры облепихи крушиновидной и энтеросорбента.

Для реализации поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

1. Изучить кинетику сорбции и десорбции БАВ побегов и коры облепихи крушиновидной на энтеросорбентах СУМС-1 и полифепан.

2. Выбрать оптимальный носитель для иммобилизации БАВ побегов и коры облепихи крушиновидной.

3. Разработать оптимальную технологию иммобилизованного препарата БАВ побегов и коры облепихи крушиновидной, а также его таблетированной и капсулированной лекарственных форм с высокой фармацевтической и биологической доступностью.

4. Провести стандартизацию, изучить стабильность иммобилизованного препарата и разработанных лекарственных форм.

5. Изучить антиоксидантную и гепатопротекторную активность иммобилизованного препарата.

6. Разработать проекты нормативной документации на иммобилизованный препарат и лекарственные формы.

Научная новизна работы. Теоретически обоснована и экспериментально подтверждена целесообразность использования коры и побегов облепихи крушиновидной как источника БАВ с антиоксидантной и гепатопротекторной активностью.

Впервые проведены исследования по иммобилизации алкалоида серотонина, суммы конденсированных дубильных веществ и катехинов на сорбентах СУМС-1 и полифепан. Выявлено, что сорбция изучаемых БАВ возможна в обоих случаях.

Установлено, что процесс сорбции на сорбенте СУМС-1 подчиняется мономолекулярной теории Ленгмюра, на сорбенте полифепан - полимолекулярной теории БЭТ. Изучены процессы десорбции БАВ коры и побегов облепихи с сорбентов СУМС-1 и полифепан в кислую, щелочную и нейтральную среды. Доказано, что практически полная десорбция иммобилизованных БАВ с сорбента СУМС-1 осуществляется только в кислую среду. Установлено, что оптимальным носителем для БАВ побегов и коры облепихи крушиновидной является гранулированная фракция энтеросорбента СУМС-1.

Теоретически и экспериментально обоснованы оптимальный состав и технология получения таблеток «ЭкоСорб» методом прямого прессования. Установлены оптимальные технологические параметры для получения капсулированной лекарственной формы, обеспечивающие высокие показатели фармацевтической доступности.

Впервые разработаны методики качественного и количественного определения алкалоида серотонина методом ВЭЖХ в гранулах, таблетках и капсулах «ЭкоСорб».

Выявлены антиоксидантная и гепатопротекторная активность разработанного препарата «ЭкоСорб». Установлено, что иммобилизация БАВ побегов и коры облепихи приводит к повышению их антиоксидантного и гепатопротекторного действия.

Практическая значимость. Разработана рациональная технология получения гранул «ЭкоСорб» способом пропитки, в основе которой лежит иммобилизация БАВ побегов и коры облепихи крушиновидной на энтеросорбенте СУМС-1.

Выявлен способ повышения антиоксидантного и гепатопротекторного действия БАВ побегов и коры облепихи за счет их иммобилизации на энтеросорбенте СУМС-1.

В результате проведенных экспериментов созданы стабильные иммобилизованные препараты на основе БАВ коры и побегов облепихи и энтеросорбента СУМС-1 в виде капсулированной и таблетированной лекарственных форм, которые после дополнительных доклинических и клинических испытаний могут быть предложены в качестве гепатопротекторных средств.

По результатам исследований разработаны следующие проекты ФСП: «ЭкоСорб гранулы», «ЭкоСорб капсулы 500 мг», «ЭкоСорб таблетки 500 мг» и проекты лабораторных регламентов: «ЭкоСорб гранулы», «ЭкоСорб капсулы 500 мг». «ЭкоСорб таблетки 500 мг». В ЦЗЛ ЗАО «Алтайвитамины» проведена апробация предлагаемых технологий гранул, капсул и таблеток «ЭкоСорб» по схемам лабораторных регламентов. Установлена стабильность показателей качества гранул в течение 3,5 лет, таблеток и капсул «ЭкоСорб» - 2,5 лет.

Результаты исследований по разработке технологии и стандартизации гранул, капсул, таблеток «ЭкоСорб» используются в лекционном курсе, на лабораторных занятиях по фармацевтической технологии и фармацевтической химии (акты внедрения).

На защиту выносятся результаты экспериментального и теоретического обоснования получения иммобилизованного препарата «ЭкоСорб» на основе БАВ коры и побегов облепихи, изучения его антиоксидантной и гепатопротекторной активности и разработки таблетированной и капсулированной лекарственных форм.

Апробация работы. Основные положения диссертации обсуждались на Итоговой научной конференции АГМУ (Барнаул, 2002); Городской конференции

Молодежь-Барнаулу», медицинский раздел (Барнаул. 2002. 2003. 2004. 2005); Научной и Учебно-методической конференции, посвященной 20-летию фармацевтического факультета Башгосмедуниверситета (Башкирия. 2002); Всероссийской конференции «Молодые ученые-медицине» (Самара. 2003); 59-й, 61-ой региональной конференции по фармации и фармакологии (Пятигорск, 2004, 2006): Конференции студентов и молодых ученых «Международный форум молодых ученых и студентов» (Анталия (Турция), 2004); Научной конференции, посвященной 50-летию Алтайского государственного медицинского университета (Барнаул. 2004); И конференции студентов, молодых ученых и специалистов «Современные проблемы науки и образования» (Хургада (Египет), 2005); Всероссийской научно-практической конференции «Современные проблемы фармакологии и фармации» (Новосибирск. 2005); Юбилейной научной конференции, посвященной 30-летию фармацевтического факультета АГМУ (Барнаул. 2005); Всероссийской научно-практической конференции «Современные принципы и технологии разработки лекарственных средств» (Москва. 2006).

Связь задач исследования с проблемным планом фармацевтических наук. Работа выполнена в соответствии с планом научно-исследовательских работ Алтайского государственного медицинского университета по медико-биологическим проблемам, раздел «Фармация» (№ Гос. регистрации 01200301413).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 16 печатных работ, в том числе 2 - в зарубежной (Турция, Египет) и 1 статья в ведущем рецензируемом журнале.

Автор выражает благодарность сотрудникам Сибирского государственного медицинского университета (г. Томск), в частности зав. кафедрой фармацевтической технологии, доктору фарм. наук, профессору B.C. Чучалину. за проведение фармакологических испытаний разработанных иммобилизованных препаратов: сотрудникам кафедры фармакологии АГМУ (доктору мед. наук, профессору Я.Ф. Звереву) за помощь в проведении фармакологических исследований: сотрудникам ООО «Сорби-Фарм». г. Новосибирск (И.И. Фроловой) за помощь в проведении некоторых физико-химических исследований, а также сотрудникам ЗАО «Алтайвитамины» (ген. директору, доктору фарм. наук Ю.А. Кошелеву. главному технологу Н.И. Кулешовой, зав. ЦЗЛ О.А. Захарьевой).

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ ГЛАВА 1. ИММОБИЛИЗАЦИЯ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ ВЕЩЕСТВ НА СОРБЕНТАХ КАК СПОСОБ ПОВЫШЕНИЯ ЭФФЕКТИВНОСТИ ДЕЙСТВИЯ И

ОБЩИЕ ВЫВОДЫ

1. Изотермы сорбции БАВ побегов и коры облепихи крушиновидной на микрограну лированном и гранулированном энтеросорбенте СУМС-1 удовлетворительно описываются уравнением Ленгмюра, что свидетельствует об образовании моноадсорбционного слоя; изотермы сорбции на полифепане характерны, согласно теории БЭТ, для полимолекулярной адсорбции БАВ.

2. Практически не смываемый монослой БАВ побегов и коры облепихи крушиновидной на микрогранулированнном энтеросорбенте СУМС-1 составил 48,6 мг/г сорбента, гранулированном энтеросорбенте СУМС-1 - 22,0 мг/г сорбента; полислой полифепана был значительно выше (300 мг\г сорбента), в связи с чем количество БАВ (с учетом фармакологически активной дозы БАВ побегов и коры облепихи 50 мг) для нанесения на 1 г сорбента методом пропитки соответствовало: 98,6 мг/г, 72 мг/г и 350 мг/г сорбентов.

3. Десорбция фармакологически активной дозы БАВ побегов и коры облепихи крушиновидной (50 мг) со всех изучаемых сорбентов полностью происходит только в кислую среду (0,1 М раствор кислоты хлористоводородной): за первые 5 минут с энтеросорбентов СУМС -1 и за 20 мин с энтеросорбента полифепан высвобождается более 75 % БАВ.

4. Для иммобилизации БАВ коры и побегов облепихи методом пропитки возможно использование сорбентов СУМС-1 и полифепан, но, учитывая меньшую величину монослоя и полную десорбцию фармакологически активной дозы БАВ, целесообразно использование гранулированной фракции энтеросорбента СУМС-1.

5. При количественном определении серотонина в гранулах, таблетках и капсулах «ЭкоСорб» предпочтительно применение метода ВЭЖХ, который более прост в исполнении, занимает меньшее количество времени и имеет незначительную ошибку опыта - 1,007 %, по сравнению со спектрофотометрическим методом.

6. В результате комплекса технологических и биофармацевтических исследований выбран оптимальный состав, разработаны рациональные технологии, проведена стандартизация, определены сроки годности (3, 2 и 2 года соответственно) и составлены технологические схемы получения иммобилизованного препарата «ЭкоСорб» в виде гранул и его таблетированной и капсулированной лекарственных форм с высокими показателями фармацевтической доступности.

7. В фармакологических экспериментах установлена антиоксидантная и гепатопротекторная активность гранул «ЭкоСорб» и его составляющих (экстракт побегов и коры облепихи крушиновидной и энтеросорбент СУМС-1) и, при этом показано, что иммобилизация БАВ побегов и коры облепихи повышает эффективность указанных видов действия. Также выявлено, что исследуемый препарат - гранулы «ЭкоСорб» практически не токсичен (4 класс - «вещества малоопасные»).

8. Результаты исследований положены в основу создания проектов ФСП на гранулы, таблетки и капсулы «ЭкоСорб».

Заключение

Анализ данных литературы позволяет сделать вывод, что иммобилизация биологически активных соединений широко используется в различных областях медицины. Данный процесс лежит в основе получения современных лекарственных форм и при этом позволяет не только повысить стабильность лекарственных препаратов, но и в значительной мере увеличить эффективность их действия. Иммобилизация лекарственных веществ значительно изменяет их фармакокинетику в организме: пролонгирует или ускоряет высвобождение из лекарственной формы, усиливает терапевтическое действие, обеспечивает целенаправленную доставку к органу-мишени, снижает токсическое и побочное влияние. В основе иммобилизации лежат физические или химические взаимодействия между включенным веществом и носителем.

Успех использования иммобилизованных препаратов в значительной мере определяется правильным выбором носителя и метода иммобилизации. В настоящее время известно большое число сорбентов, в том числе и энтеросорбентов. которые могут выступать в качестве носителей для иммобилизации БАВ. При выборе носителя наиболее важными характеристиками являются величина удельной поверхности и характер распределения пор по размерам. Перспективными энтеросорбентами для иммобилизации гидрофильного комплекса БАВ побегов и коры облепихи крушиновидной, в первую очередь благодаря сродству, достаточно большой удельной поверхности, наличию мезо- и микропористой структуры, следует считать углеродминеральные энтеросорбенты и природные полимеры.

В практической медицине России в качестве энтеросорбентов используются препараты активированного угля, кремния диоксида, лигнина гидролизного. метилкремниевой кислоты и алюминия гидроксида с активированным углем, которые нашли широкое применение в комплексной терапии заболеваний ЖКТ, в т.ч. и при лечении заболеваний, сопровождающихся нарушением функций печени. Энтеросорбенты в последние годы используются не только как самостоятельные препараты для энтеросорбции экзо- и эндотоксинов, но и как матрицы-носители для иммобилизации БАВ и биообъектов. Наиболее широко в нашей стране в настоящее время в качестве носителя для иммобилизации БАВ нашел энтеросорбент СУМС-1, благодаря не только своим физико-химическим свойствам, но и минимальным количеством побочных эффектов.

Вышеизложенное свидетельствует о целесообразности создания стабильного комплексного иммобилизованного лекарственного препарата на основе БАВ с гепатопротекторной активностью и энтеросорбентов, который был бы способен нормализовать метаболизм, функцию и структуру паренхимы печени.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ ГЛАВА 2. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1. Объекты исследования.

Объектами исследования служили экстракт побегов и коры облепихи крушиновидной жидкий, полученный по технологии, разработанной В.Ф. Турецковой с соавт. [62], и отвечающий требованиям проекта ФСП 42- ; энтеросорбент СУМС-1 (ФС 42-3283-96) и полифепан (ФСП 42-0085-1858-01).

Экстракт побегов и коры облепихи крушиновидной жидкий. Сырьем для получения экстракта побегов и коры облепихи крушиновидной жидкого служила смесь одно-, двухлетних побегов и коры облепихи в соотношении 8:2, что соответствует реальному соотношению между компонентами сырья, сформировавшемуся естественным образом в процессе проведения агротехнических мероприятий при возделывании облепихи. Рациональность использования побегов и коры облепихи крушиновидной в качестве источника получения лекарственных препаратов обусловлена значительным накоплением надземной биомассы облепихи крушиновидной в виде неиспользуемых отходов -до 50 тонн в год в садах промышленного назначения Алтайского края [134. 135].

Существенным аргументом в пользу актуальности использования побегов и коры облепихи крушиновидной в медицине является разнообразный состав БАВ указанных видов сырья с преобладанием гидрофильной фракции. Особый интерес вызывает наличие в данном виде сырья алкалоидов, основным из которых является серотонин, наличие которого впервые обнаружено в коре облепихи крушиновидной П.С. Массагетовым в 1947 году [86] и подтверждено в дальнейших исследованиях такими авторами, как М.Ф. Петрова. Г.П. Меньшиков и П.С. Кранц (1964 год) [97], R.Y. Ambaye и М.А. Indap (1970 год) [151], В.Ф. Турецкова (2000 год) [133]. Количественное содержание суммы алкалоидов, определенное В.Ф. Турецковой с соавт. спектрофотометрическим методом с использованием способности индольных алкалоидов образовывать комплексы с п-диметиламинобензальдегидом. в коре облепихи варьирует в пределах 0,84+0,004%. 1.03+0,05%, в побегах облепихи - 0,70+0.03%. 1,00±0.033%. Обращает на себя внимание наличие в изучаемых видах сырья значительного количества полифенольиых соединений, которые представлены флавоноидами группы катехина и лейкоцианидина. гликозидами кверцетина. кемпферола и изорамнетина, а также конденсированными и гидролизуемыми дубильными веществами (до 20,03 %) [2. 133, 136].

Кроме гидрофильной фракции БАВ. которая по данным В.Ф. Турецковой с соавт. составляет превалирующую часть активных соединений экстракта побегов и коры облепихи жидкого, в коре и побегах облепихи обнаружено наличие липофильных веществ (до 3.28 %). Липофильная фракция веществ представлена такими классами соединений, как каротиноиды (до 19.11 мг%); тритерпеновые соединения (содержание урсоловой кислоты достигает 0.29 %): кумарины (до 0.44 %). среди которых идентифицирован псорален и жирные кислоты (линолевая. линоленовая. олеиновая. бегеновая. миристиновая. пальметиновая. пальмитолеиновая. стеариновая) [2. 136].

Детальное изучение химического состава как гидрофильной, так и липофильной фракции БАВ было проведено В.Ф. Турецковой с соавт. [133. 135] Данные проведенных исследований положены в основу разработки технологии экстракта побегов и коры облепихи крушиновидной жидкого. Фармакологические исследования, проведенные в НИИ фармакологии г. Томска, выявили наличие противоопухолевого. противометастатического и противоязвенного действия у экстракта побегов и коры жидкого [62. 134, 136].

Экстракт побегов и коры облепихи крушиновидной жидкий, полученный способом противоточного многоступенчатого экстрагирования с законченным циклом в батарее из шести диффузоров, соответствовал требованиям проекта ФСП 42- [135], которые представлены в таблице 2.1.

Спецификация «Облепихи побегов и коры экстракт жидкий»

Показатель Метод Требования НД Экспериментальные данные

1 2 3 4

1. Описание Визуально Прозрачная жидкость красно-бурого цвета, своеобразного запаха Соответствует

2. Подлинность ТСХ, пластинка «Сорбфил». реактив п-диметиламино-бензальдегид Пятно синего цвета с Rf около 0,6 Соответствует

3. Тяжелые металлы ГФ XI, вып. 2, с. 161 Не более 0,01% Не обнаружено

4. Количественное определение Спектрофотометрия Содержание суммы алкалоидов в пересчете на серотонин от 0,35 % до 0,44 % 0,37 ±0,01 -0,38 ±0,01 %

5. Спирт ГФ XI. вып. 2, с. 26 Не менее 34 % 36.4 ±1,3-38,1 + 1,1 %

6. Сухой остаток ГФ XI, вып. 2, с. 161 Не менее 13 % 28,7 ± 1,1 -29,2 + 0,9 %

7. Микробиологическая чистота ГФ XI. вып. 2, с. 187 и Изменение №2 Категория ЗБ Соответствует

Энтеросорбенты. При разработке технологии иммобилизованных препаратов БАВ побегов и коры облепихи мы исходили из того, что к носителю предъявляются следующие требования: во-первых, необходимо, чтобы его адсорбционная емкость по отношению к данному БАВ была высокой; во-вторых, при иммобилизации на этом носителе биологическая активность БАВ должна практически полностью сохраняться; в-третьих, прочность связывания БАВ с поверхностью должна быть такой, чтобы обеспечивать частичную десорбцию вещества в течение необходимого времени. причем концентрация десорбировавшегося БАВ должна быть достаточной для проявления лечебного эффекта [68, 106].

В качестве носителей для БАВ коры и побегов облепихи нами выбраны сорбенты с достаточно высокой удельной поверхностью и развитой мезо- и макропористой структурой, обеспечивающей их умеренные адсорбционные свойства по отношению к таким низкомолекулярным соединениям, как. например, глюкозе, витаминам, гормонам. В то же время наличие в структуре крупных транспортных пор способствует более целенаправленной сорбции средне- и высокомолекулярных БАВ, таких, например, как алкалоиды и дубильные вещества [108]. Кроме того, данные сорбенты, по нашему мнению, с экономической точки зрения, относительно недорогие, что благоприятно отразится на конечной рыночной цене разработанных препаратов.

По результатам предварительных исследований и данных литературы (см. раздел 1.2.) нами были выбраны микрогранулированная и гранулированная фракции энтеросорбента СУМС-1 (Регистрационный номер МЗ РФ 93/174/7), который представляет собой ядро окиси алюминия, покрытое углеродной пленкой. Сорбент производится в виде микросферических гранул размером 0,1 - 0,2 мм и гранул размером 0,2 - 1 мм без запаха и вкуса. Энтеросорбент СУМС- 1 не растворяется в воде, органических и биологических средах [43].

Выбор данного сорбента был обусловлен тем, что он, кроме вышеизложенного, способствует выведению из организма тяжелых металлов, не токсичен, количественно выводится из организма в течение 24-28 часов, не метаболизируется и оказывает одинаковое детоксицирующее действие во всех отделах желудочно-кишечного тракта [90. 103]. Критерием в пользу выбора сорбента СУМС-1 явились также многочисленные экспериментальные и клинические данные о том. что он не нарушает равновесий водно-солевого баланса в организме (в отличие от активированного угля, сорбентов, содержащих цеолит) [103, 108]. Кроме того, были приняты во внимание те факты, что для энтеросорбента СУМС-1 установлена гепатопротекторная активность и его характерной особенностью является обратимая сорбция белковых молекул, низкомолекулярных органических веществ и бактериальных клеток, что позволяет использовать его одновременно в качестве носителя для лекарственных препаратов и энтеросорбента[102. 103].

В качестве второго экспериментального носителя использовали поливалентный неспецифический энтеросорбент на основе природных полимеров - полифепан (Регистрационный номер МЗ РФ 80/1211/4), в основе которого лежат производные фенилпропана. Данный сорбент представляет собой влажный мелкодисперсный порошок коричневого цвета, практически нерастворимый в воде и органических растворителях. Имеет развитую поверхность и значительный набор функциональных групп, что позволяет сорбировать БАВ (возможна сорбция нейромедиаторов (серотонина), алкалоидов, жирных кислот, сахара, стероидных гормонов, тяжелых металлов и др.). Не менее важным фактором, послужившим основой для выбора данного сорбента, явились данные о том. что по показателю сорбции низко- и среднемолекулярных токсинов полифепан не уступает углям [43, 108].

Вспомогательные вещества. При разработке технологии таблетированной лекарственной формы «ЭкоСорб» в качестве вспомогательных использовали вещества, разрешенные к применению в медицине и отвечающие требованиям соответствующей нормативной документации: кальция стеарат (ТУ 6-09-17-317-96) лактоза (ГФ X, с. 589) натрий-карбоксиметилцеллюлоза очищенная (Бланозе MF. Франция) поливинилпирролидон низкомолекулярный (ФС 42-1194-98) целлюлоза микрокристаллическая (ФС 42-3722-99).

2.2. Методы исследования, используемые при качественном анализе БАВ.

1). Десорбцию алкалоида серотонина и его очистку от сопутствующих веществ для качественного обнаружения методом ТСХ проводили с использованием жидкостной экстракции. При этом извлечение алкалоида из экспериментальных препаратов осуществляли органическим растворителем (смесь хлороформ-бутанол (1:1) в щелочной среде (магния оксид), с последующей очисткой от сопутствующих веществ путем реэкстракции 1% водным раствором кислоты хлороводородной [39, 135].

2). Тонкослойную хроматографию (ТСХ) проводили с использованием пластинок «Сорбфил ПТСХ-П-А-УФ» (10x10 см) (Краснодар АО «Пластмаш) - для обнаружения серотонина; пластинок «Силуфол УФ-254» (15x15 см) (УСФР) - для дубильных веществ [39, 135,146].

3). Все приведенные значения Rf являются средними величинами 5-6 измерений.

4). Для приготовления хроматографических систем применяли растворители марок ч.д.а. и х.ч. Соотношения растворителей, обозначенные цифрами, взяты в объемных единицах.

5). Хроматографирование в тонком слое сорбента для выявления алкалоида серотонина проводили в системе растворителей н-бутанол-уксусная кислота-вода (БУВ) (5:1:4); для выявления дубильных веществ - в системе растворителей БУВ (40:12:28), выбранных ранее в качестве оптимальных в исследованиях В.Ф Турецковой для экстракта побегов и коры жидкого [135].

6). Детектирование серотонина на хроматограммах осуществляли после обработки раствором п-диметиламинобензальдегида; дубильных веществ -раствором натрия персульфата, 1% раствором ванилина, раствором п-диметиламинобензальдегида [17. 51, 52, 140].

7). В качестве рабочего стандартного образца (РСО), свидетеля серотонина, здесь и далее был использован 0,1% раствор серотонина-креатинина сульфата («Reanal», Венгрия).

8). Метод высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) был использован при обнаружении серотонина, входящего в состав иммобилизованных препаратов.

Исследование проводили на микроколоночном жидкостном хроматографе Милихром А-02 («ЭкоНова», Новосибирск, Россия) с УФ-детектором, колонкой 2 х 7.5 мм и сорбентом ProntoSIL-120-5-С18, размер частиц 5 мкм, с одновременной детекцией пиков при длинах волн 200, 250, 276, 322 нм. Полярный характер анализируемого соединения, его хорошая растворимость в водных растворах [84] и ацетонитриле были положены в основу выбора элюентов в качестве подвижной фазы. Оптимальные условия определения серотонина найдены при градиентном хроматографировании стандарта и экстракта в следующих условиях: элюент А

100% ацетонитрил. элюент Б - фосфатный буферный раствор в концентрации 0.025 М с рН=6,86, температура колонки 35 С. При этом использовали градиентное элюирование со скоростью 100 мкл/мин. Показания детектора снимали с интервалом 0.34 сек.

2.3. Методы количественного определения БАВ.

1). Для определения суммы БАВ побегов и коры облепихи (серотонин, катехины и конденсированные дубильные вещества) в пересчете на катехин при изучении процессов сорбции и десорбции (при разработке иммобилизованных препаратов) было использовано прямое спектрофотометрическое определение при длине волны 276 нм. Расчеты производили с использованием удельного показателя поглощения катехина (Е -135,0) [39].

Целесообразность данного определения суммы БАВ в пересчете на катехин обосновывалась и тем, что ранее в эксперименте В.Ф.Турецковой с соавт. [39, 135] установлено, что алкалоиды в экстракте побегов и коры облепихи жидком и исходном сырье находятся в виде комплексных соединений с катехинами и лейкоцианидинами и имеют общий максимум поглощения 276 нм.

2). Для количественного определения серотонина спектрофотометрическим методом в иммобилизованных экспериментальных препаратах, полученных при разработке оптимальных технологий, были применены ранее разработанные В.Ф.Турецковой с соавт. методики для экстракта побегов и коры облепихи жидкого с некоторыми модификациями, которые заключались в выборе оптимальных количеств навесок препаратов, позволяющих получить растворы с оптической плотностью 0.3-0,8 единиц после их экстрагирования органическим растворителем (хлороформ-бутанол 1:1) в щелочной среде (магния оксид), с последующей очисткой от сопутствующих веществ путем реэкстракции 1% водным раствором хлороводородной кислоты. Далее методика основывалась на способности индола и некоторых его производных, в частности серотонина, образовывать с п-диметиламинобензальдегидом окрашенные комплексы [39, 135]. Оптическую плотность раствора комплексного соединения определяли при длине волны 590 нм, так как данный максимум характерен для комплексов алкалоидов реэкстра1сга и серотонина гидрохлорида с п-диметиламинобензальдегидом. Расчеты производили с использованием удельных показателей поглощения комплекса серотонина гидрохлорида с п-диметиламинобензальдегидом, определенных ранее В.Ф.Турецковой в эксперименте (Х= 590 нм, Е -56,0) [135].

3). Количественное определение серотонина с использованием метода ВЭЖХ было проведено без предварительного выделения из смеси БАВ (раздел 2.2.8). При этом разработанная методика позволяет одновременно проводить качественное и количественное определение серотонина, так как при найденных условиях хроматографирования наблюдается четкое разделение пиков. Относительная ошибка определения не превышала 2 %.

4). Статистическую обработку данных технологических исследований (Р = 95%) проводили при помощи критерия Стьюдента с вычислением граничных значений доверительного интервала среднего результата и определением ошибки средней арифметической при различных значениях п (число результатов) по стандартным методикам ГФ XI с использованием для расчетов компьютерной программы Exel [41].

5). Реактивы, использованные при разработке методик анализа и стандартизации, описаны в ГФ XI вып. 1 и 2 [41. 42].

2.4. Методы исследования физико-химических и технологических свойств материала.

1). Фракционный (гранулометрический) состав определяли ситовым анализом. 100,0 г исследуемого материала просеивали через набор сит (диаметр отверстий 2,0, 1,0, 0,5, 0,25 и 0,1 мм). Навеску материала помещали на самое крупное (верхнее сито) и весь комплект сит встряхивали вручную в течение 5 мин. затем находили массу каждой фракции и ее процентное содержание [40, 42, 87].

2). Сыпучесть определяли на виброустройстве для снятия характеристик сыпучих материалов ВП - 12А, при этом, навеску препарата «ЭкоСорб» 50,0 г засыпали в сухую воронку с углом конуса 60° с носиком, срезанным под прямым углом на расстоянии 3 мм от конца конуса воронки. Включали секундомер и виброустройство одновременно при закрытой заслонке. После 20 сек. утряски, необходимой для получения стабильных показаний, открывали заслонку и отмечали время, за которое вытечет весь порошок. Сыпучесть определяли по формуле:

V - сыпучесть, г/сек: М - масса навески, г; Т - полное время опыта, сек; 20 - время утряски, сек [14.70].

3). С помощью прибора ВП - 12А определяли также угол естественного откоса - угол между образующей конуса из сыпучего материала и горизонтальной плоскостью.

Для определения угла естественного откоса навеску порошка 50.0 г засыпали в сухую воронку из нержавеющей стали с углом конуса 60° с носиком, срезанным под прямым углом на расстоянии 3 мм от конца конуса воронки, включали устройство, открывали заслонку. После истечения порошка выключали устройство, убирали излишки порошка и подводили угломер, определяя по шкале угол естественного откоса.

При интерпретации результатов экспериментов, учитывали то, что угол естественного откоса для хорошо сыпучих материалов должен изменяться в пределах от 25 до 30°. для связных материалов от 60 - 70° [14. 70. 87].

4). Насыпную массу (объемную плотность) определяли на устройстве для вибрационного уплотнения порошков 545Р - АК - 3 следующим образом: в стеклянный мерный цилиндр устройства насыпали исследуемый порошок навеской 5.0 г (точная навеска) и по шкале на цилиндре замеряли объем порошка. На приборе устанавливали амплитуду колебаний. Количество необходимых колебаний цилиндра определяли по времени, когда объем порошка в цилиндре перестанет изменяться. По шкале на цилиндре определяли объем уплотненного порошка. Объемную плотность (В. кг/м3) вычисляли по формуле:

В = где q - навеска исследуемого порошка, г;

V - объем после встряхивания, мл [14,70. 87].

5). Определение прочности таблеток на истирание проводили на приборе для истирания таблеток барабанного типа - фриабиляторе 545-Р-АК-8. 10 таблеток, обеспыленных и взвешенных с точностью до 0,001 г, помещали в барабан, привинчивали крышку и включали устройство на 5 мин., что соответствовало 100 оборотам барабана. По истечении установленного времени таблетки обеспыливали и определяли их массу с точностью до 0,001г.

Прочность таблеток на истирание в процентах (П) вычисляли по формуле:

Р1 и Р2 - масса таблеток до и после испытания соответственно в граммах.

Согласно требованиям ГФ XI издания статья «Таблетки» прочность таблеток на истирание должна быть не менее 97% [42, 78, 137].

6). Прочность на сжатие (прессуемость) определяли по следующей методике: навеску 0,3 г препарата «ЭкоСорб» спрессовывали в матрице с диаметром 9 мм на гидравлическом прессе типа П-10 при Р = 120 МПа. Перед заполнением матрицы порошком пуансоны и внутренние стенки матрицы протирали ватным тампоном, увлажненным раствором стеариновой кислоты в ацетоне и высушивали. После выталкивания таблетки из матрицы, определяли прочность на сжатие в кг нагрузки с помощью динамометра, которую пересчитывали в Н [14, 70].

7). Влажность (содержание влаги) определяли высушиванием навески «ЭкоСорб» 0,3 г (т.н.) в предварительно высушенном до постоянной массы и взвешенном бюксе в сушильном шкафу в течение трех часов. Влажность (X, %) в процентах вычисляли по формуле: м - масса порошка до высушивания, г: м | - масса порошка после высушивания, г [41].

8). Гигроскопичность (способность поглощать влагу) препарата «ЭкоСорб» проводили по выше описанной методике (определение влажности) после выдерживания бюкса с навеской в камере с относительной влажностью воздуха 100% в течение 24 часов [41]. где

2.5. Методы определения показателей фармацевтической доступности.

1). Определение распадаемости проводили на лабораторном идентификаторе процесса распадаемости таблеток 545Г-АК-1. Для проведения испытаний отбирали 18 образцов исследуемых таблеток определенной прописи, помещали по одному в каждую трубку прибора, прикрепляли к верхнему диску сетку из нержавеющей стали с размером отверстий 2 мм и помещали в сосуд с 0,1 М раствором кислоты хлористоводородной при температуре (37±2) С. Включали прибор и проводили определение времени, в течение которого все образцы должны полностью распадаться, о чем судили по отсутствию частиц на сетке диска. Если 1 или 2 образца не распались, повторяли испытание на оставшихся 12 образцах. Не менее 16 из 18 образцов должны полностью распасться. Согласно требованиям ГФ XI издания статья «Таблетки» время распадаемости таблеток, не покрытых оболочкой, должно быть не более 15 мин. [42, 128].

2). Определение растворения проводили на приборе для растворения лекарственных веществ из таблеток и капсул 545Р-АК-7 типа «Вращающаяся корзинка». Под растворением подразумевают количество действующего вещества, которое в стандартных условиях за определенное время должно перейти в раствор из твердой дозированной лекарственной формы. В качестве среды растворения использовали 0,1 н раствор кислоты хлористоводородной. Испытуемый образец (одну таблетку) помещали в сухую корзинку, которую опускали в среду растворения так. чтобы расстояние до дна сосуда было (20±2) мм. Сосуд закрывали крышкой, затем приводили корзинку во вращение, режим которого составлял 100 об/мин.

Процесс растворения изучали в динамике в течение 75 мин. Через каждые 5 мин отбирали пробу раствора. Фильтрат нейтрализовали свежепрокаленным порошком магния оксида до рН 5-6, перемешивали 5 мин и проводили количественное определение алкалоида серотонина методом ВЭЖХ (методика изложена в разделе 3.3.2.).

Для каждой таблетки определенной прописи рассчитывали количество вещества, перешедшего в раствор (в процентах от содержания в таблетке, которое принимали за 100%). как среднее для 5 таблеток. Интерпретацию результатов исследований проводили согласно требованиям ОФС 42-0003-00 «Растворение»: серия считалась удовлетворительной при растворении в течение 45 мин в среднем не менее 70 % действующего вещества (от содержания в таблетке) в 0.1 М растворе кислоты хлористоводородной, при режиме перемешивания 100 об/мин [42. 128. 137].

ГЛАВА 3. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЕ ОБОСНОВАНИЕ ТЕХНОЛОГИИ И СТАНДАРТИЗАЦИЯ ИММОБИЛИЗОВАННОГО ПРЕПАРАТА «ЭКОСОРБ» НА ОСНОВЕ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ ВЕЩЕСТВ ПОБЕГОВ И КОРЫ ОБЛЕПИХИ КРУШИНОВИДНОЙ

Современное развитие фармацевтической технологии и широкий ассортимент вспомогательных веществ позволяет выйти на новые направления в создании лекарственных средств. Одним из перспективных направлений в настоящее время является использование процесса иммобилизации БАВ на сорбентах различной природы, что в значительной мере повышает их стабильность и позволяет сохранить в нативном состоянии за счет включения в разветвленную структуру полимера или в результате адсорбции на носителе. Вместе с тем, большое разнообразие сорбентов представляет возможность выбора оптимального носителя для иммобилизации БАВ побегов и коры облепихи.

3.1. Изучение процессов адсорбции БАВ побегов и коры облепихи на энтеросорбентах СУМС-1 и полифепан.

Дня изучения адсорбционных свойств БАВ побегов и коры облепихи на двух фракциях энтеросорбента СУМС-1 - микрогранулированной и гранулированной и полифепане нами была использована теория адсорбции Ленгмюра. в основе которой лежит мономолекулярная адсорбция (образование адсорбционного слоя на поверхности сорбента толщиной в одну молекулу). Уравнение изотермы адсорбции Ленгмюра справедливо для широкого интервала концентраций и для границ раздела, как подвижных (жидкость - газ, жидкость - жидкость), так и твёрдых (твердое тело - газ, твердое тело - жидкость). Согласно данной теории, важнейшей характеристикой сорбционного процесса является графическая зависимость количества сорбированного вещества от равновесной концентрации при постоянной температуре (T=const) или изотерма адсорбции.

Уравнение Ленгмюра (3.1):

А = Amax b Ср/(1 + ЬСР), (3.1) где А - экспериментальная адсорбционная емкость при определенной равновесной концентрации Ср, позволяет рассчитать предельную сорбционную емкость Атах в предположении монослойной адсорбции, а также константу Ь, определяющую энергетику сорбции в данном образце. Линеаризация изотермы - в координатах Ср/ А - Ср [54].

Построение изотермы адсорбции для выбранных нами сорбентов осуществляли по методике, разработанной в Новосибирском институте катализа им. Г.К. Борескова СО РАН [68].

3.1.1. Микрогранулированный СУМС-1.

Методика адсорбции БАВ побегов и коры облепихи заключалась в следующем:

Адсорбцию проводили при постоянной (комнатной) температуре. Растворы адсорбатов, представляющих собой смеси экстракта побегов и коры облепихи жидкого и 40 % спирта этилового (экстрагент при получении экстракта) в различных концентрациях. смешивали с сорбентом в соотношении 1:10. Полученные растворы выдерживали на встряхивателе АВУ- 6с в течение 24 часов до установления равновесия в системе сорбент - раствор. Затем растворы декантировали, разбавляли до необходимой оптической плотности (0,3 - 0,8). Оптическую плотность исходного (Со) и осветлённого раствора (Ср - равновесную концентрацию) определяли на спектрофотометре СФ-46 при длине волны 276 нм (см. глава 2.3.) - максимуме поглощения серотонина и полифенольных соединений коры и побегов облепихи (основных БАВ, обеспечивающих фармакологическое действие) [39]. В качестве раствора сравнения использовали адсорбат чистого экстрагента (40 % спирт этиловый), полученный в тех же условиях. Равновесную концентрацию (Ср). определяли по формуле (3.2): VxDx 1000 VxDx 10 .

Ср =-=- , (3-2) ax Ex 100 axE где:

Ср - равновесная концентрация осветленного раствора, мг/мл;

V-объем мерной колбы, мл:

D-оптическая плотность осветленного раствора: а -объем пробы, мл;

Е - удельный показатель поглощения суммы БАВ побегов и коры облепихи в пересчете на катехин (Е -135,0).

По разнице между исходной концентрацией адсорбата (Со) и равновесной концентрацией адсорбата в осветлённом растворе (Ср) определяли количество адсорбированного вещества А (мг/r сорбента) (3.3).

А= Со- Ср (3.3)

По полученным результатам строили графическую зависимость (изотерму адсорбции) в координатах (А : Ср). которая характеризует максимальное количество адсорбата. которое способен адсорбировать сорбент при данном соотношении масса (М) сорбента : объем (V) раствора.

Полученные данные представлены в табл. 3.1.